Реферат на тему:
Якісний аналіз компонентів
Хроматографіст, початківець працювати в області високоефективної рідинної хроматографії, повинен ознайомитися з основами якісного аналізу. Якісний аналіз застосовують для ідентифікації відомого продукту, отриманого новим шляхом або перебуває в суміші з іншими продуктами. Він необхідний при виділенні зі складних біологічних, хімічних сумішей різних компонентів, що особливо важливо в медицині, криміналістиці, екології, для контролю за перебуванням деяких ліків і хімічних продуктів і їх метаболітів у біоматеріалів. Знайомство з основами якісного аналізу допоможе уникнути типових помилок, наприклад, відрізнити домішки в зразку від домішок у розчиннику або перевіряти чистоту речовини не на одній довжині хвилі спектрофотометра, а на різних і т.д.
Перш ніж приступити до аналізу, необхідно встановити, чи весь зразок елюіруется з колонки даною системою розчинників чи ні. Щоб бути впевненим у повному елюювання, необхідно зібрати всю витікаючу з колонки рідина, упарити розчинник, зважити залишок і знайти ступінь вилучення зразка.
Ідентифікацію компонентів у ВЕРХ можна проводити трьома способами: 1) використовувати інформацію про утриманні; 2) дослідити зони, отримані при розділенні у колонці рідинного хроматографа, методами спектрального або хімічного аналізу; 3) безпосередньо підключити спектральний аналізатор до колонки.
Для реєстрації піків в хроматографії використовують утримуваний об'єм V R або час утримування t R. Обидві величини є характеристикою речовини в даній хроматографічної системі. Так як час утримування розділяється речовини складається з часу взаємодії у колонці і часу проходження порожніх ділянок трубки, воно змінюється від приладу до приладу. Зручно мати речовина, не утримується даної колонкою, прийнявши його за стандарт, час і обсяг утримування якого t 0, V 0. Хроматографування речовини і стандарту необхідно проводити при одних і тих же умовах (тиску і швидкості потоку). Поправку на мертвий об'єм можна врахувати, використовуючи виправлене час утримування tn або виправлений об'єм утримування V R, за формулою
t R '= t R - t 0
При ідентифікації за даними про утриманні, відомі індивідуальні речовини, які можуть бути присутніми в зразках, поділяють в тій же самій хроматографічної системі, і для них отримують значення t R. Порівнюючи ці значення t R з часом утримування невідомого піку, можна виявити, що вони або збігаються, і тоді ймовірно, що піки відповідають одному й тому ж речовини, або t R відомого речовини не відповідає t R невідомою зони. Тоді все-таки можлива орієнтовна оцінка значень t R речовин, не доступних для безпосереднього вимірювання ступеня їх утримування. Розглянемо обидва варіанти.
У першому випадку, очевидно, необхідно попереднє вивчення зразка для постулювання присутності в ньому конкретних речовин. При роботі з простими сумішами неважко визначити, чи збігається ступінь утримування зон зразка і відомих речовин, чи ні, тобто значення t R однакові або розрізняються. У разі складних сумішей відразу кілька речовин можуть елюіроваться зі схожими значеннями t R, і реально отримані при хроматографічному поділі зони перекриваються. У результаті отримання точних значень t R для різних зон стає неможливим. Надійність ідентифікації зростає при підвищенні роздільної здатності, більш ретельному контролі умов поділу, багаторазовому вимірі значень t R і усередненні знайдених величин. При цьому хроматографічне розділення відомого і невідомого речовин має чергуватися. При поділі складних сумішей значення t R речовини може змінюватися під впливом матриці самого зразка. Такий вплив можливо на початку хроматограми і при перекривання піків; можливо також затягування зон, про що вже згадувалося.
У подібних випадках слід додати стандарт до зразка у співвідношенні 1:1. Якщо речовини ідентичні, значення t R вихідної речовини не зміниться, і на хроматограмі отримують тільки один пік. Якщо є прилад з циклічною системою хроматографування, то для надійності ідентифікації бажано суміш пропускати через колонку кілька разів.
Відомості про ступінь утримування можна знайти і в літературі, проте цінність цієї інформації обмежена. Так як колонки навіть однієї партії дають погану відтворюваність, літературні значення не завжди відповідають істинному значенню t R на цій колонці. Для адсорбційної хроматографії можливо, однак, пророкування t R на підставі літературних даних. Інші труднощі, пов'язана з використанням літературних значень t R,-складність їх пошуку в спеціальній літературі, хоча бібліографічні огляди, що публікуються в Jornal of chromatography, мають оновлюваний покажчик за типами речовин.
