Стрибки по хромосомі
Введення
В останнє десятиліття ми стали свідками цілої серії приголомшливих успіхів у галузі молекулярної біології. Розробка надійних методів клонування, секвенування та аналізу експресії еукаріотичних генів поглибила наші уявлення про структуру та регуляції активності гена, зробила більш зрозумілими механізми багатьох спадкових хвороб людини. В цей же час швидко розвивалися і досягли значних успіхів методи картування людських генів.
До недавнього часу існував якийсь «провал» в області розмірів хромосомних сегментів від 100 до 5000 т. пар основ; для них не було адекватних методів дослідження. Таке становище значно ускладнювало інтерпретацію даних по картування, отриманих методами генетики соматичних клітин і за допомогою генетичного аналізу. Сполучення таких даних з інформацією, отриманої на молекулярному рівні, стали називати «зворотного генетикою».
В останні роки було запропоновано кілька підходів, що дозволяють вести дослідження в цій новій області. У цій роботі описано один з них - метод "стрибків по хромосомі». З його допомогою вдається клонувати послідовності ДНК, значно віддалені на генетичній карті від послідовностей, гомологічних використовуваному зонду. Викладаються методики створення бібліотек «хромосомних стрибків» і клонів-зв'язок. Обговорено переваги і недоліки описуваного методу.
1. Область застосування методу
Рис. 2 дає уявлення про розміри хромосомних сегментів, в межах яких «працюють» різні сучасні методи генетичних досліджень. Вісь ординат являє собою логарифмічну шкалу фізичних відстаней, виміряних в парах нуклеотидів. На шкалі наведено і значення генетичних відстаней, вимірювані в сантіморганідах. 1 см приблизно дорівнює 8 жовтня основ Однак це співвідношення не можна вважати універсальним, бо залежність між генетичним і фізичним відстанню на хромосомі має нелінійний характер, на неї можуть впливати «гарячі точки» рекомбінації. Наявність таких областей може призвести до ситуації, коли порівняно великим генетичному відстані відповідає невеликий відрізок на фізичній карті. У той же час в геномі існують ділянки, рекомбінація в яких малоймовірна, а це призводить до зворотної ситуації. Як показано на рис. 2, класичні методи молекулярної генетики добре працюють на послідовностях довжиною до 50 г.п.н., що відповідає максимальному розміру вставки в космідний вектор. Ділянки більшої довжини можна клонувати шляхом «прогулянки по хромосомі», коли, використовуючи вже клоновані послідовності, геномну бібліотеку скрініруют з метою отримання перекриваються клонів. Таким способом вдається аналізувати послідовності довжиною до декількох сотень т. основ Проте, в деяких випадках ця процедура може зайняти дуже багато часу. Так буде, якщо якісь ділянки практично не перекриваються з-за наявності протяжної області повторюваних послідовностей або послідовностей ДНК, які не вдається ввести в стандартні вектори. Якщо відомо, що цікавить нас ген знаходиться на відстані декількох сотень т. основ від використовуваного клону, то застосування методу «прогулянки по хромосомі» вельми проблематично.
На протилежному кінці спектра працюють методи генетики соматичних клітин, гібридизація in , анализ генетического сцепления; их разрешающая способность ограничена 1000–5000 т. п.н. situ, аналіз генетичного зчеплення; їх роздільна здатність обмежена 1000-5000 т. основ І нарешті, посередині шкали відповідають три методи, що дозволяють використовувати дані картування для пошуку специфічних молекулярних порушень. Це пульс-електрофорез, «стрибки по хромосомі» і клонування в клітинах дріжджів.
