Розробка умов оптимізації процесу ампліфікації ДНК

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Федеральне агентство з освіти
Пензенський державний педагогічний університет
ім. В.Г. Бєлінського
Факультет
Природно-географічний

Кафедра

Біохімії
Дипломна робота
Розробка умов оптимізації процесу ампліфікації ДНК
Студент _____________________________________________ Венедиктов А.А.
підпис
Керівник _________________________________________ Білецький І.П.
підпис
До захисту допустити. Протокол № від «____» ___________200_г.
Зав. кафедрою _________________________________________ Генгін М.Т.
підпис
Пенза, 2008 р.

Зміст

Введення
Глава 1. Огляд літератури
1.1 Real Time ПЛР
1.1.1 Види RealTime ПЛР
1.1.2 Кінетичні параметри
1.2 Біологічні мікрочіпи
1.2.1. ДНК-мікрочіпи
1.2.2. Гібридизація-основа технології
1.2.3. Застосування ДНК-чипів
Глава 2. Матеріал і методи
2.1 Виготовлення мікропланшетів
2.2 Визначення спектра поглинання та емісії SYBR green
2.3 Протоколи ПЛР
2.3.1 Постановка реакції з використанням фірмового набору (сістемаSYB green)
2.3.2 Постановка реакції без використання фірмового набору (сістемаSYBgreen)
2.3.3 Протокол полімеразної ланцюгової реакції з використанням TaqMan
2.4 Електрофоретичне поділ нуклеїнових кислот у зразках ПЛР-суміші після ампліфікації
2.5 Система детекції результатів аналізу
Глава 3. Результати та обговорення
3.1 Визначення залежності сигналу флуоресценції від концентрації ДНК
3.2 Проведення ПЛР в різних обсягах суміші в пробірках
3.3 Проведення ПЛР в пластикових мікропланшетах
3.4 Постановка ПЛР в мікрооб'ємах з негативними контролями
3.5 Електрофоретичне поділ нуклеїнових кислот у зразках ПЛР-суміші після ампліфікації
Висновки
Висновок
Список літератури

Введення.
З виникненням принципово нових напрямів в науці, в клінічній діагностиці успішно почали застосовуватися методи ДНК-технологій серед яких, безумовно, перше місце займають полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Не менш потужним і унікальним за своїми характеристиками методом є аналіз з використанням біологічних мікрочипів. Цей метод з'явився порівняно недавно, але вже інтенсивно застосовується в практиці.
В основі всіх ДНК-технологій, лежать процеси ампліфікації та реєстрації молекул ДНК.
Оптимізація умов даних процесів дозволить збільшити продуктивність, знизити вартість аналізу та підвищити його якість. Одним з можливих шляхів вирішення цього питання є об'єднання в єдину технологічну схему сучасних підходів у детекції ДНК.
В даний час можливі застосування подібних схем знаходяться на стадії розробки в ряді закордонних лабораторій. Найбільш вірогідним напрямком найближчого їх застосування є молекулярна діагностика спадкових захворювань та інші практичні додатки, засновані на виявленні однонуклеотидних поліморфізмів послідовностей ДНК людини.
Мета роботи - це спроба створити модель діагностичної системи за рахунок об'єднання переваг двох методів - кількісного виду ПЛР - Real Time і біочіпового аналізу, у зв'язку з чим були поставлені наступні завдання: виготовлення мікропланшетів з лунками, загальний обсяг яких не повинен перевищувати 2мкл (нині час використовуються мікроплашкі з лунками, розраховані на 200 мкл), переклад реакції у формат мікрочіпа і відпрацювання умов ПЛР в мікрообсязі (зазвичай ПЛР ставлять в обсязі 20-30 мкл, у форматі біочіпа загальний обсяг реакційної суміші не повинен перевищувати 1-2 мкл).
Робота виконувалася на базі лабораторії клітинної інженерії Інституту теоретичної та експериментальної біофізики РАН, м. Пущино.

Глава 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1. RealTime ПЛР
Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції був розроблений Кері Мюллісом в 1983 р. Перші повідомлення щодо практичного застосування методу з'явилися в 1985 р. [18] З тих пір кількість публікацій, де ПЛР використовується в якості одного з методів дослідження, займає одне з перших місць поряд з роботами, в яких застосовуються автоматичне визначення нуклеотидної послідовності (сиквенирування ДНК) і гібридізаційного технології. [7] Існує велика кількість способів отримати дані про концентрацію нуклеїнових кислот у пробі методом ПЛР, але всі вони вимагають додаткових трудомістких етапів роботи, пов'язаних з попередньою растітровкой виділеної з аналізованої проби ДНК, або отриманих в ході ПЛР амплікон, що призводить до збільшення часу, необхідного для постановки аналізу та складності інтерпретації отриманих результатів [12,15]. Також, наявність додаткових етапів роботи збільшує ймовірність помилки та отримання недостовірного результату.
На сьогодні існує метод, позбавлений перерахованих вище недоліків - це метод ПЛР в реальному часі (Real-Time PCR) [14]. Суть методу полягає в дослідженні накопичення продуктів ампліфікації за допомогою спеціального приладу без подальшого електрофорезу. Так як кінетика накопичення продуктів ампліфікації пов'язана з вихідним кількістю матриці, це дає можливість точно оцінити її кількість [13].
Відмінними рисами цього методу, на відміну від класичної ПЛР, є можливість кількісного визначення ДНК / РНК інфекційних агентів в досліджуваному матеріалі, відсутність стадії електрофорезу, менш суворі вимоги до організації ПЛР-лабораторії і автоматична реєстрація і інтерпретація отриманих результатів.
Відсутність стадії електрофорезу дозволяє мінімізувати ризик контамінації продуктами ПЛР і таким чином різко зменшити кількість хибнопозитивних результатів. Оскільки реєстрація результатів проводиться безпосередньо в процесі ПЛР, весь аналіз можна проводити в одній-двох кімнатах лабораторії і немає необхідності в окремому приміщенні для детекції продуктів реакції.
Використання математичних методів аналізу дозволяє проводити автоматичну інтерпретацію отриманих результатів і знімає проблему суб'єктивної оцінки Електрофореграма.
1.1.1. Види RealTime ПЛР
Для виявлення продуктів ампліфікації в режимі реального часу використовують такі найбільш поширені підходи.

Відщепленні 5 'кінцевий мітки (TaqMan Assay).

Дана методика заснована на використанні 5'-екзонуклеазну активності полімерази. У реакційну суміш додають ДНК-зонди, до складу яких входить флуоресцентна мітка в 5'-положенні і гаситель флуоресценції в 3'-положенні, а також фосфатна група в 3'-положенні. Ці зонди мають місця посадки всередині ампліфікується області. Гаситель поглинає випускається флуоресцентною міткою випромінювання, а фосфатна група в 3'-положенні блокує полімеразу (Мал. 1) В ході ПЛР під час стадії відпалу праймерів відбувається приєднання ДНК-зонда до комплементарного ланцюжка ДНК, причому чим більше продуктів ампліфікації утворюється в ході ПЛР, тим більше молекул зондів зв'яжеться з відповідними амплікон. Під час стадії елонгації полімераза синтезує комплементарную ланцюг ДНК і при досягненні зонда починає його розщеплювати завдяки наявності 5'-екзонуклеазну активності. Таким чином відбувається роз'єднання флуоресцентної мітки і гасителя, що призводить до збільшення Детектируемая світіння [13]. Очевидно, що чим більше амплікон було напрацьовано в ході ПЛР на даний момент часу, тим інтенсивніше буде свічення [19].

Рис. 1. Схема ПЛР в реальному часі з використанням зонда TaqMan. [7]
За допомогою серійних розведень зразків ДНК визначили чутливість системи ПЛР у реальному часі, яка в обговорюваній моделі дозволяла виявляти 0,28 нг (приблизно 20 копій) ДНК в пробі [8]

Використання зондів з комплементарними кінцевими послідовностями (molecular beacons).

