Антигени

Реакцію низькомолекулярного гаптену з антитілами можна оцінити за допомогою прямих реакцій, серед яких найбільше застосування отримав метод рівноважного діалізу. Отримані в експерименті дані дозволяють розрахувати константу рівноваги в системі гаптен-антитіло. Якщо визначати величини константи равнозесія при реакції антитіл до певного кон'югованому антигену з низкою схожих за будовою гаптенов, можна оцінити внесок кожного радикала в структуру детермінантних групи. / K _v . _T , где К _х При цьому зручно зіставляти спорідненість до антитілу якогось аналога детермінантних групи зі спорідненістю найбільш близького до неї за будовою гаптену. Таким способом одержують відносну величину константи зв'язування: Дот _Н = = Kx / K _{v. T,} де К _х - Константа зв'язування досліджуваного аналога, С _{р. Р} - Константа зв'язування референс-гаптену.

Нижче наведені величини / З _отн для ряду нітрофен-нільних похідних, що реагують з антитілами кролика проти дінітрофенілірованного гемоцианин, тобто ступінь спорідненості антідінітрофенільних антитіл кролика до різних гаптеном. Антиген отримували, модифікуючи білок по е-аміногрупи лізину дінітрофенілсульфоно-вої кислотою. Оскільки е-дінітрофеніллізін найбільш близький за будовою детермінантних групі використаного кон'югованого антигену, його використовували як референс-гаптену.

З аналізу наведених нижче даних випливає, що антитіла розпізнають як ДНФ-групу, так і амінокислотний залишок, до якого ця група приєднана. При заміні лізину на будь-яку іншу амінокислоту спорідненість антитіл до гаптеіу різко знижується. Навіть у випадку вико користування як гаптену е-дінітрофеніллізіна, в якому взято неприродний оптичний ізомер, виразно помітно зниження константи зв'язування. Особливо низька константа зв'язування знайдена у разі відсутності в молекулі гаптену амінокислотного залишку (динітрофенол). Практично не зв'язуються з досліджуваними антитілами мононітрофенільние похідні амінокислот. Дані були отримані і для інших антитіл до кон'юговані антигенів.

Необхідність стеричного відповідності антигенної детермінанти та активного центру - антідетермінанти - антитіла з усією очевидністю випливає, зокрема, з того факту, що антитіла, спрямовані до орто-, мета-і пара-амінобензойної кислот, практично не реагують перехресно. Антитіла також чітко розрізняють право-і левовращающіе ізомери виннокаменной кислоти. Менш очевидним є факт суворої специфічності розпізнавання антитілами р-амінобензойної і р-амінофенілсульфоновой кислот:

Обидва ароматичних сполуки мають у параположеніі негативно заряджений заступник. Заступники відрізняються ступенем своєї нуклеофільність, яка у сульфогрупи відчутно вище, ніж у карбоксильної групи, що призводить до більш вираженого зсуву хмари я-електронів ароматичного кільця в напрямку заступника, представленого сульфогрупп в порівнянні з карбоксильною групою. Ця обставина і відмінності в розмірі замещающей групи достатні, очевидно, для того, щоб кожне з'єднання реагувало тільки з направленим до нього антитілом.

Питання про розмір детермінантних групи кон'югі-ваного антигену, вклад у її специфічність різних радикалів був витончено проаналізовано П. Шехтером. В якості антигену використовували кон'югати білка з оліго-О-аланином. - и L -аланнна. Реакцію між антитілами до полі-О-аланіну і тест-антигеном ингибировал за допомогою різних за розміром олігопептидів з D - і L-аланнна. Як виявилося, інгібуючий ефект гаптенов наростав від ді-к тетра-О-аланнну. Подальше збільшення довжини пептиду не посилював його ннгібірующіх властивостей. Тетра-Ь-аланін був зовсім не активний як інгібітор. Ці дані означають, по-перше, що антитіла чітко розрізняють олігопептиди з право-і левовращающіе амінокислот, які не мають регулярної вторинної структури. По-друге, очевидно, що активний центр антитіла відповідає за розміром тетрапептіду.