Важливість цих підходів в тому, що вони дають ключ до розуміння молекулярних основ цілого ряду генетичних порушень, для яких невідома функція кодують їх генів. Відомі спадкові хвороби людини, пов'язані з аномаліями окремих генів, такі, наприклад, як муковісцидоз, хвороба Гентінгтона, нейрофіброматоз. Спадкування їх відбувається строго відповідно до Менделя правилами, вони мають чіткі фенотипічні характеристики, проте нормальні функції генів, що кодують ці захворювання, не визначені. Аналіз зчеплення з використанням поліморфних ДНК-маркерів дозволив картировать відповідні гени в специфічних хромосомах людини, що в свою чергу, значно збільшило можливості пренатальної та пресімптоматіческое діагностики. Щоб до кінця розібратися в природі цих захворювань і запропонувати адекватні методи їх лікування, необхідний молекулярно-біологічний метод, який працює в області великих молекулярних розмірів. Саме таким методом і є «стрибки по хромосомі».
2. Стандартні бібліотеки «стрибків»
2.1 Типи «стрибків»
Слід розмежувати поняття стандартних геномних бібліотек для "стрибків по хромосомі» і специфічних бібліотек. У першому випадку бібліотеки створюються таким чином, що починати рух уздовж хромосоми відміряних стрибками можна в принципі з будь-якої точки геному. ,
к последующему такому же сайту. Специфічні бібліотеки складаються з клонів, що дозволяють здійснювати стрибки від одного рідко зустрічається сайту рестрикції, наприклад Notl, до подальшого такого ж сайту. Типи стрибків схематично зображені на рис. 3. Очевидно, що способи створення цих бібліотек дещо різні. З технічної точки зору важче отримувати бібліотеки першого типу, так як вони повинні містити репрезентативну вибірку послідовностей геному. Зазвичай для такої бібліотеки потрібно 3 * 10 8 клонів. Тоді можна бути твердо впевненим, що з нею можна працювати, починаючи від будь-якої стартової точки на хромосомі.
Для створення ж повних специфічних бібліотек потрібно всього лише 10000-20000 клонів, так як кількість незалежних клонів еквівалентно числу рестрикційних фрагментів, отриманих при використанні даного ферменту рестрикції. ,
которая отщепляет приблизительно по 1000 т. п.н. Так, наприклад, для рестриктаз Notl, яка відщеплює приблизно по 1000 т. основ в геномі людини, таких фрагментів повинно бути всього лише близько 3000. Тому бібліотеку з 10000 клонів для стрибків по Not сайтам можна вважати практично повною. Очевидним недоліком таких бібліотек є те, що їх не можна використовувати, коли стартова точка стрибка не примикає до рідко зустрічається сайту рестрикції. На жаль, це досить часте явище, що перешкоджає швидкому розповсюдженню даного методу. Якщо ж все-таки вдається ідентифікувати клон, що примикає до рідко зустрічається сайту рестрикції, використання специфічних бібліотек для "стрибків по хромосомі» може надати неоціненну допомогу.Дуже ефективним могло б виявитися створення геномної бібліотеки третього типу, що має в своєму складі клони, що з'єднують рідко зустрічаються сайти рестрикції з прилеглими випадковими послідовностями ДНК геному. Маючи таку бібліотеку, ми могли б починати рух по хромосомі з будь-якою стартової точки, а при зустрічі з рідкісним сайтом рестрикції пускати в хід специфічну геномну бібліотеку. На жаль, поки це завдання не вирішена і підходи до її вирішення тут обговорюватися не будуть.
2.2 Принцип створення стандартних бібліотек
Основна стратегія методу «стрибків по хромосомі» полягає в отриманні кільцевих формул дуже великих фрагментів ДНК шляхом лігування їх при великому розведенні. Освіта кілець дозволяє фізично зблизити ділянки ДНК, розташовані в геномі на значній відстані один від одного. Селективне клонування таких з'єднаних фрагментів в стандартні вектори дозволяє потім отримати геномну бібліотеку клонів - «стрибків». Ця стратегія стосовно до стандартних бібліотекам схематично зображено на рис. 4.
Перш ніж приступити до створення бібліотеки, слід відповісти на декілька важливих питань.
1. Який розмір стрибка бажаний? Відомо, що розмір стрибка визначається розміром частково гідролізувати молекул ДНК. Як буде показано нижче, складність побудови бібліотеки зростає в ступені 3 / 2 з збільшенням розміру стрибка.