Дана методика відрізняється від описаної вище тим, що кінцеві послідовності зонда є взаємно комплементарні області, тому при температурі відпалу праймерів вони сплющується і утворюють шпильки [16] (Мал. 2). Внутрішня область зондів містить нуклеотидну послідовність, комплементарную ампліфікується області. При відпалі праймерів зонди, що не приєдналися до ДНК матриці, залишаються в "схлопнутом" стані, так що відбувається гасіння флуоресценції.
Ті ж зонди, які отжигаются на матрицю, розгортаються, і флуоресцентна мітка і гаситель розходяться в різні боки. Таким чином, збільшується інтенсивність світіння. Системи ПЛР в реальному часі, засновані на Використанні зондів з комплементарними кінцевими послідовностями, мають набагато більшою специфічністю ніж система TaqMan, і дозволяє виявляти одиночні заміни нуклеотидів в ДНК. [8]

Застосування 2-х зондів з резонансним перенесенням енергії (Fluorescent resonance energy transfer - FRET).

Даний спосіб детекції накопичення продуктів ампліфікації відрізняється підвищеною специфічністю, так як збільшення флуоресценції відбувається при комплементарної зв'язуванні з амплікон одразу 2-х ДНК зондів [11] (Рис 3). Принцип методу полягає в перенесенні енергії від одного флуорофорів, що знаходиться на 3 `кінці першого зонда, до другого флуорофорів, що знаходиться на 5` кінці другого зонда, причому відстань між флуорофорів становить 1-3 нуклеотиду.

Рис. 3. Схема ПЛР в реальному часі з використанням зондів FRET [7].
При одночасному зв'язуванні обох зондів з ДНК матрицею випускається перший флуорофорів випромінювання передається на другий флуорофорів, а його випромінювання детектується приладом. Таким чином, зростає специфічність аналізу.

Використання інтеркалює агентів.

Цей спосіб детекції заснований на тому факті, що флуоресценція бромистого етидію та SYBR Green I значно зростає при їх впровадженні в дволанцюжкові молекули ДНК [14] (Мал. 4). Таким чином, можна спостерігати за накопиченням продуктів ампліфікації. Дуже важливо відзначити те, що збільшення флуоресценції може бути пов'язано як з накопиченням специфічного продукту, так і неспецифічного (праймери-димери, шмер). Для отримання коректних результатів необхідно додаткове вивчення отриманих амплікон за допомогою побудови так званих "кривих плавлення".

Рис. 4. Схема ПЛР в реальному часі з використанням інтеркалює барвників [7].
Підводячи підсумки, варто відзначити наступне: використання ДНК-зондів у тому чи іншому варіанті є найбільш переважним у світлі підвищення специфічності аналізу. Однак до недоліків зондів відноситься висока вартість, що робить роботу з підбору зондів, праймерів та умов ампліфікації дорогою. Разом з тим, використання інтеркалює агентів є дуже простим і дешевим. Відпадає необхідність добору спеціальних праймерів, зондів, так як можна користуватися вже використовуваними праймерами, ефективність роботи яких вже перевірена. Ці обставини роблять застосування інтеркалює агеннтов вельми привабливим.
1.1.2 Кінетичні параметри
Кінетична крива. Флуоресцентні барвники забезпечують флуоресценцію, прямо пропорційну кількості ПЛР-продукту - репортерний флуоресценцію. Механізми генерації репортерний флуоресценції різняться в залежності від типу real-time PCR.
Кінетична крива PCR у координатах "Рівень репортерний флуоресценції - цикл ампліфікації" має сігмоідную форму (Мал. 5).

Рис 5. Приклад кінетичних кривих RealTime PCR (за матеріалами www.molbiol.ru).
У ній можна виділити три стадії:
1. Стадію ініціації (коли PCR-продукти ще не детектується флуоресцентною міткою).
2. Експоненційної стадії (у якій спостерігається експонентний залежність кількості флуоресценції від циклу PCR).
3. Плато (стадію насичення).
Експоненціальна стадія PCR описується рівнянням:
P n = P 0 * E n (1) (www.molbiol.ru),
де P n - кількість молекул продукту / репортерний флуоресценції до циклу n, P 0 - вихідне кількість молекул, що містять ампліфікується фрагмент (template), E - ефективність ампліфікації. В ідеальних умовах E = 2, тобто на кожному циклі ланцюгової реакції відбувається подвоєння кількості продукту.
Прологаріфміруем обидві частини рівняння 1 і перетворимо його до виду:
n = - (1/log E) * log P 0 + log P n / log E (2) (www.molbiol.ru)
Назвемо пороговим циклом (threshold cycle, C (T)) такий цикл n, на якому досягається певний заданий рівень репортерний флуоресценції - гранична флуоресценція P C (T) = const. Для n = C (T) рівняння 2 приймає вигляд:
C (T) = - (1/log E) * log P 0 + log P C (T) / log E (3) (www.molbiol.ru),
тобто значення С (T) прямо пропорційно логарифму кількості субстрату (за матеріалами www.molbiol.ru) .. Таким чином, real-time PCR дозволяє порівнювати кількості субстрату за умови, що ефективність реакції і заданий рівень порогової флуоресценції однакові для кожної з порівнюваних реакцій [19].
Базовий рівень флуоресценції. Це той рівень флуоресценції, який спостерігається в реакційній суміші до появи репортерного сигналу. Як правило, керуючі програми real-time PCR дозволяють задати базовий рівень декількома способами. Необхідно вибрати такий спосіб, при якому:
1. Забезпечується мінімальний рівень флуоресценції до появи репортерного сигналу.
2. Початок експоненційної фази детектується з найбільшою точністю.
У загальному випадку, базову лінію слід вибирати як середнє значення флуоресценції в досить широкому діапазоні циклів до появи репортерний флуоресценції (тобто до початку детекції експоненційної фази). При виборі діапазону бажано також уникати і цикли поза експоненційної фази, у яких спостерігаються скачки флуоресценції.
Для SYBR Green, як правило, добре працює розрахунок базового рівня за середнім значенням в діапазоні циклів з 3 по 7 (перші 2 циклу не влючає в діапазон, оскільки на них може спостерігатися більш сильна флуоресценція через недостатньо стабилизировавшийся реакції).
Більш обережно треба вибирати базову лінію при TaqMan ампліфікації, оскільки до початку PCR у суміші може спостерігатися досить високий рівень флуоресценції від "зламаних проб" (у яких відбулася дисоціація маркера від гасників). Якщо "зламані проби" не превалюють, це не представляє великої небезпеки, і базова флуоресценція поступово сходить нанівець (зазвичай до 3-7 циклу). Як вже було сказано вище, в такому випадку початковий цикл діапазону потрібно вибирати такий, в якому флуоресценція від "зламаних проб" вже досягла мінімуму.
У деяких випадках флуоресценція від "зламаних" проб спостерігається і на більш пізніх стадіях PCR, до 20-25 циклу. Такий ефект небажаний, оскільки він створює труднощі при виборі базової лінії, що може призвести до "маскування" почала експоненційної фази. У такому випадку рекомендується збирати реакцію заздалегідь і інкубувати її в холодильнику 1 годину або більш до додавання ДНК (якщо реакції инкубируются в темряві і при температурі біля +4 o C, максимальний час інкубації практично необмежена) [20].
Свідченнями того, що базовий рівень обраний некоректно, є:
1. Значне "провисання" кривої флуоресценції нижче нульового рівня.
2. Позитивне значення флуоресценції в точці перегину (тобто початку експоненціальної фази).
"Провисання" часто є наслідком включення в розрахунковий діапазон циклів, при яких вже спостерігається початок експоненційної фази або, навпаки, початкова флуоресценція. Проте "провисання" може бути викликане також і вибором занадто вузького діапазону циклів, так що розкид базової флуоресценції в ньому виявляється істотно менше, ніж у середньому по всіх циклах.
Позитивне значення флуоресценції в точці перегину також зазвичай "виправляється" розширенням діапазону циклів. Такий ефект також може спостерігатися, якщо розрахунок ведеться за мінімальними, а не за середнім значенням діапазону.
Нагадаємо, що випливає з рівняння (1) залежність, яка відображається рівнянням (3) дозволяє порівнювати результати різних експериментів лише за умови, що P C (T) = const. Таким чином, рівень порогової флуоресценції P C (T) повинен бути однаковий для всіх порівнюваних зразків.
Граничний рівень флуоресценції. Репортерний флуоресценція найбільш точно відповідає залежності 3 на самому початку детекції експоненційної фази. На більш пізніх етапах внесок стохастичних ефектів у кінетику реакції стає все більш значним. Тому пороговий рівень флуоресценції вибирають на самому початку експоненціальної фази, коли стохастичні процеси не настільки великий.
Існує три основних способи вибору рівня порогової флуоресценції:
а) на-віч;
б) за перевищення над стандартним відхиленням кінетичної кривої;
в) за другою похідною кінетичної кривої.
При виборі "на око" за пороговий рівень вибирають мінімальний рівень флуоресценції, який у всіх проведених з даною парою праймерів реакціях відповідає початку експоненціальної фази. Хоча пороговий рівень повинен бути якомога нижче, при його досягненні реакція повинна вже "усталитись" - на першому циклі експоненційної фази похибка визначення репортерний флуоресценції звичайно досить висока (у тому числі і через те, що вибір baseline також має певну похибку). Зазвичай оптимальними є порогові рівні порядку 0.05-0.1 одиниць флуоресценції, в залежності від способу завдання базової лінії і від того, як веде себе реакція. Вибір "на око" є найбільш коректним з точки зору рівняння 3, за умови, що базова лінія обрана однаково і вимірювання проводяться одночасно. Таким чином, з нашої точки зору, їм має сенс користуватися, коли необхідно порівняти дані в одній плашці (або, в крайньому випадку, декількох експериментів, виконаних з використанням однакових реактивів, субстратів, на одній і тій же машині з невеликим проміжком часу) - наприклад, при налагодженні реакції. При порівнянні більш різнорідних даних визначення "на око" буде некоректним. Принцип двох інших методів полягає в тому, щоб стандартизувати вибір порогу не за абсолютним значенням, а з поведінки кривої. Вибір порога по перевищенню над стандартним відхиленням кінетичної кривої - це установка порогу таким чином, щоб перевищення порогового рівня над базовим рівнем (threshold над baseline) було досить малим, але вже статистично достовірним. Зазвичай вибирають значення в діапазоні 8-10 стандартних відхилень. Недоліком такого методу є те, що оскільки стандартне відхилення - це усереднена величина по всій кінетичної кривої, в якихось конкретних випадках поріг може виявитися занадто низьким (коли реакція ще не "устаканилася") або, навпаки, занадто високим (коли вже спостерігаються будь -то відхилення). Цих недоліків позбавлений наступний метод вибору порогу - за другою похідною кінетичної кривої. У такому разі, з усіх стрибків рівня флуоресценції за пороговий рівень вибирається найбільш різкий стрибок - абсолютний максимум другої похідної. Цей спосіб найменш чутливий до способу вибору базової лінії і відмінностей умов реакції (за матеріалами www.molbiol.ru).
Аналіз кривої плавлення. Оцінку якості реакції проводять по специфічності ампліфікації, визначеної з кривої плавлення (для SYBR Green). Крива повинна бути побудована в діапазоні температур від температури відпалу (при більш низьких температурах це робити не має сенсу) до температури повної денатурації - приблизно 95 O C. Для цього після закінчення ПЛР реакційну суміш нагрівають і безупинно вимірюють флуоресценцію. Після досягнення температури плавлення продукту ампліфікації флуоресценція різко знижується.

