Ферменти біологічної мембрани

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Федеральне агентство з освіти
Пензенський державний педагогічний університет ім. В.Г Бєлінського
Факультет: природно-географічний
Кафедра біохімії
Ферменти біологічної мембрани
Курсова робота
Виконала: студентка гр. БХ-41
Бунтова Тетяна Іванівна
Перевірив: к. б. н.
Соловйов Володимир Борисович
Пенза, 2009

Зміст
Введення
1. Класифікація ферментів біологічної мембрани
2. Біологічне значення мембранної організації ферментів
3. Вивчення активності мембранних ферментів
4. Регуляція активності мембранозв'язаних ферментів
Висновок
Література

Введення
Багато клітинні процеси катализируются мембранозв'язаних ферментів. При цьому мембрана може виконувати цілий ряд функцій. Зв'язавши фермент з певною мембраною або ділянкою на мембрані, можна локалізувати каталітичний центр в певній частині клітини. Існує безліч прикладів, коли кілька діючих послідовно ферментів організовані таким чином в суперкомплекс, що дозволяє збільшити сумарну швидкість реакції. Багато мембранні ферменти представляють собою білки, які пронизують мембрану наскрізь, і беруть участь у трансмембранному транспорті розчинених речовин або в передачі інформації з одного боку бішару на іншу у формі трансмембранного аллостеріческого сигналу. Інші ферменти є периферичними мембранними білками і в деяких випадках здатні зв'язуватися з мембраною тільки у відповідь на певний фізіологічний сигнал.
Мета роботи: вивчення ферментів біологічної мембрани.
Для реалізації цієї мети були поставлені наступні завдання:
1. Ознайомитися з літературою;
2. Вивчити види ферментів біологічної мембрани, їх біологічне значення.
3. Ознайомитися з проблемою вивчення каталітичної активності мембранних ферментів.

1. Класифікація ферментів біологічної мембрани
Біомембран - це не просто якась пасивна структура, яка обмежує водні компартменти. Вже коротке знайомство з типами ферментів, пов'язаних з мембранами, показує, наскільки різноманітні асоційовані з мембранами каталітичні активності.
1. Трансмембранні ферменти, що каталізують пов'язані реакції на протилежних сторонах мембрани. Характерними прикладами можуть служити окислювально-відновні ферменти, наприклад фотосинтетичні реакційні центри рослин і бактерій або цитохром с-оксидаза мітохондрій. Розташовані на протилежних сторонах мембрани активні центри цих ферментів пов'язані один з одним за допомогою потоку електронів, що генерує трансмембранний електричний потенціал. До цього класу ферментів можуть бути віднесені також багато рецептори. Зв'язування ліганда (наприклад, гормону) з доменом, локалізованим із зовнішнього боку клітинної мембрани, призводить до змін в цитоплазматичної домені ферменту, які, у свою чергу, ініціюють клітинну відповідь. У цьому випадку через мембрану переноситься інформація, а не заряди або які-небудь розчинені молекули. Показано, що деякі рецептори є тирозинових протеїнкінази (див. розд. 9.7) і, отже, являють собою мембранні ферменти, які мають каталітичну активність.
2. Трансмембранні ферменти, які беруть участь у транспорті речовин. Багато мембранні білки беруть участь у транспорті молекул через бішар. Активний транспорт може бути пов'язаний з гідролізом ATP, як у випадку Ca-ATPази саркоплазматичного ретикулуму. Рушійною силою активного транспорту можуть бути також іонні градієнти.
3. Білки, які є компонентами електронтранспортних ланцюгів. Найбільш типові ферменти цього класу - компоненти дихального ланцюга мітохондрій, що закінчується цитохром с оксидазой; ферменти системи електронного транспорту мікросом, що включають цитохром Р450 і цитохром b 5; елементи фотосинтетичної електронно-транспортного ланцюжка в тилакоїди. Локалізація компонентів електронтранспортних ланцюгів у мембрані приводить до збільшення їх локальної концентрації, що дозволяє значно прискорити перенесення електронів між молекулами.
4. Ферменти, здатні використовувати мембранозв'язані субстрати. У цей клас можуть входити ферменти, які беруть участь у метаболізмі компонентів мембрани: фосфоліпідів, гліколіпідів, оліізопреноідних з'єднань і стероїдів, а також ферменти, частвующіе в процессингу мембранних і секреторних білків. У більшості випадків ці ферменти є інтегральними мембранними білками, але іноді (прикладом можуть служити фосфоліпази) представляють собою розчинні білки, лише тимчасово пов'язані з мембраною. Прикладами білків цього типу є лідерних пептідаза з Е.соli і фосфоліпаза С, пов'язані з мембраною допомогою гликозилфосфатидилинозитольного якоря.
