Фізіологічна адаптація нового RuMP штаму факультативних метілотр

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

БІОТЕХНОЛОГІЯ
Фізіологічна адаптація нового RuMP штаму факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum до важкій воді
@ 2006 О. В. Мосіна
Московська державна академія тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, просп. Вернадського, 86.
Розроблено метод фізіологічної адаптації нового фенілаланін-продукуючого RuMP штаму факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum до максимальних (98 об.%) Концентрацій 2 Н 2 О з метою подальшого мікробіологічного синтезу 2 Н-міченого фенілаланіну. Метод полягає в послідовному розсіві штаму на агаризованих середовищах М9 з 2 об.% [U - 2 Н] MetOH зі східчасто зростаючим градієнтом концентрації 2 Н 2 O (від 0 до 98 об.% 2 Н 2 О) і подальшої селекцією колоній за ознакою стійкості до 2 Н 2 О. У результаті застосування розробленого підходу для даного штаму метилотрофних бактерій на середовищі з 98 об.% 2 H 2 О були відібрані окремі колонії, зберегли високі ростові і біосинтетичні параметри. За рахунок використання адаптованого штаму можна отримати 0.95 грам 2 Н-міченого фенілаланіну з 1 літра ростової середовища. Показано, що поряд з фенилаланином штам синтезує і виділяє в ростовую середу в кількості 5-6 ммоль метаболічно пов'язані з ним амінокислоти: аланін, валін і лейцин / ізолейцин. Згідно з даними методу мас-спектрометрії EI MS метилових ефірів N-діметіламінонафталін-5-сульфонільного (Dns) похідних амінокислот, 2 Н-мічені   амінокислоти, отримані шляхом мікробіологічного синтезу представляли собою суміші молекул з різною кількістю включених атомів дейтерію; рівень дейтерірованності молекул визначали з мас-спектрів за найбільш поширеній піку молекулярного іона (M) + кожної амінокислоти - для фенілаланіну рівень дейтерірованності склав 6; для аланіну -3.1; для валіну -4.7; для лейцину / ізолейцин - 5.1 атома дейтерію.

