Тріумф рекомбінантних ДНК
Приблизно до 1970 р. стали відомі основні властивості генетичних систем. Незважаючи на відсутність багатьох важливих деталей, вдалося встановити принципи реплікації, рекомбінації і репарації і кожен з цих процесів був відтворений in vitro. Була сформульована центральна догма, згідно з якою генетична інформація передається від ДНК до РНК і далі до білка, що створило основу для визначення генотипу та фенотипу організму на молекулярному рівні. Був ідентифікований основний посередник при перенесенні інформації від ДНК до білка-інформаційна РНК. Розшифровано генетичний код, і в експериментах з реконструйованими клітинними компонентами в системі in vitro була отримана інформація про клітинному апараті та основні механізми трансляції м-РНК в білок. Підтвердилося припущення про те, що процеси транскрипції ДНК в РНК і трансляції РНК в білок регулюються і що існують позитивний і негативний способи контролю функцій генів. З розшифровкою генетичного коду розв'язався має довгу історію питання про зв'язок між хімічною структурою гена і кодованого їм білка і стало ясно, що мутації є наслідок змін у структурі ДНК. У цей період видатних відкриттів несподіваною нагородою дослідникам стала ідентифікація багатьох ферментів, для яких нуклеїнові кислоти є субстратом. Отримання їх в очищеному вигляді і визначення властивостей значною мірою полегшило аналіз структури і функцій нуклеїнових кислот, а застосування в подальших дослідженнях призвело до створення нової галузі молекулярної біології - технології рекомбінантних ДНК.
Незважаючи на широко поширену думку, що всім генетичним системам властиві одні і ті ж основні властивості, процеси, що відбуваються в клітинах прокаріот, вивчені значно глибше, ніж процеси, що протікають в еукаріотичних організмах. Дійсно, провести генетичний аналіз невеликих за розміром і менш складно організованих бактеріальних геномів значно простіше, ніж геномів еукаріотів. Порівняно легко вдалося індукувати і ідентифікувати мутаційні зміни у специфічних генах. Випадковий обмін генетичною інформацією між різними бактеріями і деякими бактеріями та їх вірусами полегшив картування цих генів, що в свою чергу дозволило встановити організацію бактеріальних і фагових геномів в цілому. Ще більш важливе значення мало чудове взаємопроникнення генетики та біохімії. Спільне використання генетичних і біохімічних методів сприяло розгадки складного процесу реплікації ДНК і навіть дозволило здійснити повноцінну реплікацію in vitro вірусних геномів. Завдяки об'єднанню цих методів вдалося отримати окремі гени в ізольованому вигляді, що підготувало грунт для вивчення транскрипції і трансляції генів in vitro та ідентифікації молекулярних продуктів, що беруть участь в цих процесах. За допомогою того ж двостороннього підходу був встановлений механізм регуляції експресії генів: було показано, що контроль здійснюється головним чином шляхом взаємодії між специфічними білками і відповідними регуляторними послідовностями в ДНК чи інформаційної РНК.
У той же час успіхи в розшифровці молекулярної структури, організації та функцій еукаріотичного геному були дуже скромними. Складні генетичні карти локусів, що містять мутації, вдалося скласти лише для тих небагатьох еукаріотичних організмів, з чиїми генетичними системами можна було проводити маніпуляції. У порівнянні з ними генетичні карти ссавців, зокрема миші і людини, представлялися суцільними «білими плямами». Ще більш загадковими були молекулярна структура еукаріотичних генів і їх організація в хромосомних ДНК, зокрема наявність множинних повторів деяких сегментів ДНК у більшості еукаріотів. Без більш повного вивчення молекулярної структури геномів еукаріотів подальший прогрес у цій області був неможливий.
Біохімічні дослідження експресії і регуляції еукаріотичних генів також зайшли в глухий кут через відсутність інформації про структуру клітинних генів. Було ясно, що ядерна ДНК еукаріотів транскрибується в РНК і що мРНК транслюється в білки за допомогою цитоплазматичних комплексів рибосома-тРНК, багато в чому нагадують прокаріотів. Однак механізм транскрипції і подальша доля транскриптів залишалися абсолютно загадковими. У багатьох еукаріот тільки невелика фракція ядерної РНК переходить в цитоплазму у вигляді інформаційної, рибосомной і транспортної РНК. Деякі молекули існують в стабільній формі у вигляді коротких ланцюгів РНК у складі рібонуклеопротеі-нових частинок, проте більшість з них швидко деградує, не залишаючи ядра. Питання про природу швидко розпадається РНК, її походження і функції постійно дебатувати. Проблема біогенезу інформаційної РНК також залишалася невирішеною через відмінності між мРНК про-і еукаріотів. В останніх на початку і в кінці молекул є особливі структури-так звані кепи і ро1у-хвости відповідно. Це вказувало на те, що інформаційна РНК еукаріот у процесі біогенезу піддається Посттранскрипційна модифікаціям. Чому, де і як відбуваються такі модифікації? Яке їхнє значення? Який шлях перетворення первинних транскриптів ДНК в зрілі молекули інформаційної РНК? Далі, як здійснюється контроль транскрипції і перетворень РНК, утворених на різних генах, в різних типах клітин одного і того ж організму? Чим різняться механізми експресії і регуляції генів у про-і еукаріотів? Через відсутність молекулярно-генетичної інформації і методології для її отримання ці питання першорядної важливості залишалися невирішеними.
На тлі появи все нових даних про організацію і експресії генетичної інформації у прокаріотів відсутність таких даних для еукаріот ставало все більш відчутним. Для подолання такого відставання потрібна була загальна методологія дослідження клітинних геномів еукаріотів на молекулярному рівні. В ідеалі це дозволило б виділити дискретні гени і визначити їх молекулярну структуру та організацію геномів. При наявності таких ізольованих генетичних елементів можна було б потім встановити біохімічні основи механізмів транскрипції і трансляції. Об'єктивні передумови до цього з'явилися лише в першій половині 70-х років, коли була розроблена технологія отримання рекомбінантних молекул ДНК. Перш ніж обговорювати ці досягнення, ми розглянемо концепції та методологію, які підготували грунт для вирішальних експериментів. Вони ведуть початок від експериментів у сфері бактеріальної генетики, і особливо велику роль тут зіграла можливість введення молекул ДНК в клітини бактерій. Така введена ДНК незалежно від того, чи відбулася вона з бактеріофага або з інших бактеріальних клітин, змінює генотип, а нерідко і фенотип реципієнтного клітини. Гени донорной ДНК здатні експресуватися і можуть рекомбінувати з хромосомної ДНК.
Введення нової генетичної інформації в клітини бактерій
Бактерії можуть набувати новий генетичний матеріал кількома способами. Це: 1) трансформація, при якій в клітини проникають молекули ДНК, додані у культуральне середовище;
2) кон'югація, в процесі якої ДНК безпосередньо переноситься від однієї клітини до іншої;
3) опосередковувані бактеріофагами трансдукція, при якій нова генетична інформація вводиться в клітку з часткою бактеріофага. Незалежно від способу попадання в реципієнтного клітку донорно ДНК рекомбінує з гомологічними ділянками або специфічними сайтами в геномі реципієнтного організму або зберігається у вигляді автономної міні-хромосоми, змінюючи таким чином генотип господаря.
