Елементи методу капілярного електрофорезу

К.ф.-м.н. Ягов Г.В.

Введення

Досвід сучасної науки показує, що поєднання здавалося б протилежних властивостей приводить до отримання нових, несподіваних результатів. Саме таке поєднання властивостей води (водних розчинів електролітів) і "каменю" (діоксиду кремнію, кварцу, з якого виготовлений капіляр), дозволили створити новий метод аналізу, який носить назву капілярного електрофорезу (КЕФ). Власне і електрофорез і капілярність були відомі досить давно, але тільки кілька десятиліть тому вдалося розробити новий метод аналізу, в якому ці явища використовуються для розділення проб складного складу на складові компоненти.

На сьогоднішній день капілярний електрофорез є одним з найбільш перспективних методів аналізу, він динамічно розвивається і набуває все більш широке застосування в різних областях аналітичної хімії. Простота і доступність цього методу, а також незаперечні переваги, які він дає при виконанні вимірювань, дозволяють сподіватися на динамічний розвиток методичного забезпечення і якнайшвидше включення капілярного електрофорезу в перелік фізико-хімічних методів аналізу, найбільш часто вживаних у повсякденному лабораторної практиці.

У запропонованій вашій увазі статті узагальнено матеріали, які обговорювалися на семінарах фірми ЛЮМЕКС, деякі з них були опубліковані раніше. Автор висловлює надію, що викладається матеріал буде корисним для фахівців, приступають до самостійної роботи з приладами капілярного електрофорезу, як в дослідницькому плані, так і для виконання рутинних вимірювань.

Основи методу

Теоретичні основи капілярного електрофорезу досить складні, що зумовлено використанням у цьому методі властивостей поверхні розділу двох фаз - рідини і твердого тіла, властивостей в'язкості рідини і властивостей іонної електропровідності рідини, тому, не претендуючи на академічну строгість викладу, постараємося продемонструвати основні моменти методу капілярного електрофорезу.

Звернемося до процесів, що відбуваються на межі розділу двох фаз: внутрішньої поверхні кварцового капіляра і водного розчину електроліту, що заповнює капіляр. На свежеобразованной (ювенільної) поверхні плавленого кварцу (SiO2) знаходяться головним чином силоксанові групи (рис. 1а). При контакті з парами води або водними розчинами силоксанові групи, що володіють подвійними зв'язками, виявляються нестійкими і, приєднуючи молекулу води, утворюють гідрофільних силанольних групи (рис. 1б). При контакті поверхні кварцу з водними розчинами, гідрофільних силанольних групи дисоціюють з відщепленням іонів Н + (рис. 1в). Ступінь дисоціації залежить від температури і складу водного розчину, зокрема від величини рН. При рН> 2,5 на поверхні кварцу утворюються дисоційованому гідрофільних силанольних групи, які створюють негативний поверхневий заряд.

Дисоційованому іони, що знаходяться як на кварцовою поверхні, так і в об'ємі електроліту, гідратіруются (рис. 1г). За рахунок сил кулонівського взаємодії, протилежно заряджені гідратовані іони, що знаходяться на поверхні і в об'ємі рідини, взаємно притягуються. Діючі при цьому сили настільки великі, що іони (частина катіонів і залишки силанольних груп) частково втрачають гідратуючий воду. У результаті цього, перший шар катіонів, безпосередньо прилягає до поверхні, втрачає рухливість, зв'язується (рис. 1д). Оскільки "пухнасті" гідратовані катіони не можуть всі розміститися у вигляді моношару і повністю компенсувати негативний заряд поверхні, деяка частина катіонів, нейтралізуючих негативний заряд, відходить у товщу розчину і утворює заряд, розподілений в об'ємі рідини, що прилягає до кордону розділу і, в силу меншої енергії зв'язку з поверхнею, що володіє здатністю до переміщення (рис. 2а).

Незважаючи на сильний кулонівське взаємодія рекомбінації зарядів не відбувається. У результаті взаємодіючі системи зарядів утворюють подвійний електричний шар, що складається ніби з двох ізольованих один від одного обкладок конденсатора, що мають заряди протилежного знака. Одну з обкладок складають негативно заряджені залишки силанольних груп, інші складаються з двох частин - нерухомого шару катіонів, що безпосередньо прилягають до поверхні кварцу, і дифузного шару, утвореного катіонами, що знаходяться в об'ємі рідини. Розподіл катіонів між нерухомим і дифузним шарами, а, отже, і товщина подвійного електричного шару залежить в першу чергу від загальної концентрації електроліту в розчині. Чим вона вища, тим бo більша частина позитивного заряду дифузного шару переміщається в нерухомий шар і тим менше стає товщина дифузного шару (рис. 2б). При концентрації бінарного однозарядного електроліту 10-3 ... 10-4 М товщина подвійного електричного шару становить у середньому 30 ... 50 мкм.