ВСТУП

В даний час мікробіологічний синтез 2 Н-мічених амінокислот привертає все більшу увагу дослідників внаслідок виключно природного конфігурації синтезованих сполук, можливістю уніформного введення дейтерієво мітки в молекули амінокислот і низька вартість в порівнянні з хімічно синтезованими аналогами [1, 2]. Саме тому пошук нових штамів-продуцентів 2 Н-мічених амінокислот, стійких до високих концентрацій дейтерію в ростових середовищах для їх подальшого мікробіологічного використання є актуальним завданням для сучасної мікробіологічної промисловості.
З розвитком нових біотехнологічних підходів з'явилася можливість використовувати для спрямованого синтезу 2 Н-мічених амінокислот біологічну конверсію [U-2 H] MetOH в клітинах отриманих за рахунок мутагенезу та генної інженерії штамів метилотрофних бактерій, асиміляційні MetOH в якості джерела вуглецю і енергії за рібулозомонофосфатному (RuMP ) або серинових шляху асиміляції вуглецю [3]. Продуктивність метилотрофних бактерій, виміряна за рівнем конверсії MetOH в клітинні компоненти досягає 50%, що робить їх зручними об'єктами для отримання з їх допомогою 2 Н-мічених амінокислот [4]. Традиційним підходом при цьому залишається вирощування метилотрофних штамів-продуцентів амінокислот на мінеральних середовищах з [U-2 Н] MetOH і максимальними концентраціями 2 Н 2 О [5]. Проте подібні процеси поки не знаходять широкого застосування в мікробіологічній промисловості, внаслідок значного негативного біостатичні ефекту, що чиниться 75-80 об.% 2 Н 2 О на зростання багатьох метілотрофов [6], в той час як рослинні клітини можуть нормально розвиватися при концентраціях не більше 50 об.% 2 H 2 О [7], а клітини тварин не більше 35 об.% 2 H 2 О [8]. Як було показано нами раніше, частково знизити негативний біостатичні ефект 2 Н 2 О у метілотрофов дозволяє попередня клітинна адаптація до 2 Н 2 О і подальше використання для мікробіологічного синтезу 2 Н-мічених амінокислот адаптованих форм метилотрофних бактерій [9]. Явище клітинної адаптації до 2 H 2 О цікаво не тільки саме по собі, але воно також дозволяє отримувати унікальний біологічний матеріал, що несе дейтерієву мітку, дуже зручний для різнопрофільних мікробіологічних досліджень. Відповідно до цього, метою цієї роботи було дослідження процесу фізіологічної адаптації нового фенілаланін-продукуючого RuMP штаму факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum до максимальних (98% об.) Концентрацій 2 Н 2 О в ростовий середовищі. Оскільки біосинтетичних потенціал даного метилотрофних штаму при зростанні на 2 Н 2 О до початку проведення роботи був вивчений недостатньо, становило інтерес дослідження його здатності до мікробіологічного синтезу 2 Н-міченого фенілаланіну та інших амінокислот в умовах максимально насиченою дейтерієм середовища.
ОБ'ЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ І МЕТОДИ
Об'єктом дослідження служив отриманий за рахунок мутагенезу нітрозогуанідіном лейцінзавісімий грам-позитивний штам RuMP факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, продуцент фенілаланіну [10]. Спожити штаму в лейцин становить 10 мг / л. Батьківський штам був отриманий з Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ) Державного науково-дослідного центру генетики та селекції промислових мікроорганізмів ГНІІГЕНЕТІКА.
Для приготування ростових середовищ і адаптації штаму використовували 2 H 2 O (99.9 ат.% 2 H) і [U-2 Н] MetOH (97.5 ат.% 2 H), отримані з Російського науково-дослідного центру ІЗОТОП (Санкт-Петербург, РФ). Для створення високого градієнта концентрації 2 Н 2 О в ростових середовищах використовували 2 Н 2 О з атомним вмістом дейтерію 99.9%. Фосфатвмісними солі були двічі перекристалізований в абсолютній 2 Н 2 О перед їх використанням і висушені у вакуумі. Тим не менше, відсоток дейтерірованності ростових середовищ після стеріллізаціі вологою парою, виміряний методом ЯМР був нижчим на 8-10% ізотопної чистоти вихідної 2 Н 2 О). За необхідності 2 H 2 O очищали від шкідливих домішок, переганяючи її над перманганатом калію [11].
Вирощування штаму проводили в мінеральному середовищі M9 [12], приготовленої на основі різних концентрацій 2 Н 2 О (див. таблицю) з добавками протоновану лейцину і [U-2 H] MetOH при 37 0 С в колбах Ерленмейера місткістю 250 мл з наповненням середовищем до 50 мл в умовах інтенсивної аерації за методикою [13]. Після 6-7 діб зростання клітини відокремлювали центрифугуванням (10000 об / хв, 20 хв). У культуральної рідини аналізували секретуються амінокислоти.
Адаптацію штаму до 2 Н 2 О проводили на агаризованих середовищах М9 (2%-ний агар), що містять східчасто зростаючий градієнт 2 Н 2 О (від 0 до 98 об.% 2 Н 2 О). При цьому використовували послідовний розсівання штаму до окремих колоній і подальшу селекцію колоній, що виросли на середовищах з ступінчастому градієнтом 2 Н 2 О. Відібраний штам зберігали в 50%-ном розчині (у 2 Н 2 О) гліцерину при -14 0 С.
Морфологію клітин досліджували за допомогою інтерференційного-поляризаційного мікроскопа МБР-5 (Угорщина).
Бактеріальний зростання оцінювали за величиною оптичної щільності суспензії клітин, виміряної на спектрофотометрі Beckman-DU6 (США) при 540 нм у кюветі кварцовою з довжиною оптичного шляху 10 мм.
Тонкошарову хроматографію (ТШХ) амінокислот проводили на пластинках Silufol UV-254 (Чехо-Словаччина) у системі розчинників: з-PrOH-аміак, (7:3).
Секретується фенілаланін визначали на приладі Beckman DU-6 (США) при 540 нм в зразках культуральної рідини, об'ємом 10 мкл після її обробки 0.1% розчином нингидрина в ацетоні.
Рівні включення дейтерію в молекули амінокислот визначали методом мас-спектрометрії EI MS у вигляді метилових ефірів N-Dns-похідних амінокислот на приладі MB-80A (Hitachi, Японія) при ионизирующем напрузі 70еВ, використовуючи пряму деріватізацію ліофілізованих культуральних рідин дансілхлорідом і діазометаном [14] .

