ЛЕКЦІЯ
Процесинг РНК
Всі інтрони транскрибуються у складі РНК-попередника і згодом видаляються в процесі розриву-возз'єднання - сплайсингу. Сплайсинг відбувається ще в ядрі, перед виходом РНК в цитоплазму. При цьому повинна бути збережена (або встановлена) правильна рамка зчитування. Явище сплайсингу у еукаріотів не дозволяє по амінокислотної послідовності білка відновити послідовність нуклеотидів в кодує його ділянці ДНК. У прокаріотів, на щастя, явище сплайсингу спостерігається рідко, і відповідність послідовностей РНК і ДНК, як правило, зберігається.
Виділяють чотири види інтронів, і, відповідно, чотири механізми сплайсингу
Види інтронів
1) Інтрони генів ядерних мРНК.
Першими були виявлені інтрони в ядерних генах, що кодують білки. Їх розмір варіює від 100 пар основ до 10 т.п.н. і більше. Найбільш характерною відмітною рисою всіх цих інтронів є наявність специфічних послідовностей поблизу їх 5 `- (лівої, або донорной) і 3` - (правою, або акцепторної) кінців (тобто на стиках інтронів і екзонів або в сайтах сплайсингу).
Нуклеотидні послідовності в місцях з'єднання екзонів і інтронів дуже консервативні і практично однакові у всіх генах ядерних мРНК майже у всіх вивчених видів (прозрачка 20). 5 `-сайт сплайсингу найчастіше фланкують послідовність ЦRГ (де R - пурин), а 3`-сайт - всього один залишок Г. тим не менше послідовності фланкирующие інтрони ззовні можуть значно варіювати, а мутації в них ніколи не запобігають сплайсинг, хоча і можуть впливати на його швидкість. Першими двома нуклеотидами на 5 `-кінці інтрони в РНК майже завжди є ГУ (виняток, ГЦ, зустрічається всього у двох випадках); наступні чотири нуклеотиду можуть трохи варіювати, але, мабуть, канонічної є послідовність Агага. Заміна залишку Г або У в місці зчленування зазвичай блокує сплайсинг, а заміна сусідніх підстав впливає на сплайсинг по-різному. Зазначені шість нуклеотидів на 5 `-кінці інтрони і визначають специфічну функцію 5`-сайту сплайсингу. На 3 `-кінці інтрони завжди знаходиться пара АГ. Мутації, що призводять до заміни константних А і Г на інші підстави, також блокують сплайсинг в цьому сайті.
Залишок А поблизу 3 `-кінця інтрони грає важливу роль в сплайсинг ядерних промРНК. У інтрони ссавців цей залишок не перебуває у фіксованому положенні або в будь-якої певної послідовності, оскільки його роль ймовірно, може грати будь-який з декількох залишків А, розташованих на ділянці від 18 до 37 нуклеотиду перед 3 `-сайтом сплайсингу. Однак мутації, які зачіпають сусідні з зазначеним залишком А послідовності, призводять до істотного зменшення ефективності сплайсингу in vitro; отже, хоча цей залишок і не належить якійсь певній послідовності його оточення вліяеть на сплайсинг.
У інтрони можуть міститися різні генетичні елементи, наприклад енхансери, інші гени, можливо, сигнали реплікації і упаковки хромосоми або послідовності, необхідні для упаковки промРНК в рібонуклеотідние частинки.
Сплайсинг ядерної про мРНК.
Сплайсинг ядерної про мРНК здійснюється в ядрі, можливо, одночасно з транскрипцією для одних генів, і лише після завершення транскрипції для інших.
Цис-сплайсинг. Першим етапом сплайсингу є складання комплексу сплайсингу. Найбільш ранні продукти, які виявляються в процесі сплайсингу in vitro утворюються в результаті точного розщеплення в 5 `-сайті сплайсингу один з них містить 5`-екзон, а інший - Інтрон і 3 `-екзон (прозрачка 22). Розщеплення в 5 `-сайті повинне передувати розщепленню в 3`-сайті. У ході реакції накопичуються два продукти: правильно лігувати Екзони і вільний цілий інтрон. Як продукт початкового розщеплення, так і вирізаний інтрон містять структури типу ласо.
Вирізанню інтрони у формі ласо і лигированию двох екзонів для сплайсингу ядерних про мРНК потрібно безліч ядерних факторів-білків і рибонуклеопротеїдними комплексів (мяРНП). Комплекс, що складається з безлічі субодиниць, який каталізує сплайсинг, називають сплайсінгосомой. Сплайсінгосома складається з інтрони, пов'язаного щонайменше з п'ятьма різними мяРНП і деякими допоміжними білками, зазвичай не пов'язаними з цими мяРНП. Сплайсінгосоми утворюються шляхом спарювання молекул РНК, приєднання білків до РНК і зв'язування цих білків один з одним (прозрачка 23). Кінцевий результат сплайсингу в разі про мРНК: інтрон вирізається, а фланкують його екзона з'єднуються.
Транс-сплайсинг. До цих пір, кажучи про сплайсинг, ми розглядали внутрішньомолекулярні, або цис-реакції. А чи існує міжмолекулярних або транс-сплайсинг? Іншими словами, чи може відбуватися легування двох екзонів, що знаходяться в різних молекулах РНК, з одночасним видаленням фланкують їх інтронів? Транс-сплайсинг є важливим етапом внутрішньоклітинного освіти всіх мРНК у Tripanosoma (прозрачка 25). Крім того, можливість міжмолекулярної сплайсингу продемонстрована в дослідах in vitro (прозрачка 24).
2) Інтрони в генах тРНК. Розмір інтронів в генах тРНК коливається від 14 до приблизно 60 нуклеотидів, але вони локалізуються завжди в одному і тому ж місці: через один нуклеотид від 3 `-кінця антикодоном (прозрачка 26). Як правило, якщо ген даної тРНК має інтрон, то всі інші гени в межах виду кодують цю тРНК теж містять такої ж інтрон. Однак у генів, що кодують різні тРНК внутрішній і фланговий ділянки інтронів помітно різняться. Встановлено, що видалення інтрони гена супресора тРНКтір за допомогою спрямованого мутагенезу не впливає на здатність до експресії при введенні в клітини. І все ж, весмотря на те, що ця тРНК транскрибується і процесує нормально, залишок У в антикодоном не модифікується як завжди з утворенням ψ. Чи є це вказівкою на роль інтронів в Посттранскрипційна модифікації тРНК або ми маємо справу з унікальною властивістю тРНКтір - не ясно.
Сплайсинг тРНК. Механізм видалення інтронів в тРНК найкраще вивчений у дріжджів, але деяка інформація є в дослідах з іншими нижчими еукаріотамі і рослинами.
Завдання полягає в тому, що потрібно вирізати інтрон в антікодоновой петлі. У дріжджів (прозрачка 26) тут включаються специфічні ферменти - ендонуклеази, які дізнаються про ці послідовності і розщеплюють про-тРНК в обох сайтах сплайсингу з утворенням зазначених решт, поліфункціональний білок, який каталізує всі реакції крім фосфатазной, 2 `фосфатази, лігази і АТФ (у цьому випадку в місці зчленування обох екзонів знаходиться фосфатна група, яка до цього була кінцевим фосфатом АТФ). У хребетних (прозрачка 27) три зазначені реакції каталізують окремі ферменти. При цьому кожен фермент бере участь тільки в сплайсинг тРНК. Відзначимо, що фосфат в місці з'єднання двох екзонів раніше знаходився в місці зчленування екзона і інтрони.
3) Особливі типи інтронів: група I.
Гени ядерних рРНК деяких нижчих еукаріот містять особливі інтрони і мають унікальний механізм сплайсингу. Подібні інтрони виявлені в багатьох генах, але жоден з них не був виявлений в генах хребетних.
Інтрони групи I відрізняються один від одного за розміром, вони мають ряд загальних властивостей:
А) вони самі каталізують свій сплайсинг, який може протікати in vitro у відсутності будь-б то не було білків;
Б) інформація, необхідна для сплайсингу, міститься у безлічі відносно коротких внутрішніх послідовностей всередині інтрони, які забезпечують укладання молекули з утворенням характерною просторової структури.
