Пульс-електрофорез і методи роботи з великими молекулами ДНК

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Пульс-електрофорез і методи роботи з великими молекулами ДНК

Введення

Метод пульс-електрофорезу дає можливість розділяти ДНК індивідуальних хромосом дріжджів і найпростіших. 10 6 нуклеотидных пар. Розміри цих молекул варіюють від 0,2 до 10 x 10 червня нуклеотидних пар. В даний час створена технологія виділення та обробки ДНК таких великих розмірів як для еукаріотів, так і для прокаріотів. Таким чином, тепер існує можливість вивчати цілі хромосоми, послідовності ДНК яких налічують кілька мільйонів підстав. Отримати фізичні карти найбільших районів деяких хромосом ссавців і цілої хромосоми Esherichia . coli. Мета цієї роботи - розповісти про біохімічні методи, які використовуються при виділенні великих молекул ДНК, і методах ПЕФ, застосовуваних для їх аналізу.

1. Приготування зразків ДНК

Препарати ДНК з дуже великою молекулярною масою неможливо отримати, використовуючи традиційні методи розчинення, оскільки такі молекули дуже чутливі до зсувними зусиллям. В основі їх - величезне осьове ставлення молекул ДНК. Наприклад, людська хромосома 21 - найменша в геномі. Її ДНК налічує 50х10 п. Н.І являє собою єдину молекулу довжиною 15 мм. Між тим діаметр цієї молекули всього 20 нм. Таким чином, осьове відношення становить 10.

Для запобігання руйнівного впливу зсувних сил процедуру екстракції ДНК з клітин проводять у присутності агарози. Цей прийом досить простий, і одержувані таким способом зразки можна потім використати в традиційних електрофоретичних дослідах і експериментах з клонування. Живі клітини суспендують у розплавленої низкоплавкие агарози. Потім агарози дають застигнути у формочках об'ємом 100 мкл для формування блоків, званих вставками. - cia - LKB или сделать самим, соединив вместе «хвост к голове» обычные гребенки для электрофореза нужных размеров. Формочки можна придбати у фірми Pharma - cia - LKB або зробити самим, з'єднавши разом «хвіст до голови» звичайні гребінки для електрофорезу потрібних розмірів. Всі маніпуляції з формами слід проводити так, щоб запобігти їх забруднення нуклеазами. Перед вживанням формочки необхідно ретельно промити дистильованою водою і витерти, одягнувши рукавички. Потім одна сторона формочки заклеюється стрічкою, яку використовують як денця.

В якості альтернативи агарозного блоквставкам можуть виступити агарозного гранули. Для їх отримання клітинну суспензію в агарози по краплях додають у масло з одночасним перемішуванням. Розміри гранул контролюються швидкістю перемішування. Зі зразками ДНК в гранулах можна поводитися так само, як з розчиненими. Проте ми вважаємо за краще використовувати агарозного вставки, тому що з ними простіше працювати.

и инкубируйте 2 дня при 50°С. Для виділення ДНК з клітин, позбавлених клітинної стінки, помістіть заполімерізовавшіеся агарозного вставки в розчин ESP і інкубують 2 дні при 50 ° С. У цьому розчині відбувається лізис клітин і відділення білків та інших молекул від ДНК. . Інтактну хромосомну ДНК можна аналізувати за допомогою ПЕФ безпосередньо з розчину ESP. хранятся неопределенно долго при +4°С или даже при комнатной температуре прямо в пробирках Эппендорф. Зразки ДНК в розчині ESP зберігаються невизначено довго при +4 ° С або навіть при кімнатній температурі прямо в пробірках Еппендорф.