Трансформація бактерій
Трансформація, тобто зміна генотипу клітини шляхом внесення до неї молекул ДНК з культурального середовища, була першим із способів введення нових генів в клітини бактерій. Це послужило також першим доказом ролі ДНК як носія генетичної інформації. Якщо в клітини організму з певним генетичним порушенням ввести ДНК, виділену з нормальних клітин, то у цього організму нерідко відновлюються втрачені функції. Така трансформація є звичайно спадкової і стабільною, оскільки в її основі лежить рекомбінація між функціональним геном донорной ДНК і дефектним геном реципієнта. Однак здійснювана за допомогою ДНК трансформація виявилася корисною лише при вивченні молекулярної генетики прокаріотів. В інших випадках можливості трансформації обмежувалися труднощами виявлення трансформуючого гена, що робило нереальним визначення його структури. Проте принцип трансформації знайшов застосування в іншій області. Наприклад, отримання трансформованих клітин є важливим етапом у багатьох експериментах з рекомбінантними молекулами ДНК. Термін «трансформація» використовується в молекулярній біології еукаріот для позначення стабільного зміни генотипу та фенотипу клітини.
Кон'югація
При зв'язуванні здійснюється пряме перенесення ДНК з однієї клітини в іншу при їх контактування. У тих випадках, коли кон'югація відбувається між певними штамами E. coli, один з них виконує функції донора, інший - реципієнта. Ці експерименти вперше показали, що всі гени Є. coli розташовані на одній кільцевої молекулі ДНК. Порівнюючи час, необхідний для перенесення різних генів під час кон'югації, можна побудувати генетичну карту хромосоми Є. coli, тобто встановити порядок проходження хромосомних генів.
Трансдукція
Охарактеризовано два типи трансдукції, що здійснюється за допомогою бактеріофагів, загальна і специфічна. При загальній трансдукції фагових частки, що містять сегменти ДНК клітини-господаря, переносять щодо протяжні ділянки геномної ДНК від однієї бактеріальної клітини до іншої. Трансдуцірующіе фагових частки утворяться в ході певних інфекційних процесів, коли ДНК клітини ефективно деградує і фрагменти, за розміром приблизно відповідні фагового геному, випадково упаковуються в зрілі частки бактеріофага. У результаті подальшого інфікування клітин бактерій популяцією фагових частинок, що містить трансдуцірующіе фаги, відбувається передача ДНК донорних клітин цим інфіковані клітинам. Рекомбінація між введеними фрагментами донорной ДНК і ДНК клітини-реципієнта призводить до зміни генотипу останньої. Кожна трансдуцірующая фагів частка зазвичай містить тільки один випадковий фрагмент вихідної донорной хромосоми. Імовірність включення в таку частку будь-якій частині цього геному приблизно однакова. Однак завдяки досить великому розміру трансдуці-ються сегментів ДНК зазвичай реципієнтного клітина набуває за один акт трансдукції цілу групу генів. У результаті гени, тісно зчеплені один з одним у хромосомі донора, з високою частотою котрансдуціруются, тоді як гени, віддалені один від одного, трансдуціруются незалежно. Визначення частоти котрансдукціі генів допомагає уточнити генетичні карти, дозволяючи оцінити відносні відстані між тісно зчепленими генами.
Трансдукція другого типу, специфічна, властива бактериофагам, інфекційний цикл яких переривається внаслідок включення геному вірусу в специфічний хромосомний локус ДНК інфікованої клітини. Бактерії, що містять такі інтегровані фагових геноми, отримали назву лізогенним. Вони несуть вірусні геноми як спадкові елементи у своїх власних хромосомах. У лизогенной клітці вірусні і клітинні геноми реплицируются як єдине ціле і є взаємно сумісними. Інтеграція фагового геному з геномом клітини-господаря позбавляє фаг можливості викликати загибель клітини і продукувати інфекційне потомство. З цієї причини бактеріофаг, здатний лізогенізіровать, на відміну від вірулентного фага отримав назву помірного. За певних умов - індукції - лизогенной стан переривається і вірусний геном вирізається з хромосоми клітини-господаря. Він реплікується, утворює безліч вірусних часток і вбиває клітину. Зазвичай вирізання вірусного геному відбувається дуже точно, і утворений фаг містить вірусний геном, повністю відповідний вихідному. Іноді, однак, фагової геном вирізається неправильно і в дочірні фагових геноми включаються хромосомні гени, прилеглі до інтегрованого вірусному геному. Ці гени включаються замість деяких вірусних генів. Під час наступного циклу інфекції гени клітини-донора переходять разом з фагових генами в реципієнтного клітини. Після включення ДНК трансдуцірующего фага в геном реципієнта клітина набуває поряд з фагових генами генетичну інформацію попереднього господаря фага. Таким чином, за допомогою специфічної трансдукції фаг служить вектором для переносу генів з однієї клітини в іншу. За допомогою цього механізму трансдуціруются тільки ті хромосомні гени клітини-господаря, які тісно зчеплені з сайтом інтеграції вірусного геному.
Оскільки різні помірні фаги вбудовуються в різні хромосомні сайти, при їх неправильному вирізання утворюються фаги, які трансдуціруют різні хромосомні гени. Так, фаги X трансдуціруют гени, відповідальні за метаболізм галактози, або гени, які контролюють синтез біотину, а фаги ф80 - різне число генів, що кодують ферменти біосинтезу триптофану. Були розроблені певні генетичні прийоми, що сприяють придбанню цими та іншими фагами різних генів E. coli або генів споріднених організмів. Та ж стратегія з невеликими модифікаціями дозволяє отримати трансдуцірующіе фаги, що містять мутантні бактеріальні гени. Такі трансдуцірующіе фаги легко ідентифікувати, розмножити і очистити, що дозволяє отримувати значні кількості алелів дикого або мутантного генів Є. coli в високоочищеним вигляді.
Збагачення бактеріальними генами, що супроводжує їх включення в геном трансдуцірующіх фагів, має важливі наслідки. Розглянемо, наприклад, ген Є. coli, що кодує фермент у-га-лактозідазу. Цей білок складається з ідентичних поліпептидних ланцюгів довжиною 1173 амінокислотних залишку; отже, ген, що кодує цей поліпептид, містить близько 3600 пар нуклеотидів. Ген по-галактозидази становить одну тисячну геному E. coli, але в геномі трансдуцірующего вірусу X lac він займає 1 / 15 частину. Таким чином, ДНК фага X lac збагачена по-галактозидазної геном приблизно в 100 разів більше, ніж ДНК E. coli. Це спрощує виділення в-галактозидазної гена і дозволяє ідентифікувати його регуляторні ділянки і визначити їх нуклеотидну послідовність. Подібним же чином з отриманням трансдуцірующіх фагів ф80 trp вдалося виділити і охарактеризувати гени та регуляторні послідовності, які утворюють триптофанового оперон. Крім того, завдяки трансдукції з'явилася можливість вивчати вплив різних мутаційних змін на експресію і регуляцію генів in vivo.