В) сплайсинг ініціюється вільним гуанозіна або будь-яким з його 5 `-фосфорелірованних похідних
Г) кінцевими продуктами сплайсингу є рРНК та лінійна РНК, розмір яких трохи менше, ніж розмір інтрони.
Самосплайсінг інтронів групи I. про-рРНК, прототип інтрони групи I здійснюється за участю послідовних реакцій трансетеріфікаціі, в яких акти фосфодіефірних обміну не супроводжуються гідролізом. (Прозрачка 28).
4) Особливі типи інтронів: група II.
Інтрони групи II поширені менш широко. Вони виявлені у двох мітохондріальних генах дріжджів, що кодують одну з субодиниць цитохромоксидази і цітіхром b; цікаво, що в цих генах присутні також інтрони групи I.
Сплайсинг інтронів групи II.
Інтрони групи II також піддаються самосплайсінгу in vitro, але в цьому випадку реакція ініціюється не екзогенним гуанозіна, а залишком входять до складу самого інтрони (прозрачка 29) Інтрони групи II, вивільнені після сплайсингу представляють собою лассоподобние структури, в яких 5 `-кінцевий фосфат РНК інтрони з'єднаний фосфодіефірних зв'язком з 2 `-гідроксильної групою внутрішнього нуклеотиду.
Альтернативний сплайсинг
При сплайсинг здебільшого про-мРНК кожен інтрон вирізається у відповідних 5 `-і 3`-сайтах сплайсингу. У результаті всі Екзони і порядок їх розташування в транскрипт зберігаються в зрілої мРНК і утворюють безперервну послідовність (конститутивний сплайсинг). Однак сплайсинг деяких про-мРНК протікає по-різному з утворенням сімейства близьких за будовою мРНК, кожна з яких складається з специфічного набору екзонів і кодує одну з ізоформ білків одного сімейства. Такий спосіб процесингу РНК називається альтернативним сплайсингом (прозрачка 30). Зростає число генів з різних організмів, від Drosophila до людини та їх вірусів, про які відомо, що при дозріванні їх про-мРНК використовується альтернативний сплайсинг. Ці гени кодують багато білків, у тому числі деякі білки, що беруть участь у формуванні цитоскелету, м'язовому скороченні, збірці мембранних рецепторів, пептидних гормонів, в проміжному метаболізмі та транспозиції ДНК (переміщення деяких сегментів ДНК в інші геномні локуси).
ЛЕКЦІЯ
Теломер і теломерази. Рібозімамі.
Зворотня транскрипція
За допомогою методу культивування клітин тварин і рослин in vitro клітини найрізноманітніших тканин людини можна вирощувати на спеціально підібраних поживних середовищах, подібно бактеріям або іншим одноклітинним організмам. Безліч клітинних культур людини спочатку отримано з клітин ракових пухлин. Ці клітини можуть ділитися в культурі необмежену кількість разів (тому їх називають безсмертними, або імморталізованнимі). Біологи довгий час перебували у впевненості, що в оптимальних умовах нескінченно довго можуть ділитися і нормальні клітини людини і тварин (як у культурі, так і в організмі).
Однак на початку 1960-х років Леонард Гейфлік встановив, що в клітинних культурах нормальні диплоїдні (соматичні) клітини людини здатні ділитися лише обмежену кількість разів. При цьому граничне число поділок (Обмеження на кількість клітинних поділів і називають лімітом Гейфліка.) Сильно залежить від віку індивідуума, якій ці клітини спочатку належали. Так, клітини, які брали у новонароджених, ділилися в культурі 80-90 разів, а у 70-річної людини - лише 20-30 разів. Досягнувши "ліміту Гейфліка", клітини переходять у стан постаріння (яке в англомовній, а тепер часто і в російській літературі називається сенесенсом, senescence), яке характеризується різкою зміною метаболізму, і в першу чергу порушенням реплікації ДНК. Слідом за цим станом звичайно треба загибель клітин.
У січні 1998 року засоби масової інформації в усьому світі буквально вибухнули повідомленнями про те, що групі американських вчених вдалося змусити нормальні клітини людини подолати "ліміт Гейфліка" майже вдвічі. Замість того щоб постаріти й померти, клітини продовжували ділитися і виглядали юними. При цьому перетворення їх на ракові клітини (тобто злоякісної трансформації) не відбувалося: за всіма ознаками клітини, що втратили здатність старіти, були нормальними. У газетах негайно з'явилися статті із заголовками на зразок "Генетики вперлися в безсмертя", "Ліки від старіння будуть доступні, як аспірин", "Пігулки від старості стають реальністю" і т.п.
Що ж відбулося насправді? Вчені з лабораторій Джеррі Шейя, Вудрінг Райта, що працюють під патронажем фірми "Джерон корпорейшн" ("Geron Corporation"), за допомогою витончених генетичних маніпуляцій змусили в нормальних клітинах людини працювати фермент теломеразу, активність якої до цього була нульовою. Теломераза бере участь в утворенні теломер-спеціальних структур, розташованих на кінцях лінійних хромосом еукаріотів. Таким чином, оновлення теломер і стало причиною порятунку клітин від постаріння.
Теломери
Теломери - це
- Спеціалізовані кінцеві райони лінійної хромосомної ДНК,
- Складаються з багаторазово повторюваних коротких нуклеотидних послідовностей.
- До складу теломер входять також багато білків, специфічно зв'язуються з теломерними ДНК-повторами.
- Таким чином, теломери (так само, як і всі інші райони хромосоми еукаріотів) побудовані з дезоксінуклеопротеідов (ДНП), тобто комплексів ДНК з білками.
- Існування таких ділянок було постульовано в 1938 році класиками генетики, лауреатами Нобелівської премії Барбарою Мак-Клінток і Германом Меллером. Незалежно один від одного вони виявили, що фрагментація хромосом (під дією рентгенівського опромінення) і поява у них додаткових решт ведуть до хромосомних перебудов і деградації хромосом. У схоронності залишалися лише області хромосом, прилеглі до їх природним кінцях. Позбавлені кінцевих теломер, хромосоми починають зливатися з великою частотою, що веде до важких генетичним аномалій.
- Вони уклали, що природні кінці лінійних хромосом захищені спеціальними структурами. Г. Меллер запропонував називати їх теломерами (від грец. Телос - кінець і мерос - частина).
- У наступні роки з'ясувалося, що теломери не тільки запобігають деградації і злиття хромосом (і тим самим підтримують цілісність геному хазяйської клітини),
- Але й, мабуть, відповідальні за прикріплення хромосом до спеціальної внутрішньоядерної структурі (своєрідному скелету клітинного ядра), званої ядерним матриксом (рис. 1).
- Таким чином, теломери грають важливу роль у створенні специфічної архітектури і внутрішньої впорядкованості клітинного ядра. Більше того, ми покажемо, що наявність на кінцях хромосом спеціальної тіломірна ДНК дозволяє вирішити так звану проблему кінцевий недореплікаціі ДНК.
- Першими об'єктами дослідження були одноклітинні найпростіші (ресничная інфузорія Тетрахімена, зокрема), оскільки через особливості будови ядерного і хромосомного апарата вони містять кілька десятків тисяч дуже дрібних хромосом і, отже, безліч теломер в одній клітці (для порівняння: у вищих еукаріот на клітину припадає менше ста теломер).
Багаторазово повторювані блоки в тіломірна ДНК найпростіших складається лише з шести-восьми нуклеотидних залишків. При цьому один ланцюг ДНК сильно збагачена залишками гуаніловой кислоти (G-багата ланцюг; у тетрахімени вона побудована з блоків TTGGGG), а комплементарна їй ланцюг ДНК відповідно збагачена залишками цітіділовой кислоти (С-багата ланцюг).
У дріжджів повторювані блоки в тіломірна ДНК помітно довше, ніж у простих, і найчастіше не настільки регулярні.