. При наявності клітинної стінки її необхідно видалити перед екстракцією ДНК, помістивши клітини в розчин ESP. Методики виділення ДНК із клітин з інтактною стінкою представлені в табл. 4-6. Склад клітинної стінки значно варіює для різних організмів. У деяких випадках може виявитися необхідним підбір різних ферментів, що розщеплюють полісахариди клітинної стінки. Багато хто з цих ферментів не вимагають для своєї роботи присутності двовалентних катіонів. Таким чином, обробка цими ферментами може проводитися в присутності великої кількості ЕДТА для запобігання деградації хромосомної ДНК-

в течение 2 дней при 50°С. Усі зразки повинні бути обов'язково проінкубованих в розчині ESP протягом 2 днів при 50 ° С. Вставки стануть прозорими набагато раніше закінчення інкубації. Однак інкубацію слід продовжити, щоб домогтися повного відокремлення від ДНК пов'язаних з нею різних молекул. Білки, пов'язані з ДНК, можуть змінювати її електрофоретична рухливість. Крім того, зразки, проінкубованих більш короткий час, виявляються стійкими до впливу деяких рестриктаз.

Найбільш загальна проблема, що виникає при використанні описаної нижче техніки отримання ДНК з нових організмів, - це вимірювання кінцевої концентрації ДНК. Треба прагнути до того, щоб концентрація ДНК в агарозному блоквставке була «зручна» для нанесення на форезний гель. Така концентрація повинна бути визначена емпірично. Можливе число клітин і кількість ДНК запропоновані до нього додається протоколах дослідів. Ці цифри можна використовувати як попередні і змінювати в залежності від умов куль-

1. 50 хісходний розчин Денхардта

Цей розчин - одні з компонентів суміші для прегібрндізаціі та гібридизації

На 500 мл розчину:

полівінілпірролідоі 5 г, фіколл 5 г, БСА, фракція V 5 м.

Простерилізуйте фільтрацією через одноразовий фільтр і зберігайте в аліквотах по 30 мл при - 20 ° С.

2. Розчин для лізису клітин Є. coli

Розчин можна використовувати для приготування сферопластов з різних бактерій

Кінцеві концентрації На 1 л

6 мл 1 М раствора 6 мМ трис-HCl 6 мл 1 М розчину

1 М NaCl 58, 4 г

100 мМ ЕДТА 100 мл 0,5 М розчину

0,5% бридж-58 60 мл 10%-ного розчину

0,2% дезоксихолатом 50 мл 4%-ного розчину

0,5% са | ркозіла 5 мл 100%-ного розчину

Проавтоклавіруйте

Додайте свіжими: 1 мг / мл лізоциму яєчного білка 20 мкл / мл бичачої панкреатичної РНКази

3. ESP

Цей розчин використовується для виділення будь-яких великих молекул ДНК.

. Він має ще одну назву - NDS.

Кінцеві концентрації

0,5 М ЕДТА

Автоклавіруются

1% лаурілсаркозін

Ретельно перемішайте до повного розчинення 1 мг / мл протеїнази До Інкубують 2 год при 37 ° С Зберігайте в аліквотах замороженим

Для роботи: змішайте з рівним об'ємом зразка та інкубують 1 - 2 дні при 50 ° С.

4. Суміш для прегібрндізаціі і гібридизації Кінцеві концентрації На 1 л

100 мл 30 X раствора SSC 100 мл 30 X розчину

5 мл 20%-иого раствора 0,1% SDS 5 мл 20%-иого розчину

10Х розчин Денхардта 200 мл 50х розчину

10% декстрансульфат> 200 мл 50%-го розчину

ДНК сперми лосося 5 мг / мл

Суміш зберігайте замороженої в аліквотах по 30 мл для прегібрідізаціонного розчину і в аліквотах по 20 мл для гібридізаційного розчину.

5. 1ХМ9

2 HPO « На 1 л: 50 г. Na 2 HPO «

1930 КН 2 Р0 4

5 г NaCl

4 C 1 1910 NH 4 C 1

Розведіть до одноразової концентрації та проавтоклавіруйте.