У другому випадку, коли часи утримування відомих сполук і зон зразка не збігаються, є можливість передбачити час утримування невідомого компонента. Цілком надійні передбачення відносного утримування на підставі даних про структуру в просторово-Ексклюзійна хроматографії. Менш точні вони в адсорбційної, розподільної хроматографії й особливо при роботі на хімічно прив'язаною фазі. Для іонної та іон-парної хроматографії речовин з відомою р Ка можливі лише приблизні визначення значень t R. Завжди легше передбачити відносне утримування або значення α, ніж абсолютні значення k '. Відносні значення t R легше оцінити для споріднених сполук або похідних, наприклад заміщених алкілкарбонових кислот або похідних бензолу.
При ізократіческом поділі гомологів або олігомерів іноді спостерігається наступна закономірність:
lgk '= A + Bn,
де A і В - константи для ряду вибраних зразків і для даної хроматографічної системи (на одній і тій же колонці, з такою ж рухомою і нерухомою фазами); n-число однакових структурних одиниць в молекулі зразка.
У градієнтному режимі при лінійному зміні сили рухомої фази рівняння приводиться до вигляду
t R = A '+ B'n,
тобто значення t R лінійно змінюються зі зміною n.
Введення в молекулу зразка функціональної групи j буде приводити до зміни k 'в першому рівнянні на деякий постійний коефіцієнт αj в даній хроматографічної системі. Можна отримати групові константи αj для різних заміщуючих груп j, значення яких будуть зростати при збільшенні полярності функціональних груп, в усіх видах хроматографії, крім обернено-фазною, де значення констант будуть зменшуватися із збільшенням полярності.
Деякі групові константи а для різних заміщуючих груп j наведено в табл. 1.
У адсорбційної хроматографії перше рівняння не завжди застосовно, так як воно справедливо за умови, що всі ізомери мають одне і те ж значення k ', що не завжди дотримується. Можна, однак, побудувати графік залежності lgk / одних і тих же сполук на одній колонці щодо lgk 'тих же сполук, але на іншій колонці або щодо відповідних характеристик у тонкошарової хроматографії, наприклад, lg [(1-Rf) / Rf], і при цьому зазвичай отримують лінійну залежність.
При зіставленні даних про утриманні речовин можна використовувати значення коефіцієнта ємності k ', так як на нього на відміну від t R не впливають швидкість рухомої фази і геометричні особливості колонки.
Поділ на хімічно прив'язаною фазі аналогічно поділу за методом розподільної хроматографії з аналогічними фазами, і тому дані з екстракції при рівноважному стані можуть бути використані для передбачення часу утримування.
Таблиця 1. Групові константи αj для різних заміщуючих груп j в різних рідинних хроматографічних системах (значення вказані для заміщення в ароматичному кільці)
У іонообмінної хроматографії на ступінь утримування впливають три чинники: ступінь іонізації кислот і підстав, заряд іонізованої молекули і здатність речовини з водного рухомої фази, використовуваної в іонообмінної хроматографії, мігрувати в органічну фазу. Останнє залежить від молекулярної маси з'єднання і його гідрофобності. Отже, більш сильні кислоти або основи сильніше утримуються при аніонообмінної або катіонообмінної поділі. При зниженні р Кα окремої кислоти, що входить до зразка, утримування зростає при поділі ряду кислот за рахунок аніонного обміну, а при збільшенні р Кα збільшується утримування основ при їх поділі за рахунок катіонного обміну.
Таким чином, збіг значень часу утримування відомого речовини з піднаглядним дає можливість припустити їх ідентичність. Достовірність ідентифікації зростає, якщо проводити порівняння хроматограм відомого речовини та невідомого компонента в різних умовах. Якщо речовини в адсорбційної і обернено-фазною або іонообмінних і Ексклюзійна хроматографії ведуть себе однаково, надійність ідентифікації зростає. Якщо достовірність ідентифікації при рівності відносного утримування становить 90%, то при вивченні поведінки цих же речовин в умовах істотно відрізняються достовірність ідентифікації складає вже 99%.
Цінною характеристикою речовини, що застосовується при ідентифікації, є ставлення сигналів, отриманих для даної речовини на двох різних детекторах. Аналізоване речовина після виходу з колонки проходить спочатку через перший детектор, потім через другий, а сигнали, що надходять з детекторів, реєструються одночасно за допомогою многоперьевого самописця або на двох самописцях. Зазвичай застосовують послідовне з'єднання ультрафіолетового детектора (більш чутливого, але селективного) з рефрактометром, або ультрафіолетового з детектором по флуоресценції, або двох ультрафіолетових детекторів, що працюють на різних довжинах хвиль. Відносний відгук, тобто відношення сигналу рефрактометра до сигналу фотометра, є характеристикою речовини за умови, що обидва детектора роблять у своєму лінійному діапазоні; це перевіряється введенням різних кількостей одного і того ж речовини. Якісну інформацію можна отримати, працюючи на фотометричних детекторах, забезпечених пристроєм для зупинки потоку (Stop flow) і дозволяють реєструвати спектр виходить з колонки піку, поки він знаходиться в проточній кюветі, порівнюючи його зі спектром відомого з'єднання.