Яке ж було здивування вчених, коли виявилося, що тіломірна ДНК людини побудована з TTAGGG-блоків, тобто відрізняється від найпростіших всього лише однією літерою у повторі. Більш того, з TTAGGG-блоків побудовані теломерні ДНК (вірніше, їх G-багаті ланцюга) всіх ссавців, рептилій, амфібій, птахів і риб. Настільки ж універсальний теломерні ДНК-повтор у рослин: не тільки у всіх наземних рослин, але навіть у їхніх вельми віддалених родичів - морських водоростей він представлений послідовністю TTTAGGG. Втім, дивуватися тут особливо нічому, так як
Процесинг РНК
Процесинг РНК у еукаріотів
Отже, у еукаріотів початковий «транскрипт» з ДНК значно більше, ніж зріла РНК. Поряд зі «значущими» учасниками рібонуклеотідной послідовності транскрипту, так званими «екзонами», які увійдуть до готову молекулу РНК, в ньому є й зайві, «мовчазні» ділянки - «інтрони», що підлягають видаленню (прозрачка 18). Зауважимо, що у еукаріотів співвідношення інтрони / Екзони (по довжині) дорівнює 9:1. У прокаріотів-співвідношення зворотне, 1:9.Всі інтрони транскрибуються у складі РНК-попередника і згодом видаляються в процесі розриву-возз'єднання - сплайсингу. Сплайсинг відбувається ще в ядрі, перед виходом РНК в цитоплазму. При цьому повинна бути збережена (або встановлена) правильна рамка зчитування. Явище сплайсингу у еукаріотів не дозволяє по амінокислотної послідовності білка відновити послідовність нуклеотидів в кодує його ділянці ДНК. У прокаріотів, на щастя, явище сплайсингу спостерігається рідко, і відповідність послідовностей РНК і ДНК, як правило, зберігається.
Виділяють чотири види інтронів, і, відповідно, чотири механізми сплайсингу
Види інтронів
1) Інтрони генів ядерних мРНК.
Першими були виявлені інтрони в ядерних генах, що кодують білки. Їх розмір варіює від 100 пар основ до 10 т.п.н. і більше. Найбільш характерною відмітною рисою всіх цих інтронів є наявність специфічних послідовностей поблизу їх 5 `- (лівої, або донорной) і 3` - (правою, або акцепторної) кінців (тобто на стиках інтронів і екзонів або в сайтах сплайсингу).
Нуклеотидні послідовності в місцях з'єднання екзонів і інтронів дуже консервативні і практично однакові у всіх генах ядерних мРНК майже у всіх вивчених видів (прозрачка 20). 5 `-сайт сплайсингу найчастіше фланкують послідовність ЦRГ (де R - пурин), а 3`-сайт - всього один залишок Г. тим не менше послідовності фланкирующие інтрони ззовні можуть значно варіювати, а мутації в них ніколи не запобігають сплайсинг, хоча і можуть впливати на його швидкість. Першими двома нуклеотидами на 5 `-кінці інтрони в РНК майже завжди є ГУ (виняток, ГЦ, зустрічається всього у двох випадках); наступні чотири нуклеотиду можуть трохи варіювати, але, мабуть, канонічної є послідовність Агага. Заміна залишку Г або У в місці зчленування зазвичай блокує сплайсинг, а заміна сусідніх підстав впливає на сплайсинг по-різному. Зазначені шість нуклеотидів на 5 `-кінці інтрони і визначають специфічну функцію 5`-сайту сплайсингу. На 3 `-кінці інтрони завжди знаходиться пара АГ. Мутації, що призводять до заміни константних А і Г на інші підстави, також блокують сплайсинг в цьому сайті.
Залишок А поблизу 3 `-кінця інтрони грає важливу роль в сплайсинг ядерних промРНК. У інтрони ссавців цей залишок не перебуває у фіксованому положенні або в будь-якої певної послідовності, оскільки його роль ймовірно, може грати будь-який з декількох залишків А, розташованих на ділянці від 18 до 37 нуклеотиду перед 3 `-сайтом сплайсингу. Однак мутації, які зачіпають сусідні з зазначеним залишком А послідовності, призводять до істотного зменшення ефективності сплайсингу in vitro; отже, хоча цей залишок і не належить якійсь певній послідовності його оточення вліяеть на сплайсинг.
У інтрони можуть міститися різні генетичні елементи, наприклад енхансери, інші гени, можливо, сигнали реплікації і упаковки хромосоми або послідовності, необхідні для упаковки промРНК в рібонуклеотідние частинки.
Сплайсинг ядерної про мРНК.
Сплайсинг ядерної про мРНК здійснюється в ядрі, можливо, одночасно з транскрипцією для одних генів, і лише після завершення транскрипції для інших.
Цис-сплайсинг. Першим етапом сплайсингу є складання комплексу сплайсингу. Найбільш ранні продукти, які виявляються в процесі сплайсингу in vitro утворюються в результаті точного розщеплення в 5 `-сайті сплайсингу один з них містить 5`-екзон, а інший - Інтрон і 3 `-екзон (прозрачка 22). Розщеплення в 5 `-сайті повинне передувати розщепленню в 3`-сайті. У ході реакції накопичуються два продукти: правильно лігувати Екзони і вільний цілий інтрон. Як продукт початкового розщеплення, так і вирізаний інтрон містять структури типу ласо.
Вирізанню інтрони у формі ласо і лигированию двох екзонів для сплайсингу ядерних про мРНК потрібно безліч ядерних факторів-білків і рибонуклеопротеїдними комплексів (мяРНП). Комплекс, що складається з безлічі субодиниць, який каталізує сплайсинг, називають сплайсінгосомой. Сплайсінгосома складається з інтрони, пов'язаного щонайменше з п'ятьма різними мяРНП і деякими допоміжними білками, зазвичай не пов'язаними з цими мяРНП. Сплайсінгосоми утворюються шляхом спарювання молекул РНК, приєднання білків до РНК і зв'язування цих білків один з одним (прозрачка 23). Кінцевий результат сплайсингу в разі про мРНК: інтрон вирізається, а фланкують його екзона з'єднуються.
Транс-сплайсинг. До цих пір, кажучи про сплайсинг, ми розглядали внутрішньомолекулярні, або цис-реакції. А чи існує міжмолекулярних або транс-сплайсинг? Іншими словами, чи може відбуватися легування двох екзонів, що знаходяться в різних молекулах РНК, з одночасним видаленням фланкують їх інтронів? Транс-сплайсинг є важливим етапом внутрішньоклітинного освіти всіх мРНК у Tripanosoma (прозрачка 25). Крім того, можливість міжмолекулярної сплайсингу продемонстрована в дослідах in vitro (прозрачка 24).
2) Інтрони в генах тРНК. Розмір інтронів в генах тРНК коливається від 14 до приблизно 60 нуклеотидів, але вони локалізуються завжди в одному і тому ж місці: через один нуклеотид від 3 `-кінця антикодоном (прозрачка 26). Як правило, якщо ген даної тРНК має інтрон, то всі інші гени в межах виду кодують цю тРНК теж містять такої ж інтрон. Однак у генів, що кодують різні тРНК внутрішній і фланговий ділянки інтронів помітно різняться. Встановлено, що видалення інтрони гена супресора тРНКтір за допомогою спрямованого мутагенезу не впливає на здатність до експресії при введенні в клітини. І все ж, весмотря на те, що ця тРНК транскрибується і процесує нормально, залишок У в антикодоном не модифікується як завжди з утворенням ψ. Чи є це вказівкою на роль інтронів в Посттранскрипційна модифікації тРНК або ми маємо справу з унікальною властивістю тРНКтір - не ясно.
Сплайсинг тРНК. Механізм видалення інтронів в тРНК найкраще вивчений у дріжджів, але деяка інформація є в дослідах з іншими нижчими еукаріотамі і рослинами.
Завдання полягає в тому, що потрібно вирізати інтрон в антікодоновой петлі. У дріжджів (прозрачка 26) тут включаються специфічні ферменти - ендонуклеази, які дізнаються про ці послідовності і розщеплюють про-тРНК в обох сайтах сплайсингу з утворенням зазначених решт, поліфункціональний білок, який каталізує всі реакції крім фосфатазной, 2 `фосфатази, лігази і АТФ (у цьому випадку в місці зчленування обох екзонів знаходиться фосфатна група, яка до цього була кінцевим фосфатом АТФ). У хребетних (прозрачка 27) три зазначені реакції каталізують окремі ферменти. При цьому кожен фермент бере участь тільки в сплайсинг тРНК. Відзначимо, що фосфат в місці з'єднання двох екзонів раніше знаходився в місці зчленування екзона і інтрони.