5. Ферменти, що використовують водорозчинні субстрати. Багато мембранозв'язані ферменти використовують розчинні субстрати. У деяких випадках фермент локалізується в такій області мембрани, де велика концентрація субстрату. Наприклад, ацетилхолінестерази, що каталізує гідроліз ацетилхоліну, мабуть, фіксується в постсинаптической мембрані за допомогою ковалентного зшивки з фосфатіділінозітольним гликолипидов. Цілий ряд ферментів, які беруть участь у гідролізі крохмалю і білків, прикріплюється до мембран мікроворсинок кишечника за допомогою гідрофобних доменів, розташованих в N-кінцевій частині поліпептидів.
6. Ферменти, що утворюють мембранозв'язаних комплекс для полегшення каналізації субстрату. Мембрани можуть служити своєрідним організуючим каркасом, з яким пов'язуються периферичні ферменти з утворенням мультиферментного комплексу. Є непрямі дані про те, що беруть участь в реакціях циклу Кребса ферменти матриксу мітохондрій зв'язуються з мембраною таким чином, що продукт одного ферменту стає субстратом іншого, не виходячи за межі мультиферментного комплексу.
7. Ферменти, які здійснюють човникові переміщення між цитозолі та мембраною і активність яких модулюється зв'язуванням з мембраною. Ця група мембранних ферментів виявлена ​​недавно. Вони здатні зв'язуватися або прямо з поверхнею фосфоліпідного бішару, або зі специфічними білковими рецепторами. Найчастіше ці ферменти активуються при зв'язуванні з мембраною, але іноді спостерігається і їх інактивація. Типовими прикладами ферментів, що активується при зв'язуванні, є піруватоксідаза з Є. соli, протеїнкіназа С і деякі ферменти, що у каскаді згортання крові.
2. Біологічне значення мембранної організації ферментів
Вивчення ролі мембранної організації білків безпосередньо у живому організмі утруднено через складну організації живої матерії і одночасного перебігу багатьох взаємопов'язаних процесів. Однак, можливість проведення мутації генів, які забезпечують виборчі зміни в структурі експресуються білків, наприклад, експресію тільки розчинних форм білків, дозволяє в деяких випадках показати важливість функціонування саме мембранозв'язаних білків. Розглянемо це на прикладі Kit-ліганда - одного з мембранозв'язаних чинників зростання ссавців. Для мутантної форми цього інтегрального глікопротеїну I типу, яка не містить трансмембранного і цитоплазматичного доменів, була продемонстрована нормальна експресія in vivo та біологічна активність при дослідженні злиття клітин, аналогічна активності секретируемой форми нативного білка. Однак у миші, що має ген такого білка, виявлялися всі симптоми тварини, взагалі позбавленого гена Кit-ліганда - макроцитарная анемія, безпліддя, біле забарвлення.
Недавні дослідження також переконливо підтверджують фізіологічну значущість мембранної форми АПФ. Миша, у якої ген нативного АПФ був замінений на ген, що кодує фермент без якоря таким чином, що весь секретується фермент був активний, однак не вбудовувався в мембрану, мала всі симптоми «нокаутного» тварини, повністю позбавленого гена АПФ: низький тиск, неконтрольоване сечовипускання , безпліддя, різні судинні дисфункції, порушення структури і функції нирок.
Відзначимо, що важливість зв'язування з біомембрані виявлена ​​не тільки для інтегральних білків, але і продемонстрована в ряді випадків для периферичних білків, наприклад, піруватоксідази - периферичного ферменту, що каталізує окислення пірувату до оцтової кислоти і відновлення убихинона. Зазначений фермент циркулює в організмі і зв'язується з плазматичною мембраною лише в присутності субстрату і кофактора, при цьому в молекулі білка формується С-кінцевий ліпідсвязивающій домен. Показано, що мутантна форма піруватоксідази, позбавлена ​​останніх 24 амінокислотних залишків, повністю неактивна in vivo з-за нездатності зв'язуватися з мембраною.