Значний інтерес при ідентифікації представляють сучасні, поки ще дорогі, спектрофотометри з діодним гратами.
Цілком невідому речовину неможливо ідентифікувати тільки за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, необхідні й інші методи.
ІДЕНТИФІКАЦІЯ РЕЧОВИН НЕХРОМАТОГРАФІЧЕСКІМІ МЕТОДАМИ
У деяких випадках ідентифікація невідомої речовини може бути забезпечена збором фракції, відповідної піку хроматографічного розділення, і наступним аналізом цієї фракції фізичними або хімічними методами. При цьому рухлива й непорушна хроматографічні фази повинні бути очищеними, щоб фон від фази був зведений до мінімуму, вони не повинні вступати в хімічну реакцію з розчиненим речовиною, повинні бути сумісними-з хроматографічної системою, яка використовується для розділення та виявлення піку. Нерухома фаза не повинна виноситися з колонки. Крім того, обидві фази не повинні заважати ідентифікації допоміжними методами і бути летючими, щоб їх можна було легко видалити випарюванням, фракції зазвичай збирають вручну, хоча можливе застосування колектора фракцій. Для забезпечення чистоти, відповідної піку збирається фракції, внутрішній об'єм трубки між детектором і виходом каналу для збору фракцій повинен бути мінімальним. Цей обсяг повинен бути визначений і внесені поправки на затримку між реєстрацією піку детектором і фактичним виходом піку з каналу для збору фракцій. Фракції зручно збирати в чисті, сухі, захищені від попадання світла посудини з нагвинчують кришками і тефлоновими прокладками для уникнення забруднень. Можливий барботаж цих фракцій чистим азотом або гелієм. Розчинники видаляють із зразка випарюванням, продувкою газом, нагріванням ІК-лампою. Воду і суміші органічних розчинників з водою видаляють випарюванням або ліофільної сушкою. Летючі буферні з'єднання видаляють при підвищених температурах.
Мас-спектрометрія - найбільш надійний і повний метод визначення структури речовини, молекулярної маси, його хімічної формули. Цей високочутливий метод дозволяє працювати всього з 0,005 мкг речовини і встановити як фрагментарний складу молекули, так і її елементне будову.
Розгляд ідентифікації невідомих речовин за допомогою мас-спектрометрії не входить у завдання цього видання. Слід зазначити, однак, що більшість неіонних, навіть відносно малолетучих речовин вдається проаналізувати, використовуючи зазвичай застосовується в мас-спектрометрії метод збудження електронним ударом. Нелеткі або іонні сполуки визначають при використанні методів хімічної іонізації, польовий десорбції та інших спеціальних прийомів.
Зразок, попередньо упарену до 1-2 крапель (обсяг 25-50 мкл), переносять микрошприца у вхідний зонд мас-спектрометра, повільно випаровують і аналізують. При цьому необхідно виконувати холості досліди, відбираючи аналогічну фракцію до виходу даного нас піку, упарюючи її і вводячи в мас-спектрограф, щоб переконатися у відсутності фонових домішок, які можуть дати значні піки і заважати правильній ідентифікації.
Для спектрального аналізу в інфрачервоній області потрібно відносно невелика проба - 5 мкг на твердому вигляді і 50 мкг в розчині. Чутливість підвищується при використанні методів, заснованих на перетворенні Фур'є, при цьому досить всього 0,05 мкг проби. Цей метод аналізу чудово доповнює дані, отримані на мас-спектрометрі, і дає інформацію про функціональні групах, а іноді і про структуру речовини. Є декілька прийомів, що дозволяють аналізувати розділені на хроматографі речовини за допомогою ІЧ-спектрофотометра. Найбільш простим є концентровано на таблетці КВЧ. Зібрану з хроматографа і упарену до 1-2 крапель фракцію наносять микрошприца на 5-10 мг порошку броміду калію, причому кожну нову порцію розчину випарюють на таблетці, пропускаючи сухий струм інертного газу.
Рис.1. Посудина для концентрування зразка на мікротаблетке КВГ для спектрального аналізу:
1 - КВГ; 2 - зібрана фракція, 3 - голка для підшкірних ін'єкцій, 4 - подача сухого азоту
Інший шлях полягає у випаровуванні всієї зібраної фракції в посудині з опуклим дном (рис. 1), на якому знаходиться порошок броміду калію. Розчинник повністю видаляють, а порошок броміду калію перемішують і спресовують в мікротаблетку. Таблетку з броміду калію можна безпосередньо перенести в зону мас-спектрометр або в ІЧ-спектрофотометр. Можна вводити концентровану фракцію в мікрокювет спектрофотометра і сканувати, використовуючи компенсуючий розчинник. Метод, заснований на перетворенні Фур'є, дає досить високу чутливість.