Рис. 6. Приклад кривої плавлення [7].
Кожне різке зменшення флуоресценції на графіку відповідає числу смужок, одержуваних на електрофорезі, тобто числа різних типів амплікон. Для полегшення роботи з отриманою інформацією проводять диференційний аналіз кривої плавлення. Такий спосіб візуалізації отриманих даних набагато зручніше для розуміння і аналізу.
Застосування кривих плавлення не обмежується тільки детекцией продуктів ампліфікації за допомогою бромистого етидію та SYBR Green I. При використанні кривих плавлення в системах з ДНК-зондами (Taq-man assay, beacons) можливо розрізняти точкові мутації, розташовані всередині областей зв'язування ДНК-матриці і зонда. Наявність таких мутацій здатне привести до зміни температури плавлення зонда і до змін у графіку кривої плавлення [11]. Використання кривих плавлення не вимагає від оператора ампліфікатора ніяких додаткових маніпуляцій з пробірками, а інтерпретація отриманих даних автоматизована і формалізована.
В ідеальному випадку, в реакціях з матрицею ми повинні спостерігати один пік (відповідний плавлення специфічного продукту), а контроль "праймери без ДНК" - слабкі, затухаючі стохастичні коливання у всьому діапазоні температур.
Обробка даних. Методи обробки даних real-time PCR засновані на застосуванні рівняння (3). Основний принцип обробки даних Real-time PCR - це - метод калібрувального графіка.
Цей метод передбачає побудову калібрувального графіка в координатах C (T) - log P 0 з серією розведень ДНК-стандарту, з якого знаходять концентрацію субстрату (P 0) в експериментальних зразках.
Точність методу залежить від того, наскільки умови PCR (і, перш за все, ефективність ампліфікації) серії стандартів близькі до умов PCR експериментальних зразків. Тому при виборі стандартів необхідно керуватися наступними правилами:
а) стримані домішок у стандартному препараті повинно бути схоже з таким в експериментальному препараті;
б) для ампліфікується фрагмента в стандартній ДНК повинна бути близька до такої в експериментальній ДНК;
в) серія розведень стандартної ДНК повинна охоплювати весь діапазон можливих концентрацій субстрату в експериментальній ДНК.
Якщо достатньо визначити лише відносну концентрацію субстрату, для побудови калібрувального графіка зручно використовувати серію розведень одного з експериментальних зразків. У тих випадках, коли зразки можуть сильно відрізнятися по домішках і частці ампліфікується фрагмента в реакційній суміші, має сенс при налагодженні експерименту приготувати серію розведень кожного з них і порівняти ефективності.
У тих випадках, коли потрібно оцінити "абсолютне" кількість субстрату, вибір стандартів для градуювального графіка являє собою більш складну задачу, оскільки з одного боку, необхідно знати точну кількість. Для визначення кількості матриці в RT-PCR запропоновані наступні варіанти стандартів:
1. очищений RT-PCR-продукт;
2. рекомбінантна ДНК;
3. рекомбінантна РНК з наступною зворотною транскрипцією;
4. синтетичний олігонуклеотиди, що містить ампліфікується послідовність.
При використанні очищених препаратів в реакцію завжди необхідно додавати неспецифічні ДНК, щоб наблизити умови реакції до експериментальних. Для RT-PCR це можуть бути, наприклад, зворотні транскрипти бактеріальної РНК, polyA-РНК, тРНК або рРНК. Проте наскільки б умови реакції зі стандартними зразками не були наближені до експериментальних, "абсолютна" визначення, як і раніше залишається розрахунком щодо стандарту.