Після автоклавування додайте Кінцеві концентрації На 1 л

0 4 1 мл 1 М раствора 1 мМ MgS 0 4 1 мл 1 М розчину

0,1 М СаС1 2 0,2 мл 0,5 М розчину

0,4% глюкоза 10 мл 40%-ного розчину

0,5% казамінокіслот 25 мл 20%-ного розчину

Необов'язкові добавки

50 мкл / мл амінокислот 10 мл розчину 5 мг / мл

10 мкг / мл вітамінів 10 мл розчину 1 мг / мл

50 мкг / мл підстав 25 мл розчину 2 мг / мл

IV 6. Pett IV

Цей розчин призначений для відмивання бактеріальних клітин перед виділенням сферопластов

Кінцеві концентрації На 1 л

10 мМ трис-HCl 10 мл 1 М розчину

1 М NaCI 58,44 м.

Проавтоклавіруйте.

7. 0,1 М ФМСФ Розчин використовується для інактивації протеїнази К. Ресуспендіруйте 17,5 мг ФМСФ в 1 мл ізопропанолу.

Пам'ятайте, що розчин нестабільний, тому його треба використовувати свіжим і готувати перед вживанням. ФМСФ дуже токсичний.

8. PSG

Цей розчин використовується для відмивання найпростіших перед лізисом. Кінцеві концентрації На 1 л

-фосфатный буфер 75 мл 1 М раствора 75 мМ Na-фосфатний буфер 75 мл 1 М розчину

65 мМ NaCI 13 мл 3 М розчину

10% глюкоза 100 г.

Проавтоклавіруйте.


Організм

Концентрація клітин у 100 мкл блок-вставки

Навантаження на доріжку при форез

Trypanosoma brucei Plasmodium falciparum Giardia lambia Leishmania

2х10х10 1х10 2х10

1 / 16

1 / 8

1 / 10

1 / 16

Відомо, що хромосомна ДНК з-за великих розмірів молекули надзвичайно чутлива до впливу нуклеаз. У зв'язку з цим необхідно взяти за правило попередньо обробляти всі розчини, що контактують з ДНК. Розчини слід розлити на невеликі порції і простерилізувати. Стерильними повинні бути і посуд, і устаткування. Для перенесення зразків з вставок або з трубочок можна використовувати вигнуту скляну паличку, простерилізованих в спирті і в полум'ї пальника. При роботі зі зразками ДНК не можна користуватися ніякими пристосуваннями, які містять металеві деталі, зокрема з нержавіючої сталі, а також шпателями і бритвеними лезами. ДНК міцно пов'язується з багатьма бівалентним металами і контакт з ними зазвичай призводить до появи розривів у молекулі ДНК.

2. Приготування вставок зі зразками ДНК найпростіших

Вільно живуть найпростіші можуть бути прямо використані для приготування вставок з препаратами ДНК. Їх можна відокремити від культурального середовища центрифугуванням. Перед приготуванням вставок внутрішньоклітинних паразитів виділяють з клітин крові або інших хазяйських клітин. Еритроцити можна лизировать, як зазначено в табл. 3. У деяких випадках трипаносом виділяли з різних клітинних елементів за допомогою іонно-обмінної хроматографії на ДЕАЕ-носії.

2.1 Виділення ДНК із культивованих клітин і лімфоцитів

Процедури отримання ДНК з культивованих клітин та з найпростіших мають багато спільного. Для рестрикційного картування необхідно використовувати клітинні лінії тільки з нормальним стабільним геномом. очень удобны для культивирования, но содержат большое количество хромосомных перестроек и имеют разную плоидность. Наприклад, клітини HeLa дуже зручні для культивування, але містять велику кількість хромосомних перебудов і мають різну плоїдності. Один мільйон диплоїдних клітин повинен містити приблизно 6,6 мкг ДНК, що відповідає розмірам геному 6х10 нуклеотидних пар. Оскільки несинхронізовані клітинні культури зазвичай являють собою суміш диплоїдних, тетраплоїдних і проміжних станів, ми використовуємо для роботи 1х10 клітин, вважаючи, що вони містять приблизно 10 мкг ДНК.