3) Особливі типи інтронів: група I.
Гени ядерних рРНК деяких нижчих еукаріот містять особливі інтрони і мають унікальний механізм сплайсингу. Подібні інтрони виявлені в багатьох генах, але жоден з них не був виявлений в генах хребетних.
Інтрони групи I відрізняються один від одного за розміром, вони мають ряд загальних властивостей:
А) вони самі каталізують свій сплайсинг, який може протікати in vitro у відсутності будь-б то не було білків;
Б) інформація, необхідна для сплайсингу, міститься у безлічі відносно коротких внутрішніх послідовностей всередині інтрони, які забезпечують укладання молекули з утворенням характерною просторової структури.
В) сплайсинг ініціюється вільним гуанозіна або будь-яким з його 5 `-фосфорелірованних похідних
Г) кінцевими продуктами сплайсингу є рРНК та лінійна РНК, розмір яких трохи менше, ніж розмір інтрони.
Самосплайсінг інтронів групи I. про-рРНК, прототип інтрони групи I здійснюється за участю послідовних реакцій трансетеріфікаціі, в яких акти фосфодіефірних обміну не супроводжуються гідролізом. (Прозрачка 28).
4) Особливі типи інтронів: група II.
Інтрони групи II поширені менш широко. Вони виявлені у двох мітохондріальних генах дріжджів, що кодують одну з субодиниць цитохромоксидази і цітіхром b; цікаво, що в цих генах присутні також інтрони групи I.
Сплайсинг інтронів групи II.
Інтрони групи II також піддаються самосплайсінгу in vitro, але в цьому випадку реакція ініціюється не екзогенним гуанозіна, а залишком входять до складу самого інтрони (прозрачка 29) Інтрони групи II, вивільнені після сплайсингу представляють собою лассоподобние структури, в яких 5 `-кінцевий фосфат РНК інтрони з'єднаний фосфодіефірних зв'язком з 2 `-гідроксильної групою внутрішнього нуклеотиду.
Альтернативний сплайсинг
При сплайсинг здебільшого про-мРНК кожен інтрон вирізається у відповідних 5 `-і 3`-сайтах сплайсингу. У результаті всі Екзони і порядок їх розташування в транскрипт зберігаються в зрілої мРНК і утворюють безперервну послідовність (конститутивний сплайсинг). Однак сплайсинг деяких про-мРНК протікає по-різному з утворенням сімейства близьких за будовою мРНК, кожна з яких складається з специфічного набору екзонів і кодує одну з ізоформ білків одного сімейства. Такий спосіб процесингу РНК називається альтернативним сплайсингом (прозрачка 30). Зростає число генів з різних організмів, від Drosophila до людини та їх вірусів, про які відомо, що при дозріванні їх про-мРНК використовується альтернативний сплайсинг. Ці гени кодують багато білків, у тому числі деякі білки, що беруть участь у формуванні цитоскелету, м'язовому скороченні, збірці мембранних рецепторів, пептидних гормонів, в проміжному метаболізмі та транспозиції ДНК (переміщення деяких сегментів ДНК в інші геномні локуси).
ЛЕКЦІЯ
Теломер і теломерази. Рібозімамі.
Зворотня транскрипція
За допомогою методу культивування клітин тварин і рослин in vitro клітини найрізноманітніших тканин людини можна вирощувати на спеціально підібраних поживних середовищах, подібно бактеріям або іншим одноклітинним організмам. Безліч клітинних культур людини спочатку отримано з клітин ракових пухлин. Ці клітини можуть ділитися в культурі необмежену кількість разів (тому їх називають безсмертними, або імморталізованнимі). Біологи довгий час перебували у впевненості, що в оптимальних умовах нескінченно довго можуть ділитися і нормальні клітини людини і тварин (як у культурі, так і в організмі).
Однак на початку 1960-х років Леонард Гейфлік встановив, що в клітинних культурах нормальні диплоїдні (соматичні) клітини людини здатні ділитися лише обмежену кількість разів. При цьому граничне число поділок (Обмеження на кількість клітинних поділів і називають лімітом Гейфліка.) Сильно залежить від віку індивідуума, якій ці клітини спочатку належали. Так, клітини, які брали у новонароджених, ділилися в культурі 80-90 разів, а у 70-річної людини - лише 20-30 разів. Досягнувши "ліміту Гейфліка", клітини переходять у стан постаріння (яке в англомовній, а тепер часто і в російській літературі називається сенесенсом, senescence), яке характеризується різкою зміною метаболізму, і в першу чергу порушенням реплікації ДНК. Слідом за цим станом звичайно треба загибель клітин.
У січні 1998 року засоби масової інформації в усьому світі буквально вибухнули повідомленнями про те, що групі американських вчених вдалося змусити нормальні клітини людини подолати "ліміт Гейфліка" майже вдвічі. Замість того щоб постаріти й померти, клітини продовжували ділитися і виглядали юними. При цьому перетворення їх на ракові клітини (тобто злоякісної трансформації) не відбувалося: за всіма ознаками клітини, що втратили здатність старіти, були нормальними. У газетах негайно з'явилися статті із заголовками на зразок "Генетики вперлися в безсмертя", "Ліки від старіння будуть доступні, як аспірин", "Пігулки від старості стають реальністю" і т.п.
Що ж відбулося насправді? Вчені з лабораторій Джеррі Шейя, Вудрінг Райта, що працюють під патронажем фірми "Джерон корпорейшн" ("Geron Corporation"), за допомогою витончених генетичних маніпуляцій змусили в нормальних клітинах людини працювати фермент теломеразу, активність якої до цього була нульовою. Теломераза бере участь в утворенні теломер-спеціальних структур, розташованих на кінцях лінійних хромосом еукаріотів. Таким чином, оновлення теломер і стало причиною порятунку клітин від постаріння.
Теломери
Теломери - це
- Спеціалізовані кінцеві райони лінійної хромосомної ДНК,
- Складаються з багаторазово повторюваних коротких нуклеотидних послідовностей.
- До складу теломер входять також багато білків, специфічно зв'язуються з теломерними ДНК-повторами.
- Таким чином, теломери (так само, як і всі інші райони хромосоми еукаріотів) побудовані з дезоксінуклеопротеідов (ДНП), тобто комплексів ДНК з білками.
- Існування таких ділянок було постульовано в 1938 році класиками генетики, лауреатами Нобелівської премії Барбарою Мак-Клінток і Германом Меллером. Незалежно один від одного вони виявили, що фрагментація хромосом (під дією рентгенівського опромінення) і поява у них додаткових решт ведуть до хромосомних перебудов і деградації хромосом. У схоронності залишалися лише області хромосом, прилеглі до їх природним кінцях. Позбавлені кінцевих теломер, хромосоми починають зливатися з великою частотою, що веде до важких генетичним аномалій.
- Вони уклали, що природні кінці лінійних хромосом захищені спеціальними структурами. Г. Меллер запропонував називати їх теломерами (від грец. Телос - кінець і мерос - частина).
- У наступні роки з'ясувалося, що теломери не тільки запобігають деградації і злиття хромосом (і тим самим підтримують цілісність геному хазяйської клітини),
- Але й, мабуть, відповідальні за прикріплення хромосом до спеціальної внутрішньоядерної структурі (своєрідному скелету клітинного ядра), званої ядерним матриксом (рис. 1).
- Таким чином, теломери грають важливу роль у створенні специфічної архітектури і внутрішньої впорядкованості клітинного ядра. Більше того, ми покажемо, що наявність на кінцях хромосом спеціальної тіломірна ДНК дозволяє вирішити так звану проблему кінцевий недореплікаціі ДНК.
- Першими об'єктами дослідження були одноклітинні найпростіші (ресничная інфузорія Тетрахімена, зокрема), оскільки через особливості будови ядерного і хромосомного апарата вони містять кілька десятків тисяч дуже дрібних хромосом і, отже, безліч теломер в одній клітці (для порівняння: у вищих еукаріот на клітину припадає менше ста теломер).
