Селекція за допомогою маркерів

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

План

1.Вступ

2.Що ж таке молекулярно-генетичні маркери?

3.Які ж бувають маркери?

4.Як і для чого можуть використовуватися молекулярні маркери?

5.Заключеніе

ВСТУП

З часів зародження тваринництва людина, волею-неволею, отримував велику кількість порід різних тварин. Спочатку селекція тварин була процесом спонтанним, людина залишав і розводив тих тварин, які менше його боялися і давали необхідну йому продукцію. З часом людина вловив деякі закономірності у передачі будь-яких ознак від предків до нащадків, і селекція ставала все продуманней і ефективніше. До моменту зародження генетики людина вже сам міг планувати відбір і підбір по фенотипическим ознаками з досить великою ефективністю і вже міг цілеспрямовано виводити нові породи. Поява генетики означало новий виток у розведенні тварин, поняття глибини принципів наслідування поставило розведення на науковий фундамент.

В даний час розведення тварин це розвинена наука, яка охоплює широкий спектр завдань і методів їх вирішення в тваринництві. Як основні інструменти селекції можна виділити оцінку тварин, відбір і підбір. Найбільш складний і найважливіший процес - це оцінка тварин, від точності оцінки багато в чому залежить подальший успіх селекційних заходів (ключове слово тут «багато в чому»). На даний момент користуються оцінкою тварин за екстер'єром і за продуктивним якостям (надій молока за лактацію, скоростиглість поросят тощо), в обох випадках користуються фенотипическими показниками, з цього, для використання цих ознак у розрахунках, необхідно знати їх коефіціент успадкованого, але навіть в цьому випадку ми будемо мати справу з ймовірністю генетичного обгрунтування будь-якої ознаки.

Наука не стоїть на місці, а в останні десятиліття її прогрес досягає взагалі колосальної швидкості, це не обійшло стороною і тваринництво. Розвиток високих технологій в оптиці, електроніці, математики і в інших науках відкрило великі можливості у вивченні молекулярної біології, дозволило у великій мірі вивчити глибинні механізми життя і успадкованими. Сукупність нових знань послужила фундаментом для народження нової науки - селекції за допомогою маркерів (Marker Assisted Selection - MAS). У селекціонера з'явилася можливість виключити фактори дії середовища на ознаки з оцінки тваринного і користуватися голою генетичної складової фенотипу.

2. Що ж таке молекулярно-генетичні маркери?

Молекулярними маркерами називають такі біохімічні особливості обміну речовин і, безпосередньо, структурні особливості геному організму тварини, рослини, бактерії або гриба, які тісно корелюють з якими або фізіологічними показниками організму (наприклад, активністю ферментів), пов'язаними з господарсько корисними ознаками цієї істоти. Використовуючи молекулярно-генетичні маркери селекціонер може, з величезною точністю, вибирати з популяції тільки тварин володіють певним алелем, необхідного йому, гена, такого як, наприклад ген стійкості до лейкозу у корів, і створювати стада стійкі до захворювань, з тваринами генетичним здоровими і високо продуктивними.

У селекції за допомогою маркерів використовуються тільки природні комплекси генів, характерні для даного виду тварин. Ці комплекси пройшли через сито природного відбору у предків домашніх тварин, тому їх присутність у геномі тварин є природним і безпечним як для самої тварини, так і для людини споживає продукцію від нього.

Використовувані маркери повинні володіти певними властивостями і відповідати ряду вимог, до них відносяться:

  1. Фенотипічні прояви алельних варіантів повинні бути доступні для ідентифікації у різних особин;

  2. Алельних заміщення в одному локусі повинні бути відмінними від алельних варіантів в інших локусах;

  3. Істотна частина алельних заміщень в кожному досліджуваному локусі повинні бути доступна для ідентифікації;

  4. Вивчаються локуси повинні представляти випадкову вибірку генів у відношенні їх фізіологічних ефектів і ступенів мінливості;

  5. Маркери повинні володіти рівномірним розподілом по локалізації в геномі;

  6. Маркери повинні мати легку виявленням і відтворюваністю;

  7. Одержані дані повинні бути порівняні в різних лабораторіях;

  8. Необхідна можливість автоматизації їх виявлення;

  9. Маркери повинні володіти відносною нейтральністю. 1

Очевидно, що не існує такого стандартного набору маркерів, який відповідав би всім цим вимогам.

3. Які ж бувають маркери?

Вперше ідею застосування маркерів в селекції теоретично обгрунтував А. С. Серебровський ще в 20-х роках, тоді він говорив про морфологічних моногенно успадкованих ознаках.

На сьогоднішній день відомо вже чимало різних за природою маркерів. Найбільш прості маркери - це відмінності у морфологічній будові хромосом. Наявність будь-яких перетяжок на хромосомі, супутників або яких-небудь інших особливостей морфологічної будови хромосом, може корелювати з положенням гена в певній алелі. Ідея непогана, найголовніше нова і досить достовірна, але проблема полягає в тому, що дуже незначна кількість ознак корелює з такими морфологічними особливостями хромосом, які можна побачити на метафазної платівці через мікроскоп. З цієї причини морфологічними відмінностями хромосом, як генетичні маркери, використовуються мало.

Наступним кроком у MAS стало відкриття значною мірою поліморфізму макромолекул в організмах, в основному білків. Тобто один і той же білок (мається на увазі відповідає за одні і ті ж функції і має однакове походження) може мати різну електрофоретична рухливість у різних тварин (а іноді і в одного і того ж тварини) і володіти різною активністю в метаболічної ланцюга. Такі варіанти називаються алельними і походять з-за амінокислотних замін в поліпептидного ланцюга білка, що приводить до зміни довжини або заряду білка, що в свою чергу є наслідком нуклеотидної заміни (або будь-яких інших точкових мутацій) в ланцюзі ДНК гена, що кодує цей білок. Відразу ж після відкриття високої поліморфності білків між дослідниками почалася дискусія з приводу адаптивного або нейтрального дії алельних варіантів білків. Ця дискусія триває і зараз, але більшість досліджень свідчать про те, що поліморфні білки можуть використовуватися в якості ефективних молекулярно-генетичних маркерів в селекції організмів.