Процедуру, описану в табл. 3, використовували також для отримання інтактних хромосом з різних клітинних ліній комах. При цьому концентрація клітин повинна бути перерахована відповідно з меншими розмірами геному.

Методика виділення ДНК з лімфоцитів істотно близька використовуваної для культивованих клітин, якщо лімфоцити вільні від домішки еритроцитів. Еритроцити можуть бути або ціалізуватися), або вилучені за допомогою центрифугування в градієнті фіколл або перколла. Ці методи описані в табл. 3.

2.2 Виділення ДНК з клітин прокаріот

Методика виділення ДНК з клітин Є. coli представлена ​​в табл. 4. , Legionella , Mycobacterium , Haemophilus , Bacillus , Streptomyces , Halobacterium Саме ця методика була з успіхом використана для отримання інтактною хромосомної ДНК широкого набору бактерій і архей, включаючи Salmonella, Legionella, Mycobacterium, Haemophilus, Bacillus, Streptomyces, Halobacterium і деякі інші швидкорослі, які супроводжували ім. Розміри хромосом у цих бактерій варіюють у межах від 1 до 20хЮ нуклеотидних пар, кількість хромосом на одну клітку також може змінюватися від 1 до 5 залежно від умов культивування. Таким чином, в попередні експерименти необхідно включити підрахунок клітин в широкому діапазоні.

У деяких випадках можуть виявитися необхідними невеликі зміни в методиці. IV, когда его использовали для обработки Halobacterium , концентрацию NaCl пришлось увеличить до 0,5 М, чтобы предотвратить преждевременный лизис клеток. Наприклад, у розчині Pett IV, коли його використовували для обробки Halobacterium, концентрацію NaCl довелося збільшити до 0,5 М, щоб запобігти передчасний лізис клітин.

Прийом, описаний у табл. 4, призначений для синхронізації реплікативних вилок, яка досягається інкубацією клітин в хлорамфенікол протягом 1 год безпосередньо перед збором. Обробка хлорамфеніколом дозволяє закінчитися вже розпочатим реплікативних процесам, але запобігає запуск нових. Препарати ДНК можна отримати і з несинхронізованих культур. Однак необхідно пам'ятати, що області хромосом близько точок кінця реплікації можуть бути недопредставлени в деяких препаратах. Іноді це не має значення, але не завжди. Так, наприклад, інтенсивність фарбування бромідом етидію залежить від молекулярної ваги. Таким чином, хромосомну ДНК з області термінації реплікації буде непросто виявити за допомогою цього з'єднання.

2.3 Виділення ДНК з клітин грибів

Ми пропонуємо дві методики для дріжджів. Перша з них призначена для Saccharomyces , а вторая – для делящихся клеток Schlzosaccharomyces cerevisiae, а друга - для клітин, які діляться Schlzosaccharomyces . В обоих случаях для удаления клеточной стенки и приготовления сферопластов используется зимолиаза 100 Т. Получить сферо-пласты из 5. pombe pombe. В обох випадках для видалення клітинної стінки і приготування сферопластов використовується зімоліаза 100 Т. отримала сфера-пласти з 5. pombe більше важко. У цьому випадку ми рекомендуємо контролювати процес лізірованія під мікроскопом.

Інші представники грибів можуть мати інші, ніж дріжджі, компоненти клітинної стінки. У цьому випадку корисно згадати, що існують різноманітні зімоліази, що відрізняються один від одного по своїй специфічності та активності. У кожному конкретному випадку можна підібрати підходящий фермент. На жаль, у цих ферментах присутня велика кількість домішкових нуклеаз, які перешкоджають отриманню великих фрагментів ДНК. Препарат «Новозін», що випускається фірмою Novo Bio , является смесью ферментов, воздействующих на клеточную стенку самых разных грибов. Labs, є сумішшю ферментів, що впливають на клітинну стінку самих різних грибів. Ми так і не зважилися використовувати цей препарат; нас збентежив його коричневий колір. Ймовірно, необхідна більш ретельне очищення.