2. Який використовувати фермент? В ідеальному випадку хотілося б мати абсолютно випадковий набір фрагментів ДНК.
3. Яке джерело ДНК використовувати? Для оптимальної реалізації бібліотеки за наявності самих різноманітних стартових зондів було б застосовувати джерело ДНК, що представляє весь геном організму, наприклад периферичні лімфоцити донорської крові у разі геномних бібліотек людини. Якщо ж передбачається дослідження специфічної хромосоми, краще працювати з гібридними соматичними клітинами, які містять саме цю хромосому на відомому тлі хромосом інших видів. Перевага такої стратегії в тому, що вона дозволяє відразу визначити принципову цінність клону, отриманого за допомогою наявної бібліотеки, шляхом простої перевірки клонованого фрагмента на його приналежність цікавить хромосомі.
2.3 Отримання ДНК-фрагментів бажаного розміру
ДНК, яку піддають часткового гідролізу, повинна бути досить високомолекулярної. Методика приготування зразків ДНК та ж, що і для пульс-електрофорезу, з тією лише різницею, що кількість ДНК розраховується для препаративних цілей.
1. Виходячи з того, що одна клітина ссавця містить 6,7 пкг ДНК, необхідно виростити їх стільки, щоб отримати достатню кількість ДНК. Зазвичай для створення бібліотеки потрібно 200 мкг ДНК, що відповідає приблизно 3 х10 7 клітинам. ДНК повинна бути дуже високої якості, тому дуже важливо ростити клітини в оптимальних умовах. - Hypaque .
Можна приготувати клітини і з периферичної крові центрифугуванням в суміші Ficoll - Hypaque.2. Після збору клітин акуратно прорахуйте їх кількість у гемоцітометре і суспендують у такому обсязі фосфатно-сольового буфера, щоб концентрація клітин становила приблизно 2хЮ 7 / мл. Потім суспензію швидко змішайте з рівним об'ємом розплавленої 2%-ної низкоплавкие агарози в 125 мМ ЕДТА при 40 ° С. Залийте у форму. Крім стандартних комірок форма повинна мати осередки для блоків розміром 2x8x135 мм, які служать для отримання ДНК в препаративних кількостях. Корисно приготувати 10-20 стандартних блоків з ДНК для тест-гідролізатів і два великих блоки безпосередньо для дослідів.
-лаурилсаркозина, как описано ранее .
3. Обробіть ДНК протеїназ К в присутності великих кількостей ЕДТА і N-лаурілсаркозіна, як описано раніше.4. Очищену ДНК перевірте на нативної і на присутність нуклеаз. 2 и нанесите эту смесь, а также необработанную половину на OFAGE -гель или на гель для электрофореза в инвертированном поле.
Для цього інкубують половину вмісту блоку при 37 ° З 3 год з 10 мм MgCl 2 і нанесіть цю суміш, а також необроблену половину на OFAGE-гель або на гель для електрофорезу в інвертованому полі. Визначте розмір ДНК. Необроблена ДНК повинна практично повністю залишитися в лунці, а в обробленому магнієм препараті не повинно бути низькомолекулярних домішок. Тільки в цьому випадку можна використовувати препарати для "стрибків по хромосомі». Якщо ж у препаратах, оброблених магнієм, в наявності ознаки деградації, значить вони забруднені нуклеазами і треба повторити обробку протеїназ К. Як правило, цього буває достатньо, щоб позбутися від забруднень.5. З деяких джерел ДНК постійно виділяється з невеликою кількістю низькомолекулярних домішок розміром 50-100 т. пар основ, мабуть із мертвих клітин. Найбільш характерно це для лімфобластів. Такі деградовані молекули ДНК можуть сильно спотворювати результати «стрибків по хромосомі», тому необхідно видалити їх з агарозного блоків перед обробкою рестріктазами. -геля и проводят пульс-электрофорез в течение 2–3 ч с интервалами между импульсами 20 с.