Оскільки тільки деякі варіанти білків відрізняються за розміром і / або електричного заряду, то генетичні варіації, які можуть бути виділені такими методами, представляють лише 25% від загальної кількості варіантів на генному рівні.

В якості молекулярних маркерів тварин можуть використовуватися системи груп крові, існує безліч робіт з визначення впливу груп крові на продуктивність тварин і їх стійкість до захворювань, але про це пізніше.

Досягнення в молекулярній генетиці за останні 28 років дозволяють проводити оцінку поліморфізму алельних генів на рівні ДНК. ДНК поліморфізм може бути тестований різними способами - це і безпосереднє визначення нуклеотидної послідовності цікавить гена (сиквенирування, найбільш дорогою, довгий, складний і точний метод), і складання рестрикційних карт організмів (ПДРФ), і ампліфікація різних ділянок ДНК (RAPD - PCR, ISSR - PCR), і гібридизація ДНК (FISH, GISH, блотів) і т.д. Ці методи є найбільш чутливими і достовірними, вони дозволяють виявити поліморфізм не тільки експресірующіх послідовностей, але і регуляторних, і неекспресірующіх (наприклад, комплекс генів «молочності» бика).

Це було цілком наукове вступ до моєї роботи, а тепер я пропоную приступити до справи.

4. Як і для чого можуть використовуватися молекулярні маркери?

Хочеться, хоч це і трохи несистематично, зробити невеликий вступ (передмова). Звідки ж взагалі з'являється поліморфізм ДНК та білків? На це питання відповідає еволюційна теорія, основи якої заклав ще Чарльз Дарвін. Утворення різних алелів генів, нових генів і взагалі видів тварин процес, більшістю, повільний і поступовий, основна діюча сила це мутації і природний відбір. Мутації можуть з'являтися з різних причин - це іонізуюче випромінювання, короткохвильовий ультрафіолет, хімічні мутагени (до яких відноситься і звичайний для нас анальгін!), Помилки ДНК-полімерази (частота появи помилки 1 * 10 -9 нуклеотидів, якщо не помиляюся) і за деякими інших причин. Мутації утворюються у випадкових місцях на ДНК, і, найчастіше, виявляються шкідливими або непотрібними для організму, механізм «виживає найсильніший» поступово (а іноді й відразу) виключає тварин мають злоякісні мутації з популяції (звичайно якщо це не рецесивна алель, тоді все складніше , але це курсова не по популяційної генетики). У разі ж, якщо у процесі мутагенезу з'являються тварини більш пристосовані, мутація підхоплюється відбором і число таких тварин в популяції зростає. У даній роботі ми будемо говорити, переважно про генні мутації - це мутації пов'язані зі зміною в послідовності нуклеотидної ланцюга в межах одного гена (ну і ще трохи про дуплікації генів). Це може бути перестановка нуклеотидів місцями, заміна одного нуклеотиду на інший і, найстрашніше, втрата або вставка нуклеотидів (особливо їх числа, некратний трьом).

Так от уявімо собі, що у нас є популяція тварин (нехай це будуть кози) з абсолютно ідентичним геномом, гени не мають алелів (не алельних). Наші кози пасуться на рівнині під теплі сонечком і щипають соковиту травичку. Біди, як говоритися, не чують. Геном наших тварин настільки спеціалізований, для проживання в цих умовах, що якщо виникає якась мутація у будь-якої тварини, то його потомство стає дуже погано пристосованим і, неминуче, гине (це мої умови). І ось вони їдять, плодяться і їх популяція все збільшується і збільшується, а, між тим, сонечко престає гріти так добре як раніше, травички ставати все менше (загалом, кажучи, змінюються умови довкілля) і тваринам ставати вже не так добре як раніше, а надалі все гірше і гірше. Наші кози виявилися розумнішими, ніж можна було припустити, і вони не стали чекати біля моря погоди, а розділилися на кілька груп і почали мігрувати, але невелика частина залишилася на колишньому місці і сказала: «Будь, що буде!». Частину тварин відправилася шукати кращого життя в гористу місцевість, а інша, навпаки, попрямувала в низину на берег моря, четвертої групі пощастило менше всіх, їх блукання завели в болото і про них нам більше нічого не відомо. Так, що ж відбувалося в дорозі з нашими тваринами?

Перша група піднімалася в гори все вище і вище, атмосфера ставала все разреженней і разреженней, а мета їх - альпійські луки, що знаходяться на висоті 3000 метрів. І ось їх, тепер вже, популяція поступово мігрує, постійно виникають мутації вже не відкидаються, як раніше, а обробляються відбором і залишаються, але тільки ті, які дозволяють козам виживати краще. Від колишнього геному мало що залишилося в незайманому вигляді: гени, що кодують такі білки, як гем і глобін розмножилися, утворивши кластери, це сталося в одного ягняти в сім'яниках, в ядрі однієї із, що готовий до мейозу, клітин, з-за випадкових перебудов ділянок ДНК і дуплікації генів, в процесі реплікації генетичного матеріалу. Сам козел має звичайну кількість генів гема і глобіну в своєму геномі, як у вихідній популяції, але ось частина його численних нащадків успадкувала від нього цю мутацію і вони стали краще виживати в умовах розрядженою атмосфери у високогір'ї, за рахунок більшої кількості експресують одночасно генів, а , отже, і з-за більшої кількості гемоглобіну (у вигляді, звичайно, еритроцитів) у крові. Ці нащадки краще виживають і розмножуються, залишаючи в популяції все більше тварин мають цей ознака. Загальний обмін речовин у тварин знижується, це відбувається по засобах зміни безлічі ферментних механізмів. Ось, наприклад, одна з молодих кізок, випадково, з'їла отруйну траву, сік якої містив канцерогени. Ці канцерогени викликали в її яєчниках ряд мутацій геномів яйцеклітин. Одна з мутацій призвела до заміни одного нуклеотиду в кодує ділянці ДНК гена фосфофруктокінази-1, через це одна з амінокислот, а саме лейцин, помінялася на фенілаланін, заміна відбулася не в активному центрі ферменту, і призвела тільки до незначної зміни в третинної структурі білка, і трошки відтягнула на себе загальний електричний заряд. Через цю мутації активність ферменту дещо знизилася, а, як нам відомо, фосфофруктокінази-1 головний ключовий фермент, що каталізує реакцію, що лімітує швидкість всього процесу гліколізу, отже, швидкість цієї реакції знизилася, як знизилася і швидкість гліколізу. У наших умовах це позитивний момент, і козлик, що народився поколінням пізніше, розповсюдив мутацію далі. Про подібні мутації можна друкувати годинами, але краще я трохи узагальню результат: у нашій нової популяції відбулися зміни, на генетичному, а відповідно і на фізіологічному рівні, які підвищили виживаність наших кіз в умовах високогір'я. Їх геном помінявся, щодо рівнинної популяції, внаслідок чого шерсть їх погустішала, в ній стало більше пухових шерстинок, обмін речовин сповільнилося, об'єм легенів зріс, а кров стала краще переносити кисень. І тепер вони пасуться на горбистому газоні Альпіка і радіють подиху свіжого зустрічного вітерцю.