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

Вирощування штаму на 2 Н 2 О-вмісних середовищах.
Для вирощування штаму був обраний східчасто-збільшується градієнт концентрації 2 H 2 О в ростових середовищах в присутності 2 об.% [U - 2 H] MetOH, так як Предпологалось, що поступове звикання клітини до 2 Н 2 О буде позитивно впливати на параметри росту і загальне самопочуття культури (таблиця). Для компенсації ауксотрофності по лейцину цю амінокислоту додавали в ростовую середу в протоновану вигляді в концентрації 10 мг / л. Спочатку вихідний штам вирощували на 2 Н 2 О-вмісних середовищах без його попередньої адаптації до 2 Н 2 О, для того щоб визначити його ростові і біосинтетичні параметри на цих середовищах. При зростанні вихідного штаму на контрольному середовищі зі звичайною водою тривалість лаг-фази і час клітинної генерації склали 20 і 2.2 год відповідно (таблиця, досвід 1). У проміжних експериментах ці параметри змінювалися пропорційно концентрації 2 Н 2 О. Зокрема, тривалість лаг-фази і час клітинної генерації збільшувалися, а зростання та рівень накопичення фенілаланіну зменшувалися, причому найнижчі значення були зафіксовані на максимально дейтерированного середовищі з 98 об.% 2 Н 2 О. Так, в експерименті (5), таблиця, вихід мікробної біомаси був знижений в 3.3, а рівень накопичення фенілаланіну в ростовий середовищі в 2.7 разів у порівнянні з контролем, тому було необхідно проводити адаптацію штаму до 2 Н 2 О.
Таблиця. Ізотопний склад ростових середовищ і параметри бактеріального росту вихідного штаму

Компоненти середовища, об.%

H 2 O 2 H 2 O MetOH [U - 2 H]
MetOH
лаг - фаза
(Ч)
Вихід біомаси ((%)
Час генерації
(Ч)
Максимальний рівень накопичення фенілаланіну в ростовий середовищі
(%)
(1)
98
0
2
0
20
100.0
2.2
100.0
(2)
73.5
24.5
0
2
34
85.9
2.6
97.1
(3)
49.0
49.0
0
2
44
60.5
3.2
98.8
(4)
24.5
73.5
0
2
49
47.2
3.8
87.6
(5)
0
98.0
0
2
60
30.1
4.9
37.0
                                                                                                                                                                                                                        
Клітинна адаптація до 2 Н 2 О.
Спеціальний підхід щодо адаптації полягав у серії з чотирьох адаптаційних пасажів вихідної культури на твердих агаризованих середовищах з 2 об.% [U-2 H] MetOH з 0, 24.5, 49, 73.5 і 98 об.% 2 Н 2 О. При цьому відбирали окремі колонії, які виросли на середовищах з низькими концентраціями 2 Н 2 О. Потім їх послідовно пересівали на середовища з більшою концентрацією 2 Н 2 О, включаючи середовище з 98 об.% 2 H 2 О, проводячи їх паралельні контрольні розсіви на протоновану середовищі (ступінь виживання бактерій склала не більше 40%).
За ходом адаптації стежили щодо змін тривалості лаг-фази, часу клітинної генерації і виходів мікробної біомаси, а також за максимальним рівнем накопичення фенілаланіну в ростовий середовищі (рис. 2). Так, вихід мікробної біомаси, час клітинної генерації та рівень накопичення фенілаланіну в ростовий середовищі при зростанні адаптованого до 2 Н 2 О штаму в 98 об.% 2 Н 2 О змінюються порівняно з контрольними умовами на 13, .. і 5%, тобто незначно (рис. 2, досвід 5 '). Тривалість часу генерації істотно не відрізняється від вихідного штаму на Н 2 О-середовищі. Адаптовані до 2 Н 2 О клітки зберегли здатність синтезувати і екзогенно продукувати фенілаланін в ростовую середу, який можна виділяти в кількості 0.95 г / л.