Для цього блоки поміщають в лунки OFAGE-гелю і проводять пульс-електрофорез протягом 2-3 год з інтервалами між імпульсами 20 с. Молекули ДНК розміром менше 100 т. основ виходять з блоків у гель, а високомолекулярна ДНК залишається практично без зміни. Блоки потім можна вилучити з гелю, отримавши, таким чином, високоякісний матеріал для подальшого дослідження.6.
. Проведіть контрольну рестрикції половинок агарозного блоків різними концентраціями Mbol. Згідно цієї методики, в кожній половині блоку міститься приблизно 3,3 мкг ДНК, отже, концентрація ферменту складе від 0,01 од. / мкг до 0,045 од. / мкг. Зупиніть реакцію додаванням 10 мкл ЕДТА. Оброблені рестриктазою зразки помістіть в гель і проведіть пульс-електрофорез. Це допоможе визначити концентрацію ферменту, оптимальну для отримання фрагментів потрібного розміру. На малюнку наочно продемонстрована необхідність пре-електрофорезу для видалення низькомолекулярних домішок ДНК перед обробкою рестріктазами.7. При використанні великих агарозного блоків пропорційно збільште кількість ферменту, але так, щоб концентрації ферменту в од. / мкл і ДНК в мкг / мл залишилися колишніми.
8. Оброблені рестриктазою препаративні блоки помістіть в гель і, використовуючи відповідні маркери, проведіть пульс-електрофорез з інтервалами між імпульсами, що дозволяють добре відокремити фрагменти потрібної величини.
-гель , маркеры следует наносить в середине и по обоим краям геля.
Якщо використовується OFAGE-гель, маркери слід наносити в середині і по обох краях гелю. -гели и гель-электрофорез в инвертированном поле. Ми виявили, що для отримання прямих смуг молекул ДНК бажаних розмірів краще використовувати CHEF-гелі та гель-електрофорез у інвертованому полі.9. Важливо, щоб ДНК, яку належить клонувати, не піддавалася ультрафіолетового опромінення. Тому відріжте краю гелю, що містять маркери, а також невелика кількість рестріцірованной геномної ДНК, пофарбуйте їх бромідом етидію і візуалізують в ультрафіолеті. За отриманими даними визначте ділянку гелю з цікавить вас ДНК.
10. Виріжте потрібну ділянку гелю. На цій та наступних стадіях важливо використовувати безнуклеазние реактиви та інструменти. Виділяти ДНК з гелю для отримання кільцевої молекули можна двома способами. Нам уявлялося зручним робити це методом електроелюціі. Помістіть шматочок гелю з ДНК в діалізний мішок, залийте чотирма об'ємами електрофорезного буфера, а потім помістіть пакет в камеру для горизонтального електрофорезу. Елюіруйте ДНК з гелю протягом двох годин 0,5 хТВЕ-буфером при постійній напрузі 100 В. Щоб переконатися, що вся ДНК елюірована, можна розкрити діалізний мішок, дістати гель і забарвити бромідом етидію. Після видалення гелю знову запечатайте діалізний мішок і отдіалі-зуйте ДНК проти 10 мм Тріс, рН 7,4, 1 мм ЕДТА з кількома змінами буфера, підготувавши таким чином препарат для лігування.
11. Препаративні гелі для визначення розмірів ДНК можна готувати з легкоплавкой агарози. І тоді виділяти ДНК з них можна, вирізаючи потрібні ділянки і розплавляючи їх при 65 ° С. Після того як гель розплавиться, ДНК доводять до потрібної концентрації і проводять лігування у присутності агарози, яка не інгібує цю реакцію. В даний час немає підстав віддавати перевагу один метод іншому. Важливо лише уникати операцій, які могли б порушити цілісність молекул ДНК після вилучення їх з гелю. Не можна центрифугувати, струшувати, піпетувати препарати. І бажано якомога швидше приступати до їх лигированию.