Застосовують метод аналізу в ІК-області з використанням комбінаційного розсіювання. Розчинник, що містить речовину, випарюють на спеціальній платівці, на якій залишається тонка плівка, після чого знімають спектральну характеристику. І тут для підвищення чутливості бажано мати прилад з перетворювачем Фур'є.
Для ідентифікації хроматографічних піків можна використовувати спектри, що визначають структури, що містять 1 Н, 11 В, 13 С, 19 F, 31 Р. Хоча для спектрів ЯМР потрібна велика кількість зразка (до 1000 мкг), при застосуванні методів, заснованих на перетворенні Фур'є, значно підвищується чутливість, так як багаторазове сканування покращує відношення сигналу до шуму і дозволяє працювати з малими (до 5 мкг) кількостями зразка. Розчинник видаляють з хроматографічної фракції повністю і замінюють його відповідним для ЯМР розчинником.
Якісний аналіз компонентів
Хроматографіст, початківець працювати в області високоефективної рідинної хроматографії, повинен ознайомитися з основами якісного аналізу. Якісний аналіз застосовують для ідентифікації відомого продукту, отриманого новим шляхом або перебуває в суміші з іншими продуктами. Він необхідний при виділенні зі складних біологічних, хімічних сумішей різних компонентів, що особливо важливо в медицині, криміналістиці, екології, для контролю за перебуванням деяких ліків і хімічних продуктів і їх метаболітів у біоматеріалів. Знайомство з основами якісного аналізу допоможе уникнути типових помилок, наприклад, відрізнити домішки в зразку від домішок у розчиннику або перевіряти чистоту речовини не на одній довжині хвилі спектрофотометра, а на різних і т.д.
Перш ніж приступити до аналізу, необхідно встановити, чи весь зразок елюіруется з колонки даною системою розчинників чи ні. Щоб бути впевненим у повному елюювання, необхідно зібрати всю витікаючу з колонки рідина, упарити розчинник, зважити залишок і знайти ступінь вилучення зразка.
Ідентифікацію компонентів у ВЕРХ можна проводити трьома способами: 1) використовувати інформацію про утриманні; 2) дослідити зони, отримані при розділенні у колонці рідинного хроматографа, методами спектрального або хімічного аналізу; 3) безпосередньо підключити спектральний аналізатор до колонки.
Для реєстрації піків в хроматографії використовують утримуваний об'єм V R або час утримування t R. Обидві величини є характеристикою речовини в даній хроматографічної системі. Так як час утримування розділяється речовини складається з часу взаємодії у колонці і часу проходження порожніх ділянок трубки, воно змінюється від приладу до приладу. Зручно мати речовина, не утримується даної колонкою, прийнявши його за стандарт, час і обсяг утримування якого t 0, V 0. Хроматографування речовини і стандарту необхідно проводити при одних і тих же умовах (тиску і швидкості потоку). Поправку на мертвий об'єм можна врахувати, використовуючи виправлене час утримування tn або виправлений об'єм утримування V R, за формулою
t R '= t R - t 0
При ідентифікації за даними про утриманні, відомі індивідуальні речовини, які можуть бути присутніми в зразках, поділяють в тій же самій хроматографічної системі, і для них отримують значення t R. Порівнюючи ці значення t R з часом утримування невідомого піку, можна виявити, що вони або збігаються, і тоді ймовірно, що піки відповідають одному й тому ж речовини, або t R відомого речовини не відповідає t R невідомою зони. Тоді все-таки можлива орієнтовна оцінка значень t R речовин, не доступних для безпосереднього вимірювання ступеня їх утримування. Розглянемо обидва варіанти.
У першому випадку, очевидно, необхідно попереднє вивчення зразка для постулювання присутності в ньому конкретних речовин. При роботі з простими сумішами неважко визначити, чи збігається ступінь утримування зон зразка і відомих речовин, чи ні, тобто значення t R однакові або розрізняються. У разі складних сумішей відразу кілька речовин можуть елюіроваться зі схожими значеннями t R, і реально отримані при хроматографічному поділі зони перекриваються. У результаті отримання точних значень t R для різних зон стає неможливим. Надійність ідентифікації зростає при підвищенні роздільної здатності, більш ретельному контролі умов поділу, багаторазовому вимірі значень t R і усередненні знайдених величин. При цьому хроматографічне розділення відомого і невідомого речовин має чергуватися. При поділі складних сумішей значення t R речовини може змінюватися під впливом матриці самого зразка. Такий вплив можливо на початку хроматограми і при перекривання піків; можливо також затягування зон, про що вже згадувалося.