Рис.1
Вивчення продукції фенілаланіну на 2 Н 2 О-вмісних середовищах.
У всіх експериментах не залежно від присутності 2 Н 2 О в ростовий середовищі було зафіксовано збільшення продукції фенілаланіну на ранній фазі експоненціального зростання, коли вихід мікробної біомаси був незначний, у той час як на фазі пізнього експоненціального зростання спостерігалося зниження рівня його накопичення в ростовий середовищі ( рис. 3). Для того щоб пояснити ефект зниження рівня накопичення фенілаланіну були висловлені можливі припущення про морфологічну неоднорідності мікробної популяції, інгібуванні біосинтезу фенілаланіну кінцевим продуктом порушенні транспорту фенілаланіну через клітинну мембрану. Результати по мікроскопічному дослідженню зростання популяції мікроорганізмів показали, що даний характер динаміки накопичення фенілаланіну не корелював з якісними змінами клітинної морфології на пізніх стадіях росту, що служило підтвердженням морфологічної однорідності мікробної популяції. Швидше за все, накопичений екзогенно в процесі росту фенілаланін ингибировал ферменти власного шляху біосинтезу. Крім того, не виключена можливість, що при вирощуванні без рН-статірованія може відбуватися як зворотне перетворення секретованої фенілаланіну в інтермедіаторние з'єднання його біосинтезу по шляху шікімовой кислоти, так і спонтанна асиміляція фенілаланіну клітиною для забезпечення своїх власних метаболічних потреб, що зазначено в інших роботах [ 15, 16]. Ефект зменшення рівня накопичення фенілаланіну спостерігався при зростанні як на протоновану, так і на середовищі з 98 об.% 2 Н 2 О, що ускладнювало його дослідження (рис. 3). Через те, що на середовищі з 98 об.% 2 Н 2 О ухучшалісь всі ростові параметри, було зроблено припущення, що зменшення рівня накопичення фенілаланіну в ростовий середовищі належить не до зміни транспорту фенілаланіну через клітинну мембрану, а до негативного біостатичні ефекту 2 Н 2 О. Дані з дослідження культуральної рідини методом ТШХ показали, що крім фенілаланіну даний штам синтезує і накопичує в ростовий середовищі незначні кількості (на рівні 5-6 ммоль) метаболічно пов'язаних з ним амінокислот (аланін, валін, лейцин / ізолейцин), присутність яких також підтверджувалося аналізом суміші метилових ефірів N-DNS-похідних амінокислот методом мас-спектрометрії EI MS.