Розглянемо ті властивості фагового геному, які відповідальні за його здатність до специфічної трансдукції. По-перше, геном повинен бути здатний реплицироваться після того, як сталася інфекція. По-друге, він повинен придбати ковалентно зчеплений сегмент невірусной ДНК, який буде трансдуціроваться. Цей сегмент ДНК зазвичай має клітинне походження, але в принципі він може бути з будь-якого джерела. Він може включитися в будь-яке місце вірусного генома, якщо це не впливає на реплікацію вірусної ДНК в інфікуванні клітині хазяїна або на її здатність упаковуватися в зрілі фаговой частки. Будучи складовою частиною фагового геному, транс-дуціруемий сегмент ДНК реплікується разом
з вірусною ДНК. По-третє, гени, що кодують структурні фагових білки, повинні бути функціонально активними або їх роль повинен виконувати коінфіцірующій фаг або клітка-хазяїн. І нарешті, якщо ми хочемо використовувати трансдукція, нам потрібно знайти спосіб поділу різних типів вірусних геномів та ідентифікації, яка нас цікавить геному, оскільки трансдуціру ющіе віруси часто інфікують клітину спільно з вірусом дикого типу. Зазвичай для такого поділу використовують клонування.
Принципи клонування
Щоб зрозуміти, як використовувалися концепції трансдукції при розробці методів отримання рекомбінантних ДНК, нам слід ознайомитися з тим, що являє собою клонування. Клон вірусу або клітин-це якась популяція, кожен член якої веде походження від одного репродукується вириона або від однієї клітини відповідно. Всі члени клону незалежно від того, чи є вони вірусами або клітинами, по суті ідентичні вірусу або клітці, які дали
початок клону; вони також ідентичні один одному. При клонуванні вірусів необхідно, щоб вірусне потомство з однієї клітини, інфікованої однією вірусною часткою, розмножувалося протягом багатьох циклів інфекції, не змішуючись з потомством з інших інфікованих клітин. Такі вірусні клони утворюють прозорі зони на монослое неінфікованих клітин. Клонування клітин можна здійснити тільки в тому випадку, якщо клітини при розмноженні залишаються ізольованими один від одного. Клони бактеріальних клітин або клітин ссавців легко утворюються при розрідженому посіві їх на чашці таким чином, що вони утворюють окремі колонії.
За допомогою клонування отримують чистий препарат одного генома, оскільки всі члени клону містять ідентичні ДНК. Ця концепція молекулярного клонування використовується і при отриманні чистих препаратів певних молекул рекомбінантних ДНК.
Концепція рекомбінантної ДНК
Методологія отримання рекомбінантних ДНК заснована на тих же принципах, що і трансдукція.
Молекули ДНК, здатні реплицироваться у відповідних клітинах, представлені вірусними геномами або плазмідами, служать переносниками, або векторами, «чужорідних» сегментів ДНК, що одержали назву вставки. При цьому, замість того, щоб покладатися на клітинні процеси, що ведуть до утворення рекомбінантних трансдуцірующіх геномів, проводять об'єднання, або рекомбінацію, відповідним чином модифікованих вставок і векторів in vitro за допомогою ферменту ДНК-лігази. Такі рекомбінантні ДНК вводять потім у відповідні клітини, де вони амплифицируют в результаті реплікації.
Величезні потенційні можливості цієї методології обумовлені не тільки тим, що з її допомогою можна конструювати і реплікувати рекомбіновану ДНК, але і тим, що вона дозволяє клонувати окремі рекомбінантні молекули ДНК. Розглянемо, наприклад, що виходить в результаті об'єднання суміші випадкових сегментів ДНК будь-якого організму з векторною ДНК. Асортимент всіх можливих рекомбінантів надзвичайно різноманітний, кожен рекомбінантів містить якийсь певний сегмент
початкової ДНК. Однак при клонуванні рекомбінантних ДНК з утворенням окремих вірусних бляшок в кожній вірусної частинки з даної бляшки міститься унікальна рекомбінантна ДНК, що складається з векторної ДНК і одного з сегментів вихідного геному. Таким чином, технологія рекомбінантних ДНК дозволяє виділяти окремі сегменти ДНК з надзвичайно складної суміші сегментів, що походять з клітинного або вірусного геному.
У результаті перенесення якогось гена Є. coli з бактеріального генома у геном трансдуцірующего фага можна отримати приблизно 100-кратне збагачення з цього гену. У порівнянні з тим рівнем збагачення, якого вдається досягти шляхом молекулярного клонування сегментів ДНК складних організмів, таке збагачення є незначним. Наприклад, ген ссавців довжиною 5 т. основ становить лише одну мільйонну частину всього геному і приблизно одну десяту частину рекомбінантного генома фага X. Таким чином, молекулярне клонування дозволяє розщеплювати навіть найбільші і самі складно організовані геноми і отримувати окремі сегменти, що містять один або декілька генів в чистому вигляді. Таке відносно просте застосування принципів і методів, розроблених
Важливі відкриття
Як це часто буває при розвитку науки, методології рекомбінантних ДНК прокладали шлях багато відкриттів, що здавалися раніше незначними і не мають відношення до справи. Одним з таких відкриттів була трансдукція. Інші пов'язані з виділенням та вивченням властивостей бактеріальних плазмід і рестріктірующіх ендонуклеаз.
Бактеріальні плазміди
Одним з несподіваних наслідків використання антибіотиків для лікування інфекційних захворювань була поява стійких штамів патогенних мікроорганізмів. Це дуже важлива проблема вимагала свого рішення і стимулювала інтенсивні дослідження. Незабаром стало ясно, що стійкість до лікарських препаратів являє собою відносно стабільний генетична ознака, який може бути переданий чутливим бактерійних кліток способом, що нагадує інфекційний процес. Пізніше було встановлено, що поширення резистентності до антибіотиків відбувається при контактуванні клітин один з одним. Було показано, що резистентні до антибіотиків клітини містять генетичні елементи - плазміди, не пов'язані з хромосомною ДНК, здатні реплицироваться незалежно від хромосоми і передаватися від клітини до клітини при їх контактування. Саме такі позахромосомних елементи і містять гени, які надають клітинам наслідувану стійкість до одного або декількох антибіотиків. Вони отримали назву факторів резистентності, або R-факторів.
Механізм розповсюдження R-факторів став більш зрозумілий після того, як було встановлено спосіб перенесення генетичної інформації від однієї клітини до іншої під час кон'югації бактерій. Перенесення генетичного матеріалу здійснюється завдяки здатності донорних клітин реплікувати і переносити свою геномної ДНК через кон'югаційні місток в Клек реципієнта. Штами Е. coli, що є донорами, містять у складі свого геному ДНК плазмідної походження, названу чинником фертильності, або F-фактором. Такі донорні хромосоми утворюються після придбання клітинами F-фактора і рекомбінації між цією плазми-мідой і хромосомою клітини. У присутності інтегрованого F-фактора полегшуються кон'югація і перенесення хромосоми. Перенесення ініціюється в сайті інтеграції F-фактора. Завдяки здатності плазміди вбудовуватися в ДНК у багатьох сайтах різні штами ініціюють перенесення в різних сайтах хромосоми E. coli. У деяких випадках F-фактор залишається в клітинах у вигляді незалежного позахромосомних елемента - F-плазміди. Такі клітини, що позначаються F +, переносять плазміду F в реципієнтного клітини таким же способом, як у випадку перенесення R-факторів.