А що ж сталося з групою, що йде до моря? Зараз ми подивимося! Будемо називати і цю групу грізним словом - популяція. А популяція наша йде в зону субтропіків, поступово спускаючись в родючий долину на березі моря, вкриту густими лісами. Клімат тут жаркіше, ніж в їхньому минулому місці проживання, вологість вище, вражає велика кількість інших тварин, серед яких зустрічаються і харчові конкуренти нашим козам, і кровожерливі хижаки. З нашої популяцією, як і з «гірської», починають відбуватися зміни, і виникають мутації починають фільтруватися через сито природного відбору. Починають виживати більш дрібні тварини, які краще прослизають між деревами, шерсть рідшає і, разом з тим, грубіє шкіра, щоб було не так жарко, але гілки не так дряпали тіло. Наших кіз підстерігають небезпеки, що виходять від хижаків, на кожному кроці. Дорослі тварини переміщаються по лісу невеликими групами, так простіше помітити підкрадається леопарда. Нюх у тварин, у цій популяції, загострилося і це допомагає їм швидше помітити загрозу. Але одна справа дорослі тварини, вони можуть помітити ворога і швидко втекти з небезпечної зони. А молодняк! Він дуже вразливий для хижаків, козенята протягом трьох місяців повинні пити молоко, і потім ще п'ять місяців пройде поки вони стануть самостійними. За перші три місяці життя помирає більше всього молодняку, і пересунути цей страшний, для популяції, поріг вийшло чисто випадково: шкіра у кіз ще мало пристосувалася до активного сонця і великій кількості ультрафіолету, короткохвильовий ультрафіолет є сильним мутагенним чинником. А один, недбайливий, козел занадто довго засмагав на узліссі, ощіпивая молодий кущ. Ультрафіолет викликав у його насінники, в однієї з клітин ще не вступила в сперматогенез, мутацію гена-регулятора, що відповідає за регуляцію експресії іншого гена (у нас буде «LX»), експресованого в молочній залозі у самок. Білок, експресуються геном LX, поліпшує проникність мембран клітин залози для жирів. В результаті у самок, які отримали цей новий алель гена-регулятора, молоко стало жирніше, і дитинчата стали рости швидше. Зменшився період підвищеного ризику у потомства, звичайно ж, цей ген поширився і закріпився в популяції. І так ми маємо тварин більш дрібних, в порівнянні з рівнинною популяцією, живуть вони невеликими групами в лісі, збираючись у великі стада тільки на період гону (де і відбувається активний обмін генетичною інформацією), обмін речовин у них дуже швидкий, шерсть рідкісна, молоко у самок дуже жирне. Одним словом наші тваринки відмінно пристосувалися до життя в своєму новому будинку.

Ну а тепер повернемося до наших прихильникам консервативного способу життя, тваринам залишилися «вдома». А ці кози пережили чимало негараздів, і їх популяція дуже сильно обміліла, холод і голод поглинули більшість тварин, а разом з ними і не народилися у них козенят. Дійшло до того що від усього стада залишилося всього три самці і вісім самок, як раптом (ну це звичайно зовсім з області фантастики), негаразди відступили, сонечко засвітило з колишньою силою і зазеленіла трава. Наша невелика група весело початку плодитися і бігати за рідними просторами, батьківщині їх далеких предків. І, уявіть собі, генотип у тварин практично не змінився (пошлемося на те, що стихійне лихо продовжувалося недовго), вони залишилися такими ж, якими завжди були ці тварини на рівнині.

І ось три наших популяції живуть на різних територіях, в різних кліматичних зонах і чудово себе відчувають. З першого погляду можна навіть не подумати, що вони походять від однієї гомоморфной рівнинної популяції, але це дійсні було так.

Відступимо трохи від лірики і підведемо невеликий, холоднокровний під підсумок: ми мали одну популяцію, у кожної тварини гени, що кодують одні й ті ж білки, однакові, та й білки у них теж однакові, з цього випливає, що кожен ген мав тільки одну аллель (сказати точніше, не мав не яку, був неалельних). Але ось наша популяція розбилася на кілька частин, і частини віддалилися один від одного, утворивши декілька популяцій. Гени у цих популяціях мутували, утворювали різні варіанти, і відбиралися такі варіанти, які були потрібні (для кожної популяції свої). З'явилися різні алелі одного і того ж гена, вони відповідають за ті ж функції, що й у степовій популяції (первинний тип), але з деякими особливостями. Повертаємося назад:

Як же ви думаєте? Що відбулося в цій історії далі? Ну звичайно! З'явився чоловік!

Наші кізоньки паслися собі і не знали горя, як раптом, в один прекрасний сонячний ранок (у горах, правда, лив дощ, але це опустимо), звідки не візьмися, з'явилося в кожному стаді по двоногого. Наші кози навіть вухом не повели й анітрохи не злякалися (навіть не знаю чому, за свого, напевно, взяли - за козла)! І ось двоногий все стадо побудував (складніше за все справа з «лісовими» йшла, поки всіх зібрав ...) і сказав, що він тепер ватажок, і всі повинні йому підкорятися! А кізоньки то, наші й полякались, подумали: «Нехай править, а те, як би чого не вийшло». І адже недаремно!