Рис.2.
Вивчення рівнів включення дейтерію в молекули амінокислот.
У цій роботі рівні включення дейтерію в молекули амінокислот визначали методом мас-спектрометрії EI MS у вигляді метилових ефірів N-Dns-похідних амінокислот, за рахунок зіставлення молекулярних мас протоновані і 2 Н-мічених похідних амінокислот.
Отримані мікробіологічним синтезом 2 Н-мічені амінокислоти представляли собою суміші ізотопнозамещенних форм молекул, що розрізняються кількістю атомів водню, заміщених на дейтерій. Внаслідок цього ефекту піки молекулярних іонів метилових ефірів N-Dns-амінокислот в мас-спектрах були поліморфно розщеплені на кластери за рахунок домішки молекул з відносинами m / z, більше або менше детектіруемих приладом величин (М) + з різним внеском в сумарний рівень дейтерірованності. В якості прикладу на рис. 4, б наведено мас-спектр суміші метилових ефірів N-Dns-похідних амінокислот отриманих з середи з 98 об.% 2 Н 2 О (мас-спектр наведено щодо контрольних умов (а) на звичайній воді). Підрахунок рівня дейтерірованності молекул амінокислот проводили за величиною найінтенсивнішого піку молекулярного іона (М) +, зареєстрованого самим мас-спектрометром; для фенілаланіну - шість (М + при m / z 418 замість М + при m / z 412 для протоновану метилового ефіру N- Dns-фенілаланіну), для аланіну -3.1 (М + при m / z 339.5 замість М + при m / z 336.4), для валіну -4.7 (М + при m / z 369.2 замість М + при m / z 364.5), для лейцину / ізолейцин -5.1 атома дейтерію (М + при m / z 383.6 замість М + при m / z 378.5). Таким чином, загальна кількість дейтерію в молекулі фенілаланіну склало 75%, аланін -77.5%, валіну -58.8%, лейцину / ізолейцин 51%. Рівні дейтерірованності 2 Н-мічених амінокислот сімейства лейцину повинні бути нижче інших внаслідок того що лейцин додавали в ростовую середу в протоновану вигляді, що підтвердилося експериментальними даними (див. вище). У той же час біосинтез фенілаланіну був побічно пов'язаний з ауксотрофностью по лейцину, тому дейтерівая мітка в молекулі самого фенілаланіну також була дещо розбавлена.
Отримані дані в цілому підтверджують стійке уявлення про те, що адаптація до 2 H 2 О є фенотипическим явищем, оскільки адаптовані клітини поверталися до нормального зростання і біосинтезу фенілаланіну в протоновані середовищах після деякого лаг-періоду. У той же час ефект оборотності зростання на 2 H 2 O / Н 2 O-середовищах теоретично не виключає можливості того, що ця ознака стабільно зберігається при зростанні в Н 2 О, але маскується при перенесенні клітин на дейтерированного середу. У загальних рисах, при перенесенні клітини в дейтерированного середу вона не тільки поступово втрачає звичайну воду за рахунок насичення внутрішньоклітинного середовища 2 H 2 О, а й відбувається дуже швидкий ізотопний (1 Н-2 H)-обмін у гідроксильних, карбоксильних, сульфгідрильних і аминогруппах всіх біологічних макромолекул, включаючи нуклеїнові кислоти і поліпептиди. Потім у процесі росту клітини дейтерій включається у вуглецеві скелети макромолекул, утворюючи зв'язки типу С-2 H [17]. У зв'язку з тим, що фізико-хімічні параметри С-2 Н зв'язку істотно відрізняються від її протоновану прототипу [18], можна припустити, що клітина реалізує лабільні адаптивні механізми, які сприяють стабілізації роботи макромолекулярних компонентів життєво-важливих систем, які зазнали дейтерірованію. Не виключено, що позитивні ефекти, які спостерігаються при адаптації до 2 H 2 О пов'язані з утворенням в 2 H 2 O конформацій 2 Н-мічених макромолекул з іншими структурно-динамічними властивостями, ніж конформацій, утворених за участю водню, і тому мають іншу активність і біологічні властивості, які підходять для роботи в 2 Н 2 О. З іншої точки зору просторова структура 2 Н-мічених макромолекул може стабілізуватися в 2 H 2 О за рахунок вторинного ізотопного ефекту дейтерію і дії 2 H 2 О як розчинника (велика структурованість, щільність і в'язкість порівняно з Н 2 О) [19].

Підсумовуючи отримані для вивченого штаму дані, можна зробити висновок про адаптивної стабілізації за допомогою поступового звикання до 2 Н 2 О і як наслідок цього поліпшення ростових і біосинтетичні параметрів. Вибір метилотрофних бактерій в якості модельних об'єктів для даних досліджень представляється найбільш доцільним, так як метілотрофи як організми, що реалізують RuMP і серинові шляху асиміляції MetOH, еволюційно прості і досить лабільні в генетичному аспекті і тим самим швидше реагують і пристосовуються до мінливих факторів середовища. В даний час аналогічні підходи щодо адаптації інших штамів метилотрофних бактерій до 2 Н 2 О активно вивчаються.