R-і F-фактори являють собою ковалентно замкнуті кільцеві молекули дволанцюжкової ДНК. Обидва вони містять гени, що забезпечують їх реплікацію у вигляді автономних плазмід та їх перенесення при контакті з відповідними реципієнтами. R-фактори несуть також гени резистентності до антибіотиків. Одні такі гени змінюють реакцію клітини на антибіотик, інші індукують утворення білків, які викликають деградацію або модифікацію певних антибіотиків. Наприклад, одна з R-плазмід кодує по-лактамазу, що забезпечує стійкість до ампіциліну завдяки деградації цього антибіотика. Стійкість до хлорамфеніколу обумовлюється ацетилюванням цього антибіотика. Ацетилювання каталізується ферментом хлорамфенікол-ацетілтранс-феразим, кодуються плазмидой.
Плазмідні ДНК легко виділити у великих кількостях і отримати в очищеному вигляді, що дозволяє досліджувати їх потенційну здатність служити векторами для введення в клітини нових сегментів ДНК. З'єднання плазмідної ДНК з відповідним чином модифікованими вставками можна здійснити in vitro аналогічно тому, як це відбувається у випадку з'єднання вставок з фагових векторами. У цих експериментах велику роль зіграв досвід здійснення трансформації клітин за допомогою ДНК. Були розроблені методи включення очищеної плазмідної ДНК в клітини відповідних бактерій-господарів. Завдяки наявності в таких плазмідах генів резистентності до антибіотиків можна провести відбір клітин, що містять R-плазміди в якості стабільно реплікується структури. Такі клітини живуть і діляться у присутності антибіотика, а клітини, що втратили цю плазміду, гинуть. Рекомбінантні плазмідні ДНК зберігаються у присутності антибіотика як якісь автономно реплицируются геноми під час наступних клітинних поділів. При клонуванні утворюються колонії клітин, що містять унікальну рекомбіновану ДНК, тому що кожна клітина господаря містить тільки одну плазміду. Оскільки розмір багатьох плазмідних векторів не перевищує кількох тисяч пар нуклеотидів, збагачення за сегментами еукаріотичної ДНК в цьому випадку виявляється більш високим, ніж при використанні фагових векторів. Саме плазміди виявилися першими векторами, за допомогою яких було здійснено молекулярне клонування в клітинах бактерій.
Рестріктірующіе ендонуклеази
Одним з найбільш важливих результатів генетичного вивчення бактерій і їх бактеріофагів було відкриття рестріктірующіх ендонуклеаз - ферментів, які дізнаються специфічні короткі нуклеотидні послідовності і розрізають обидві ланцюга подвійної спіралі ДНК в сайті впізнавання або на деякій відстані від нього. У відкритті цих ферментів ключову роль зіграло спостереження, зроблене приблизно 30 років тому. Воно полягало в тому, що бактеріофаг, вирощений в клітинах одного штаму, інфікуючи клітини інших штамів цього ж виду, часто росте дуже погано. Більше того, виділені після такої неефективної інфекції бактеріофаги у свою чергу погано розвиваються у вихідних клітинах. Цей феномен не пов'язаний з генотипом фага і була пояснена тим, що в Фаге відбуваються якісь модифікації, контрольовані господарем. Було висловлено припущення, що якийсь фагової компонент, необхідний для реплікації, специфічним чином модифікується в клітинах господаря, так що фаг може завершити реплікацію при повторному інфікуванні того ж штаму. При цьому його зростання в неспорідненій штамі обмежується, оскільки останній не містить відповідного системи модифікації.
Було доведено, що модифікуються фагових компонентом є ДНК, а нездатність фага реплицироваться в неспорідненій штамі обумовлена деградацією інфікуючої фагової ДНК. Розщеплення ДНК ініціюється внесенням декількох розривів у високоспецифічних сайтах, після чого відбувається повна неспецифічна деградація. Модифікацією, що захищає деякі інфікують фагових ДНК, а також геном клітини від розривів, є штам-специфічне метилювання ДНК. За допомогою генетичних і біохімічних досліджень встановлено, що метилювання ДНК відбувається в строго специфічних ділянках. Рестрикція здійснюється ендонуклеаза, які дізнаються аналогічні короткі специфічні послідовності, позбавлені метильних груп. Системи модифікації і рестрикції завжди відповідають один одному, тобто метилювання і розрізування відбуваються в одних і тих же послідовності ДНК. У кожній системі в якості мішеней для штам-специфічних систем рестрикції-модифікації використовуються свої короткі послідовності ДНК. Метильованих ДНК не розрізається по цій послідовності спорідненої рестріктірующей ендонук-леазой. Аналогічно рестріктірующіе ендонуклеази розрізають тільки ті ДНК, у яких не модифіковані відповідні сайти рестрикції. Регуляція системи рестрикції і модифікації здійснюється за допомогою родинних наборів генів, і такі парні системи є в багатьох видів бактерій, бактеріофагів і плазмід.
При аналізі генетичної та фізичної організації складних геномів особливо важливими виявляються дві властивості рестріктірующіх ендонук-леаз. Перша пов'язана з величезним діапазоном спеці-фічностей, які проявляються в сукупності різними рестріктірующімі ендонуклеаза, що дозволяє розрізати практично будь-яку ДНК на дискретні фрагменти самими різними способами. Ці фрагменти можна розділити за розмірами за допомогою гель-електрофорезу. Розподіл фрагменов за розмірами, що виходить при розщепленні даної ендонуклеазною ДНК у специфічних сайтах, є свого роду «відбитком пальців», характерним для цієї ДНК. Друга властивість ендонуклеаз рестрикції пов'язано зі здатністю багатьох з них здійснювати несиметричні розрізи дволанцюжкової ДНК, у результаті чого утворюються фрагменти з комплементарними одноланцюжковий кінцями. Це дозволяє проводити рекомбінацію ДНК in vitro. Будь-які два сегменти ДНК зі взаємодоповнюючими кінцями можуть об'єднатися, у результаті чого відбувається вбудовування фрагментів у фагів, плазмідну ДНК або інші потенційні вектори. Такі специфічні комбінації «вектор-вставка» можна отримати у чистому вигляді шляхом молекулярного клонування і ампліфікації у відповідних хазяйських клітинах.
Розвиток методології рекомбінантного ДНК і молекулярного клонування саме по собі призвело до створення нових областей біологічних досліджень. Однак повна реалізація цих нових можливостей залежала від інших проводяться одночасно розробок: розвитку методів фракціонування, які дозволяли б розділяти фрагменти ДНК, лише незначно розрізняються за довжиною; створення відносно простих і швидких процедур секвенування ДНК довжиною кілька тисяч нуклеотидів; отримання специфічно модифікованих генів шляхом внесення мутацій в їх клоновані копії in vitro; генетичної трансформації клітин, тканин і всього організму шляхом введення клонованих генів до відповідних систем.
Часто звертається увага на ранні результати, завдяки яким було розроблено той чи інший метод. Вчені, які отримали ці результати, не могли передбачити, як вони позначаться на розвитку технології рекомбінантних ДНК. Тепер ми знаємо, що саме успіхи в молекулярній генетиці прокаріотів і у вивченні ферментів, що здійснюють синтез і деградацію нуклеїнових кислот, відкрили шлях до дослідження еукаріотичних геномів.