Таким чином, біологічна роль різних мембранних ферментів може в значній мірі визначатися їхньою здатністю до зв'язування з мембраною. По-перше, зв'язування з біомембрані забезпечує локалізацію (концентрування) ферментів у певної частини клітини та / або в тій області мембрани, де концентрується субстрат. Наприклад, ацетилхолінестерази фіксується в постсинаптической мембрані, де велика концентрація ацетилхоліну. По-друге, адсорбція ферментів на мембрані створює можливість для сполучення процесів каталізу і трансмембранного переносу. Так, при функціонуванні мембранозв'язаних ферментів, які беруть участь у гідролізі крохмалю і білків, поблизу клітинної мембрани створюється локально висока концентрація розчинних молекул продукту, що сприяє їх ефективному поглинанню клітиною. По-третє, для багатьох ферментів при зв'язуванні з мембраною забезпечується доступність водонерозчинних субстратів. Це можуть бути інтегральні ферменти, які беруть участь у процессингу мембранних білків, а також периферичні ферменти: фосфоліпази, протеїнкіназа С, піруватоксідаза та ін Нарешті, при зв'язуванні формується оптимальне мікрооточення, що забезпечує нативну конформацію і каталітичну активність мембранних ферментів.
3. Вивчення активності мембранних ферментів
Каталітична активність мембранних ферментів часто дуже сильно залежить від використовуваного детергенту або фосфолипида. Зазвичай активність мембранних ферментів вимірюють у суміші, яка містить детергент і екзогенно доданий фосфолипид. Крім того, ферментний препарат нерідко містить соочіщаемие з ним ендогенні ліпіди. У таких умовах фізичний стан ферменту, зокрема ступінь його агрегації, виявляється досить невизначеним і швидше за все гетерогенним. Часто в одній і тому ж середовищі, компоненти якої змішувалися в різній послідовності, отримують зовсім різні ферментативні активності. Така залежність від передісторії препарату являє собою приклад гистерезиса і досить типова для мембранних ферментів. По суті фермент «застряє» в метастабільних стані і не може придбати найбільш стабільну «робочу конформацію».
Після того як мембранний фермент очищений, для вивчення його каталітичної активності бажано, а часто і необхідно реконструювати його з фосфоліпідами. Вивчення очищених і реконструйованих ферментів дає великі переваги. Зокрема, в такій системі не протікають різні конкуруючі реакції, притаманні біомембранами. Використання реконструйованої системи дозволяє не тільки охарактеризувати ізольовану систему, а й визначити мінімальне число компонентів, необхідних для прояву тих чи інших біохімічних активностей.
Для вбудовування мембранного білка в ліпідну везикул, перш за все, необхідно позбавитися від знаходиться у препараті білка детергенту, який, якщо він присутній у значних кількостях, дестабілізує фосфоліпідний бішар. Зазвичай детергент видаляють вже з суміші білка з фосфоліпідів, але в деяких випадках білок очищають від детергенту до початку реконструкції. Для видалення детергенту використовують гель-фільтрацію, діаліз або адсорбцію на поверхні кульок з полістиролу. Останній спосіб застосовують в першу чергу для видалення тритона Х-100.
Методи реконструкції можна розділити на дві групи.
1. Процедури, при яких білок попередньо очищають від детергенту, а потім проводять реконструкцію.
2. Процедури, в яких білки і фосфоліпіди змішують у присутності детергенту, а потім видаляють детергент до утворення протеоліпосом. Обраний фосфолипид повинен бути здатний до формування стабільних бішару.
Реконструкція без надлишку детергенту
1. Інкубація білка із заздалегідь отриманими везикулами.
Цей спосіб використовується для реконструкції не пронизують бішар білків з обмеженою гідрофобною поверхнею, наприклад цитохрому b5 і по-гидроксибутиратдегидрогеназы.
2. Реконструкція з участю амфіфільних каталізаторів.
Додавання в білково-вфосфоліпідну суміш амфіфільних речовин в низьких концентраціях полегшує вбудовування в везикули таких мембранних ферментів, як бактеріородопсин або цитохром с-оксидаза. Як амфіфільних речовин використовували холестерол, короткоцепочесние фосфатидилхоліну і жирні кислоти. Даний спосіб хороший тим, що в ньому не використовують будь-які грубі процедури, в тому числі обробка надлишком детергентів, проте поки він мало поширений.
3. Заморожування - відтавання / обробка ультразвуком.