Звернемо (подумки) розглянуту поверхню у вигляді труби з внутрішнім діаметром 50 ... 100 мкм, тоді виявиться, що практично вся рідина, що заповнює її, буде представляти собою дифузну частина подвійного електричного шару. Трубу настільки малого діаметра прийнято називати капіляром. Якщо в такій системі вздовж осі капіляра прикласти електричне поле, то в капілярі виникне поздовжнє рух вільних носіїв електричних зарядів (різнополярних іонів) у взаємно протилежних напрямках, а оскільки в дифузійної частини подвійного електричного шару присутня надлишкова концентрація катіонів, то число іонів, що переміщуються до катода буде значно більше, при цьому їх рух буде захоплювати за собою всю іншу масу рідини в капілярі (внаслідок молекулярного зчеплення та внутрішнього тертя). Виникає так званий електроосмотичного потік (ЕОП), спрямований до катода, який буде здійснювати пасивний перенесення розчину всередині капіляра (рис. 3).

Внаслідок цього процесу в електроліті, що заповнює капіляр, виникає спрямоване переміщення маси рідини, яке викликане прикладеної різниці потенціалів, при цьому вся маса рідини (за малим винятком приповерхневого шару) переміщається з однаковою швидкістю, тобто формується плоский профіль швидкостей. Це дуже важлива обставина, яка дозволяє отримати надзвичайно високу роздільну здатність методу, тому на нього треба звернути особливу увагу.

Технічна реалізація методу КЕФ

Мінімальний склад системи, що реалізує метод капілярного електрофорезу, повинен мати у своєму складі наступні компоненти: кварцовий капіляр, джерело високої напруги, пристрій введення проби, детектор і пристрій виведення інформації. Додаткові пристрої дозволяють автоматизувати подачу зразків, термостатіровалі капіляр і зробити більш зручною обробку одержуваної інформації.

На рис. 4 представлена ​​схема системи капілярного електрофорезу в найпростішому випадку. Капіляр заповнюється розчином електроліту, своїми кінцями капіляр опущений у дві посудини, що містять той же електроліт. Електроліт обов'язково повинен володіти буферними властивостями, щоб, з одного боку, перешкодити зміни складу розчину в приелектродних просторах, а з іншого - стабілізувати стан компонентів проби в процесі аналізу. У судини введені електроди, до яких прикладається різницю потенціалів. Під дією різниці потенціалів в капілярі швидко встановлюється стаціонарний стан: через нього протікає електроосмотичного потік (ЕОП), на який буде накладатися ЕЛЕКТРОМІГРАЦІЯ катіонів та аніонів у взаємно протилежних напрямках.

Як правило, в приладах капілярного електрофорезу ЕОП спрямований від вхідного кінця капіляра до детектора тому, при використанні кварцового капіляра, різниця потенціалів встановлюють таким чином, що вхідний кінець капіляра має позитивну полярність (анод), а детектор встановлюється поблизу катода. Якщо тепер в капіляр з боку анода ввести невеликий об'єм розчину проби, то ЕОП буде переносити зону проби до катода, і вона якийсь час знаходитиметься в капілярі під впливом електричного поля високої напруженості. Протягом цього часу компоненти проби, мають заряди і відрізняються від компонентів робочого буфера, будуть пересуватися відповідно з притаманними їм електричними подвижностями, специфічними для кожного компонента. Катіонні компоненти проби, рухаючись до катода, будуть обганяти електроосмотичного потік. Швидкість їхнього руху буде складатися з швидкості ЕОП і швидкості електроміграціі, тому на виході капіляра катіонні компоненти будуть з'являтися першими і тим раніше, чим більше електрична рухливість даного іона. Нейтральні компоненти проби будуть переміщатися тільки під дією ЕОП, і з'являться на виході, коли його досягне зона проби. Аніонні компоненти переміщуються до анода з різними швидкостями. Деякі з них, повільно мігруючі, будуть з'являтися поблизу детектора після виходу ЕОП, а ті, чия швидкість міграції за абсолютною величиною перевищує швидкість ЕОП, рано чи пізно вийдуть з капіляра в пріанодное простір.