Зробимо невеликий відступ і поговоримо про наших трьох. Це чоловіки середнього зросту характери стримані, нордичні, хоча і родом вони з різних куточків Євразії. Так ось звуть їх Серхіо (той, що в ліс прийшов), Іван (на рівнині) і старий Джамбулат (горець, звичайно ж). Жити вони у нас будуть невизначену кількість часу. Один про одного, до пори до часу, і знати не знають.

Уявіть собі, що прийшли вони до наших козам багато років тому (тисячі 3), і ось стали пасти стада і творити в них, що їм заманеться.

Минають роки, наші молодці і старий Джамбулат мирно пасуть свої стада, ростять дітей (у Джамбулата їх 12), і всі примічають: у більш великої кози і козла потомство більше, у хворого-доходяги козенята слабкі, а у білої кози і чорного цапа козенята і білі і чорні народжуються. Про як! І думають вони: «Що за диво?!; Чому?; Навіщо?; Хто винен? і що робити? »Старий Джамбулат навіть чаклувати пробував, але крім дощу нічого не вийшло. Так і не вирішили вони, по першій, хто винен, зате, що робити зрозуміли: стали великих і сильних залишати, а маленьких і слабких їсти. А потім Серхіо свою улюблену козу постриг, що б їй не так спекотно було, а на шерсті її став спати. Навіть не знаю, чи він перший додумався її прясти, але факт у тому, що наші чабани (сподіваюся, що термін доречний) стали козлячі сорочки носити, а Джамбулат взагалі в кожусі цапиному ходити почав. Ну і по шерсті звірина відбирати почали, і по шкірі, складніше жити нашим чабанам стало: тепер звірина за багатьма ознаками відбирати треба! Зате шерсть та м'ясо з молочком зайві з'явилися, і почали вони потихеньку бартером торгувати з земляками, а Серхіо і за море плавав.

Так вони і жили, а між тим Левенгук мікроскоп винайшов, і мух всяких під ним дивився. На Кавказі Російська Імперія війну затіяла, а Іван і старий Джамбулат, тихо, мирно у себе кіз пасли. Все б так і продовжувалося, але от тільки Серхіо його економічна позиція в кінці 18 влаштовувати перестала, і почав він мудрувати, як, ж йому ефективність свого господарства підвищити? І ось колеги Серхіо, вчені люди, всякі системи оцінки та підбору стали вигадувати, мудровані, математичні. Ванька, то й слів тоді таких не знав, а про Джамбулата і взагалі говорити нічого, у цього на все одна відповідь була: «У! Шайтан! ». І ось ніби до 20 століття Серхіо самий просунутий став, система у нього оцінна складна, відбір жорсткий, і думав він, що всіх своїх «колег» (а про них він вже знав) за пояс заткнув, але не тут-то було! Русь то Матінка, виявляється, і не такі голови виношувала! Як тільки наука нова, генетика, з'явилася, наші відразу імена загриміли: Вавилов, Кольцов, Серебровський і багато інших. І зрозуміли наші чабани тоді, що не нечиста сила їх кіз фарбує, а гени їм від батька з матір'ю передаються всякі.

Так от ближче до справи. Народилася у нашої трійці ідея, створити спільними зусиллями нову породу овець, щоб і молоко жирне було, і вовни багато і на рівнині добре себе почувала. Для початку треба якісно оцінити, які тварини «дріб'язкові», які «шорстнее», і на основі Ванькіной степової вивести нову породу.

І ось думають, як оцінити? Серхіо то хороший, звичайно, але він на оболонку тільки козячу дивитися мастак, а земляк нашого Ваньки, А.С. Серебровський в 20-х роках 20-го ж століття, вперше теоретично обгрунтував ідею застосування маркерів в селекції, тоді він говорив про морфологічних моногенно успадкованих ознаках. Ідея то Ваньке сподобалася, але тільки ознак він таких небагато знайшов, та й ті які знайшов тільки двома алелями представлялися, а Ванька хоча б три хотілося. Але ідея надовго в шафі не затрималася, і в світі науки почалися активніше пошуки нових маркерів.

Ще в 19-му столітті Вейсман припустив, що спадкова інформація знаходитися в хромосомах, на початку 20 це вже було всім точно ясно. Ось і спробували вчені використовувати розбіжності у морфологічній будові хромосом в якості генетичних маркерів. Наявність будь-яких перетяжок на хромосомі або яких-небудь інших особливостей морфологічної будови хромосом, може бути пов'язано (може корелювати) з положенням будь-якого гена в певній алелі. Але і ці маркери не підійшли нашій трійці (тепер уже - селекціонерам), тому як дуже незначна кількість ознак корелює з такими морфологічними особливостями хромосом, які можна побачити на метафазної платівці через мікроскоп (тут і Левенгук згадався). Хоча, в деяких, випадках ці маркери все-таки можуть використовуватися.

І ось, нарешті, у світі знайшовся герой (а може і не один), який відкрив значний поліморфізм макромолекул, а саме білків. Метод ідентифікації цього поліморфізму був названий - електрофоретичного розділення білків. Це був справжній прорив у селекції рослин і тварин. Можна сказати, що саме в цей час справжнє народження пережила селекція за допомогою маркерів (MAS). Увага! наукова довідка:

Електрофоретичне поділ білків - це досить простий спосіб ідентифікації різних алелів цікавлять нас генів. Він не вимагає знати амінокислотну послідовність поліпептидного ланцюга білка і для аналізу не потрібно складного дорогого устаткування (камери для електрофорезу раніше (у союзі) взагалі своїми руками робили). Метод здатний диференціювати відмінності білків по заряду і довжині. Загальний заряд молекули білка може змінитися за допомогою точковой мутації, що призводить до заміни нуклеотиду, у нуклеотидної ланцюги і, як наслідок, до заміни однієї амінокислоти на іншу. Мені, правда, насилу представляється, що в білку, що складається із сотні амінокислот, заміна однієї амінокислоти на іншу, в багатьох випадках, може призвести до глобальної зміни електричного заряду, це, насправді, відбувається порівняно рідко. А подовження поліпептидного ланцюга може відбуватися через дублювання будь-якої нуклеотидної послідовності в гені (у експресіруещей частини гена). Взагалі вкорочення білка на одну (а то й дві) амінокислоти, або подовження на таку ж кількість, часто не відображаються, або дуже слабо відображаються, на його функціях (зворотна кореляція з розміром білкової молекули), якщо звичайно це не відбулося в активному центрі ферменту або в деяких інших випадках. Але якщо подовження або вкорочення білкового ланцюга, раптом, потягне за собою зміну заряду молекули, то в цьому випадку, з великою ймовірністю, може змінюватись його активність (якщо, наприклад, це фермент) і взагалі функціональність у діапазоні від підвищення активності, аж до повної дисфункції або взагалі негативного впливу на організм.