Приблизно до 1970 р. стали відомі основні властивості генетичних систем. Незважаючи на відсутність багатьох важливих деталей, вдалося встановити принципи реплікації, рекомбінації і репарації і кожен з цих процесів був відтворений in vitro. Була сформульована центральна догма, згідно з якою генетична інформація передається від ДНК до РНК і далі до білка, що створило основу для визначення генотипу та фенотипу організму на молекулярному рівні. Був ідентифікований основний посередник при перенесенні інформації від ДНК до білка-інформаційна РНК. Розшифровано генетичний код, і в експериментах з реконструйованими клітинними компонентами в системі in vitro була отримана інформація про клітинному апараті та основні механізми трансляції м-РНК в білок. Підтвердилося припущення про те, що процеси транскрипції ДНК в РНК і трансляції РНК в білок регулюються і що існують позитивний і негативний способи контролю функцій генів. З розшифровкою генетичного коду розв'язався має довгу історію питання про зв'язок між хімічною структурою гена і кодованого їм білка і стало ясно, що мутації є наслідок змін у структурі ДНК. У цей період видатних відкриттів несподіваною нагородою дослідникам стала ідентифікація багатьох ферментів, для яких нуклеїнові кислоти є субстратом. Отримання їх в очищеному вигляді і визначення властивостей значною мірою полегшило аналіз структури і функцій нуклеїнових кислот, а застосування в подальших дослідженнях призвело до створення нової галузі молекулярної біології - технології рекомбінантних ДНК.
Незважаючи на широко поширену думку, що всім генетичним системам властиві одні і ті ж основні властивості, процеси, що відбуваються в клітинах прокаріот, вивчені значно глибше, ніж процеси, що протікають в еукаріотичних організмах. Дійсно, провести генетичний аналіз невеликих за розміром і менш складно організованих бактеріальних геномів значно простіше, ніж геномів еукаріотів. Порівняно легко вдалося індукувати і ідентифікувати мутаційні зміни у специфічних генах. Випадковий обмін генетичною інформацією між різними бактеріями і деякими бактеріями та їх вірусами полегшив картування цих генів, що в свою чергу дозволило встановити організацію бактеріальних і фагових геномів в цілому. Ще більш важливе значення мало чудове взаємопроникнення генетики та біохімії. Спільне використання генетичних і біохімічних методів сприяло розгадки складного процесу реплікації ДНК і навіть дозволило здійснити повноцінну реплікацію in vitro вірусних геномів. Завдяки об'єднанню цих методів вдалося отримати окремі гени в ізольованому вигляді, що підготувало грунт для вивчення транскрипції і трансляції генів in vitro та ідентифікації молекулярних продуктів, що беруть участь в цих процесах. За допомогою того ж двостороннього підходу був встановлений механізм регуляції експресії генів: було показано, що контроль здійснюється головним чином шляхом взаємодії між специфічними білками і відповідними регуляторними послідовностями в ДНК чи інформаційної РНК.
У той же час успіхи в розшифровці молекулярної структури, організації та функцій еукаріотичного геному були дуже скромними. Складні генетичні карти локусів, що містять мутації, вдалося скласти лише для тих небагатьох еукаріотичних організмів, з чиїми генетичними системами можна було проводити маніпуляції. У порівнянні з ними генетичні карти ссавців, зокрема миші і людини, представлялися суцільними «білими плямами». Ще більш загадковими були молекулярна структура еукаріотичних генів і їх організація в хромосомних ДНК, зокрема наявність множинних повторів деяких сегментів ДНК у більшості еукаріотів. Без більш повного вивчення молекулярної структури геномів еукаріотів подальший прогрес у цій області був неможливий.
Біохімічні дослідження експресії і регуляції еукаріотичних генів також зайшли в глухий кут через відсутність інформації про структуру клітинних генів. Було ясно, що ядерна ДНК еукаріотів транскрибується в РНК і що мРНК транслюється в білки за допомогою цитоплазматичних комплексів рибосома-тРНК, багато в чому нагадують прокаріотів. Однак механізм транскрипції і подальша доля транскриптів залишалися абсолютно загадковими. У багатьох еукаріот тільки невелика фракція ядерної РНК переходить в цитоплазму у вигляді інформаційної, рибосомной і транспортної РНК. Деякі молекули існують в стабільній формі у вигляді коротких ланцюгів РНК у складі рібонуклеопротеі-нових частинок, проте більшість з них швидко деградує, не залишаючи ядра. Питання про природу швидко розпадається РНК, її походження і функції постійно дебатувати. Проблема біогенезу інформаційної РНК також залишалася невирішеною через відмінності між мРНК про-і еукаріотів. В останніх на початку і в кінці молекул є особливі структури-так звані кепи і ро1у-хвости відповідно. Це вказувало на те, що інформаційна РНК еукаріот у процесі біогенезу піддається Посттранскрипційна модифікаціям. Чому, де і як відбуваються такі модифікації? Яке їхнє значення? Який шлях перетворення первинних транскриптів ДНК в зрілі молекули інформаційної РНК? Далі, як здійснюється контроль транскрипції і перетворень РНК, утворених на різних генах, в різних типах клітин одного і того ж організму? Чим різняться механізми експресії і регуляції генів у про-і еукаріотів? Через відсутність молекулярно-генетичної інформації і методології для її отримання ці питання першорядної важливості залишалися невирішеними.
На тлі появи все нових даних про організацію і експресії генетичної інформації у прокаріотів відсутність таких даних для еукаріот ставало все більш відчутним. Для подолання такого відставання потрібна була загальна методологія дослідження клітинних геномів еукаріотів на молекулярному рівні. В ідеалі це дозволило б виділити дискретні гени і визначити їх молекулярну структуру та організацію геномів. При наявності таких ізольованих генетичних елементів можна було б потім встановити біохімічні основи механізмів транскрипції і трансляції. Об'єктивні передумови до цього з'явилися лише в першій половині 70-х років, коли була розроблена технологія отримання рекомбінантних молекул ДНК. Перш ніж обговорювати ці досягнення, ми розглянемо концепції та методологію, які підготували грунт для вирішальних експериментів. Вони ведуть початок від експериментів у сфері бактеріальної генетики, і особливо велику роль тут зіграла можливість введення молекул ДНК в клітини бактерій. Така введена ДНК незалежно від того, чи відбулася вона з бактеріофага або з інших бактеріальних клітин, змінює генотип, а нерідко і фенотип реципієнтного клітини. Гени донорной ДНК здатні експресуватися і можуть рекомбінувати з хромосомної ДНК.
Введення нової генетичної інформації в клітини бактерій
Бактерії можуть набувати новий генетичний матеріал кількома способами. Це: 1) трансформація, при якій в клітини проникають молекули ДНК, додані у культуральне середовище;
2) кон'югація, в процесі якої ДНК безпосередньо переноситься від однієї клітини до іншої;
3) опосередковувані бактеріофагами трансдукція, при якій нова генетична інформація вводиться в клітку з часткою бактеріофага. Незалежно від способу попадання в реципієнтного клітку донорно ДНК рекомбінує з гомологічними ділянками або специфічними сайтами в геномі реципієнтного організму або зберігається у вигляді автономної міні-хромосоми, змінюючи таким чином генотип господаря.