Багаторазово повторювані блоки в тіломірна ДНК найпростіших складається лише з шести-восьми нуклеотидних залишків. При цьому один ланцюг ДНК сильно збагачена залишками гуаніловой кислоти (G-багата ланцюг; у тетрахімени вона побудована з блоків TTGGGG), а комплементарна їй ланцюг ДНК відповідно збагачена залишками цітіділовой кислоти (С-багата ланцюг).
У дріжджів повторювані блоки в тіломірна ДНК помітно довше, ніж у простих, і найчастіше не настільки регулярні.
Яке ж було здивування вчених, коли виявилося, що тіломірна ДНК людини побудована з TTAGGG-блоків, тобто відрізняється від найпростіших всього лише однією літерою у повторі. Більш того, з TTAGGG-блоків побудовані теломерні ДНК (вірніше, їх G-багаті ланцюга) всіх ссавців, рептилій, амфібій, птахів і риб. Настільки ж універсальний теломерні ДНК-повтор у рослин: не тільки у всіх наземних рослин, але навіть у їхніх вельми віддалених родичів - морських водоростей він представлений послідовністю TTTAGGG. Втім, дивуватися тут особливо нічому, так як
-В тіломірна ДНК не закодовано жодних білків (вона не містить генів), а у всіх організмів теломери виконують універсальні функції, мова про які йшла вище. Щоправда, як це часто буває в живій природі, з цього загального правила є рідкісні, але важливі винятки. Найбільш відоме з них - тіломірна ДНК плодової мухи дрозофіли. Вона представлена не короткими повторами, а ретротранспозону - рухливими генетичними елементами (докладніше про рухомих генетичних елементах і ролі ретротранспозонів в освіті теломер див. у статтях В. М. Глазера "гомологичная генетична рекомбінація" і "Генетична рекомбінація без гомології: процеси, що ведуть до перебудов в геномі "і В. А. Гвоздьова" Рухомий ДНК еукаріотів. Ч. 1-2 "в" Соросівської Освітньому Журналі "(1998. № 7, 8).
- Дуже важлива характеристика теломерна ДНК - їх довжина. У людини вона коливається від 2 до 20 тис. пар основ (т.п.о.), а у деяких видів мишей може досягати сотень т.п.о.
- Було відмічено, що в багатьох видів двуспіральной тіломірна ДНК на самому кінці містить однотяжевой "хвіст". Цей однотяжевой район тіломірна ДНК представлений її G-багатою ланцюгом і закінчується вільної 3'-гідроксильної групою. Відповідно білки теломер прийнято поділяти на дві групи: білки, які пов'язані з однотяжевой тіломірна ДНК, і білки, пов'язані з двутяжевой ДНК теломери. Ці білки вивчаються дуже інтенсивно, але знаємо ми про них ще мало. Немає сумнівів у тому, що теломерні білки беруть участь у всіх функціях теломер, підтримуючи їх структуру і регулюючи довжину тіломірна ДНК (як ми побачимо нижче, довжина теломер - надзвичайно важливий параметр). Встановлено, що деякі з білків, асоційованих з двуспіральной тіломірна ДНК, регулюють активність певних генів, підвищуючи або пригнічуючи їхню експресію. Як приклад можна навести дріжджовий білок Rap1p. Цей ДНК-зв'язуючий білок, безсумнівно, бере участь у регуляції довжини тіломірна ДНК. У той же час, навіть будучи у складі теломери, він бере участь в активації і репресії транскрипції. Це означає, що зміни чи порушення в структурі теломер можуть зачіпати не тільки їх власні функції, а й експресію життєво важливих генів, що знаходяться в інших районах хромосом. Крім того, важливі для підтримки загальної структури хромосом білки розташовуються на ДНК, що безпосередньо примикає до тіломірна (іноді її називають субтеломерной ДНК).
Відомо, що ДНК-полімерази, синтезуючи дочірню ланцюг ДНК, прочитують батьківську ланцюг у напрямку від її 3'-кінця до 5'-кінця. Відповідно дочірня ланцюг синтезується в напрямку 5 '3'. У протилежному напрямку синтез ланцюга ДНК фермент каталізувати не може (рис. 2). Крім того, ДНК-полімераза починає синтез тільки зі спеціального РНК-праймера - короткою РНК-затравки, комплементарної ДНК. Після закінчення синтезу ДНК РНК-праймери видаляються, а пропуски в одній з дочірніх ланцюгів ДНК заповнюються ДНК-полімеразою. Однак на 3'-кінці ДНК такий пропуск заповнений бути не може, і тому 3'-кінцеві ділянки ДНК залишаються однотяжевимі, а їх 5'-кінцеві ділянки - недорепліцірованнимі. Звідси ясно, що кожен раунд реплікації хромосом буде призводити до їх вкорочення. Зрозуміло, що перш за все повинна скорочуватися довжина тіломірна ДНК.
У 1984 році Е. Блекберн і Е. Грайдер виділили фермент, який за допомогою механізму, відмінного від механізму реакцій, що лежать в основі реплікації ДНК, синтезує тіломірна ДНК. Цей фермент був названий теломеразою.
ЯК ПРАЦЮЄ Теломераза
Теломераза - це фермент, що синтезує тандемної повторювані сегменти ДНК, з яких складається G-ланцюг тіломірна ДНК.
- Вона відноситься до класу ДНК-полімераз
- Теломераза - це РНК-залежна ДНК-полімераза або зворотна транскриптаза.
- Ферменти цього класу, що синтезують ДНК на РНК-матрицях, дуже добре відомі молекулярним біологам. Вони закодовані і містяться в ретровірусу (наприклад, у вірусі імунодефіциту людини, що викликає захворювання СНІДом) і служать для синтезу ДНК-копій їхніх геномів, який у ретровірус представлений РНК.
- У клітинному геномі зворотні транскриптази закодовані в ретротранспозону.
- РНК, яка використовується теломеразою для синтезу тіломірна ДНК в якості матриці, входить до складу цього ферменту. У цьому унікальність теломерази: на сьогодні це єдина відома РНК-містить зворотна транскриптаза.
- Теломеразной РНК у різних організмів сильно розрізняються по довжині і структурі.
- Теломерази найпростіших містять РНК довжиною в 150-200 нуклеотидних залишків (Н.О.),
- Довжина теломеразной РНК людини - 450 Н.О.,
- Теломераза дріжджів містить аномально довгу РНК (близько 1300 Н.О.).
- Як і будь-яка інша РНК клітини, теломеразной РНК має специфічної вторинної та третинної структурою. Вторинна структура ізольованою теломеразной РНК достовірно встановлено тільки для теломерази найпростіших. Просторова структура теломеразной РНК у складі ферментативного комплексу поки ще невідома.
- Матричний ділянку представлений в теломеразной РНК тільки один раз. Його довжина не перевищує довжину двох повторів у тіломірна ДНК, які він кодує і яким він, зрозуміло, комплементарний.
- Так як теломераза синтезує сегменти ДНК, що повторюються багато разів, використовуючи тільки один сегмент своєї РНК, вона повинна володіти здатністю періодично (після завершення синтезу кожного повтору) переміщувати (транслоціровать) матричний ділянку в район 3'-кінця синтезується тіломірна ДНК. Джерелом енергії для такого переміщення, мабуть, служить сама реакція синтезу ланцюга тіломірна ДНК, оскільки дезоксинуклеозидтрифосфаты - субстрати цієї реакції - високоенергетичні речовини.