У нашому випадку про подовження поліпептидного ланцюга ми не говорили, та й про зміну заряду тільки в ковзати. Отже, використовуючи цей, метод наші герої не можуть розділити за алелями, жоден з описаних мною генів. Невеликий шанс є тільки у старого Джамбулата, білок фосфофруктокінази-1, в його стаді, трохи різниться, за величиною заряду, з білком фосфофруктокінази-1 в Ванькіном стаді. Для того, щоб побачити ці відмінності Джамбулат доведеться виготовити дуже довгу форезную камеру, добу готувати поліакріламідний гель і гнати в ньому білки годин 12, думаю, він навряд чи стане цим займатися. Але не подумайте, що метод поганий! Він не підійшов для нашого конкретного випадку. Його активно використовують зараз повсюдно в насінництві, тваринництві, рослинництві і в інших галузях сільського господарства.

Існують, також, спроби використати в якості маркерів поліморфізм груп крові тварин. Як відомо сільськогосподарські тварини мають складні системи груп крові, ряд учених спробував зіставити відмінності цих систем з продуктивністю тварин. Результати вивчення зв'язку молочної продуктивності корів з їх генотипічними особливостями - присутністю в крові тих чи інших факторів - дозволили перейти до розгляду цієї зв'язку на рівні окремих алелів груп крові. Корови - носії деяких алелів крові мають достовірне перевагу по удою і змістом жиру перед тваринами носіями деяких інших алелів крові, але існують і не корелюють з продуктивністю групи крові. Існують, також, переконливі дані, отримані при зіставленні молочної та жирномолочного продуктивності дочок батьківських пар, в різному ступені сполучаються між собою за генотипом. Але на жаль, це дуже мало досліджена залежність і поки не дозволяє на практиці використовувати групи крові у тварин як маркери. 2 Тому я тільки згадую в цій курсової про те, що такі роботи ведуться, і навіть не пропоную спробувати, нашим трьом «селекціонерам» , використовувати даний метод.

Довелося нашим героям чекати біля моря погоди, і вони дочекалися! Відкрилася нова ера в MAS - ера маркерів поліморфізму ДНК. Це робота не з продуктами експресії генів, а з сомою матрицею, вона відкриває майже безмежні можливості нашим селекціонерам.

Перший відкритий спосіб - це обробка геномної ДНК тварини або рослини сайтспеціфічнимі рестріктазами. Ферменти ділить ланцюжка ДНК за строго специфічним послідовностей, і виходять фрагменти ДНК різної довжини. Вони поділяються на електрофорезі по довжині. Метод носить назву поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ). Використовується кілька різних рестриктаз. Для аналізу необхідно досить велика кількість геномної ДНК, її ділять на порції і до кожної порції додають одну рестриктаз, створюють умови для реакції і проводять електрофорез, причому кожна доріжка це продукт однієї рестріктази. Потім ми дивимося, які довжини фрагментів ДНК відповідають аллелям досліджуваного гена. Для того щоб все стало ясно нам доведеться почитати мої додатки 3.

Додатки: це доповнення стосується не тільки ПДРФ методу, але ставиться і до наступних методів, і до поліморфізму електрофоретичної рухливості білків, і до груп крові. Насправді воно взагалі багато до чого відноситься. Спробую пояснити як раз на прикладі білків. Існує прямий спосіб визначення алелізм, тобто сам фермент, розганяється на електрофорезі, має кілька алельних варіантів рухливості та активності. А чи існує непрямий метод визначення алелізм по рухливості білків: наприклад міоглобін має два алельних варіанти і розрізняється по довжині, а активність і всі інші властивості у них однакові, але його алельні варіанти зчеплені з алельними варіантами якого-небудь пепсину. Отже, розганяючи міоглобін, ми можемо робити висновки про алелізм цього пепсину! Такий же непрямий принцип маркування ми бачимо в ПДРФ. У процесі мутацій можуть або утворюватися нові сайти рестрикції, або пропадати, а ще можуть дублюватися вже існуючі. Ці сайти успадковуються за законами Менделя, тому також можуть називатися алелями. Необхідно, спочатку, статистично встановити, з якими іншими алельними ознаками зчеплені сайти рестрикції, а потім, на підставі результатів електрофорезу, можна говорити про алелізм якогось гена. Для того щоб це встановити, нам необхідна велика кількість проб геномної ДНК, виділеної в багатьох тварин. Також необхідно знати, як між собою різняться алелі досліджуваної ознаки, і які тварини мають якусь аллель. Тепер ми «ріжемо» наші проби ДНК різними ферментами і звіряємо продукти їх електрофоретичного поділу по довжині. Для наочності я вирішив привести електрофоретичного розділення, рестрикційних фрагментів ДНК кіз. Зверху наведено назви рестриктаз, якими гідролізувати проби. Картинка з брошури Селекція XXI століття: використання ДНК-технологій.

Знаходимо аналогію (математичну кореляцію) між якими або довжинами відрізків і алелями цікавить нас гена. Сподіваюся, що зрозуміло пояснив, у противному випадку запитуйте прямо, писати не мій коник.

Наша трійця не може скористатися і цим методом, тому, що встановити які довжини фрагментів відповідають яким аллелям, що цікавлять нас, генів ми не можемо. У нас дуже мало матеріалу (мало розмаїття) для статистичної обробки.