Подальші досліди показали, що внесок кожного залишку аланіну в зв'язування тетрапептіда антитілом далеко не однаковий. Були синтезовані аналоги гаптену, в яких один із залишків аланіну замінювали на гліцин. -концевого аланина на глицин константа связывания такого гаптена по сравнению с тетрааланином уменьшалась в 100 раз. У разі заміни N-кінцевого аланіну на гліцин константа зв'язування такого гаптену в порівнянні з тетрааланіном зменшувалася в 100 разів. Навпаки, заміна З-кінцевого аналіна на гліцин майже не позначалася на величині константи зв'язування. -концевого аланина. Оскільки пептиди приєднували до білка-носія через С-кінцеву групу, можна зробити висновок, що вирішальний внесок у зв'язування гаптену антитілом вносить найбільш віддалений від молекули білка-носія ділянку приєднаного до неї пептиду: у випадку, що розглядається метильная група N-кінцевого аланіну. Така група в молекулі гаптену отримала назву іммунодомінантной.

Таблиця 1. Дослідження специфічності антитіл до полі-Ь-алани-ну з допомогою тетрапептідов різної будови

Кон'юговані антигени виявилися дуже корисними для вивчення багатьох ключових проблем клітинної імунології, питань регуляції імунної відповіді.

2. Білки і синтетичні поліпептиди

Вивчення антигенної структури білків здійснюють за допомогою декількох методів: 1) дослідженням продуктів обмеженого протеолізу, 2) хімічною модифікацією різних бічних амінокислотних залишків з подальшим аналізом антигенного будови утворюється продукту, 3) руйнуванням притаманною даному білку вторинної та третинної структури. Кожен з перерахованих методів має свої обмеження, в силу чого достатньо повна інформація про будову детермінантних груп білків може бути отримана ліщь при поєднанні ряду методів.

При розщепленні мономеру флагелліна по залишках метіоніну за допомогою бромціана утворюються 4 фрагменти, розмір яких

наведено на рис. Фрагмент А, що становить менше половини молекули, має у своєму складі всі антигенні детермінанти цього білка, так як повністю інгібує реакцію антитіл проти нативного флагелліна з цілими флагелліном. Істотно, що зазначений фрагмент на відміну від решти частини молекули містить відносно резистентні до дії пепсину і трипсину ділянки поліпептидного ланцюга. Це узгоджується з висновком, згідно з яким резистентність до ферментативного гідролізу служить фактором, сприятливим прояву антигенних властивостей біополімеру.

Фрагменти, що утворюються при розщепленні флагелліна бромцианом

У глобулярних білків з великим вмістом а-спіральних ділянок антигенні детермінанти розташовуються в місцях вигину скрученої в спіраль ланцюга. Так, в міоглобіні кашалота детермінанти розташовуються між залишками 15-29, 56-69, 70-76, 77-89, а також в С-кінцевій частині молекули. Ці дані були отримані при аналізі продуктів гідролізу міоглобіну трипсином і хімотрипсину.

Як і в молекулі міоглобіні, у стафілококової нуклеази антигенні детермінанти розташовані на поверхні молекули переважно в тих ділянках, де між спіраль відрізками пептидного ланцюга знаходяться неспіралнзованние ділянки.

При антигенному аналізі продуктів протеолізу білків бажано використовувати антисироватки від декількох тварин, отримані в різні терміни після імунізації. -концевого дека-пептида. Так, у випадку вивчення антигенної структури білка вірусу тютюнової мозаїки було встановлено, що індивідуальні антисироватки кроликів реагують, як правило, з С-кінцевим декапептид, але частина антисироваток містить антитіла проти N-кінцевого дека-пептиду. Антитіла до С-кінцевого декапептид від деяких кроликів взаємодіють з пептидом, від якого отщепляя С-кінцевий аргінін, в той час як антитіла від інших кроликів розпізнають детермінанту тільки при наявності С-концевіго аргініну. Для наочності наводимо структуру зазначеного пептиду:

-концевым участком. Отримані в ранні терміни після імунізації антитіла кролика проти розчинної колагену зі шкіри щурів реагують з детермінантами в С-кінцевій частині молекули, а «пізні» антитіла взаємодіють також з N-кінцевим ділянкою.

Будова молекули міоглобіну кашалота

При імунізації кроликів лізоцимом з яєць курей антитіла з'являються вперше через 10 днів. Але тільки через 2 - 3 місяці накопичуються визначні їх кількості, що реагують з пептидами, які включають залишки з 1 по 20 та з 60 по 83, поперечно пов'язані дисульфідній зв'язком із залишками 123-129.