У подібних випадках слід додати стандарт до зразка у співвідношенні 1:1. Якщо речовини ідентичні, значення t R вихідної речовини не зміниться, і на хроматограмі отримують тільки один пік. Якщо є прилад з циклічною системою хроматографування, то для надійності ідентифікації бажано суміш пропускати через колонку кілька разів.
Відомості про ступінь утримування можна знайти і в літературі, проте цінність цієї інформації обмежена. Так як колонки навіть однієї партії дають погану відтворюваність, літературні значення не завжди відповідають істинному значенню t R на цій колонці. Для адсорбційної хроматографії можливо, однак, пророкування t R на підставі літературних даних. Інші труднощі, пов'язана з використанням літературних значень t R,-складність їх пошуку в спеціальній літературі, хоча бібліографічні огляди, що публікуються в Jornal of chromatography, мають оновлюваний покажчик за типами речовин.
У другому випадку, коли часи утримування відомих сполук і зон зразка не збігаються, є можливість передбачити час утримування невідомого компонента. Цілком надійні передбачення відносного утримування на підставі даних про структуру в просторово-Ексклюзійна хроматографії. Менш точні вони в адсорбційної, розподільної хроматографії й особливо при роботі на хімічно прив'язаною фазі. Для іонної та іон-парної хроматографії речовин з відомою р Ка можливі лише приблизні визначення значень t R. Завжди легше передбачити відносне утримування або значення α, ніж абсолютні значення k '. Відносні значення t R легше оцінити для споріднених сполук або похідних, наприклад заміщених алкілкарбонових кислот або похідних бензолу.
При ізократіческом поділі гомологів або олігомерів іноді спостерігається наступна закономірність:
lgk '= A + Bn,
де A і В - константи для ряду вибраних зразків і для даної хроматографічної системи (на одній і тій же колонці, з такою ж рухомою і нерухомою фазами); n-число однакових структурних одиниць в молекулі зразка.
У градієнтному режимі при лінійному зміні сили рухомої фази рівняння приводиться до вигляду
t R = A '+ B'n,
тобто значення t R лінійно змінюються зі зміною n.
Введення в молекулу зразка функціональної групи j буде приводити до зміни k 'в першому рівнянні на деякий постійний коефіцієнт αj в даній хроматографічної системі. Можна отримати групові константи αj для різних заміщуючих груп j, значення яких будуть зростати при збільшенні полярності функціональних груп, в усіх видах хроматографії, крім обернено-фазною, де значення констант будуть зменшуватися із збільшенням полярності.
Деякі групові константи а для різних заміщуючих груп j наведено в табл. 1.
У адсорбційної хроматографії перше рівняння не завжди застосовно, так як воно справедливо за умови, що всі ізомери мають одне і те ж значення k ', що не завжди дотримується. Можна, однак, побудувати графік залежності lgk / одних і тих же сполук на одній колонці щодо lgk 'тих же сполук, але на іншій колонці або щодо відповідних характеристик у тонкошарової хроматографії, наприклад, lg [(1-Rf) / Rf], і при цьому зазвичай отримують лінійну залежність.
При зіставленні даних про утриманні речовин можна використовувати значення коефіцієнта ємності k ', так як на нього на відміну від t R не впливають швидкість рухомої фази і геометричні особливості колонки.
Поділ на хімічно прив'язаною фазі аналогічно поділу за методом розподільної хроматографії з аналогічними фазами, і тому дані з екстракції при рівноважному стані можуть бути використані для передбачення часу утримування.
Таблиця 1. Групові константи αj для різних заміщуючих груп j в різних рідинних хроматографічних системах (значення вказані для заміщення в ароматичному кільці)
| Замісна Група | Адсорбційне поділ на силикогель | Розподільний поділ на обащенной фазі вода - н-октанол | Поділ на зверненій хімічно прив'язаною фазі з відношенням метанол - вода (1:1) |
| -Br-Cl-F -CH2 ^-CH3 -O-CH3 -NO2 -CN -CHO -CO2CH3 -COCH3 -OH -NH2 -COOH -CONH2 | 0.5 0.15 0.7 0.8 1.7 2.1 2.3 3.7 4.9 5.2 22 22 55 200 450 | 7.2 5.1 1.4 3.6 4.1 1.0 0.5 0.3 1.0 0.3 0.2 0.06 0.50 | 2 1.9 0.9 0.7 0.5 0.5 1.1 0.6 0.3 0.3 0.1 |
Таким чином, збіг значень часу утримування відомого речовини з піднаглядним дає можливість припустити їх ідентичність. Достовірність ідентифікації зростає, якщо проводити порівняння хроматограм відомого речовини та невідомого компонента в різних умовах. Якщо речовини в адсорбційної і обернено-фазною або іонообмінних і Ексклюзійна хроматографії ведуть себе однаково, надійність ідентифікації зростає. Якщо достовірність ідентифікації при рівності відносного утримування становить 90%, то при вивченні поведінки цих же речовин в умовах істотно відрізняються достовірність ідентифікації складає вже 99%.