1.2. Біологічних мікрочіпів
Останнім часом активно розвиваються ДНК-технології, які дозволяють не тільки визначати ознака, а й одночасно проводити диференціальний сиквенсу, тобто визначення точкових мутацій або поліморфізму у відомих ділянках геному. Дані технології мають значні переваги перед традиційними молекулярно-біологічними методами, тому що вони дозволяють миниатюризировать досліджуваний зразок і аналізатор, що значно знижує вартість аналізу і час його проведення, а також одночасно визначати різні параметри досліджуваного зразка, причому без втрати чутливості ампліфікаціонних методів [6]. Головною перевагою методів заснованих на використанні чіпів з олігонуклеотидами всіх можливих нуклеотидних послідовностей даної довжини, є їх універсальність. Наявність на чіпі олігонуклеотиду будь-якій послідовності робить можливим аналіз будь-якої досліджуваної послідовності [4]. В основі застосування мікрочіпів лежить принцип швидкого визначення взаємодій тих чи інших лігандів з безліччю різних зондів одночасно. Власне біологічні мікрочіпи являють собою ту чи іншу тверду підкладку, на якій нанесені або певні фрагменти нуклеїнових кислот, або білки, або вуглеводи, або будь-які інші молекули-зонди, здатні бути впізнаними чи виявляти біологічну активність. Кількість різних зондів на підкладці може досягати сотень тисяч, причому чіпи кожного типу суворо ідентичні і за існуючих технологіях можуть бути реплікувати в сотнях тисяч і мільйони копій нанесених на підкладку [1].
1.2.1 ДНК-мікрочіпи
Існують білкові, ДНК, вуглеводні, тканеие чіпи. Особливої ​​уваги заслуговують ДНК-чіпи. Вони представляють собою унікальний аналітичний інструмент, що дозволяє визначати наявність в аналізованому зразку (як правило, біологічного походження) заданих послідовностей ДНК (т.зв. гібридізаційного аналіз). Проведення аналізу за допомогою ДНК-чипів обходиться в кілька разів дешевше, ніж при використанні альтернативних технологій (електрофорез, ПЛР в реальному часі) і допускає, при наявності детектора нескладної конструкції, роботу поза лабораторією.
Вперше ДНК-чіпи були використані в дослідженнях в кінці 80-х років минулого століття [10]. В основі цього тепер вже широко розповсюдженого методу, що дозволяє одночасно аналізувати експресію безлічі генів, лежить принцип пізнавання мРНК-ових або кДНК-ових мішеней за допомогою їх гібридизації з іммобілізованими на мікрочіпі одноланцюжковий фрагментами ДНК.
ДНК-чіп - це тверда підкладка, на якій іммобілізовані (як правило, ковалентно) однониткових фрагменти ДНК різної довжини: короткі - 15-25 нуклеотидів, довгі - 25-60 нуклеотидів і кДНК фрагменти - від 100 до 3000 нуклеотидів. В якості матеріалу підкладки використовують скло, кремній, різні полімери, гідрогелі (наприклад, на основі поліакриламіду) [17] і навіть золото [3].
1.2.2. Гібридизація-основа технології
Основа всіх сучасних ДНК-технологій - гібридизація. У результаті гібридизації молекули нуклеїнових кислот здатні формувати стійкі дволанцюжкові структури завдяки зв'язкам між елементами молекул - нуклеотидами. Нуклеотид аденін (А) компліментарний тимін (Т), гуанін (Г) - цитозину (Ц). У результаті одноланцюжкова послідовність нуклеотидів АТГЦ буде утворювати стабільну асоціацію, двухцепочечную структуру, з одноланцюжковою молекулою ДНК складу ТАЦГ.
... .. АТГЦ ....
| | | |
... .. ТАЦГ ....
Подібна комплементарність призводить до «злипання» двох молекул ДНК, одна з яких може бути нерухомо закріплена на підкладці, і бути елементом ДНК-чіпа. Чим більше міститься в зразку молекул комплементарних елементів чіпа, тим більше їх буде зв'язуватися з чіпом, і тим вищою буде інтенсивність сигналу, сприйманого від цього елемента. На рис. 9 показаний принцип дії осередку ДНК або олігонуклеотидно біочіпа, заснований на комплементарних взаємодіях підстави аденіну (А) з тиміном (Т) і гуаніну (G) з цитозином (С) у двох нитках ДНК. Якщо послідовність підстав в одній нитки ДНК (або олігонуклеотиду) повністю комплементарна послідовності іншої нитки, то утворюється стабільна досконала двухнітчатая спіраль - дуплекс. Проте присутність в дуплексі навіть однієї неправильної пари, наприклад GG, запобігає утворенню дуплексу. Якщо іммобілізувати в одному з елементів мікрочіпа специфічну одноланцюжкову ДНК або, покладемо, 20-мірний олігонуклеотиди (пробу), то при додаванні до мікрочипу мічених флуоресцентними барвниками фрагментів ДНК, наприклад геному людини, відбуватиметься їх високоспецифічні взаємодію. Поставлене олігонуклеотидно елемент біочіпа специфічно зв'яже тільки одну комплементарную послідовність з 4 20 = 1.09х10 12 всіх можливих послідовностей цієї довжини в ДНК. У результаті флюоресцентні світіння спостерігається тільки на цьому комплементарної елементі біочіпа. Таким чином, один елемент біочіпа виробляє одну вибірку приблизно з трильйона можливих варіантів, на відміну від елемента електронного чіпа, де відбувається двійкова вибірка: ТАК чи НІ [5].

Рис. 9. Схема освіти подвійної спіралі ДНК на біочіпе.Олігонуклеотід фіксований на одному з елементів біочіпа і вибірково пов'язує з багатьох флуоресцентно мічених фрагментів ДНК лише комплементарний. У результаті тільки цей елемент починає світитися. Це відбувається завдяки високо-специфічним взаємодіям комплементарних пар нуклеотидів А з Т і G з З. Присутність некомплементарной пари, наприклад GG, запобігає взаємодія і залишає елемент мікрочіпа темним [5].
Використовувані для визначення параметрів гібридизації пристрої дозволяють реєструвати не тільки кінцевий результат, а й кінетику асоціації і дисоціації комплементарних ланцюгів. Ці технології, роблячи можливим багатопараметричний аналіз зразків, можуть надавати велику кількість інформації. Результати гібридизації залежать від довжини ДНК - проби, хімічного складу міченої ДНК - мішені, температури, при якій проводиться гібридизація, складу гібридізаційного суміші, типу флуоресцентної мітки. Тут необхідно зазначити, що в ДНК-чіпах в основному використовується пасивна гібридизація, тобто взаємодія ДНК-мішені з иммобилизованной пробою є імовірнісним процесом і залежить від різних умов.
1.2.3. Застосування ДНК-чипів
Оцінка стану та ідентифікація всіх генів досліджуваного організму є однією з найважливіших завдань, поставлених перед розробниками ДНК-чипів. Вирішення цього завдання може бути реалізовано в іммобілізації всіх генів організму на біологічний чіп, що дозволить комплексно оцінити стан генів і геному в цілому. Біогенетичні бази даних, що містять всю інформацію (систематизовану) за генами і геномам різних організмів, представляють дослідникам величезні можливості в дизайні ДНК-чипів.
До основних причин широкого розповсюдження біочіпових ісследовіаній відносять високу чутливість, специфічність і відтворюваність, простоту процедури виконання, можливість одночасного аналізу безлічі параметрів і відносно невисоку вартість робіт. Ці ж причини змушують розглядати біочіпи як перспективний інструмент в різних галузях народного господарства [9].
Підводячи деякі підсумки потрібно відзначити, що мікрочіпи є ефективним підходом для одночасної ідентифікації від десятків до тисяч генів і їх структурного аналізу, для виявлення специфічних нуклеотидних послідовностей та нуклеотидних варіацій в їх структурі. Проте, коли гени присутні в геномі в кількості однієї або декількох копій, з чим постійно і доводиться стикатися в клінічній практиці, потрібно їх попередня ампліфікація. Найбільш ефективним методом ампліфікації ДНК є полімеразна ланцюгова реакція, в процесі якої відбувається експоненціальне збільшення кількості молекул ДНК від кількох до мільйонів і більше копій, а основна перевага такого виду ПЛР як Real Time, дозволяють давати навіть кількісну оцінку досліджуваної матриці. Це має важливе значення для вирішення завдань у галузі розвитку фундаментальних та інтегральних наук, а так само оптимізації умов методів діагностики.
Отже, два методи, що стали вже традиційними для деяких галузей науки і прикладних технологій, на ряду зі своїми недоліками мають абсолютно унікальні гідності.
RealTime ПЛР:
· Дає можливість оцінювати кількість вихідної матриці;
· Не вимагає додаткових трудомістких етапів роботи;
· Відсутність стадії електрофорезу дозволяє мінімізувати ризик контамінації і таким чином зменшити кількість хибнопозитивних результатів;
· Використання математичних методів аналізу дозволяє проводити автоматичну інтерпретацію отриманих результатів і знімає проблему суб'єктивної оцінки Електрофореграма;
· Забезпечує менш суворі вимоги до організації ПЛР-лабораторії і автоматичної реєстрації та інтерпретації результатів;
· Дозволяє економити час.
Біологічні мікрочіпи:
· Дозволяють миниатюризировать зразок і аналізатор;
· Економить час і вартість аналізу;
· Дозволяє одночасно визначати кілька параметрів досліджуваного зразка;
· Убладает високою чутливістю ампліфікаціонних методів, специфічністю і відтворюваністю;
· Забезпечує простоту процедури виконання роботи.
Можливо, що об'єднав цих методів за рахунок переведення полімеразної ланцюгової реакції у формат мікрочіпів дозволить створити діагностичну систему нового покоління, яку будуть характеризувати такі якості: більш висока чутливість і, головним чином, специфічність визначення нуклеїнових кислот, висока продуктивність при низькій собівартості виконання аналізу, загальне скорочення кількості маніпуляцій в межах кожного етапу аналізу.