2.4 Циклизация
Успіх чи невдача «стрибків по хромосомі» у вирішальній мірі визначаються можливістю лігувати великі сегменти ДНК з утворенням кільцевих молекул. Аналіз стратегії цього методу, схематично зображеної на рис. 4, показує, що тандемною лігування молекул ДНК дає зчеплені фрагменти, що сполучають в собі дві випадкові послідовності. Таке зчеплення призводить до утворення аномальних клонів, які провокують «стрибки по хромосомі» з даної стартової точки на якусь випадкову послідовність генома. Звести до мінімуму ризик виникнення такої події можна, проводячи лігування при досить низьких концентраціях ДНК так, щоб на частку тандемних лігування припадало менше 5-10%.
Теорія лігування ДНК при низьких концентраціях була розроблена в 50-і роки Джекобсоном і Стокмайером. Для деяких розмірів послідовностей ДНК теоретичні прогнози підтвердилися експериментально. Дуже корисно, наприклад, наступне співвідношення:
– концентрация молекул ДНК контурной длины / и сегментной длины b , при которой с равной вероятностью лигируются как разные молекулы, так и концы одной молекулы.
де j - концентрація молекул ДНК контурної довжини / та сегментної довжини b, при якій з однаковою ймовірністю лігуються як різні молекули, так і кінці однієї молекули. Очевидно, що для ефективної циклізації краще працювати з концентраціями набагато більш низькими, ніж /. Підставляючи в рівняння відомі параметри ДНК для водного розчину, його можна перетворити в такий спосіб:
де т.п.н. - Довжина ДНК в тисячах пар нуклеотидів.
При даній концентрації ДНК i - Частка лігування, що призводять до циклізації. Щоб ця частка сягала 90%, працювати треба з концентрацією ДНК, яка визначається рівнянням:
Зазвичай для отримання 3 х10 6 клонів у бібліотеці, необхідно після розщеплення ціклізованних молекул ДНК мати 0,5 мкг зчеплених фрагментів. Середній розмір такого фрагмента 5 т. пар основ, а це значить, що для здійснення стрибків у 100 т. основ необхідно мати 10 мкг фракціонованої за розміром ДНК; для стрибків у 200 т. основ - Вже 20 мкг. На інтенсивність лігування впливають два фактори: 1) кількість ДНК, необхідний для отримання достатнього числа зчеплених фрагментів і створення геномної бібліотеки. Ця кількість зростає лінійно із збільшенням розміру стрибка; 2) необхідність переважного отримання ціклізованних молекул. Інтенсивність лігування з циклізації зростає пропорційно квадратному кореню довжини молекул ДНК. Тому зі збільшенням розміру стрибка обсяг лігазну суміші повинен зростати пропорційно 3 / 2 ступеня довжини молекули ДНК. У табл. 1 наведено стандартні параметри для створення геномної бібліотеки, розрахованої на стрибки в 100 т. основ
Дуже важливо маркувати в кільцевих молекулах місця з'єднання фрагментів з тим, щоб селективно клонувати їх на наступних стадіях.
, хотя возможны и другие способы селекции. В якості селективного маркера ми використовували ген супресорної тРНК - supF, хоча можливі й інші способи селекції. -концевым фрагментам геномной ДНК – Для этой цели было взято несколько supF Супресорних ген повинен мати кінці, комплементарні Mfeol-кінцевим фрагментами геномної ДНК - Для цієї мети було взято кілька supF з различающимися кінцевими послідовностями, отриманими при обробці рестріктазной Ват.Нижче представлена методика реакції циклізації.
1. Використовуючи наведені вище рівняння, розчиніть ДНК і доведіть розчин до потрібної концентрації в 50 мМ Тріс, рН 7,4, 1 мМЕДТА.
2. -фрагмёнтов supF , предварительно проверенных на эффективность лигирования.