Якщо час перебування проби в капілярі (яке можна регулювати довжиною капіляра, швидкістю ЕОП або прикладеною різницею потенціалів) достатньо, то на виході капіляра поблизу катода формуються зони розчину, в яких знаходяться індивідуальні компоненти проби. Відбувається, таким чином, розділення початкової суміші. Якщо тепер за допомогою детектора зареєструвати поява компонентів на виході з капіляра, то отримана запис буде називатися Електрофореграма і може служити основою для якісного та кількісного аналізу суміші. Описаний варіант аналізу носить назву капілярного зонного електрофорезу (КЗЕ). У цьому варіанті можуть визначатися катіонні компоненти проб і деякі повільно мігруючі аніони. Однак головні аніони, що визначають мінеральний склад води, зареєструвати такий спосіб неможливо.

Аналіз аніонів методом капілярного електрофорезу

Для того щоб методом КЗЕ можна було визначати аніонні компоненти проб, необхідно змінити полярність прикладається напруги. Однак у цьому випадку зміниться не тільки напрямок міграції аніонів, але також напрямок ЕОП і він буде перешкоджати переміщенню в бік детектора повільно мігруючих аніонів. Для зміни напрямку ЕОП необхідно модифікувати поверхню кварцового капіляра таким чином, щоб знаки зарядів подвійного електричного шару помінялися на зворотні, і напрям ЕОП збігалося з напрямком переміщення аніонів. Це досягається введенням в робочий буферний розчин катіонного поверхнево-активної речовини, наприклад, броміду цетілтріметіламмонія (ЦТАБ). Катіон ЦТАБ активно сорбується на кварцовою поверхні, займаючи при достатній його концентрації, всі вакансії в найближчому до поверхні шарі. Поверхня як би "нащетинюються" довгими цетільнимі (С16Н33-) ланцюжками. при подальшій промиванні робочим буферним розчином поверхню сорбує ще один шар поверхнево-активного катіона, орієнтованого амонійним кінцем назовні (сорбція "щітка в щітку"). У результаті перше обкладання подвійного електричного шару стає позитивно заряженнной, а друга (в тому числі і дифузна її частина) набуває негативний заряд, і тепер ЕОП знову переміщається в напрямку від вхідного кінця капіляра до детектора.

Аналогічними властивостями по модифікації поверхні капіляра володіють і інші буферні розчини, наприклад, приготовлений на основі 2 - [N-циклогексиламін] етан-сульфоновой кислоти з модифікатором електроосмотичного потоку в гідроксильної формі (тетрадецетілтріметіл амонію гідроксид) і т.п.

Детектування сигналів

У системах капілярного електрофорезу найбільш часто застосовується фотометричне детектування, в якому використовується одна мулу кілька довжин хвиль, зазвичай лежать в ультрафіолетовій області спектру. Відповідно відгук детектора буде спостерігатися тільки в тому випадку, коли визначається компонент має помітний поглинання на довжині хвилі детектування. Це - пряме детектування. Електрофореграма буде представляти собою набір позитивних піків, що піднімаються над базовою лінією.

Однак, аніони, розчинені у воді, зареєструвати таким простим способом не вдається, тому що вони не мають власного поглинанням в зазначеному спектральному діапазоні. У цьому випадку застосовується непряме детектування, суть якого полягає в тому, що ведучий електроліт готується з добавкою речовини, що поглинає світло на довжині хвилі детектування. У разі визначення аніонів добавка також повинна бути аніоном, наприклад, це може бути хромат-іон. Внаслідок того, що іонна сила провідного електроліту в процесі поділу залишається постійною, в зоні, де знаходиться непоглинаючих іон, еквівалентно зменшується концентрація поглинаючого іона. У цьому випадку на електрофореграмме будуть спостерігатися зворотні (негативні) піки, площі яких пропорційні концентраціям визначаються іонів. Надалі, при комп'ютерній обробці результатів вимірювань, графік "перевертається" і набуває вигляду, зручний для розгляду, з позитивно розташованими піками.

Таким чином, варіант зонного капілярного електрофорезу з модифікацією поверхні капіляра і непрямим детектуванням дозволяє аналізувати компоненти, які в умовах проведення аналізу знаходяться у формі аніонів.

Висновок

Зрозуміло, в рамках елементарного введення в метод, довелося піти на певні жертви і відмовитися від розгляду всього різноманіття прийомів та методик, які напрацьовані в хіміко-аналітичній практиці при використанні капілярного електрофорезу. Так, наприклад, для реєстрації сигналів в системах капілярного електрофорезу використовуються флуоріметріческіе детектори, детектори з використанням фотодіодному лінійок, мас-спектрометричні детектори і т.п. В якості аналітичних методів, крім капілярного зонного електрофорезу, використовуються міцелярна електрокінетичних хроматографія, капілярна електрохроматографія, ізотахофорез, капілярний гель-електрофорез, капілярна ізоелектрична фокусування і ін