Таке подовження можливо, тому що кінці хромосом містять повтори з декількох нуклеотидів (наприклад, у людини ТТАGGG), яким комплементарний ділянку РНК - компонента теломерази. Таким чином, теломераза дізнається виступаючий 3'-кінець і подовжує його. У такому випадку вдається, знову з використанням ДНК-затравки і РНК-матриці, добудувати кінець ДНК (див. рис. 3). Теломеразной машина влаштована таким чином, що кінець хромосоми може не тільки зберігатися, але і подовжуватись у ряді поколінь. Дійсно, останнім неважко собі уявити, якщо добудовується, 3'-кінець буде досить довгим. Одна з причин старіння бачиться в тому, що за відсутності теломерази у деяких тканинах відбувається укорочення хромосоми із втратою важливих генів. Навпаки, безсмертя ряду клітин у культурі поза організмом, властиве, як правило, клітинам з пухлин, пояснюється реактивацією теломерази. Ми коротко розглянули цю цікаву проблему, пов'язану з активністю теломерази і вічними проблемами біологічного старіння та пухлинного росту, оскільки виявилося, що іноді в боротьбу з укороченням кінців хромосом вступають мобільні елементи. У плодової мушки дрозофіли відсутня теломеразной машина, але кінці ДНК подовжуються за рахунок переміщень ретротранспозонів. На цьому прикладі вперше показана важлива структурна і функціональна роль ретротранспозонів. Вони виступають як компоненти генома, які рятують хромосому від укорочування. В якості рятувальників виступають ретротранспозону, пов'язані з домами, без довгих кінцевих повторів. Ретротранспозон переміщуються, утворюючи повторювану структуру, в якій елементи з'єднані один з одним за типом "голова до хвоста" (див. рис. 3). Спочатку на РНК-транскриптів як на матриці за допомогою ревертази будується комплементарна нитка ДНК, а потім після видалення РНК-матриці добудовується інша. Таким чином, якщо ці ретротранспозону і існували колись як елементи-паразити, то згодом геном господаря пристосував їх для виконання такої важливої функції, як збереження кінцевих ділянок хромосом. Ці ретротранспозону стали вже не егоїстами, а безцінними помічниками, що рятують хромосому від втрати генів.
1. На першій стадії теломераза знаходить 3'-кінець тіломірна ДНК, до якого частина матричного ділянки теломеразной РНК утворює комплементарний комплекс. При цьому теломераза використовує 3'-кінець хромосомної ДНК в якості праймера.
2. Далі настає черга РНК-залежною ДНК-полімеразної активності теломерази. Вона забезпечується спеціальною субодиницею теломерази, яка по влаштуванню свого каталітичного центру багато в чому схожа з зворотними транскриптаза ретровірусів і ретротранспозонів.
3. Коли синтез ДНК-повтору закінчується, відбувається транслокація, тобто переміщення матриці і білкових субодиниць ферменту на заново синтезований кінець тіломірна ДНК, і весь цикл повторюється знову.
Знайомство навіть з дуже схематичним описом механізму теломеразной реакції (див. рис. 3) призводить до висновку, що двома компонентами - зворотного транскриптазою і теломеразной РНК - для її здійснення обійтися не можна.
Немає сумнівів у тому, що в його складі повинні бути субодиниця, що відповідає за пошук і зв'язування 3'-кінця хромосоми (і виконує таким чином своєрідну якірну функцію); субодиниця, відповідальна за транслокацію; субодиниці, що зв'язують продукт реакції (однотяжевую ДНК). У складі теломерази зазвичай виявляється і білкова субодиниця з нуклеазну активністю, яка, мабуть, відщеплює від 3'-кінця тіломірна ДНК один за одним кілька нуклеотидів до тих пір, поки на цьому кінці не виявиться послідовність, комплементарна потрібної ділянки матричного сегмента теломеразной РНК . Ці субодиниці теломерази, що виконують різноманітні функції в ході синтезу G-ланцюга тіломірна ДНК, зображені на рис. 4, на якому наведена гіпотетична структура теломерази дріжджів. Потрібно ще раз підкреслити, що повний білковий склад ферменту не відомий до цього часу ні в одному випадку. Тому в табл. 1 наведені характеристики тільки добре вивчених білкових субодиниць декількох теломерази.
Широке поширення теломерази серед еукаріот говорить про те, що механізм синтезу тіломірна ДНК, який ми спостерігаємо у сучасних організмів, виник дуже давно. Більш того, еволюційно-генетичний порівняльний аналіз нуклеотидних послідовностей генів каталітичних субодиниць теломерази та інших зворотних транскриптаз показує, що цей механізм міг існувати ще до появи перших еукаріотичних клітин.
З-ланцюг тіломірна ДНК синтезується за допомогою звичайної ДНК-полімерази (див. рис. 2). Тому 3'-кінцевий ділянку G-ланцюга, на якому, мабуть, спочатку була РНК-запал, в кінцевому підсумку залишається в однотяжевом стані (тобто в принципі він готовий до того, щоб теломераза наростила на ньому новий повтор).
Активність теломерази у вищих еукаріот виявлена лише в трьох типах клітин:
- Генеративних,
- Ракових
- Лініях імморталізованних клітинних культур.
статевих і стовбурових клітинах. В інших типах клітин синтез цього ферменту припиняється ще в ембріональний період розвитку
В організмі при диференціювання клітин теломераза репресуються. Експресію теломерази вважають фактором імморталізаціі клітин.
У соматичних клітинах, культивованих in vitro, теломераза не працює і теломери поступово скорочуються. Довжина теломер достовірно корелює з проліферативним потенціалом (наприклад, у фібробластах людини). Скорочення теломер може грати роль мітотичних годин, які відлічують кількість поділів клітини. Після досягнення критичної довжини тіломірна ДНК запускаються процеси зупинки клітинного циклу [5]. Блок клітинних поділів настає ще до того, як теломера зникла зовсім. Існує деяка мінімальна довжина теломери, коли поділ ще дозволено. Іншими словами, припинення поділу наступає до того, як почав руйнуватися смислової текст геному. Таким способом еукаріоти страхують себе від появи монстрів внаслідок недореплікаціі ДНК.
Опублікована в 1998 році в журналі "Science" стаття американських дослідників завдяки засобам масової інформації привернула увагу не лише науковців (а в першу чергу не на науковців) у зв'язку з проблемами старіння і "клітинного безсмертя". У цій прекрасній роботі колективу, очолюваного Джеррі Шеем, вдалося на 40% збільшити число поділів нормальних соматичних клітин людини в культурі. За допомогою генно-інженерних методів у клітини був введений ген каталітичної білкової субодиниці теломерази і прилеглий до нього ділянку ДНК, що регулює його роботу. При активній роботі гена збільшувався як розмір тіломірна ДНК, так і тривалість життя клітинних культур. Понад звичайних 50 поділів клітини пройшли додатково 20 поділок.
Скорочення теломер можна розглядати як молекулярний індикатор кількості поділів, але не старіння клітини. Так, на культурі нормальних фібробластів людини, взятих від донорів у віці від 0 до 93 років, виявили кореляцію між початковою довжиною теломер і проліферативної здатністю клітини у всьому діапазоні віків. А розмір тіломірна ДНК сперматозоїдів не зменшувався відповідно до віку чоловіки, що говорить про експресії теломерази у лінії статевих клітин. Припинення роботи теломерази, що відзначається в переважній більшості диференційованих соматичних клітин тварин, є свідченням їх зрілості, а отже, і неминуче наступних потім процесів в'янення та загибелі.
Старіння особини - це нормальна біологічна функція, яка сприяє прогресивної еволюції виду, розмножується статевим шляхом. Тиск природного відбору слабшає після досягнення тваринам репродуктивного успіху, оскільки існування особини після цього має менше значення для вигляду. Смерть від старості видаляє з популяції виконали свою роль предків і дає простір нащадкам - носіям нових корисних ознак. Як будь-яка важлива біологічна функція, старіння обумовлене паралельним дією декількох молекулярних механізмів [6]. Вимкнення теломерази - лише один з них.
Не варто розглядати гени, що кодують білкові субодиниці теломерази і входить до її складу РНК, як "гени безсмертя". Підтримання довжини тіломірна ДНК на певному рівні залежить не тільки від взаємодії з нею теломерази і теломерсвязивающіх білків, але і деяких, поки невідомих факторів, що регулюють освіту самих компонентів теломеробразующего комплексу.
Навряд чи безсмертя, досягнуте раковими клітинами, що розмножуються в культурі десятиліттями без укорочення теломер, - це те, до чого потрібно прагнути. Ліки від смерті немає. Але той факт, що введення в такі клітини препаратів, що зв'язують РНК-компонент теломерази, призводить до вкорочення теломер з подальшою загибеллю клітин, вселяє надію на появу нових засобів боротьби з раком.