Цінною характеристикою речовини, що застосовується при ідентифікації, є ставлення сигналів, отриманих для даної речовини на двох різних детекторах. Аналізоване речовина після виходу з колонки проходить спочатку через перший детектор, потім через другий, а сигнали, що надходять з детекторів, реєструються одночасно за допомогою многоперьевого самописця або на двох самописцях. Зазвичай застосовують послідовне з'єднання ультрафіолетового детектора (більш чутливого, але селективного) з рефрактометром, або ультрафіолетового з детектором по флуоресценції, або двох ультрафіолетових детекторів, що працюють на різних довжинах хвиль. Відносний відгук, тобто відношення сигналу рефрактометра до сигналу фотометра, є характеристикою речовини за умови, що обидва детектора роблять у своєму лінійному діапазоні; це перевіряється введенням різних кількостей одного і того ж речовини. Якісну інформацію можна отримати, працюючи на фотометричних детекторах, забезпечених пристроєм для зупинки потоку (Stop flow) і дозволяють реєструвати спектр виходить з колонки піку, поки він знаходиться в проточній кюветі, порівнюючи його зі спектром відомого з'єднання.
Значний інтерес при ідентифікації представляють сучасні, поки ще дорогі, спектрофотометри з діодним гратами.
Цілком невідому речовину неможливо ідентифікувати тільки за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, необхідні й інші методи.
ІДЕНТИФІКАЦІЯ РЕЧОВИН НЕХРОМАТОГРАФІЧЕСКІМІ МЕТОДАМИ
У деяких випадках ідентифікація невідомої речовини може бути забезпечена збором фракції, відповідної піку хроматографічного розділення, і наступним аналізом цієї фракції фізичними або хімічними методами. При цьому рухлива й непорушна хроматографічні фази повинні бути очищеними, щоб фон від фази був зведений до мінімуму, вони не повинні вступати в хімічну реакцію з розчиненим речовиною, повинні бути сумісними-з хроматографічної системою, яка використовується для розділення та виявлення піку. Нерухома фаза не повинна виноситися з колонки. Крім того, обидві фази не повинні заважати ідентифікації допоміжними методами і бути летючими, щоб їх можна було легко видалити випарюванням, фракції зазвичай збирають вручну, хоча можливе застосування колектора фракцій. Для забезпечення чистоти, відповідної піку збирається фракції, внутрішній об'єм трубки між детектором і виходом каналу для збору фракцій повинен бути мінімальним. Цей обсяг повинен бути визначений і внесені поправки на затримку між реєстрацією піку детектором і фактичним виходом піку з каналу для збору фракцій. Фракції зручно збирати в чисті, сухі, захищені від попадання світла посудини з нагвинчують кришками і тефлоновими прокладками для уникнення забруднень. Можливий барботаж цих фракцій чистим азотом або гелієм. Розчинники видаляють із зразка випарюванням, продувкою газом, нагріванням ІК-лампою. Воду і суміші органічних розчинників з водою видаляють випарюванням або ліофільної сушкою. Летючі буферні з'єднання видаляють при підвищених температурах.
Мас-спектрометрія - найбільш надійний і повний метод визначення структури речовини, молекулярної маси, його хімічної формули. Цей високочутливий метод дозволяє працювати всього з 0,005 мкг речовини і встановити як фрагментарний складу молекули, так і її елементне будову.
Розгляд ідентифікації невідомих речовин за допомогою мас-спектрометрії не входить у завдання цього видання. Слід зазначити, однак, що більшість неіонних, навіть відносно малолетучих речовин вдається проаналізувати, використовуючи зазвичай застосовується в мас-спектрометрії метод збудження електронним ударом. Нелеткі або іонні сполуки визначають при використанні методів хімічної іонізації, польовий десорбції та інших спеціальних прийомів.
Зразок, попередньо упарену до 1-2 крапель (обсяг 25-50 мкл), переносять микрошприца у вхідний зонд мас-спектрометра, повільно випаровують і аналізують. При цьому необхідно виконувати холості досліди, відбираючи аналогічну фракцію до виходу даного нас піку, упарюючи її і вводячи в мас-спектрограф, щоб переконатися у відсутності фонових домішок, які можуть дати значні піки і заважати правильній ідентифікації.
Для спектрального аналізу в інфрачервоній області потрібно відносно невелика проба - 5 мкг на твердому вигляді і 50 мкг в розчині. Чутливість підвищується при використанні методів, заснованих на перетворенні Фур'є, при цьому досить всього 0,05 мкг проби. Цей метод аналізу чудово доповнює дані, отримані на мас-спектрометрі, і дає інформацію про функціональні групах, а іноді і про структуру речовини. Є декілька прийомів, що дозволяють аналізувати розділені на хроматографі речовини за допомогою ІЧ-спектрофотометра. Найбільш простим є концентровано на таблетці КВЧ. Зібрану з хроматографа і упарену до 1-2 крапель фракцію наносять микрошприца на 5-10 мг порошку броміду калію, причому кожну нову порцію розчину випарюють на таблетці, пропускаючи сухий струм інертного газу.