Ця методика, проте, застосовується нечасто через небезпеку денатурації білка. Іноді для полегшення реконструкції використовують просту обробку ультразвуком. Найімовірніше, білок спочатку включається в маленькі везикули, що володіють високою кривизною. Заморожування - відтавання, можливо, потрібно для злиття дрібних протеоліпосом в більш однорідні за розмірами.
Реконструкція з використанням миючих засобiв
В даний час для реконструкції використовують методики, що складаються в солюбілізаціі суміші білка та фосфолипида детергентом і наступному видаленні детергенту. Після його видалення білок і фосфолипид спонтанно формують одношарові везикули, цілком придатні для ензимологічних досліджень. Зазвичай вибирають детергенти з високою критичною концентрацією міцелоутворення і малими розмірами міцел, з тим, щоб їх можна було легко видалити діалізом або гель-фільтрацією. Найчастіше використовують холато натрію і октілглюкозід. В якості прикладів можна навести вбудовування цитохром с-оксидази і Na + / K +-ATPази.
За допомогою такої методики можна ввести в везикули відмінні від фосфоліпідів речовини, наприклад холестерол або убіхінон. У ряді випадків виникає необхідність у досить швидкому видаленні детергенту, особливо якщо білок нестабільний при його надлишку. Тоді застосовують гель-фільтраційну хроматографію, теж дозволяє ефективно відокремити білково-ліпідні везикули від детергенту (наприклад, при реконструкції гліцерил-3-фосфатацілтрансферази і фосфатіділінозітолсінтази)
Ще більш швидким є метод розведення, коли білково-ліпідно-детергентно суміш розводять до концентрації детергенту багато меншою, ніж критична концентрація міцелоутворення. При цьому спонтанно утворюються білково-фосфоліпідних везикули, які можна відокремити від детергенту центрифугуванням.
Зазвичай використовується для очистки мембранних ферментів тритон Х-100 дуже незручний при реконструкції, оскільки його важко видалити з системи. Для видалення тритона застосовують кульки з полістиролу, і одна з проблем - втрата білка з-за його сорбції на поверхні кульок. Як приклад білка, реконструюється цим методом, можна навести натрієвий канал.
І нарешті, для реконструкції застосовували метод, заснований на диспергування суміші холестерол-фосфолипид-білок в діетиловому ефірі і наступному випаровуванні зверненої фази.
4. Регуляція активності мембранозв'язаних ферментів
Мембранні ферменти відрізняються від розчинних ферментів однією важливою властивістю: всі вони міцно пов'язані з ліпідного бішару відповідних мембран. Тому крім субстратів, активаторів або інгібіторів їх регуляторами є самі мембранні ліпіди. Ліпіди при цьому можуть виконувати дві функції: 1) створювати необхідне середовище; 2) діяти як аллостеріческій регулятор, модулирующий активність ферменту. У першому випадку ліпіди не тільки запобігають денатурацію ферментів один з одним і з іншими мембранозв'язаних компонентами, зокрема з ліпофільними субстратами. Як аллостеріческій ефекторів ліпіди зазвичай активують фермент переважно шляхом стабілізації його в певній стабілізації. В ідеальній експериментальній системі аллостеріческій ефекторів повинен бути специфічний ліпід, а необхідна для роботи оточення ферменту має створюватися всій основною масою ліпідів у бішарі. На жаль, поки виявлений тільки один приклад абсолютної специфічності ферменту до визначення ліпідів. β-Гидроксибутиратдегидрогеназе для здійснення каталітичної активності необхідний саме фосфатидилхолін, а в більшості випадків ферменти досить ефективно активуються різними ліпідами. На ферментативну активність може впливати також фізичний стан бішару, зокрема поверхнева щільність заряду і в'язкість. Зміна фізичного стану бішару може впливати на взаємодію з ферментом будь-яких ліпідів, в тому числі і тих, які функціонують як аллостеріческій ефектори.
Для дослідження впливу ліпідів на мембранні ферменти застосовується метод змішаних міцел. Фермент розчиняють в детергенти, не активує його, і до суміші додають ліпіди. Багато мембранні ферменти зберігають певну активність і в детергенти, причому така активність сильно залежить не тільки від природи ферменту, але і від вибраного детергенту, а також, можливо, від наявності ендогенних ліпідів у препараті очищеного ферменту. Для методу змішаних міцел бажано повністю звільнити фермент від ліпіду. Методи повного знежирення звичайно засновані на пропущенні препарату ферменту через середовище з великим надлишком детергенту. Для цього використовують гель-фільтрацію, центрифугування в градієнті щільності сахарози або зв'язування ферменту з яким-небудь твердим носієм (наприклад, ДЕАЕ-сефароза) з подальшим промиванням надлишком детергенту.