Трансформація бактерій
Трансформація, тобто зміна генотипу клітини шляхом внесення до неї молекул ДНК з культурального середовища, була першим із способів введення нових генів в клітини бактерій. Це послужило також першим доказом ролі ДНК як носія генетичної інформації. Якщо в клітини організму з певним генетичним порушенням ввести ДНК, виділену з нормальних клітин, то у цього організму нерідко відновлюються втрачені функції. Така трансформація є звичайно спадкової і стабільною, оскільки в її основі лежить рекомбінація між функціональним геном донорной ДНК і дефектним геном реципієнта. Однак здійснювана за допомогою ДНК трансформація виявилася корисною лише при вивченні молекулярної генетики прокаріотів. В інших випадках можливості трансформації обмежувалися труднощами виявлення трансформуючого гена, що робило нереальним визначення його структури. Проте принцип трансформації знайшов застосування в іншій області. Наприклад, отримання трансформованих клітин є важливим етапом у багатьох експериментах з рекомбінантними молекулами ДНК. Термін «трансформація» використовується в молекулярній біології еукаріот для позначення стабільного зміни генотипу та фенотипу клітини.
Кон'югація
При зв'язуванні здійснюється пряме перенесення ДНК з однієї клітини в іншу при їх контактування. У тих випадках, коли кон'югація відбувається між певними штамами E. coli, один з них виконує функції донора, інший - реципієнта. Ці експерименти вперше показали, що всі гени Є. coli розташовані на одній кільцевої молекулі ДНК. Порівнюючи час, необхідний для перенесення різних генів під час кон'югації, можна побудувати генетичну карту хромосоми Є. coli, тобто встановити порядок проходження хромосомних генів.
Трансдукція
Охарактеризовано два типи трансдукції, що здійснюється за допомогою бактеріофагів, загальна і специфічна. При загальній трансдукції фагових частки, що містять сегменти ДНК клітини-господаря, переносять щодо протяжні ділянки геномної ДНК від однієї бактеріальної клітини до іншої. Трансдуцірующіе фагових частки утворяться в ході певних інфекційних процесів, коли ДНК клітини ефективно деградує і фрагменти, за розміром приблизно відповідні фагового геному, випадково упаковуються в зрілі частки бактеріофага. У результаті подальшого інфікування клітин бактерій популяцією фагових частинок, що містить трансдуцірующіе фаги, відбувається передача ДНК донорних клітин цим інфіковані клітинам. Рекомбінація між введеними фрагментами донорной ДНК і ДНК клітини-реципієнта призводить до зміни генотипу останньої. Кожна трансдуцірующая фагів частка зазвичай містить тільки один випадковий фрагмент вихідної донорной хромосоми. Імовірність включення в таку частку будь-якій частині цього геному приблизно однакова. Однак завдяки досить великому розміру трансдуці-ються сегментів ДНК зазвичай реципієнтного клітина набуває за один акт трансдукції цілу групу генів. У результаті гени, тісно зчеплені один з одним у хромосомі донора, з високою частотою котрансдуціруются, тоді як гени, віддалені один від одного, трансдуціруются незалежно. Визначення частоти котрансдукціі генів допомагає уточнити генетичні карти, дозволяючи оцінити відносні відстані між тісно зчепленими генами.
Трансдукція другого типу, специфічна, властива бактериофагам, інфекційний цикл яких переривається внаслідок включення геному вірусу в специфічний хромосомний локус ДНК інфікованої клітини. Бактерії, що містять такі інтегровані фагових геноми, отримали назву лізогенним. Вони несуть вірусні геноми як спадкові елементи у своїх власних хромосомах. У лизогенной клітці вірусні і клітинні геноми реплицируются як єдине ціле і є взаємно сумісними. Інтеграція фагового геному з геномом клітини-господаря позбавляє фаг можливості викликати загибель клітини і продукувати інфекційне потомство. З цієї причини бактеріофаг, здатний лізогенізіровать, на відміну від вірулентного фага отримав назву помірного. За певних умов - індукції - лизогенной стан переривається і вірусний геном вирізається з хромосоми клітини-господаря. Він реплікується, утворює безліч вірусних часток і вбиває клітину. Зазвичай вирізання вірусного геному відбувається дуже точно, і утворений фаг містить вірусний геном, повністю відповідний вихідному. Іноді, однак, фагової геном вирізається неправильно і в дочірні фагових геноми включаються хромосомні гени, прилеглі до інтегрованого вірусному геному. Ці гени включаються замість деяких вірусних генів. Під час наступного циклу інфекції гени клітини-донора переходять разом з фагових генами в реципієнтного клітини. Після включення ДНК трансдуцірующего фага в геном реципієнта клітина набуває поряд з фагових генами генетичну інформацію попереднього господаря фага. Таким чином, за допомогою специфічної трансдукції фаг служить вектором для переносу генів з однієї клітини в іншу. За допомогою цього механізму трансдуціруются тільки ті хромосомні гени клітини-господаря, які тісно зчеплені з сайтом інтеграції вірусного геному.
Оскільки різні помірні фаги вбудовуються в різні хромосомні сайти, при їх неправильному вирізання утворюються фаги, які трансдуціруют різні хромосомні гени. Так, фаги X трансдуціруют гени, відповідальні за метаболізм галактози, або гени, які контролюють синтез біотину, а фаги ф80 - різне число генів, що кодують ферменти біосинтезу триптофану. Були розроблені певні генетичні прийоми, що сприяють придбанню цими та іншими фагами різних генів E. coli або генів споріднених організмів. Та ж стратегія з невеликими модифікаціями дозволяє отримати трансдуцірующіе фаги, що містять мутантні бактеріальні гени. Такі трансдуцірующіе фаги легко ідентифікувати, розмножити і очистити, що дозволяє отримувати значні кількості алелів дикого або мутантного генів Є. coli в високоочищеним вигляді.
Збагачення бактеріальними генами, що супроводжує їх включення в геном трансдуцірующіх фагів, має важливі наслідки. Розглянемо, наприклад, ген Є. coli, що кодує фермент у-га-лактозідазу. Цей білок складається з ідентичних поліпептидних ланцюгів довжиною 1173 амінокислотних залишку; отже, ген, що кодує цей поліпептид, містить близько 3600 пар нуклеотидів. Ген по-галактозидази становить одну тисячну геному E. coli, але в геномі трансдуцірующего вірусу X lac він займає 1 / 15 частину. Таким чином, ДНК фага X lac збагачена по-галактозидазної геном приблизно в 100 разів більше, ніж ДНК E. coli. Це спрощує виділення в-галактозидазної гена і дозволяє ідентифікувати його регуляторні ділянки і визначити їх нуклеотидну послідовність. Подібним же чином з отриманням трансдуцірующіх фагів ф80 trp вдалося виділити і охарактеризувати гени та регуляторні послідовності, які утворюють триптофанового оперон. Крім того, завдяки трансдукції з'явилася можливість вивчати вплив різних мутаційних змін на експресію і регуляцію генів in vivo.