Рис.1. Посудина для концентрування зразка на мікротаблетке КВГ для спектрального аналізу:
1 - КВГ; 2 - зібрана фракція, 3 - голка для підшкірних ін'єкцій, 4 - подача сухого азоту
Інший шлях полягає у випаровуванні всієї зібраної фракції в посудині з опуклим дном (рис. 1), на якому знаходиться порошок броміду калію. Розчинник повністю видаляють, а порошок броміду калію перемішують і спресовують в мікротаблетку. Таблетку з броміду калію можна безпосередньо перенести в зону мас-спектрометр або в ІЧ-спектрофотометр. Можна вводити концентровану фракцію в мікрокювет спектрофотометра і сканувати, використовуючи компенсуючий розчинник. Метод, заснований на перетворенні Фур'є, дає досить високу чутливість.
Застосовують метод аналізу в ІК-області з використанням комбінаційного розсіювання. Розчинник, що містить речовину, випарюють на спеціальній платівці, на якій залишається тонка плівка, після чого знімають спектральну характеристику. І тут для підвищення чутливості бажано мати прилад з перетворювачем Фур'є.
Для ідентифікації хроматографічних піків можна використовувати спектри, що визначають структури, що містять 1 Н, 11 В, 13 С, 19 F, 31 Р. Хоча для спектрів ЯМР потрібна велика кількість зразка (до 1000 мкг), при застосуванні методів, заснованих на перетворенні Фур'є, значно підвищується чутливість, так як багаторазове сканування покращує відношення сигналу до шуму і дозволяє працювати з малими (до 5 мкг) кількостями зразка. Розчинник видаляють з хроматографічної фракції повністю і замінюють його відповідним для ЯМР розчинником.
З інших методів ідентифікації слід відзначити елементний аналіз, що вимагає від 200 до 1000 мкг речовини, полярографії (0,01 мкг речовини), спектрофлуоріметри-, (0,05 мкг речовини) і, нарешті, спектральний аналіз в УФ-та видимій областях (0 , 1 мкг).
Простим, надійним і зручним способом визначення функціональних груп є кольорові селективні реакції, для яких потрібно всього 0,1 мкг речовини. Збіг часу утримування і відповідна кольорова реакція є надійним підтвердженням правильності структури. Іноді достатньо розчинник, який застосовується в рідинної хроматографії, лише частково упарити, а в деяких випадках його слід повністю замінити відповідним розчинником. У табл. 2 наведено приклади кольорових реакцій для впізнання функціональних груп.
Таблиця 2. Якісні реакції визначення функціональних груп
СПЕКТРАЛЬНИЙ АНАЛІЗ БЕЗПОСЕРЕДНЬО У хроматографічної системи
Розроблено комплексні автоматизовані системи, що дозволяють вводити речовина після поділу у колонці хроматографа безпосередньо в спектрофотометр, але подібне обладнання є досить дорогим, потребує значної підготовки оператора і має ряд обмежень. Для багатьох задач застосування таких систем недоцільно, а іноді навіть непридатне.
Як і в випадку газової хроматографії існує кілька систем сполучення з мас-спектрометром. Ці системи, природно, повинні забезпечувати ефективний перенесення піку розчиненої речовини, мати високу чутливість при ступеня вилучення зразка більше 30% і давати можливість вибору потрібного виду рідинної хроматографії та режиму роботи мас-спектрометра. Така система повинна гарантувати швидкий, надійний аналіз при мінімальних вимогах до підготовки оператора. Необхідно також забезпечити можливість швидкого і повного видалення розчинника, застосованого в якості рухомої фази; нарешті, перенесення піку повинен бути відтворюваним.
Можливе підключення до рідинного хроматографа ІЧ-спектрометра з перетворювачем Фур'є. При цьому хімічна структура речовин, відповідних пікам на хроматограмі, може бути ідентифікована за допомогою даних, записаних в бібліотеку спектральної інформації системи.
Література
1. Енгельгардт X. Рідинна хроматографія при високих тисках: Пер. з англ. М., Мир, 1980. 245 с.
2. Рідинна колонкової хроматографії / Под ред. 3. Дейла, К. Мащека, Я. Янакі. Пер. з англ, (в 3-х томах). М., Мир, 1978.
3. Остерман Л. А. Хроматографія білків і нуклеїнових кислот. М., Наука, 1985. 536 с. 9 Berendsen GE, DeGalan R. / l. Chromatogr., 1980, v. 196, No. 1, p. 21-37.