Наступний народився метод це пряме визначення повної нуклеотидної послідовності фрагмента ДНК - сіквінірованіе. Метод дуже точний, якщо звичайно використовувати сучасний сіквінатор, але довгий і прилад дуже дорогою. Нам необхідно спочатку знати точні послідовності нуклеотидів у різних алелі генів або некодуючих послідовностей, зчеплені з алелізм якого-небудь ознаки. Знаючи це, ми беремо пробу ДНК у тварини і сіквеніруем її, чи не так просто в двох словах!? Але насправді сиквенирування - це геніально складний, в технічному виконанні, процес, заснований на геніально простому принципі. В даний час відомі послідовності ДНК багатьох генів можна дізнатися в Інтернеті за допомогою програми BLAST, багато чого я про неї не розповім, але підведу до того, що BLAST користується електронною бібліотекою сіквенсів генів, про них моя наступна довідка:

Довідка: Поява глобальної мережі «Інтернет» полегшила життя більшості дослідників (не будемо чіпати вчених таких країн як Північна Корея, їм анітрохи не полегшила), тепер вони маю можливість швидко і дешево спілкуватися між собою і проводити наукові роботи спільно, іноді навіть будучи незнайомими людьми . Створення електронних бібліотек генів в інтернеті - це, на мій погляд, яскравий тому приклад. Електронна бібліотека містить в собі сиквенсу різних генів істот нашої планети, і вона постійно поповнюється новим матеріалом. Якщо б я, наприклад, займався генетикою клопа, а саме його стійкістю до іонізуючим випромінюванням, і мені вдалося б виділити ген, відповідальний за білок, який визначає цю стійкість. То я б, по перше став мільйонером, а по друге отсіквеніровал б цей ген, що кодує цей білок, і запустив би сиквенсу в електронну бібліотеку під ім'ям «Родоназа клопа» (може, я б його так назвав). Тепер кожен учений, який виділив аналогічний ген, у якого-небудь іншої істоти, в анонімному вигляді і отсіквеніровавшій його, запускає в BLAST свою послідовність і отримує відсоток його аналогії з Родоназой клопа, всім добре, ну а мені краще всіх!

На даний момент у нашій країні (та й у багатьох інших країнах) існують електронні бібліотеки генетичних маркерів. Візьмемо для прикладу електронну бібліотеку генетичних маркерів в різних популяціях домашньої свині (Sus skrofa domesticus) інституту цитології і генетики СВ РАН. Бібліотека складається з великої кількості генетичних і кількісних ознак, що представляють первинну інформацію. Це дозволяє користувачеві на свій розсуд організовувати математичну обробку даних, будувати і перевіряти нові моделі і гіпотези. В даний час бібліотека представлена ​​окремими базами даних по свиням порід велика біла, кемеровська, скоростигла м'ясна і Семіречинські. Селекційно-генетична інформація представлена ​​символьними (у разі генетичних маркерів) і числовими (для опису кількісних ознак) полями. Формат баз даних дозволяє проводити статистичну обробку стандартними методами в середовищі FoxPro.

Створені бази даних дозволяють проводити пошук і фільтрацію даних по конкретних параметрів (наприклад, можливе складання підвибірок з заданим комплексним генотипом і оцінка кількісних ознак в певних групах). Молекулярно-генетичний сервер підтримує різні функції, такі як прийом і передача даних користувачеві; підтримка користувацьких проектів; статистична обробка; формування запитів та одержання даних з бази і т.д. Самі дані зберігаються в об'єктно-реляційному виставі під управлінням SQL сервера. Вихідні результати можуть бути представлені в різному вигляді, який користувач визначає при формуванні запиту. Наприклад, таблиці первинних даних, таблиці результатів статистичної обробки, графіки, діаграми і т.д. 4 Авторство останніх півтора абзаців належить якомусь ентузіасту з авторів статті «Електронні бібліотеки - 1999 - Том 2 - Випуск 3», я вирішив залишити цей шматок без зміни, насправді він потрібен не тільки щоб ​​збільшити обсяг моєї роботи (а це має місце бути), але і як сучасний приклад роботи з маркерами. Припустимо ми маємо кнура (майбутнього виробника), якого на наш погляд потрібно залишити на плем'я. Ми оцінюємо його за допомогою певного набору маркерів і вводимо дані в анализирующую систему нашої бібліотеки, вона видає, наскільки цей кнур відповідає стандарту і чим він краще або гірше вже наявних в бібліотеці кнурів. Якщо ми приймаємо рішення про злучці нашого кнура з племінної свиноматкою, то достатньо дати комп'ютера команду і система автоматично підбере нам оптимальних свиноматок.

Найголовніше, що я хотів донести в цій довідці це те, що у випадку з сиквенирування і багатьма іншими методами найлегше працювати, вже знаючи конкретні маркери, а от не знати, і знаходити нові маркери це вже зовсім інша тема, мимохіть я намагався пояснити про це в «Додатку». Так от наш просунутий селекціонер Серхіо має доступ до електронних бібліотек генетичних маркерів різних популяцій кіз і інтернету (на дворі у нас вже 21 століття, а наші чабани все зі своєї новою породою возяться, мабуть ще не клюнув). Так що ж будуть тепер робити наші молодці і старий Джамбулат?

До прямого сиквенирування вони також вирішили не вдаватися (ще на початку 80-х), щоб не розоритися і не влазити в борги. А пошуки їх тривали і, на превелику їх радості, в 1983 році Карі Малліс, одиночний геній, зробив революцію в науковому світі, відкривши полімеразно-ланцюгову реакцію (ПЛР, по англійський PCR). На базі ПЛР придумано безліч методик для роботи з ДНК у різних сферах науки і життя. Величезне поширення вони отримали і в сільському господарстві, зокрема в MAS. Можливостями деяких нових методів і вирішили скористатися наші чабани. Розповім, для початку, про то які ж це методи, хоча б про частину з них:

Не будемо вдаватися в подробиці про те, що ж таке ПЛР і як вона відбувається, як каже моя мама: «Це і їжаку зрозуміло!», Хоча питання спірне, навряд чи ця інформація якось допоможе йому краще вижити. І знову до справи! Перший метод, про який я хочу розповісти, чимось нагадує мені ПДРФ, але тільки по видимих ​​результатів, а називається він RAPD - PCR (Random Amplified Polymorphic DNA). Метод полягає в тому, що геномної ДНК, досліджуваного об'єкта, амплифицируют з декануклеотіднимі, виродженими праймерами (універсальними праймерами). Праймери гібрідізуються з комплементарними послідовностями на молекулі ДНК, ці комплементарні ділянки розташовуються на молекулі у випадковому порядку (не знаю наскільки в даному випадку доречно такий вислів, принаймні, ці праймери іноді називають випадковими). У процесі ПЛР ампліфіціруються ділянки, фланкованому цими праймерами. Потім ПЛР-продукт розганяється на електрофорезі, і ми бачимо картинку, можемо звірити її з «форез» іншої тварини. Чимось нагадує ПДРФ, чи не так? Розташування, комплементарних праймера, послідовностей має видові відмінності, а також може мати і внутрішньовидові відмінності, і успадковується за законами Менделя. За допомогою RAPD - PCR можна встановлювати походження чорної ікри (приклад взято з книги «ДНК технології у розвитку агробіології»), а можна (напевно) зв'язати поліморфізм ПЛР-продуктів з алелями будь-яких генів, як при ПДРФ (моє особисте припущення).

Знаючи нуклеотидну послідовність, яка нас цікавить гена, можна підібрати специфічні йому праймери. Як правило, мінімум 18-ти нуклеотидні (в деяких джерелах мінімум 17-ти нуклеотидні), і ампліфікувати сам цікавить нас ген. Таким чином, ми можемо ідентифікувати наявність або відсутність гена стійкості до захворювань, встановлювати підлогу у тварин на будь-якій стадії розвитку, у випадку якщо це утруднене, визначати наявність інфекційних збудників у внутрішньо середовищі організму, вірусних інфекцій і т.д. Існує безліч варіантів ПЛР: це і якірна ПЛР, і гніздовий, і інвертована ПЛР і т.д. Є, також, і поєднані методи аналізу, такі як ПЦР-ПДРФ,

ПЛР-ПДРФ - метод, при якому продукт ампліфікації піддають рестрикції і розганяють на електрофорезі (часто на поліакриламідному гелі, так як він має більшу роздільну здатність). У даному випадку всі використовувані принципи мною вже описані, ампліфікується фрагмент ДНК перевіряється на наявність точкових мутацій, що призводять до появи або зникнення в ньому сайтів рестрикції. Використовуючи цей метод можна розпізнавати алелізм досліджуваного гена і визначити його гомозиготність або гетерозиготність (якщо, звичайно, це еукаріот). Знову ж таки говорячи метод, дає результат не у всіх випадках. У цього методу є модифікації, але докладно говорити про них не будемо, причини я поясню нижче.

Про різні варіанти використання ПЛР, для ідентифікації поліморфізму можна говорити тижнями, а вже 6, через дві години мені треба йти гуляти з собакою і їхати в університет, а ще хочеться про гібридизацію розповісти і підсумки підвести. Та й загалом принципових відмінностей у множині методів ампліфікації немає, така величезна кількість методів зумовлено неймовірною складністю пристрою геному. Як невеликий підсумок хочу звернути вашу увагу на наявність двох основних принципів використання ПЛР, в одному випадку ми не знаємо послідовність досліджуваного гена і проводимо аналогію між зчепленням «алелів ампліфікації» і алельних становищем досліджуваного гена (або який-небудь іншій послідовності), а в іншому випадку ми знаємо сиквенсу нашої послідовності (зокрема гена) і працюємо з ним безпосередньо.

Необхідно звернути увагу на те, що методи поліморфізму ДНК дозволяють міркувати не тільки про наявність або алельними експресують послідовностей, але і про гени-регуляторах, і про неекспрессрующіх послідовностях, а також встановлювати гомо-чи гетерозиготність організму і ще купу всього цікавого 5.

А тепер поговоримо трохи про гібридизації. Гібридизація, в даному випадку, це утворення водневих зв'язків між комплементарними нуклеотидами двох одноланцюгових молекул нуклеїнових кислот (ДНК-ДНК; ДНК-РНК; РНК-РНК). Цей метод може використовуватися для картування геному (FISH), визначення гомології геномів різних організмів (GISH), для ідентифікації генетичних маркерів і багато чого іншого. Щоб використовувати гібридизацію в якості молекулярного маркера нам необхідно виготовити зонд (ну або купити його). Зондом називають відому нам одноланцюжкову послідовність ДНК або РНК, комплементарную шуканої нами послідовності (наприклад, гену), що володіє якою-небудь UA. Зонд може містити від 15 до 1000 нуклеотидів. У якості мітки можна використовувати флюрохроми або радіоактивні нуклеотиди. До речі кажучи, часто ДНК-зонди отримують за допомогою ПЛР у присутності мічених нуклеотидів або ще рядом методів.

Один з варіантів гібридизації - блот. Наприклад, Саузерн-блот (Southern-blotting, Southern-transfer) - це метод виявлення специфічних нуклеотидних послідовностей шляхом переносу, електрофоретичної розділених, фрагментів ДНК з агарозного гелю на нітроцелюлозні фільтр за рахунок капілярного ефекту (blotting - «промокання») і гібридизації ДНК- або РНК-зондом, комплементарним шуканої послідовності; освіта гібридів виявляють в основному методом авторадіографії. Метод розроблений Е. Саузерн і Р. Дейвісом в 1975. Якщо досліджувану геномної ДНК гідролізувати будь-якими рестріктазами, розігнати отриману суміш фрагментів на електрофорезі, перенести фрагменти на нітроцелюлозні фільтр і гібрідізовать їх з ДНК-зондом досліджуваної послідовності, можна вбити відразу двох зайців: виявити чи є обумовлена ​​послідовність у досліджуваного істоти і, якщо є , то в якому з рестрикційних фрагментів вона знаходитися. Подібний метод роботи з РНК називається Нозерн-блот, а з білками Вестерн-блот. За допомогою Нозерн-блотів можна виявити експресується або мовчить будь-якої ген у досліджуваній клітці, для цього треба провести гібридизацію відповідного ДНК-зонда з молекулами РНК, виділеними з клітки. За допомогою блотів можливо ідентифікувати і різні алельних варіантів генів, для цього необхідно виготовляти мінісателітних ДНК-зонди (довжиною 15-20 нуклеотидів), комплементарні ділянки точкової мутації на молекулі ДНК 6.