Розглянемо ті властивості фагового геному, які відповідальні за його здатність до специфічної трансдукції. По-перше, геном повинен бути здатний реплицироваться після того, як сталася інфекція. По-друге, він повинен придбати ковалентно зчеплений сегмент невірусной ДНК, який буде трансдуціроваться. Цей сегмент ДНК зазвичай має клітинне походження, але в принципі він може бути з будь-якого джерела. Він може включитися в будь-яке місце вірусного генома, якщо це не впливає на реплікацію вірусної ДНК в інфікуванні клітині хазяїна або на її здатність упаковуватися в зрілі фаговой частки. Будучи складовою частиною фагового геному, транс-дуціруемий сегмент ДНК реплікується разом
з вірусною ДНК. По-третє, гени, що кодують структурні фагових білки, повинні бути функціонально активними або їх роль повинен виконувати коінфіцірующій фаг або клітка-хазяїн. І нарешті, якщо ми хочемо використовувати трансдукція, нам потрібно знайти спосіб поділу різних типів вірусних геномів та ідентифікації, яка нас цікавить геному, оскільки трансдуціру ющіе віруси часто інфікують клітину спільно з вірусом дикого типу. Зазвичай для такого поділу використовують клонування.
Принципи клонування
Щоб зрозуміти, як використовувалися концепції трансдукції при розробці методів отримання рекомбінантних ДНК, нам слід ознайомитися з тим, що являє собою клонування. Клон вірусу або клітин-це якась популяція, кожен член якої веде походження від одного репродукується вириона або від однієї клітини відповідно. Всі члени клону незалежно від того, чи є вони вірусами або клітинами, по суті ідентичні вірусу або клітці, які дали
початок клону; вони також ідентичні один одному. При клонуванні вірусів необхідно, щоб вірусне потомство з однієї клітини, інфікованої однією вірусною часткою, розмножувалося протягом багатьох циклів інфекції, не змішуючись з потомством з інших інфікованих клітин. Такі вірусні клони утворюють прозорі зони на монослое неінфікованих клітин. Клонування клітин можна здійснити тільки в тому випадку, якщо клітини при розмноженні залишаються ізольованими один від одного. Клони бактеріальних клітин або клітин ссавців легко утворюються при розрідженому посіві їх на чашці таким чином, що вони утворюють окремі колонії.
За допомогою клонування отримують чистий препарат одного генома, оскільки всі члени клону містять ідентичні ДНК. Ця концепція молекулярного клонування використовується і при отриманні чистих препаратів певних молекул рекомбінантних ДНК.
Концепція рекомбінантної ДНК
Методологія отримання рекомбінантних ДНК заснована на тих же принципах, що і трансдукція.
Молекули ДНК, здатні реплицироваться у відповідних клітинах, представлені вірусними геномами або плазмідами, служать переносниками, або векторами, «чужорідних» сегментів ДНК, що одержали назву вставки. При цьому, замість того, щоб покладатися на клітинні процеси, що ведуть до утворення рекомбінантних трансдуцірующіх геномів, проводять об'єднання, або рекомбінацію, відповідним чином модифікованих вставок і векторів in vitro за допомогою ферменту ДНК-лігази. Такі рекомбінантні ДНК вводять потім у відповідні клітини, де вони амплифицируют в результаті реплікації.
Величезні потенційні можливості цієї методології обумовлені не тільки тим, що з її допомогою можна конструювати і реплікувати рекомбіновану ДНК, але і тим, що вона дозволяє клонувати окремі рекомбінантні молекули ДНК. Розглянемо, наприклад, що виходить в результаті об'єднання суміші випадкових сегментів ДНК будь-якого організму з векторною ДНК. Асортимент всіх можливих рекомбінантів надзвичайно різноманітний, кожен рекомбінантів містить якийсь певний сегмент
початкової ДНК. Однак при клонуванні рекомбінантних ДНК з утворенням окремих вірусних бляшок в кожній вірусної частинки з даної бляшки міститься унікальна рекомбінантна ДНК, що складається з векторної ДНК і одного з сегментів вихідного геному. Таким чином, технологія рекомбінантних ДНК дозволяє виділяти окремі сегменти ДНК з надзвичайно складної суміші сегментів, що походять з клітинного або вірусного геному.
У результаті перенесення якогось гена Є. coli з бактеріального генома у геном трансдуцірующего фага можна отримати приблизно 100-кратне збагачення з цього гену. У порівнянні з тим рівнем збагачення, якого вдається досягти шляхом молекулярного клонування сегментів ДНК складних організмів, таке збагачення є незначним. Наприклад, ген ссавців довжиною 5 т. основ становить лише одну мільйонну частину всього геному і приблизно одну десяту частину рекомбінантного генома фага X. Таким чином, молекулярне клонування дозволяє розщеплювати навіть найбільші і самі складно організовані геноми і отримувати окремі сегменти, що містять один або декілька генів в чистому вигляді. Таке відносно просте застосування принципів і методів, розроблених
Важливі відкриття
Як це часто буває при розвитку науки, методології рекомбінантних ДНК прокладали шлях багато відкриттів, що здавалися раніше незначними і не мають відношення до справи. Одним з таких відкриттів була трансдукція. Інші пов'язані з виділенням та вивченням властивостей бактеріальних плазмід і рестріктірующіх ендонуклеаз.
Бактеріальні плазміди
Одним з несподіваних наслідків використання антибіотиків для лікування інфекційних захворювань була поява стійких штамів патогенних мікроорганізмів. Це дуже важлива проблема вимагала свого рішення і стимулювала інтенсивні дослідження. Незабаром стало ясно, що стійкість до лікарських препаратів являє собою відносно стабільний генетична ознака, який може бути переданий чутливим бактерійних кліток способом, що нагадує інфекційний процес. Пізніше було встановлено, що поширення резистентності до антибіотиків відбувається при контактуванні клітин один з одним. Було показано, що резистентні до антибіотиків клітини містять генетичні елементи - плазміди, не пов'язані з хромосомною ДНК, здатні реплицироваться незалежно від хромосоми і передаватися від клітини до клітини при їх контактування. Саме такі позахромосомних елементи і містять гени, які надають клітинам наслідувану стійкість до одного або декількох антибіотиків. Вони отримали назву факторів резистентності, або R-факторів.
Механізм розповсюдження R-факторів став більш зрозумілий після того, як було встановлено спосіб перенесення генетичної інформації від однієї клітини до іншої під час кон'югації бактерій. Перенесення генетичного матеріалу здійснюється завдяки здатності донорних клітин реплікувати і переносити свою геномної ДНК через кон'югаційні місток в Клек реципієнта. Штами Е. coli, що є донорами, містять у складі свого геному ДНК плазмідної походження, названу чинником фертильності, або F-фактором. Такі донорні хромосоми утворюються після придбання клітинами F-фактора і рекомбінації між цією плазми-мідой і хромосомою клітини. У присутності інтегрованого F-фактора полегшуються кон'югація і перенесення хромосоми. Перенесення ініціюється в сайті інтеграції F-фактора. Завдяки здатності плазміди вбудовуватися в ДНК у багатьох сайтах різні штами ініціюють перенесення в різних сайтах хромосоми E. coli. У деяких випадках F-фактор залишається в клітинах у вигляді незалежного позахромосомних елемента - F-плазміди. Такі клітини, що позначаються F +, переносять плазміду F в реципієнтного клітини таким же способом, як у випадку перенесення R-факторів.