Метод змішаних міцел має ще й ту перевагу, що ліпофільний субстрат можна додати в міцелах того ж детергенту, хоча в цьому випадку можуть виникнути труднощі, пов'язані з просторовим поділом ферменту і субстрату. На жаль, фізичний стан комплексу фермент-детергент-фосфолипид визначити практично неможливо, і це серйозний недолік описуваного підходу.
Результати дослідження багатьох систем дозволяють зробити кілька загальних висновків.
1. Для активації ферменту дуже рідко буває необхідний ліпід з якоюсь суворо певною структурою. Одні ліпіди активують цей фермент з більшою ефективністю, ніж інші, однак така перевага може залежати від умов вимірювання. Може виявитися, що ліпід, з високою ефективністю активує фермент, взагалі не є присутнім у мембрані, з якої цей фермент виділено.
2. Вимірюється в системі зі змішаними мицеллами залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації ліпіду зазвичай свідчить про високу кооперативності процесу. Таку поведінку можна пояснити, зокрема, тим, що ліпіди зв'язуються некооперативна з кількома еквівалентними центрами на ферменті, але активними є лише ті молекули ферменту, у яких зайнята велика частина ліпідсвязивающіх центрів.
3. Сама по собі біслойную структура не є необхідною для активації ферментів, оскільки багато ферментів виявляють активність у присутності детергенту або в складі ліпідно-детергентних міцел.
4. Важливим параметром, що визначає активність більшості мембранних ферментів, безумовно, є фізичний стан бішару. При переході ліпідів у фазу гелю багато ферментів стають неактивними або їх активність різко зменшується. Виявити зв'язок ферментативної активності з в'язкістю мембрани, виходячи з температурної залежності, дуже непросто, оскільки температура впливає одночасно на дуже багато параметрів. Слід мати на увазі, що в'язкість мембрани в значній мірі корелює з щільністю упаковки молекул ліпіду в бішарі індуковані температурою зміни в'язкості можна пояснити в основному змінами в щільності упаковки. Ліпіди можуть сильно впливати не тільки на максимальну швидкість, але і на зв'язування ферменту із субстратами і кофакторами.
5. Взагалі кажучи, при дослідженні взаємодії з певним ферментом великого числа різних ліпідів кореляції між активністю ферменту і яким-небудь одним параметром (наприклад, в'язкістю) не спостерігається. Поки ліпід знаходиться в рідкокристалічному стані, для ферментативної активності часто більш важлива структура полярної головки ліпіду, ніж в'язкість бішару. Іншими словами, важлива хімічна структура індивідуальних ліпідів.

Висновок
Мембранні ферменти в складі бішару набувають більшу стабільність і здатність до здійснення реакцій, які в гідрофільному оточенні протікали б з дуже малою швидкістю. Ліпідне оточення надає таким білкам «привілейовані» умови функціонування, але і накладають обмеження на поведінку білкових асоціатів: останнє сильно залежить від щільності упаковки мембран. Інтерпретувати дані по впливу ліпідів на активність ізольованих мембранних ферментів часто дуже непросто. Вивчення очищених мембранних білків ставить перед дослідником величезна безліч абсолютно особливих проблем, які не зустрічаються при роботі з розчинними ферментами.

Література
1. Р. Генніс. Біомембрани .- Москва: «Світ», 1997. - 624с.
2. С.В. Грінштейн, О.А. Кост. Структурно-функціональні особливості мембранних білків. - Львів: ЛДУ, 104с.
3. С.Є. Северин, Г.А. Соловйова. Практикум з біохімії. - Москва: Вид-во МДУ, 1989. - 509с.
4. Б.Ф. Коровкін, Т.Т. Березів. Біологічна хімія. - Москва: «Медицина», 1998. - 704с.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Курсова
41.9кб. | скачати


Схожі роботи:
Фонон - квант біологічної клітинної мембрани
Біологічні мембрани
Ферменти
Ферменти 3
Транспорт речовин через біологічні мембрани
Каталізатори і ферменти
Білки і ферменти
Іммобілізовані ферменти
Ферменти клінічної діагностики
© Усі права захищені
написати до нас