Методи гібридизації з використанням ДНК-зондів дуже гарні й нескладні. Вони дають точну інформацію про нас цікавить об'єкті, але має і недоліки, наприклад необхідність знати точну послідовність нуклеотидів в досліджуваному фрагменті ДНК або РНК. В даний час розроблений метод аналізу з використанням чіпів. Чіпи є платівки з іммобілізованими ДНК-зондами. Кожна така платівка може містити кілька десятків тисяч зондів, розташованих у певній послідовності. Мітка проявляється тільки в спарених дволанцюжкові фрагментах. Якщо в досліджуваному зразку є послідовності, комплементарні послідовностей зонда, то гібридизацію можна визначити візуально або за допомогою спеціальних приладів. Як правило, детектори з'єднані з комп'ютером, тобто процедура зчитування, і обробки інформації автоматизована.

Такі ДНК-чіпи можна застосовувати для комплексної діагностики інфекційних захворювань, спадкових дефектів, встановлення експресії тих чи інших генів (в цьому випадку йде гібридизація з мРНК), тобто відстеження порушень обміну речовин. Вони дешеві, дуже надійні, прості в обігу і може багаторазово використовуватися. Недолік - дорога апаратура для детекції.

Повернемося до наших кіз і подивимося, який же метод використовували для детекції наші чабани:

А користуватися вони стали найпоширенішим і універсальним - ПЛР діагностикою. Серхіо в інтернеті знайшов бібліотеку генетичних маркерів кіз, зроблену якимось дослідником до них, Ванька проаналізував які гени їм потрібні, а Джамбулат праймери потрібні на всіх замовив (напевно йому син допоміг). І почали вони кіз своїх оцінювати за допомогою маркерів. Відібрали кожен потрібних кіз і Ваньке привезли, почав він їх схрещувати. Після кожного схрещування все потомство знову за допомогою маркерів оцінювалося і так поки абсолютної однорідності з досліджуваних ознаками не домоглися. Отримали наші чабани нову породу, жирномолочна, густошерстную, рівнинну. Стали жити-поживати і добра наживати!

Висновок

Селекція за допомогою маркерів це нова, розвивається наука. В даний час вона набуває поширення на всі види сільськогосподарських тварин і рослин. MAS вже використовують в селекції свиней, коней, ВРХ, овець та інших тварин. В даний час внесок MAS в загальну селекцію не великий, але майбутнє саме за маркерами. Проблема продовольства в усьому світі вже дає про себе знати і це тільки початок. Екстенсивний розвиток сільського господарства призводить до глобального знищення природи, а їжі все одно починає не вистачати. Застосування нових методів селекції дозволить, з часом, перейти на інтенсивне господарство, отримати рослини і тварин набагато більшою продуктивність і більш стійких до різних факторів середовища. Якщо діяти з розумом, то в майбутньому перестануть нищити природу, шалене зростання населення землі припинитися, рівень населення стабілізується, с, порівняно, невеликих територій можна буде отримувати необхідну кількість продуктів харчування і сировини для промисловості. Є невелика надія, що людина нарешті заживе в гармонії з природою.

Як я вже говорив, MAS безпечна з точки зору екології та споживання продуктів харчування. Це один з реальних, з моєї точки зору, шляхів порятунку планети.

Майбутнє за селекцією за допомогою маркерів!

У своїй роботі я постарався своєю мовою пояснити своє власне розуміння застосування селекції за допомогою маркерів. Механізми адаптації та мутирование генів, які я наводив у роботі, придумані мною, але я намагався максимально наблизитися до реальних еволюційним механізмам. Всі особистості і назви генів, виключаючи вчених і фосфофруктокінази-1, є також вигаданими, будь-які аналогії проведені з реальними людьми будуть чистим збігом.

Список використаної літератури:

  1. П.М. Харченко, В.І. Глазко. ДНК-технології у розвитку агробіології. М: «Неділя», 2006, - 480 стор с илл.

  2. Дєєва B. C., Сухова Н.О. Групи крові великої рогатої худоби та їх селекційне значення / РАСГН. Сиб. отд-ние. Сиб-НІПТІЖ. - Новосибірськ, 2002. - 172 с.

  3. Л.А. Калашникова, І.М. Дунін, В.І. Глазко Селекція XXI століття: використання ДНК-технологій / Мінсільгосп РФ. ВНІІПлем. - Московська область, Лісові Поляни, 2001 - 50 с.

  4. www.elbib.ru/index.phtml?page=elbib/rus/journal/1999/part3/orlova - 36k -

  5. www.biotechnolog.ru/ge/ge7_1.htm - 10k

1 П.М. Харченко, В.І. Глазко. ДНК-технології у розвитку агробіології. М: «Неділя», 2006, - 480 стор с илл. стор 55-56.

2 Дєєва B. C., Сухова Н.О. Групи крові великої рогатої худоби та їх селекційне значення / РАСГН. Сиб. отд-ние. Сиб-НІПТІЖ. - Новосибірськ, 2002. - 172 с. стор 133-150.

3 Л.А. Калашникова, І.М. Дунін, В.І. Глазко Селекція XXI століття: використання ДНК-технологій / Мінсільгосп РФ. ВНІІПлем. - Московська область, Лісові Поляни, 2001 - 50 с. стор 5-15.

4 www.elbib.ru/index.phtml?page=elbib/rus/journal/1999/part3/orlova - 36k -

5 П.М. Харченко, В.І. Глазко. ДНК-технології у розвитку агробіології. М: «Неділя», 2006, - 480 стор с илл. стор 101-108.

  1. 6 www.biotechnolog.ru/ge/ge7_1.htm - 10k


Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Сільське, лісове господарство та землекористування | Реферат
111.1кб. | скачати


Схожі роботи:
Селекція 2
Селекція гладіолусів
Селекція і трансплантація в скотарстві
Селекція і походження культурних рослин
Селекція і вирощування волоського горіха
Селекція гороху сорту Чишмінський-95
Селекція гороху сорту Чишмінський-80
Селекція гороху сорту Чишмінський 80
Селекція гороху сорту Чишмінський 95
© Усі права захищені
написати до нас