R-і F-фактори являють собою ковалентно замкнуті кільцеві молекули дволанцюжкової ДНК. Обидва вони містять гени, що забезпечують їх реплікацію у вигляді автономних плазмід та їх перенесення при контакті з відповідними реципієнтами. R-фактори несуть також гени резистентності до антибіотиків. Одні такі гени змінюють реакцію клітини на антибіотик, інші індукують утворення білків, які викликають деградацію або модифікацію певних антибіотиків. Наприклад, одна з R-плазмід кодує по-лактамазу, що забезпечує стійкість до ампіциліну завдяки деградації цього антибіотика. Стійкість до хлорамфеніколу обумовлюється ацетилюванням цього антибіотика. Ацетилювання каталізується ферментом хлорамфенікол-ацетілтранс-феразим, кодуються плазмидой.
Плазмідні ДНК легко виділити у великих кількостях і отримати в очищеному вигляді, що дозволяє досліджувати їх потенційну здатність служити векторами для введення в клітини нових сегментів ДНК. З'єднання плазмідної ДНК з відповідним чином модифікованими вставками можна здійснити in vitro аналогічно тому, як це відбувається у випадку з'єднання вставок з фагових векторами. У цих експериментах велику роль зіграв досвід здійснення трансформації клітин за допомогою ДНК. Були розроблені методи включення очищеної плазмідної ДНК в клітини відповідних бактерій-господарів. Завдяки наявності в таких плазмідах генів резистентності до антибіотиків можна провести відбір клітин, що містять R-плазміди в якості стабільно реплікується структури. Такі клітини живуть і діляться у присутності антибіотика, а клітини, що втратили цю плазміду, гинуть. Рекомбінантні плазмідні ДНК зберігаються у присутності антибіотика як якісь автономно реплицируются геноми під час наступних клітинних поділів. При клонуванні утворюються колонії клітин, що містять унікальну рекомбіновану ДНК, тому що кожна клітина господаря містить тільки одну плазміду. Оскільки розмір багатьох плазмідних векторів не перевищує кількох тисяч пар нуклеотидів, збагачення за сегментами еукаріотичної ДНК в цьому випадку виявляється більш високим, ніж при використанні фагових векторів. Саме плазміди виявилися першими векторами, за допомогою яких було здійснено молекулярне клонування в клітинах бактерій.
Рестріктірующіе ендонуклеази
Одним з найбільш важливих результатів генетичного вивчення бактерій і їх бактеріофагів було відкриття рестріктірующіх ендонуклеаз - ферментів, які дізнаються специфічні короткі нуклеотидні послідовності і розрізають обидві ланцюга подвійної спіралі ДНК в сайті впізнавання або на деякій відстані від нього. У відкритті цих ферментів ключову роль зіграло спостереження, зроблене приблизно 30 років тому. Воно полягало в тому, що бактеріофаг, вирощений в клітинах одного штаму, інфікуючи клітини інших штамів цього ж виду, часто росте дуже погано. Більше того, виділені після такої неефективної інфекції бактеріофаги у свою чергу погано розвиваються у вихідних клітинах. Цей феномен не пов'язаний з генотипом фага і була пояснена тим, що в Фаге відбуваються якісь модифікації, контрольовані господарем. Було висловлено припущення, що якийсь фагової компонент, необхідний для реплікації, специфічним чином модифікується в клітинах господаря, так що фаг може завершити реплікацію при повторному інфікуванні того ж штаму. При цьому його зростання в неспорідненій штамі обмежується, оскільки останній не містить відповідного системи модифікації.
Було доведено, що модифікуються фагових компонентом є ДНК, а нездатність фага реплицироваться в неспорідненій штамі обумовлена деградацією інфікуючої фагової ДНК. Розщеплення ДНК ініціюється внесенням декількох розривів у високоспецифічних сайтах, після чого відбувається повна неспецифічна деградація. Модифікацією, що захищає деякі інфікують фагових ДНК, а також геном клітини від розривів, є штам-специфічне метилювання ДНК. За допомогою генетичних і біохімічних досліджень встановлено, що метилювання ДНК відбувається в строго специфічних ділянках. Рестрикція здійснюється ендонуклеаза, які дізнаються аналогічні короткі специфічні послідовності, позбавлені метильних груп. Системи модифікації і рестрикції завжди відповідають один одному, тобто метилювання і розрізування відбуваються в одних і тих же послідовності ДНК. У кожній системі в якості мішеней для штам-специфічних систем рестрикції-модифікації використовуються свої короткі послідовності ДНК. Метильованих ДНК не розрізається по цій послідовності спорідненої рестріктірующей ендонук-леазой. Аналогічно рестріктірующіе ендонуклеази розрізають тільки ті ДНК, у яких не модифіковані відповідні сайти рестрикції. Регуляція системи рестрикції і модифікації здійснюється за допомогою родинних наборів генів, і такі парні системи є в багатьох видів бактерій, бактеріофагів і плазмід.
При аналізі генетичної та фізичної організації складних геномів особливо важливими виявляються дві властивості рестріктірующіх ендонук-леаз. Перша пов'язана з величезним діапазоном спеці-фічностей, які проявляються в сукупності різними рестріктірующімі ендонуклеаза, що дозволяє розрізати практично будь-яку ДНК на дискретні фрагменти самими різними способами. Ці фрагменти можна розділити за розмірами за допомогою гель-електрофорезу. Розподіл фрагменов за розмірами, що виходить при розщепленні даної ендонуклеазною ДНК у специфічних сайтах, є свого роду «відбитком пальців», характерним для цієї ДНК. Друга властивість ендонуклеаз рестрикції пов'язано зі здатністю багатьох з них здійснювати несиметричні розрізи дволанцюжкової ДНК, у результаті чого утворюються фрагменти з комплементарними одноланцюжковий кінцями. Це дозволяє проводити рекомбінацію ДНК in vitro. Будь-які два сегменти ДНК зі взаємодоповнюючими кінцями можуть об'єднатися, у результаті чого відбувається вбудовування фрагментів у фагів, плазмідну ДНК або інші потенційні вектори. Такі специфічні комбінації «вектор-вставка» можна отримати у чистому вигляді шляхом молекулярного клонування і ампліфікації у відповідних хазяйських клітинах.
Розвиток методології рекомбінантного ДНК і молекулярного клонування саме по собі призвело до створення нових областей біологічних досліджень. Однак повна реалізація цих нових можливостей залежала від інших проводяться одночасно розробок: розвитку методів фракціонування, які дозволяли б розділяти фрагменти ДНК, лише незначно розрізняються за довжиною; створення відносно простих і швидких процедур секвенування ДНК довжиною кілька тисяч нуклеотидів; отримання специфічно модифікованих генів шляхом внесення мутацій в їх клоновані копії in vitro; генетичної трансформації клітин, тканин і всього організму шляхом введення клонованих генів до відповідних систем.
Часто звертається увага на ранні результати, завдяки яким було розроблено той чи інший метод. Вчені, які отримали ці результати, не могли передбачити, як вони позначаться на розвитку технології рекомбінантних ДНК. Тепер ми знаємо, що саме успіхи в молекулярній генетиці прокаріотів і у вивченні ферментів, що здійснюють синтез і деградацію нуклеїнових кислот, відкрили шлях до дослідження еукаріотичних геномів.