Глава 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Поставивши перед собою мету об'єднати переваги методів, ми зіткнулися з низкою перешкод, що стосуються інструментального забезпечення дослідження. Проведення полімеразної ланцюгової реакції в мікрообсязі вимагає певного технічного оснащення. Сучасний ринок пропонує мікропланшет, обсяг лунок яких складає не менше 200 мкл. Проведення ПЛР в мікрообсязі в подібних планшетах суперечить умовам нашого експерименту. Крім того, сучасні ампліфікатора не дозволяють маніпулювати формами термоблоків. У зв'язку з цим перед початком досліджень необхідно було створення експериментальної апаратної бази для ампліфікації та реєстрації сигналів, виготовлення мікропланшетів з лунками, загальний обсяг яких не повинен перевищувати 2 мкл.
2.1. Виготовлення мікропланшетів
Для експерименту були виготовлені пластини розміром 50х50 мм з робочою зоною 20х20 мм з різною кількістю лунок (до 91 шт). При виготовленні планшетів ми керувалися розміром термокамер в експериментальному зразку ампліфікотора, тому такі їх довжина і ширина є оптимальними. Схема ампліфікатора представлена ​​на рис. 10.
Матеріал, з якого мають бути виготовлені плашки повинен володіти наступними властивостями:
ü термостійкість (матеріал повинен витримувати мінімум 95 С-найвища температура в циклі);
ü міцність (не повинен піддаватися деформації навіть при незначних механічних впливах);
ü хімічна інертність (матеріал не повинен взаємодіяти з компонентами ПЛР суміші);
ü дешевизна (матеріал повинен бути не дорогим і доступним).
Експериментально був підібраний матеріал, який володіє всіма перерахованими вище якостями - це полімерна плівка Aikor DecoDesign Black (виробництво Німеччина). Виготовлення плашок робили шляхом термоформовки на металевій матриці за допомогою металевого пуансона-позиціонера як показано на рис 11. В результаті отримували планшети з лунками обсяг яких бал дорівнює 1,5 мм 3.
2.2 Визначення спектру поглинання і емісії SYBRgreen
У RealTimeПЦР використовують як описано вище кілька видів зондів. У своїх дослідженнях ми використовували SYBR Green. При виборі зондів ми керувалися декількома параметрами, у тому числі вартість, сумісність з системою детекції і т.д. Технології Molecular beacons і LightCycler коштують відчутно дорого, і їх осмислено застосовувати лише в тому випадку, коли потрібно вкрай специфічна детекція лише одного з утворюються PCR-продуктів (наприклад, при аналізі SNP). Методики SYBR Green і TaqMan коштують дешевше, однак кожен з них має свої особливості. У таблиці 1, наведеної нижче, порівнюються методики SYBR Green і TaqMan. У наших дослідженнях ми використовували ці системи. Вони активно використовуються в RealTimeПЦР для визначення кількісних параметрів ПЛР безпосередньо в ході реакції. Однак ми для вирішення поставлених завдань користувалися цими методиками для детекції сигналу по кінцевій точці.
У своїй роботі ми використовували флуоресцентний інтеркалює барвник SYBRgreen (10000 кратний стік виробництва фірми «ДНК-синтез») і набір компонентів для проведення ПЛР з використанням TaqMan, синтезованих компанією «синтол» (напрацьований продукт ампліфікації має розмір близько 100 пар основ).
Барвник SYBR Green - винятково чутливий флуоресцентний індикатор дволанцюжкової ДНК. Застосовується для realtime-PCR, а також для прокраські гелів (як агарозного, так і поліакриламідних). Межа виявлення дволанцюжкової ДНК для SYBR Green становить 1-2 нанограма для коротких синтетичних олігонуклеотидів і до 20 пикограмм високомолекулярної природної ДНК. SYBR Green I має істотно високу специфічність щодо ДНК-дуплексу і є більш безпечним у порівнянні з іншими барвниками - вiн не має високого рівня мутагенної дії.
Методика
Переваги
Недоліки
SYBR Green
Значно дешевше зібрати нову реакцію, тому що достатньо лише замовити нові праймери.
Неможливість працювати більше, ніж з одного PCR-реакцією в одній реакційній суміші.

Високі вимоги до специфічності реакції - будь-яка двуцепочечной ДНК, в тому числі димери праймерів, буде генерувати репортерний флуоресценцію.

Менша точність при малих кількостях субстрату.
Окислення з часом
TaqMan
Можливість проведення декількох колічествленних реакцій в одній суміші.

Менші вимоги до специфічності реакції: репортерний флуоресценція буде генеруватися тільки при гібридизації проби зі специфічним PCR-продуктом.

Більша точність при малих кількостях субстрату.
Дорожнеча. Новий зонд (близько $ 200) для кожної реакції.

Менше можливостей для оптимізації (якщо реакція не пішла з даною комбінацією зонда і праймерів, то, швидше за все, доведеться замовляти новий зонд і нові праймери).
Дані про флуоресценції: максимум флуоресценції в комплексі з ДНК складає 521 нм, максимум порушення - 497 нм (другий максимум близько 254 нм). Добре збуджується стандартним 488-нм лазером. Квантовий вихід флуоресценції - близько 0.8 (що в 5 разів перевищує квантовий вихід комплексу етидій-ДНК). Зазвичай SYBR Green добре працює приблизно до C (T) = 35-37, потім точність починає падати. Діапазон достовірності результатів легко перевірити для кожної конкретної пари праймерів, провівши кілька незалежних real-time PCR.
У системі TaqMan використовували зонд, мічений барвником FAM і має таку послідовність:
5 ' (FAM) - СTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG - (TAMRA) - 3 ' . Довжина 33 нуклеотиду. Молекулярний вага 10137. Довжина хвилі збудження FAM 470 нм, довжина хвилі емісії 525 нм.
Перед роботою визначали спектр поглинання і випускання світла інтеркалятора на приладі Perkin Elmer MPF-44-B Fluorescence Spectrophotometer. Результати вимірювань представлені на рис. 13.