Закономірним є питання, чи не можна уникнути зазначених вище труднощів антигенного аналізу, відмовившись від традиційної техніки отримання антитіл в результаті імунізації і оперуючи замість цього моноклінальними антитілами, отриманими за допомогою гібридомної техніки. Очезідно, що для детального аналізу антигенної структури, наприклад білків, необхідне використання великої кількості індивідуальних клонів. Щоб врахувати генетичні особливості імунної відповіді індивідуальних реципієнтів, доведеться виробляти злиття з клітинами плазмацітоми лімфоїдних клітин від генетично неідентичних особин, відбір яких може бути лише випадковим. Тим самим ступінь невизначеності завдання не зменшиться.

Продовживши розгляд питання про будову детермінантних груп білків, проаналізуємо один із широко застосовувалися для цих цілей методів, пов'язаних з хімічною модифікацією бічних амінокислотних залишків у глобулярних білках. Такий вплив робить вплив на їх антигенні властивості. У результаті модифікації змінюється, як правило, конформація молекули. Так, модифікація з допомогою ангідриду янтарної кислоти 32 і 57 аміногруп у молекулі бичачого сироваткового альбуміну зменшує здатність білка взаємодіяти з антитілами на 8 і 65% відповідно. Вимірювання при цьому обсягу молекули модифікованого альбуміну, оцінене за величиною стоксовского радіуса, показало, що в першому випадку він зростає на 27%, а в другому - вже на 78%. Отже, збільшення ступеня гідратації модифікованого білка за рахунок зростання його негативного заряду при певній мірі модифікації безсумнівно пов'язано зі значною зміною нативної конформації. Останнє виражається і в руйнуванні детермінантних груп. Те, що цей висновок справедливо і інактивація білка як антигену в описаному вище прикладі не обумовлена ​​лише заміщенням аміногруп, підтверджується даними, отриманими при антигенному аналізі бичачого сироваткового альбуміну, в молекулі якого було амідініровано 58 аміногруп. При такому способі модифікації заряд білкової молекули не змінюється. Не змінюється при цьому і гтоксовскій радіус. Антигенна структура модифікованого таким способом білка також практично повністю зберігається.

Переконливі свідчення існування як в глобулярних, так і в фібрилярних білках антигенних детермінант, структура яких залежить від просторової конформації молекули, були отримані при порівнянні антигенних властивостей нативних і денатурованих білків.

У разі відновлення внутріцепьевих дисульфідних зв'язків в молекулі рибонуклеази в присутності концентрованої сечовини такий білок втрачає, за даними фізичних методів дослідження, нативну конформацію. Одночасно відбувається руйнування його антигенних детермінант, оскільки денатурований білок не реагує з антитілами проти нативного білка. Однак відновлення двох з чотирьох дісуль-вміст сульфідної зв'язків у молекулі рибонуклеази, виконане за відсутності денатуруючих агентів, не позначається на антигенних властивостях ферменту. . Аналогічні дані були отримані при вивченні пепсину, папаїну, імуноглобуліну G. Отже, сама по собі дисульфідний зв'язок не визначає структури антигенних детермінант, якщо при її розриві не руйнують стабілізуючих вторинну і третинну структуру нековалентних зв'язків.

Не тільки третинна, але і четвертинна структура білків визначає їх антигенну будову. . Детермінанти, в утворенні яких беруть участь дві або три поліпептидні ланцюги, в тому числі ланцюга різної будови, знайдені, зокрема, в молекулі гемоглобіну, колагену, імуноглобуліну G. При дисоціації молекули білка на ізольовані ланцюга такі детермінанти руйнуються. У разі спонтанної рекомбінації пептидних ланцюгів з поновленням активної конформації відновлюється також структура антигенних детермінант, в утворенні яких беруть участь дві або 'більше кіл.

Навіть незначні зміни конформації білка здатні спричинити за собою відчутні зміни його антигенної структури. Так, видалення тема з молекули метміоглобіна призводить до появи вільного від гена білка - апоміоглобіна. Останній відрізняється від нативного білка зменшенням вмісту а-спіральних ділянок з 56-64 до 42-49%. Одночасно відбувається невелике набухання молекули, збільшення її асиметрії. Збільшується чутливість білка до протея-лізу, доступність для модифікації залишків тирозину і гістидину. Ці та інші дані вказують на меншу конформаційну стійкість апоміоглобіна в порівнянні з метміоглобіном. Антитіла до метміоглобіну мають низьку ступінь спорідненості до апоміоглобіну. Якщо шляхом додавання гема до апоміоглобіну реконструювати молекулу метміоглобіна, відновлюється також і його антигенна структура.