Додайте 100 або 500-кратний молярний надлишок ДНК BamHI-фрагментів supF, попередньо перевірених на ефективність лігування. Для цього проведіть самолігірованіе і подальший аналіз гелю. На нашу думку, найбільш зручно отримувати фрагменти генів supF електрофорезом з подальшою електроелюціей. Важливо, щоб фрагмент був максимально очищений від плазміди, оскільки навіть незначні кількості її можуть проявитися в остаточній бібліотеці у вигляді клонів, гибрідизуючою з зондом, що несе плазміду. Залиште суміш supF ДНК з геномної ДНК на півгодини.3. Доведіть концентрацію магнію до 10 мМ і залиште суміш ще на 10 хв, щоб встановилася рівновага. Потім додайте ДНК-лігази бактеріофага Т4 до кінцевої концентрації 1-2 од. / мкл. Лигируют 12 год при 14 ° С, потім додайте другу порцію лігази і лигируют ще 12 ч. осадити ціклізовавшуюся ДНК етанолом, додавши 20 мкг дріжджовий тРНК-носія. 27.
Отцентріфугіруйте осад при 23 000 об / хв в роторі SW 27. Ресуспендіруйте осад в 100 мкл ТЕ і інактивує всі нелігіровавшіеся кінці, або обробивши їх лужною фосфатазою, або додавши фрагмент Кльонова ДНК-полімерази I. . Ця стадія дуже важлива, тому що, якщо лігування при низьких концентраціях відбувається не повністю, вільні фрагменти можуть аномально лігувати з вектором. Екстрагують ДНК фенолом, облога і, розчинивши, знову обробіть EcoRl.-гтом. В случае успешной реакции циклического лигирования ДНК гена supF
5. Для контролю дуже корисно на кожній стадії відбирати невеликі аліквотах і піддавати їх електрофорез в 1,4%-ном агарозному гелі з подальшим перенесенням на нітроцелюлозу або поліамід і блот-гібридизацією з supF-гтом. У разі успішної реакції циклічного лігування ДНК гена supF буде давати смуги у вигляді сходів, і невелика її кількість повинна опинитися в тій зоні гелю, яка відповідає високомолекулярної ДНК. - гена должна остаться, а полосы из высокомолекулярной области должны расщепиться на множество фрагментов размером от 1 до 20 т. Після обробки рестриктазою ЕсоЩ драбинка supF - гена повинна залишитися, а смуги з високомолекулярної області повинні розщепитися на безліч фрагментів розміром від 1 до 20 т. основ
6. ДНК, оброблену ЕсоШ, екстрагують фенолом і обложити етанолом.
2.5 Клонування та скринінг
На цій стадії оброблені кільцеві молекули ДНК генома вже можна лігувати і виробляти селекцію зчеплених фрагментів. Для селекції геномні фрагменти вбудовують в фагової вектор, що несе амбермутаціі принаймні двох генів білкової оболонки, упаковують фагів ДНК in и инфицируют клетки бактерии-хозяина, лишенные функции supF . Формировать бляшки на таком газоне могут только те фаговые частицы, геномы которых содержат собственные supF -гены. vitro і інфікують клітини бактерії-господаря, позбавлені функції supF. Формувати бляшки на такому газоні можуть тільки ті фаговой частки, геноми яких містять власні supF-гени.
Теоретично підходить будь-який фагової вектор, що несе Амбер-мутації і клонуючим сайт. Бажано, звичайно, щоб цей вектор забезпечував максимальну клонуючим ємність. Ідеальною можна вважати ситуацію, коли кільцеві геномні фрагменти розщеплювалися б лише частково мелкощепящім ферментом, а потім лігувати у вектор великої місткості, щоб не було дискримінації фрагментів, зумовленої розташуванням сайтів рестрикції. Проте обов'язкові втрати, що відбуваються при частковому розщепленні, виявляються перешкодою на шляху створення повної бібліотеки. . Можно использовать и другие ферменты, для которых имеются амбермутантные фаговые клонирующие векторы . Наявні у нас в даний час стандартні геномні бібліотеки для «стрибків по хромосомі» були отримані в результаті повного розщеплення кільцевих геномних фрагментів рестриктазою EcoRl. Можна використовувати й інші ферменти, для яких є амбермутантние фагових клонуючі вектори.