Рис. 13. Графік залежності сигналу фотодетектора від довжини хвилі.
На малюнку синьою кривої зображений спектр поглинання світла барвником. Крива отримана при емісії зразка 520нм. Видно що SYBR поглинає світло довгою 260нм (перший пік). Другий пік доводиться на 470 і 495 нм. Зелена крива показує спектр випускання довжини хвилі. Відповідно до неї, інтеркалятор випромінює світло з довжиною хвилі 520 нм. Ця крива отримана при порушенні зразка довгої хвилі 470 нм.
2.3. Протоколи полімеразної ланцюгової реакції:
2.3.1. Постановка реакції з використанням фірмового набору (система SYBgreen)
  Для ПЛР як матрицю використовували плазміду pcDNA3 cavmut - плазмідний вектор, що містить кДНК мутантного кавеолина (P132L) людини (вихідна концентрація 0,7 мг / мл), пару праймерів pc1 (ісх.конц. 31 мкМ) і pc2 (ісх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen (10000 кратний розчин) і taq-полімеразу. Фермент поставляється фірмою Sigma в наборі c буфером в ліофільних стані в комплекті з розчинником. Кіт розрахований на загальний обсяг суміші 20 мкл. Амліфіціровался ділянку (фрагмент) розміром близько 650 пар основ
Постановка ПЛР:
· 7 нг матриці,
· 0,2 мкМ pc1,
· 0,2 мкМ pc2,
· Деіонізірованная (milliQ) дистильована вода до 10 мкл,
· 10мкл розчинника,
· 0,2 мкл SYBRgreen (розведеного в 100 разів).
Для експерименту використовувалися мікропланшет власного виготовлення. В якості контролю служила лунка з ПЛР-ної сумішшю без матриці. Для відпрацювання умов ПЛР в мікрообсязі проводили 30 циклів. Реєстрацію флуоресценції проводили по кінцевій точці. Температурний режим (1 цикл):
94 о С 120 сек
1 цикл
94 про 20 сек
30 циклів
60 о 20 сек
72 о С 40 сек
і після закінчення потрібної кількості циклів
72 о С 120 сек
2.3.2. Постановка реакції без використання фірмового набору (система SYBRgreen)
  В якості матриці використовували плазміду pcDNA3 cavmut (вихідна концентрація 0,7 мг / мл), пару праймерів pc1 (ісх.конц. 31мкМ) і pc2 (ісх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen і комплекс ферменту (taq-полімераза) з антитілами - так званий Hotstart, 10-кратний сток буфера, розчини dNTP і MgCl 2. Зв'язування полімерази з антитілами потрібен для того, щоб фермент починав свою роботу тільки при високих температурах (перша температура кожного циклу реакції - 94 о С), а при кімнатній залишався неактивним. Загальний обсяг суміші 20 мкл. Амліфікаціі піддавався ділянку розміром близько 650 пар основ
Постановка ПЛР:
· 7 нг матриці,
· 0,2 мкМ pc1,
· 0,2 мкМ pc2,
· Деіонізірованная (milliQ) дистильована вода до 14 мкл,
· 2 мкл SYBRgreen,
· 2 мкл буфера (сток х 10),
· 2 мкл 2ММ MgCl 2,
· 0,2 мкл taq-полімерази (5Е/мл),
· 0,4 мкл 0,2 мМ dNTP (нуклеотідтріфосфоти).
Для експерименту використовувалися мікропланшет власного виготовлення. В якості контролю служила лунка з ПЛР-ної сумішшю без матриці. Для відпрацювання умов ПЛР в мікрообсязі проводили 30 циклів. Реєстрацію флуоресценції проводили по кінцевій точці.
Температурний режим (1 цикл):
94 о С 120 сек
1 цикл
94 про 20 сек
30 циклів
60 о 20 сек
72 о С 40 сек
і після закінчення потрібної кількості циклів
72 о С 120 сек
2.3.3. Протокол полімеразної ланцюгової реакції з використанням TaqMan.
На одну пробу об'ємом 20 мкл змішують:
· 8,75 мкл суміші А,
· 8,75 мкл суміші Б,
· 0,2 мкл Taq-полімерази,
· 2 мкл ДНК.
95 про З 5 хв
1 цикл
95 про З              20 сек
40 циклів
62 о С              20 сек
72 о С 40 сек
і після закінчення потрібної кількості циклів
72 о С 40 сек
2.4 Електрофоретичне поділ нуклеїнових кислот у 8% ПААГ
Для приготування гелю було використано.
gels
1
2
H 2 O (мл)
3,7
7,4
30% АА / bAA (29:1) (мл)
1,87
3,74
5х ТВЕ (мл)
1,4
2,8
TEMED (мкл)
20
40
10% PSA (мкл)
27
54
Збирали касету з вертикальними пластинками. У гель вносили полімеризатори, перемішували і заливали 4.2 мл між пластин. Після повної полімеризації гелю між стекол вставляли гребінку. Після полімеризації гелю пластини витягували з касети і поміщали в камеру для електрофорезу. Заливали електродний буфер наступного складу:
0,5 М ЕДТА, рН = 8.0,
0,4 Borie Acid,
0,4 Tris.
Витягували гребінку з гелю, не деформуючи кишені. Піпеткою або шприцом промивали кишені від неполімерізовавшейся рідини електродним буфером. Вносили ДНК проби в кишені піпеткою, V = 5 мкл. Підключали камеру до джерела струму. Електрофорез проводили від мінуса до плюса при постійній силі струму I = 20мA на одну пластину, поки що лідирує барвник не виходив з гелю (бромфеноловий синій), близько 40 хвилин.
2.5. Система детекції результатів аналізу
Після ампліфікації реєстрацію флуоресцентного сигналу проводили на експериментальній установці, зібраної на базі бінокулярного мікроскопа МБС-11 (Росія) c телевізійним адапторов TV-A і камерою фірми «Wateс» (Japan) WAT-120 N. Сигнал з камери подавався на плату відеозахвату «PixelView CX 881 P», що знаходиться на шині IDE персонального комп'ютера типу IBM PC. За допомогою установки реєстрували сигнал (збудження - 470 нм, емісія - 520 нм), обробляли за допомогою програми «Qwantа» (оригінальна розробка лабораторії).
Він поділений на 4 частини. Перша-Capture window - це онлайн вікно, в полі якого проектує зображення лунки із зразком. Ліве темне поле - це поле захоплення зображення. Тут за допомогою настройок можна вказувати розташування області вимірювання, межі якого позначені зеленою окружністю, встановлювати розмір і зберігати зображення. Нижні поля - «розрахункові дані експерименту» і «вимірювання в поточному кластері» дають можливість знімати показання вимірювань і маніпулювати їх розрахунками. Програма так само дозволяє знімати запам'ятовувати й обробляти свідчення флуоресценції не тільки з одного, як показано на малюнку, але і з декількох рядів лунок із зразками.
Обладнання складається з двох корпусів. Корпус номер 2 має предметний столик, куди кладеться аналізований чіп. На корпусі 1 закріплені світлодіодна матриця і цифрова ТV-камера. Об'єктів камери має знімні оптичні фільтри. При аналізі зразків з SYBRgreen використовували зелений світлофільтр, відповідний довжині хвилі випускається їм. Світлодіодна матриця складається з декількох джерел світла, довжина хвилі якого відповідає спектру збудження барвника. На малюнку це зображено синіми стрілками. Зеленими показана емісія.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ
3.1. Визначення залежності сигналу флуоресценції від концентрації ДНК
Готували розведення матриці з концентраціями 7, 3.5, 1.75, 0.875 і 0.219 нг. До розчинів ДНК додавали однакову кількість барвника SYBRgreen згідно з протоколом описаного в пункті 2.3.1. Зразки об'ємом 1 мкл поміщали в лунки планшетів. Вимірювання та реєстрацію флуоресцентного сигналу проводили за допомогою описаної системи детекції та програми «Qwantа». Результати вимірювань представлені в таблиці 2 і рис. 16.
Таблиця 2
Концентрація ДНК (нг)
Флуоресцентний сигнал (у.о.)
Вимірювання
Відхилення
7
180
+ / -15
3,5
170
+ / -13
1,75
142
+ / -11
0,875
63
+ / -7
0,437
41
+ / -4
0,219
21
+ / -2
0
17
+ / -2
На графіку (рис. 16) видно, що залежність сигналу флуоресценції від концентрації ДНК має якусь криву. Розкид значень в міру зростання концентрації ДНК збільшується.

Рис 16. Графік залежності флуоресцентного сигналу від концентрації ДНК.
3.2. Проведення ПЛР в різних обсягах суміші в пробірках
Перед проведенням реакції в мікроплашках ПЛР провели в пробірках Eppendorf із загальним обсягом суміші 5, 4, 3, 2 і 1 мкл (вихідна концентрація ДНК - 7 нг) в середовищі масла. Подібна модель мініатюризації реакції може дати відповідь на запитання в якому мінімальному обсязі можливе проходження ампліфікації і наскільки ефективно. Дані про приріст сигналу флуоресценції будуть своєрідним контролем для реакції суміші відповідного обсягу у виготовлених мікропланшетах.
ПЛР-суміш заливали мінеральним маслом об'ємом 10 мкл. В результаті отримували крапельки зразка в середовищі масла (рис. 17 А).