Розуміння механізму роботи теломерази, а головне, регуляції експресії її в клітці наблизить нас до розуміння процесів і злоякісної трансформації і старіння.
Теломераза, РАК І СТАРІННЯ
Питання про те, якою мірою теломерні механізм бере участь в старінні багатоклітинних організмів. Цілком можливо, що вони винайшли зовсім інші програми старечого феноптоза. Але немає сумніву, що у людей - рекордсменів за довгожительством зменшення довжини теломер вже наближається до тієї фатальної межі, за якою наступає заборона на розмноження клітин. Так, за даними групи К. Сасаджіми з Японії, теломери в клітинах печінки старих старше 80 років виявляються майже вдвічі коротше, ніж у дітей до 8 років. Мабуть, продовжити життя тим, кому за 100, можна лише за умови, що вдасться наростити їх теломери, включивши на якийсь час теломеразу в печінці та інших тканинах, де цей фермент виключився ще під час ембріонального розвитку.
Розглянемо дані про довжину тіломірна ДНК і активності теломерази у різних клітинах людини, наведені в табл. 2.
Висока теломеразной активність спостерігається в статевих клітинах людини протягом всього його життя. Відповідно їх теломери складаються з найбільшого числа ДНК-повторів та містять усі необхідні білки для нормальної проліферації клітин. Аналогічна ситуація спостерігається і для стовбурових клітин. Нагадаємо, що стовбурові клітини діляться необмежено довго. Однак у стовбурної клітини завжди є можливість дати дві дочірні клітини, одна з яких залишиться стовбурової ("безсмертну"), а інша вступить у процес диференціювання. Завдяки цьому стовбурові клітини служать постійним джерелом різноманітних клітин організму. Наприклад, стовбурові клітини кісткового мозку дають початок гемопоезу - процесу утворення клітин крові, а з базальних клітин епідермісу відбуваються різноманітні клітини шкірного покриву. Як тільки нащадки статевих або стовбурових клітин починають диференціюватися, активність теломерази падає і їх теломери починають зменшуватися. У клітинах, диференціювання яких завершена, активність теломерази падає до нуля, і, як ми вже відзначали, з кожним клітинним поділом вони з неминучістю наближаються до стану сенесенса (перестають ділитися). Слідом за цим настає криза, і більшість клітин гинуть (рис. 5). Ця картина характерна для переважної більшості відомих культур клітин еукаріот. Однак і тут є рідкісні, але важливі винятки: теломеразной активність виявляється в таких "смертних" клітинах, як макрофаги і лейкоцити.
Нещодавно було встановлено, що нормальні соматичні клітини тому позбавлені теломеразной активності, що в них повністю пригнічена експресія гена її каталітичної субодиниці (зворотної транскриптази). Інші ж складові теломерази, включаючи теломеразной РНК, утворюються в цих клітинах, хоча і в менших кількостях, ніж у їх "безсмертних" прабатьків, але постійно (або, як кажуть, конститутивно). Відкриття цього важливого факту Дж. Шеем, В. Райтом і їхніми співробітниками і стало основою для тієї сенсаційної роботи щодо подолання "ліміту Гейфліка". Дійсно, все інше було вже справою техніки (хоча й дуже непростий).
У нормальні соматичні клітини були внесені гени теломеразной зворотної транскриптази за допомогою спеціальних векторів, сконструйованих з вірусних ДНК. Рівень експресії гена в еукаріотичної клітці залежить від багатьох факторів, в тому числі від білків - чинників транскрипції, зв'язуються зі спеціалізованими ділянками ДНК, розташованими в хромосомі по сусідству з цим геном. Геноми вірусів, яким потрібно швидко розмножитися в клітці-хазяїні, несуть в собі ділянки ДНК, здатні в багато разів підсилити експресію того чи іншого гена. Дослідники подбали про те, щоб в їх конструкціях ген теломеразной зворотної транскриптази людини опинився в оточенні саме таких ділянок вірусної ДНК. Результати їхніх експериментів можна підсумувати коротко: клітини, в яких теломераза підтримувала довжину теломер на рівні, характерному для молодих клітин, продовжували ділитися і тоді, коли контрольні клітини (без теломерази) старіли і вмирали.
У цій та аналогічної їй роботах особливо ретельно контролюється відсутність в культурі клітин ракових клітин. Відомо, що клітини більшості досліджених на сьогодні ракових пухлин характеризуються досить високою активністю теломерази, яка підтримує довжину теломер на постійному рівні (див. табл. 2). Цей рівень помітно нижче, ніж, наприклад, у ембріональних клітин, але він достатній, щоб забезпечити безмежне ділення ракових клітин в культурі. Існує гіпотеза, у якої чимало прихильників, що припускає, що втрата теломеразной активності соматичними клітинами сучасних організмів є набутих в процесі еволюції властивість, що захищає їх від злоякісного переродження.
Порівняно невелика довжина теломер у більшості ракових клітин наводить на думку про те, що вони походять з нормальних клітин, досягли передкризового стану. Як ми вже відзначали, цей стан характеризується порушенням регуляції багатьох біохімічних реакцій. У таких клітинах відбуваються численні хромосомні перебудови, які в тому числі ведуть і до злоякісної трансформації (більш докладно про походження злоякісних пухлин можна знайти у статті Г. І. Абелева "Що таке пухлина": Соросівський Освітній Журнал. 1997. № 10). Більшість цих клітин гинуть, але в частини з них в результаті випадкових мутацій може активуватися постійна експресія генів теломерази, яка буде підтримувати довжину теломер на рівні, необхідному і достатньому для їх функціонування (див. рис. 5).
Деякий час викликав подив той факт, що приблизно п'ята частина проаналізованих ракових пухлин і клітин взагалі не містила активної теломерази. Виявилося, однак, що довжина теломер у них підтримується на належному рівні. Таким чином, в цих клітинах діє інший (не теломеразной, а скоріше рекомбінаційний) механізм утворення тіломірна ДНК (див. статтю В. М. Глазера "гомологичная генетична рекомбінація": Соросівський Освітній Журнал. 1998. № 7). Іншими словами, такі клітини знаходяться в тому ж ряду винятків із правила, що і дрозофіла.
ЗАМІСТЬ ВИСНОВКУ
Які ж практичні висновки випливають з того, що на сьогоднішній день вдалося дізнатися про зв'язок між активністю теломерази, раковим зростанням і старінням клітин. Здавалося б, вони лежать на поверхні: не хочеш старіти - активуй теломеразу; хочеш убити ракову пухлину - убий в ній спочатку теломеразу.
Легковажність першого висновку (а саме його підхопили засоби масової інформації) очевидна: між культурою клітин і клітинної тканиною, а тим більше організмом дистанція величезного розміру. Ще не настав час серйозно обговорювати проблему отримання трансгенних органів людини для пересадки їх хворим людям (хоча теоретично це, звичайно, можливо). А головне, процес старіння не тільки організму, але і клітини - це виключно складний комплекс змін в безлічі біохімічних реакцій, і його навряд чи можна повернути назад, впливаючи тільки на якусь одну з них. У той же час існують цілком реальні плани активувати теломеразу в клітинах шкіри, яку пересаджують пацієнтам із сильними опіками, і тим самим активувати їх зростання. Або спробувати тим же шляхом "омолодити" клітини сітківки ока, взявши їх у пацієнта, який страждає помутнінням сітківки (а це широко поширене захворювання у літніх людей, що призводить до сліпоти), і потім повернути назад.
Що ж стосується розробки методів виборчого придушення теломеразной активності в ракових пухлинах, то зараз це важливий напрямок в пошуку нових засобів боротьби із злоякісними захворюваннями. Поки більшість робіт пов'язано з випробуванням інгібіторів зворотних транскриптаз (каталітичних субодиниць теломерази). Досвід боротьби зі СНІДом, де намагаються вирішити аналогічну задачу, говорить про те, що певні надії знайти такі ліки є. Головна трудність полягає в тому, що каталітична субодиниця теломерази - це одна з ДНК-полімераз і шуканий інгібітор повинен бути спрямований саме на теломеразной ДНК-синтезуючу активність. В іншому випадку він буде токсичний для нормальних клітин.