2.4 Виділення ДНК з рослинних клітин

Зусилля багатьох дослідників направлени'сейчас на розробку методів отримання інтактних хромосомних ДНК із солідних тканин. Попередні експерименти з плоскими черв'яками, Caenorhabditis , личинками Drosophila elegans, личинками Drosophila - domotias і з Chlamy - domotias продемонстрували можливість використання різних прийомів. Для невеликих багатоклітинних організмів можуть стати в нагоді методи, застосовувані для одноклітинних. Для запобігання виходу рухливих клітин за межі вставок корисна обробка розчином 0,2 мМ азиду натрію. . ДНК з великою молекулярною вагою вдається отримати при обробці коллагеназа, гомогенізірованіі, тріпсінізаціі або просто розрізуванні матеріалу, поміщеного в розчин ESP. Можна спочатку виділити з клітин ядра, а потім з них приготувати вставки із зразками.

3. Робота з агарозного блок-вставками, що містять зразки ДНК

Для багатьох цілей зручніше і простіше мати справу з ДНК, укладеними в агарозному гель, ніж знаходяться в розчині. Низькомолекулярні компоненти вільно дифундують через агарози при м'якому перемішуванні. Ми працювали з 100 мкл-агарозного блок-вставками просто як з рідкими зразками об'ємом 100 мкл.

Можливість обробляти ДНК ферментами безпосередньо в агарози залежить від типу агарози. Принаймні, половина партій агарози містить домішки, які не дозволяють ферментам ефективно працювати. выпускает агарозу с низкой температурой плавления, специально проверенную на пригодность к рестрикционной обработке заключенных в нее молекул ДНК. Компанія FMC випускає агарози з низькою температурою плавлення, спеціально перевірену на придатність до рестрикційної обробці ув'язнених у неї молекул ДНК.

3.1 Ферментативна обробка

Для ферментативної обробки ДНК, що міститься в блок-вставці, необхідно попередньо інактивувати протеинкиназу К, що залишилася після приготування зразка, і прибрати діалізом ЕДТА і детергенти. при 4°С по крайней мере 1 год. Протеиназа К вельми стійкий фермент і може залишатися активною в розчині ESP при 4 ° С по крайней мере 1 рік. Однак вона повністю інактивується при обробці фенилметилсульфонилфторидом, який вкрай нестабільний і свіжий розчин, якого тому треба додавати щодня. Будь-яка залишається у вставці протеиназа До зруйнує вносяться ферменти. Необхідна надзвичайна акуратність, щоб не забруднювати лабораторний стіл і використовуване устаткування протеїназ К. У правильно обраної агарози ефективними будуть якщо не всі, то більшість рестриктаз. Коли рестріктази не активні в агарози, вони, як правило, не проявляють активність і в розчині. Зазвичай ми використовуємо співвідношення фермент: ДНК, рівне 20: 1. У більшості випадків це відповідає принаймні 10-кратному перевищенню над реально необхідною кількістю ферменту. Наш досвід, заснований на використанні ДНК і рестриктаз з різних джерел, а також досвід інших дослідників підказує, що саме такий підхід гарантує повноту рестрикції. У випадку низької концентрації ДНК, особливо при роботі з бактеріями, може виявитися необхідним підвищити концентрацію рестриктаз. Для часткового рестріктазного гідролізу необхідно титрувати окремі рестриктаз, додаючи різне їх кількість до вставкам із зразками ДНК і інкубуючи протягом 2,5 ч.

Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Контрольна робота
77.1кб. | скачати


Схожі роботи:
Виявлення одиничних нуклеотидних замін в ДНК розщеплення РНКаз і денатуруючих градієнтний гель-електрофорез
Фінансовий аналіз ТОВ Пульс
Відповідність між молекулами і групами симетрії
Управління великими компаніями
Ієрархічне управління великими системами
Електрофорез
Електрофорез і електроосмос
Медикаментозний електрофорез
Як змусити дистриб`юторів працювати з великими корпоративними клієнтами
© Усі права захищені
написати до нас