ЛІТЕРАТУРА

1. Мосін О. В., складні Д. А., Єгорова Т. А., Швець В. І. Методи отримання амінокислот і білків, мічених стабільними ізотопами 2 Н, 13 С, 15 N, 18 О. / / Біотехнологія. 1996. № 10. С. 24-40.
2. Пшеничникова О. Б., Карнаухова Є. Н., Звонкова Є. Н., Швець В. І. Методи отримання дейтерированного амінокислот. / / Біоорганічна хімія. 1995. Т. 21. № 3. С. 163-178.
3. Antony C. Bacterial Oxidation of Methane and Methanol. The Biochemistry of Methylotrophs, 2 nd edn. 1982. Academic Press, London. P. 78
4. Colby J., Dalton H., Whittenbury R. Biological and biochemical aspects of microbial growth on C 1 compounds. / / Ann. Rev. Microbiol. 1979. V. 33. P. 481-517.
5. Karnaukhova EN, Reshetova OS, Semenov SY, Skladnev DA, Tsygankov Y. D. 2 H-and 13 C-Labeled Amino Acids Generated by Obligate Methylotrophs Biosynthesis and MS Monitoring. / /   Amino Acids. 1994. V. 6. P. 165-176
6. Складне Д. А., Мосін О. В., Єгорова Т. А., Єрьомін С. В., Швець В. І. метилотрофних бактерій - джерело ізотопномечених 2 Н-та 13 С-амінокислот. / / Біотехнологія. 1996. № 5. С. 25-34.
7. Daboll HF, Crespi HL, Katz JJ Mass cultivation of algae in pure heavy water. / / Biotechnol. and bioengineering. 1962. V. 4. P. 281-297
8. Crespi HL Stable isotopes in life sciences. Intern. atomic energy agency, Vienna, 1977. P. 111-121.
9. Мосін О. В., складні Д. А., Єгорова Т. А., Юркевич О. М., Швець В. І. Вивчення біосинтезу амінокислот штамом Brevibacterium methylicum при зростанні на середовищах, що містять важку воду і дейтерометанол. / / Біотехнологія. 1996. № 3. С. 3-12.
10. Mosin O. В., складні Д. А., Циганков Ю. Д. Патент РФ 93055824/13 (17 листопада 1995)
11. Кейл Дж. Лабораторний практикум з хімії. Наука. Москва. 1981. С. 56.
12. Miller JH, Experiments in molecular genetics. 1976. Cold Spring Harbor laboratory Cold Spring Harbor, New York p 393
13. Мосін О. В., Карнаухова Є. Н., Пшеничникова О. Б., складні Д. А., Акімова О. Л. біосинтетичні отримання дейтеріймеченного фенілаланіну, що секретується метилотрофних мутантом Brevibacterium methylicum. / / Біотехнологія. 1993. № 9. С. 16-20.
14. Мосін О. В., складні Д. А., Єгорова Т. А., Швець В. І. Мас-спектрометричний оцінка рівня включення 2 Н і 13 С в молекули амінокислот бактеріальних об'єктів. / / Біоорганічна хімія. 1996. Т. 22. № 10-11. С. 856-869.
15. Boer L de, Harder W, Dijkhuizen L Phenylalanine and tyrosine metabolism in the facultative methylotroph Nocardia sp. 239. / / Arch. Microbiol. 1988. V. 149. P. 459-465
16. Dijkhuizen L. Metabolic regulation in the actinomycete Amycolatopsis methanolica, a facultative methylotroph employing the RuMP cycle for formaldehyde assimilation. Microbial growth on C 1 compounds 1996, Kluwer academic publishers, London, P. 9-15
17. LeMaster DM Deuterium labeling in NMR structural analysis of larger proteins. / / Quart. Revs. Biophys. 1990. V. 23. № 1. P. 133-174.
18. Єремії В. А., Чекулаева Л. М., Харатьян Є. Ф., Островський Д. М. Вирощування бактерій Micrococcus lysodeikticus на дейтерированного середовищі. / / Мікробіологія. 1978. Т. 37. Вип. 4. С. 629-635.
19. Fesik SW, Zuiderweg ERP Heteronuclear three-dimentional NMR spectroscopy of isotopically labelled biological macromolecules. / / Quart. Revs. Biophys. 1990. V. 23. № 1. P. 97-131.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Стаття
49.5кб. | скачати


Схожі роботи:
Фізіологічна адаптація нового RuMP штаму факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium
Еколого біологічні особливості облігатних та факультативних паразитів надцарства Protozoa
Кометаболізм ЕДТА і глюкози у бактеріального штаму LPM-4
Кометаболізм ЕДТА і глюкози у бактеріального штаму LPM 4
Фізіологічна основа відчуттів
Темперамент як фізіологічна основа характеру
Надниркові залози і їх фізіологічна функція
Клініко фізіологічна концепція екстремального стану організму
Фізіологічна основа корекційної спрямованості фізичного виховання
© Усі права захищені
написати до нас