4. Cooke NHC, Olsen / (. / J. Chromatogr. Sci., 1980, v. 18, p. 1-12.
5. Scottt CD, Lee NE / J. Chromatogr., 1973, v. 83, p. 383-393.
6. Kabra PM, Marion LJ Liquid Chromatography in Clinical Analysis. Humana Press, Cliftond, 1981. 466 p.
7. Edelson EH, ea / J. Chromatogr., 1979, v. 174, p. 409-419.
Простим, надійним і зручним способом визначення функціональних груп є кольорові селективні реакції, для яких потрібно всього 0,1 мкг речовини. Збіг часу утримування і відповідна кольорова реакція є надійним підтвердженням правильності структури. Іноді достатньо розчинник, який застосовується в рідинної хроматографії, лише частково упарити, а в деяких випадках його слід повністю замінити відповідним розчинником. У табл. 2 наведено приклади кольорових реакцій для впізнання функціональних груп.
Таблиця 2. Якісні реакції визначення функціональних груп
| Тип речовини | Реактив | Придбаний колір Межа виявлення, мкг | Виявлені речовини | |
| Спирти Альдегіди Кетони | Біхромат калію, азотна кислота Нітрат церію 2,4-динитрофенола Реактив Шиффа 2,4-динитрофенола | Блакитний Бурштиновий Жовтий Рожевий Жовтий осад | 20 100 20 50 20 | C1-C8 C1-C8 C1-C6 C1-C6 C ^-C8 |
| Ефіри | Гідроксамат заліза | Червоний | 40 | C1-C5 |
| Меркаптани | Нітропрусид натрію Ізатином Ацетат свинцю Нітропрусид натрію | Червоний Зелений Жовтий осад Червоний | 50 100 100 50 | C1-C9 C1-C9 C1-C9 C2-C12 |
| Сульфіди | ||||
| Дисульфіди | Нітропрусид натрію ізатином Реактив Гінзберга нітропрусид натрію гідроксамат заліза - пропіленгліколь Формальдегід, сірчана кислота | Червоний Зелений Помаранчевий Червоний, блакитний Червоний | 50 100 100 50 40 | C2-C6 C2-C6 C1-C4 C1-C4 C2-C5 |
| Аміни Нітрили | ||||
| Ароматичні сполуки | Бордовий | 20 | C6H ^-C6H4-C4 | |
| Аліфатичні неграничні з'єднання | Те ж | Бордовий | 40 | C2-C8 |
| Галогеналкіли | Спиртовий розчин AgNOa | Білий осад | 20 | C1-C5 |
Розроблено комплексні автоматизовані системи, що дозволяють вводити речовина після поділу у колонці хроматографа безпосередньо в спектрофотометр, але подібне обладнання є досить дорогим, потребує значної підготовки оператора і має ряд обмежень. Для багатьох задач застосування таких систем недоцільно, а іноді навіть непридатне.
Як і в випадку газової хроматографії існує кілька систем сполучення з мас-спектрометром. Ці системи, природно, повинні забезпечувати ефективний перенесення піку розчиненої речовини, мати високу чутливість при ступеня вилучення зразка більше 30% і давати можливість вибору потрібного виду рідинної хроматографії та режиму роботи мас-спектрометра. Така система повинна гарантувати швидкий, надійний аналіз при мінімальних вимогах до підготовки оператора. Необхідно також забезпечити можливість швидкого і повного видалення розчинника, застосованого в якості рухомої фази; нарешті, перенесення піку повинен бути відтворюваним.
Можливе підключення до рідинного хроматографа ІЧ-спектрометра з перетворювачем Фур'є. При цьому хімічна структура речовин, відповідних пікам на хроматограмі, може бути ідентифікована за допомогою даних, записаних в бібліотеку спектральної інформації системи.
Література
1. Енгельгардт X. Рідинна хроматографія при високих тисках: Пер. з англ. М., Мир, 1980. 245 с.
2. Рідинна колонкової хроматографії / Под ред. 3. Дейла, К. Мащека, Я. Янакі. Пер. з англ, (в 3-х томах). М., Мир, 1978.
3. Остерман Л. А. Хроматографія білків і нуклеїнових кислот. М., Наука, 1985. 536 с. 9 Berendsen GE, DeGalan R. / l. Chromatogr., 1980, v. 196, No. 1, p. 21-37.
4. Cooke NHC, Olsen / (. / J. Chromatogr. Sci., 1980, v. 18, p. 1-12.
5. Scottt CD, Lee NE / J. Chromatogr., 1973, v. 83, p. 383-393.
6. Kabra PM, Marion LJ Liquid Chromatography in Clinical Analysis. Humana Press, Cliftond, 1981. 466 p.
7. Edelson EH, ea / J. Chromatogr., 1979, v. 174, p. 409-419.