Рис. 17. Пробірки з різним обсягом ПЛР суміші в середовищі мінерального масла. А - схематичне зображення. Б - реальне зображення краплі в об'єктиві камери.
В якості контролю служила суміш без матриці у відповідних обсягах. Ампліфікацію проводили в ампліфікатора «Терцик» виробництва «ДНК-технологія». Реакцію ставили з використанням зондів SYBRgreen і TaqMan по протоколах описаним у пункті 2.3.2 і 2.3.3 відповідно. Після ампліфікації з кожної проби відбирали по 1 мкл на вимірювання у стрипах. Тим самим вимірювали флуоресценцію в однакових обсягах. За результатами цих вимірів судили про ефективність ампліфікації в кожній краплині. Результати детектувала на описаному вище обладнанні в пробірках і в перенесених у мікропланшетах (обсяг аналізованої суміші однаковий у всіх п'яти випадках - 1 мкл) (рис. 18.).
А Б
Рис 18. Лунка мікропланшетах із зразком об'ємом 1 мкл. А - в розрізі, Б - вигляд в об'єктив камери (фото).
Результати вимірювань представлені в таблицях 2 і 3.

Таблиця 2.
Обсяг суміші
(Мкл)
Зразки з матрицею
(У.о. флуоресценції)
Зразки без матриці
(У.о. флуоресценції)
Приріст сигналу
(У.о. флуоресценції)
Зразки з матрицею (у.о. флуоресценції)
Зразки без матриці (у.о. флуоресценції)
Приріст сигналу
(У.о. флуоресценції)
в мікропробірці
в обсязі 1 мкл у пластикових мікростріпах
1
130,43
119,12
11,31
59,44
31,38
28,06
2
129,82
111,55
18,25
50,89
44,01
6,88
3
176,10
150,34
25,76
63,01
59,86
3,14
4
162,77
155,13
7,64
65,70
55,88
9,82
5
161,55
149,38
12,17
70,00
52,70
17,30
Таблиця 3.
Обсяг суміші
(Мкл)
Зразки з матрицею
(У.о. флуоресценція)
Зразки без матриці
(У.о. флуоресценції)
Приріст сигналу
(У.о. флуоресценції)
Зразки з матрицею (у.о. флуоресценції)
Зразки без матриці (у.ефлуоресценціі)
Приріст сигналу
(У.о. флуоресценції)
в мікропробірці
в обсязі 1мкл в пластикових мікростріпах
1
218,43
199,52
18,91
98,48
78,61
19,87
2
226,78
202,54
24,24
90,61
81,81
8,80
3
187,78
156,85
30,93
92,38
76,21
16,17
4
199,48
166,48
33,01
112,30
97,60
14,70
5
215,14
186,65
28,49
-
65,43
-
За результатами очевидно, що ампліфікація пройшла у всіх пробах, так як у всіх випадках число, що означає приріст флуоресцентного сигналу, є позитивним. Якщо звернути увагу на прирощення сигналу в зразках вимірюються в мікростріпах і порівняти з один з одним, можна зробити висновок, що ампліфікація в одному мкл пройшла не менш ефективно, ніж в інших обсягах. Наступний етап роботи - це проведення реакції в пластикових мікропланшетах в обсязі суміші 1 мкл.
3.3. Проведення ПЛР реакції в пластикових мікропланшетах
ПЛР проводили за вищеописаному протоколу (використовуючи кит) на планшеті з 25 лунками. ПЛР суміш додавали в лунки об'ємом 1 мкл. Використовувалося 2 види контрольних проб. Перший контроль - це ПЛР суміш без матриці. Другий контроль - це водний розчин SYBRgreen тієї ж концентрації що і в ПЛР суміші. Схема експерименту представлена ​​на рис. 19. Вимірювання та реєстрацію флуоресцентного сигналу проводили за допомогою описаної системи детекції та програми «Qwantа».
SHAPE \ * MERGEFORMAT
1
2
3
4
5
ПЦРсмесь з матрицею
Вода

Рис. 19. Схема нанесення проб в лунки планшета.
 
Рис. 20. Результат ампліфікації в пластикових мікропланшетах.
За результатами експерименту (рис. 20) видно що в 1 і 3 ряду ампліфікація пройшла, так як інтенсивність флуоресценції помітно зросла. Темне плямочка по центру лунок - це деякий об'єм повітря який утворюється при покритті плашки плівкою. Це вказує на те, що практично весь обсяг лунки заповнений зразком.
У цих же лавах у лунках під номером 5 сигнал значення не змінив. Це доводить те, що матриця тут не була присутня. Контроль номер 2 також спрацював, так як флуоресценція в 4 ряду своє значення не змінила. Другий і п'ятий ряди практично не флуоресціюють. Це підтверджує наявність в їх лунках води. Значення сигналу флуоресценції кожної лунки представлені в таблиці 4. Графічне зображення отриманої картини представлено на рис. 21.
1 стовпець
2 стовпець
3 стовпець
4 стовпець
5 стовпець
1 ряд
49,82
73,54
84,25
83,68
38,91
2 ряд
17,61
35,76
34,41
31,66
24,56
3 ряд
72,26
92,30
117,95
113,88
41,02
4 ряд
26,88
34,04
40,36
43,36
40,88
5 ряд
10,34
12,81
17,81
20,89
19,08
Таблиця 4

Р ис. 21. Діаграма, що відображає рівень сигналу в лунках пластикової мікроплашкі.
3.4. Постановка ПЛР в мікрообсязі з негативними контролями
ПЛР ставили за протоколами з використанням SYBRgreen і TaqMan. Загальний обсяг ПЛР суміші становив 1 мкл. Кількість внесеної матриці однаково - 7 нг. Контролем служили проби без матриці. Вимірювання та реєстрацію флуоресцентного сигналу проводили за допомогою описаної системи детекції та програми «Qwantа». Результати вимірювань представлені в таблиці 5.
За даними таблиці видно, що приріст сигналу флуоресценції можна порівняти з вимірами, отриманими при проведенні ПЛР у краплі суміші об'ємом 1 мкл в середовищі масла в обох випадках. А значить ампліфікація проходить з не меншою ефективністю ніж на моделях з краплями. Сильний розкид значень у разі SYBRgreen зайвий раз доводить, що робота з мікрооб'ємах - це дуже складний процес, де навіть мінімальні погрішності в роботі (похибки піпеток, чистота преперата і т.д.) стають критичними і впливають на результат.
Таблиця 5.
SYBRgreen
З матрицею (флуоресценція, у.о.)
Середнє значення (середнє відхилення)
Без матриці (флуоресценція, у.о.)
Середнє значення (середнє відхилення)
Приріст (флуоресценція, у.о.)
Середнє значення (середнє відхилення)
41
40,8 (3)
34
35,4 (4)
7
5,4 (3,5)
40
31
9
38
36
2
44
39
5
41
37
4
TaqMan
З матрицею (флуоресценція, у.о.)
Середнє значення (середнє відхилення)
Без матриці (флуоресценція, у.о.)
Середнє значення (середнє відхилення)
Приріст (флуоресценція, у.о.)
Середнє значення (середнє відхилення)
82
89,2 (8,5)
57
58,2 (1,5)
25
31 (19)
99
55
44
91
60
31
89
60
29
85
59
26
3.5. Електрофоретичне поділ нуклеїнових кислот у зразках ПЛР-суміші після ампліфікації
ПЛР ставили за протоколами з використанням SYBRgreen і TaqMan. Ампліфікація проходила в мікропланшетах в обсязі суміші - 1 мкл (на гелі ці зразки позначені прописною літерою «г») і як контроль у ампліфікатора «Терцик» під мінеральним маслом в обсязі 20 мкл (на гелі - це зразки з індексом «а»). Великі букви T і S означають ПЛР з системою TaqMan і SYBRgreen відповідно. Індекси 1, 2 і 3 у системі TaqMan означають використання різних розчинів полімераз і в принципі важливого значення для цього досвіду не мають, тому їх можна розцінювати як 3 повтору. Індекс «ч до» в одного з S означає ПЛР-суміш до ампліфікації. У кишеню гелю наносили по 5 мкл зразка. М - маркер - суміш нуклеїнових кислот розміром від 50 до 1000 пар основ
На рис. видно, що ампліфікація пройшла у всіх пробах системи TaqMan. Шість смуг, що проявилися на гелі трохи нижче рівня смуги маркера з цифрою 100 означають, що у всіх цих пробах пройшла реакція і напрацювався фрагмент ДНК розміром близько 100 пар основ На доріжках, куди вносили проби після ампліфікації в «Терцик» смуги проявилися сильніше, ніж на доріжках з пробами з чіпа. Значить напрацьованого фрагмента в плашках менше, ніж у макрооб'еме під маслом. Ця обставина знову ж таки пояснюється форматом мікрооб'ємів, де похибки кожного з етапів роботи стає критичним. У випадку з SYBRgreen також спостерігається подібна картина. Смужки не проявилися у випадку з зразком не пройшли ампліфікацію і проявилися на доріжках лунок, куди вносили зразки після ампліфікації. Отже ампліфікація в них пройшла і напрацювався фрагмент розміром близько 600 пар основ
Гель фотографували із зеленим світлофільтром, проникним відповідну довжину хвилі барвника (520 нм). На гелі добре помітні зелені смуги фарбованої напрацьованої в процесі ампліфікації ДНК і вихідної матриці (смуги на самому початку кишень), яка має великий розмір (5000 пар основ) і за час поділу встигла тільки увійти в гель. Знову ж кількість напрацьованого фрагмента в чіпі менше (хоч і не значний, порівняно з системою TaqMan), ніж у макрооб'емной ПЛР-суміші. Однак потрібно звернути увагу на те, що верхня смуга в лунці S 18 год забарвлена ​​слабкіше, ніж в лунці S 18 а. Це говорить про те, що спочатку кількість матриці у зразку було менше, що знову ж таки пов'язано з похибками в роботі з мікрооб'ємах.