Взагалі спонтанне відновлення конформації денатурованого білка веде до відновлення його антигенної структури. . Це продемонстровано на абсолютно різних за ступенем складності структурної організації білках, в тому числі на таких, як рібонук-леаза і імуноглобулін G. Тим самим антигенний аналіз може служити одним з надійних методів оцінки ступеня ренатурації білка.

Окремо слід розглянути питання про специфічність антитіл, що утворюються при імунізації денатурований білками. Вони взаємодіють тільки з денатурованим білком, причому антитіла до одного з денатурованих білків взаємодіють з іншим денатурованим білком. Це спостерігається і в тому випадку, коли досліджувані білки в нативному вигляді не мають антигенного спорідненості. Тут треба мати на увазі, що, втративши певну конформацію внаслідок денатурації, білок набуває деяку іншу конформацію, найчастіше хаотичного клубка, яка допускає виникнення у різних білків статистично вірогідних просторових структур, мало залежать від їх первинної структури. Швидше за все саме завдяки цим структурам виникає антигенну спорідненість різних денатурованих білків.

-аланина, индуцируют образование антител, реагирующих с тетра- и даже триаланином. Кон'юговані антигени, які мають у ролі детермінантних груп пептиди, наприклад пептиди з D-аланіну, індукують утворення антитіл, що реагують з тетра-і навіть тріаланіном. Подібні пептиди не мають стійкої конформації. Отже, антитіла в цьому випадку розпізнають лише певну амінокислотну послідовність. Такого типу детермінанти, що отримали назву секвенційних, мабуть, вкрай рідко зустрічаються в глобулярних білках. Навіть короткі відрізки пептидних ланцюгів глобулярних білків, з якими реагують антитіла, наприклад, С-кінцевий гептапептід многлобіна, мають певну просторову конформацію. Однак у фібрилярних білках є ділянки пептидних ланцюгів, позбавлені вторинної структури. -концевых участков цепей. Так, велика частина кролячих антитіл проти гетерологічного колагену спрямована проти коротких неспіральних N-кінцевих ділянок ланцюгів. -концевыми участками полипептидных цепей денатурированного растворимого коллагена. Ці антитіла реагують також з N-кінцевими ділянками поліпептидних ланцюгів денатурованого розчинної колагену.

Одним з основних доказів приналежності антигенної детермінанти білка до секвенційного типу служить наявність іммунодомінантной групи у вигляді кінцевого амінокислотного залишку. -фрагментом аутологичного иммуноглобулина G , можно получить антитела, реагирующие только с этим фрагментом, но не с целой молекулой иммуноглобулина. Імунізуємо кролика Fab-фрагментом аутологичного імуноглобуліну G, можна отримати антитіла, що реагують тільки з цим фрагментом, але не з цілої молекулою імуноглобуліну. Антитіла практично повністю втрачають здатність реагувати з фрагментом після обробки останнього карбоксипептидази. -фрагмента отщепляется только С-концевой лейцин. У використаних для протеолізу умовах від однієї з пептидних ланцюгів Fab-фрагмента відщеплюється тільки С-кінцевий лейцин. Останній служить іммунодомінантной групою детермінанти секвенційного типу, що знаходиться в С-кінцевій частині фрагмента.

Важливим підтвердженням існування антитіл проти конформаційних і секвенційних детермінант послужили експерименти з синтетичними поліпептидами, виконані в лабораторії М. Села. — Glu . Були використані два типи пептидів, кожен з яких мав у своєму складі трипептид: туг - Ala - Glu. . Один пептид мав розгалуженою структурою, будучи утворений сополімером аланіну і лізину, до е-аміногрупи якого аперіодично були приєднані зазначені тріпептідов - TAG. Другий пептид представляв собою періодичний полімер у формі а-спіралі з формулою. ; они характеризовались сходными молекулярными массами.* Як видно з рис., При різній структурі обидва поліпептнда мали у своєму складі блоки TAG; вони характеризувалися подібними молекулярними масами .*