2.6 Аналіз клонів
Після очищення бляшок можна приготувати мінілізат ДНК з клонів, керуючись будь стандартною методикою. 392 позволяет получить несколько больший выход фаговой ДНК, чем при посеве на МС1061. Використання цього стадії в якості газону LE 392 дозволяє отримати дещо більший вихід фагової ДНК, ніж при посіві на МС1061. позволит определить размер инсерционного фрагмента. Обробка рестриктазою Ј coRI дозволить визначити розмір інсерційного фрагмента. -фрагмента, это значит, что при клонировании в один вектор были лигированы две вставки. Якщо в даному клоні є більше одного fcoRI-фрагменти, це значить, що при клонуванні в один вектор були лігіровани дві вставки. , чтобы определить, находятся ли эти вставки в одном EcoRI -фрагменте или в разных. У такому випадку слід провести блот-гібридизацію даного клону з вихідним зондом і з supF, щоб визначити, чи знаходяться ці вставки в одному EcoRI-фрагменті або в різних. У першому випадку з клоном можна продовжувати працювати далі традиційними методами, у другому випадку він не представляє цінності для подальших досліджень.
-фрагмент полезно переклонировать в плазмиду, чтобы упростить работу по его изучению. ZTcoRI-фрагмент корисно переклоніровать в плазміду, щоб спростити роботу з його вивчення. -маркера. Субклони можна легко ідентифікувати, завдяки наявності SHpF-маркера. 322, предварительно обработанную Ј coRI и фосфатазой, и полученной рекомбинантной ДНК трансформировать штамм бактерии-хозяина, несущий какую-либо амбермутацию в lacZ , например CARD -15. Рестріцірованний мінілізат ДНК можна лігувати в pBR 322, попередньо оброблену Ј coRI і фосфатазою, і отриманої рекомбінантної ДНК трансформувати штам бактерії-господаря, що має будь-яку амбермутацію в lacZ, наприклад CARD -15. Висів культури на агар Мак-Конки з ампіциліном дозволяє практично відразу виявити цікавлять колонії, так як вони здатні зброджувати лактозу і пофарбовані в пурпуровий колір на відміну від інших, шмеющіх рожеве забарвлення.
. Для того щоб розділити стартову та кінцеву точки стрибка, дуже корисно використовувати присутність сайту в центрі гена supF. 322 сайт Aval Особливо ефективно це в тому випадку, коли наявний у pBR 322 сайт Aval елімінірованной. , достраивание фрагментом Клёнова и повторное лигирование. Ми добивалися цього, проводячи послідовно обробку плазміди рестриктазою Aval, добудовування фрагментом Кленова і повторне лігування. , Aval Відокремити половини клонованого фрагмента можна, обробляючи субклони EcoRl, Aval і обома рестріктазами одночасно. Ліасайти зустрічаються іноді в геномних послідовностях, що дещо ускладнює складання карти. Проте за допомогою блот-гібридизації рестріцірованних субклона з вихідним зондом, supF і геномної ДНК людини, що дозволяє локалізувати повтори, зазвичай легко вдається побудувати рестрикційну карту і ідентифікувати унікальні послідовності. А це, у свою чергу, дозволяє визначити, чи є даний стрибок ефективним. Результати блот-гібридизації становлять особливий інтерес, тому що з їх допомогою вдається ідентифікувати найближчі до супресорної гену фрагменти.
У випадку ж використання supF з додатковими вставками рідко зустрічаються сайтів рестрикції поділ половинок фрагмента, що становить стрибок, спрощується, й зонди можна отримувати безпосередньо з мінілізатафаговой ДНК. Після того як встановлено, що фрагмент - «стрибок» представлений в геномі одиничної копією, треба провести його гібридизацію з блоту геномної ДНК з гібридних соматичних клітин, щоб переконатися, що стрибок здійснено в межах потрібної хромосоми. Це дуже важливий момент, тому що при створенні геномної бібліотеки завжди існує небезпека нециклічного лігування.