Висновки.
· Створено експериментальні зразки мікропланшетів, що дозволяють проводити полімеразну ланцюгову реакцію в загальному обсязі ПЛР-суміші - 1 мкл.
· Підібрано умови ефективної полімеразної ланцюгової реакції в обсязі реакційної суміші 1 мкл.
· Відпрацьовано умови ПЛР в мікрообсязі (1 мкл) - форматі біологічних мікрочипів.

Висновок.
Зараз без перебільшення можна сказати: розвиток "технології маніпулювання із спадковою інформацією" порівнянне за темпами зростання з мікроелектронікою та інформатикою, нерідко ефективно поєднується з ними. І тільки унікальне поєднання переваг традиційних методів і технологій приведе людину до вирішення раніше недоступних завдань у цій цікавій та перспективній галузі. Подібні напрями дозволяють встановлювати структуру і вивчати процеси на рівні генів всього геному, білків всієї клітки або клітин всій тканині.
У ході виконаної роботи створена система, яка дозволила об'єднати переваги таких методів як RealTime ПЛР та мікрочіпових аналізу. Впровадження основи цієї розробки в медицину може покласти початок створення унікальних тест систем та інструментів клінічної діагностики. Кількісний ПЛР особливо необхідний для виявлення та моніторингу деяких вірусних захворювань (таких як вірусний гепатит С і В, СНІД). Біочіп є унікальним пристроєм, що дозволяє проводити одночасно велику кількість аналізів на одній підкладці. Переклад кількісного ПЛР у формат чіпа зробить аналіз швидким і економічним.

Список літератури
1. А. Шляпникова, Ю. М. Шляпников, В. М. Афанасьєв, Г. В. Афанасьєва, А. В. Гаврюшкін, І. П. Білецький. «Дослідження якості аміно-модифікованих підкладок, які використовуються для гібридізаційного аналізу» Інститут теоретичної та експериментальної біофізики РАН. УДК 547.963.3
2. Шляпникова Е.А., Шляпников Ю.М., Грановський І.Е., Афанасьєва, Г.В., Гаврюшкін А.В., Білецький І.П «Біологічні мікрочіпи в медицині» Інститут теоретичної та експериментальної біофізики РАН.
3. Шишкіна І.Г., Левіна А.С., Заритова В.Ф. «Афінний сорбенти, які містять нуклеїнові кислоти та їх фрагменти» / / Успіхи хімії / / 2001 р. № 70 (6), с.581,.
4. Іванов, І., Єршов Г., Барський, В., Бельговскій, А., Кирилов, Е., Крейндлін, Е., Парінов, С., Мологіна, Н., і Мірзабеков А., Діагностика генетичних мутацій на олігонуклеотидних мікрочіпах . ( 1997 р .) Мол. Біол., 31, с. 159-167.
5. «Біочіп в біології та медицині XXI століття» Академік А.Д. Мірзабеков. Виступ на науковій сесії загальних зборів РАН
6. Барський В., Колчинський А., Лисов Ю., Мірзабеков А. Біологічні мікрочіпи, що містять іммобілізовані в гідрогель нуклеїнові кислоти, білки та інші сполуки: властивості та програми в геноміки / / Мол. біол., 2002. Т. 36. С. 563-584.
7. Новітні технології в генодіагностікі: полімеразна ланцюгова реакція у реальному часі (Real-Time PCR). Єкимов О.М., Шипулін Г.А., Бочкарьов Є.Г. Рюмін Д.В. Центральний науково-дослідний інститут епідеміології Міністерства охорони здоров'я РФ.
8. Л. І. Патрушев «Штучні генетичні системи» Том 1 Москва, Наука, 2004 с.228.
9. Моминаліев К.Т., Говорун В.М. «Методи розвитку ДНК-діагностики в клінінеческой медицині» Лабораторія генної інженерії та імуногенетики НДІ фізико-хімічної медицини МОЗ РФ, Москва 2003
10. Ekins RP (1987) An overview of divsent and future ultrasensitive nonisotopic immunoassay development. Clin. Biochem. Revs. 8, 12-22.
11. Bernard PS, Pritham GH, Wittwer CT Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. / / Analytycal Biochemistry.-1999. - № 273 .- p. 221-228.
12. Coutlee, F., He Y., Saint-Antoine P., Olivier C. , Kessous A. Coamplification of HIV type 1 and beta-globin gene DNA sequences in a nonisotopic polimerase chain reaction assay to control for amplification efficiency. / / AIDS Res. Hum. Retroviruses.-1995 .- № 11 .- p.363-371
13. Heid CA Real-time quantitative PCR. / / Genome Res.-1996 .- № 6.-p. 986-994.
14. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions / / Biotechnology.-1993 .- № 11 .- 1026-1030.
15. Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E., Condon J., Morley А.А. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. / / BioTechniques.-1995 .- № 13 .- p.444-449.
16. Tyagi S., Kramer FR Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. / / Nat Biotechnol.-1996 .- № 14 .- p.303-308.
17. Timofeev E., Mirzabekov A. (1998) Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manifacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips and protein microchips. Anal.Biochem., 259, 34-41.
18. Adessi C., Matton G., Ayala G., Turcatti G., Mermod J., Mayer P. , Kawashima E. Solid phase DNA amрlification: characterisation of primer attachment and amplification mechanism / / Nucleic Acids Research. - 2000. - Vol. 51. - No. 20.
19. Bing D., Boles C., Rehman F., Audeh M., Belmarsh M., Kelley B., Adams C.. Bridge amplification: a solid phase PCR system for the amplification and detection of allelic differences in single copy genes / / Genetic Identity Conference Proceedings, Seventh International Symposium on Human Identification. - 1996.
20. Brookes A., Lehvaslaiho H., Siegfried M., Boehm J., Yuan Y., Sarkar C., Bork P., Ortigao F. HGBASE: a database of SNPs and other variations in and around human genes / / Nucleic Acids Res. - 2000. - Vol. 28. - № 1 - pp. 356-60.
21. Mercier J., Slater G. Solid Phase DNA Amplification: A Brownian Dynamics Study of Crowding Effects / / Biophysical Journal .- 2005. - Vol. 89.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Диплом
202.3кб. | скачати


Схожі роботи:
Удосконалення технологічного процесу за рах т оптимізації ос
Удосконалення технологічного процесу за рахунок оптимізації освітленості робочого місця
Розробка методики оптимізації конфліктів в організації
Використання мережевої моделі для оптимізації процесу ремонту візків пасажирського тепловоза ТЕП60
Розробка програми оптимізації оподаткування як інструменту антикризового корпоративного управління
Розробка економіко-математичної моделі оптимізації виробничої структури сільськогосподарського
Розробка технологічного процесу складання редуктора циліндричного і технологічного процесу
Аналіз регіональних умов і технологій пошук резервів і розробка проекту виробництва картоплі
Розробка моделі процесу настилання тканин
© Усі права захищені
написати до нас