Більш перспективними здаються недавно з'явилися роботи, в яких описано виборче придушення теломеразной РНК, що викликає загибель ракових клітин у культурі. У нормальних клітинах, як це ми зазначали вище, теломеразной РНК синтезується, але ці клітини позбавлені теломеразной активності і, швидше за все, теломеразной РНК їм не потрібна.
Вивчення тонкої структури теломер і механізму дії теломерази знаходиться ще тільки на початковій стадії. Однак вони привертають до себе величезний інтерес дослідників, що працюють в самих різних галузях біології та медицини, і тут вже найближчим часом можна чекати нових цікавих відкриттів.
- Дуже важлива характеристика теломерна ДНК - їх довжина. У людини вона коливається від 2 до 20 тис. пар основ (т.п.о.), а у деяких видів мишей може досягати сотень т.п.о.
- Було відмічено, що в багатьох видів двуспіральной тіломірна ДНК на самому кінці містить однотяжевой "хвіст". Цей однотяжевой район тіломірна ДНК представлений її G-багатою ланцюгом і закінчується вільної 3'-гідроксильної групою. Відповідно білки теломер прийнято поділяти на дві групи: білки, які пов'язані з однотяжевой тіломірна ДНК, і білки, пов'язані з двутяжевой ДНК теломери. Ці білки вивчаються дуже інтенсивно, але знаємо ми про них ще мало. Немає сумнівів у тому, що теломерні білки беруть участь у всіх функціях теломер, підтримуючи їх структуру і регулюючи довжину тіломірна ДНК (як ми побачимо нижче, довжина теломер - надзвичайно важливий параметр). Встановлено, що деякі з білків, асоційованих з двуспіральной тіломірна ДНК, регулюють активність певних генів, підвищуючи або пригнічуючи їхню експресію. Як приклад можна навести дріжджовий білок Rap1p. Цей ДНК-зв'язуючий білок, безсумнівно, бере участь у регуляції довжини тіломірна ДНК. У той же час, навіть будучи у складі теломери, він бере участь в активації і репресії транскрипції. Це означає, що зміни чи порушення в структурі теломер можуть зачіпати не тільки їх власні функції, а й експресію життєво важливих генів, що знаходяться в інших районах хромосом. Крім того, важливі для підтримки загальної структури хромосом білки розташовуються на ДНК, що безпосередньо примикає до тіломірна (іноді її називають субтеломерной ДНК).
Відомо, що ДНК-полімерази, синтезуючи дочірню ланцюг ДНК, прочитують батьківську ланцюг у напрямку від її 3'-кінця до 5'-кінця. Відповідно дочірня ланцюг синтезується в напрямку 5 '3'. У протилежному напрямку синтез ланцюга ДНК фермент каталізувати не може (рис. 2). Крім того, ДНК-полімераза починає синтез тільки зі спеціального РНК-праймера - короткою РНК-затравки, комплементарної ДНК. Після закінчення синтезу ДНК РНК-праймери видаляються, а пропуски в одній з дочірніх ланцюгів ДНК заповнюються ДНК-полімеразою. Однак на 3'-кінці ДНК такий пропуск заповнений бути не може, і тому 3'-кінцеві ділянки ДНК залишаються однотяжевимі, а їх 5'-кінцеві ділянки - недорепліцірованнимі. Звідси ясно, що кожен раунд реплікації хромосом буде призводити до їх вкорочення. Зрозуміло, що перш за все повинна скорочуватися довжина тіломірна ДНК.
У 1984 році Е. Блекберн і Е. Грайдер виділили фермент, який за допомогою механізму, відмінного від механізму реакцій, що лежать в основі реплікації ДНК, синтезує тіломірна ДНК. Цей фермент був названий теломеразою.
ЯК ПРАЦЮЄ Теломераза
Теломераза - це фермент, що синтезує тандемної повторювані сегменти ДНК, з яких складається G-ланцюг тіломірна ДНК.
- Вона відноситься до класу ДНК-полімераз
- Теломераза - це РНК-залежна ДНК-полімераза або зворотна транскриптаза.
- Ферменти цього класу, що синтезують ДНК на РНК-матрицях, дуже добре відомі молекулярним біологам. Вони закодовані і містяться в ретровірусу (наприклад, у вірусі імунодефіциту людини, що викликає захворювання СНІДом) і служать для синтезу ДНК-копій їхніх геномів, який у ретровірус представлений РНК.
- У клітинному геномі зворотні транскриптази закодовані в ретротранспозону.
- РНК, яка використовується теломеразою для синтезу тіломірна ДНК в якості матриці, входить до складу цього ферменту. У цьому унікальність теломерази: на сьогодні це єдина відома РНК-містить зворотна транскриптаза.
- Теломеразной РНК у різних організмів сильно розрізняються по довжині і структурі.
- Теломерази найпростіших містять РНК довжиною в 150-200 нуклеотидних залишків (Н.О.),
- Довжина теломеразной РНК людини - 450 Н.О.,
- Теломераза дріжджів містить аномально довгу РНК (близько 1300 Н.О.).
- Як і будь-яка інша РНК клітини, теломеразной РНК має специфічної вторинної та третинної структурою. Вторинна структура ізольованою теломеразной РНК достовірно встановлено тільки для теломерази найпростіших. Просторова структура теломеразной РНК у складі ферментативного комплексу поки ще невідома.
- Матричний ділянку представлений в теломеразной РНК тільки один раз. Його довжина не перевищує довжину двох повторів у тіломірна ДНК, які він кодує і яким він, зрозуміло, комплементарний.
- Так як теломераза синтезує сегменти ДНК, що повторюються багато разів, використовуючи тільки один сегмент своєї РНК, вона повинна володіти здатністю періодично (після завершення синтезу кожного повтору) переміщувати (транслоціровать) матричний ділянку в район 3'-кінця синтезується тіломірна ДНК. Джерелом енергії для такого переміщення, мабуть, служить сама реакція синтезу ланцюга тіломірна ДНК, оскільки дезоксинуклеозидтрифосфаты - субстрати цієї реакції - високоенергетичні речовини.
Таке подовження можливо, тому що кінці хромосом містять повтори з декількох нуклеотидів (наприклад, у людини ТТАGGG), яким комплементарний ділянку РНК - компонента теломерази. Таким чином, теломераза дізнається виступаючий 3'-кінець і подовжує його. У такому випадку вдається, знову з використанням ДНК-затравки і РНК-матриці, добудувати кінець ДНК (див. рис. 3). Теломеразной машина влаштована таким чином, що кінець хромосоми може не тільки зберігатися, але і подовжуватись у ряді поколінь. Дійсно, останнім неважко собі уявити, якщо добудовується, 3'-кінець буде досить довгим. Одна з причин старіння бачиться в тому, що за відсутності теломерази у деяких тканинах відбувається укорочення хромосоми із втратою важливих генів. Навпаки, безсмертя ряду клітин у культурі поза організмом, властиве, як правило, клітинам з пухлин, пояснюється реактивацією теломерази. Ми коротко розглянули цю цікаву проблему, пов'язану з активністю теломерази і вічними проблемами біологічного старіння та пухлинного росту, оскільки виявилося, що іноді в боротьбу з укороченням кінців хромосом вступають мобільні елементи. У плодової мушки дрозофіли відсутня теломеразной машина, але кінці ДНК подовжуються за рахунок переміщень ретротранспозонів. На цьому прикладі вперше показана важлива структурна і функціональна роль ретротранспозонів. Вони виступають як компоненти генома, які рятують хромосому від укорочування. В якості рятувальників виступають ретротранспозону, пов'язані з домами, без довгих кінцевих повторів. Ретротранспозон переміщуються, утворюючи повторювану структуру, в якій елементи з'єднані один з одним за типом "голова до хвоста" (див. рис. 3). Спочатку на РНК-транскриптів як на матриці за допомогою ревертази будується комплементарна нитка ДНК, а потім після видалення РНК-матриці добудовується інша. Таким чином, якщо ці ретротранспозону і існували колись як елементи-паразити, то згодом геном господаря пристосував їх для виконання такої важливої функції, як збереження кінцевих ділянок хромосом. Ці ретротранспозону стали вже не егоїстами, а безцінними помічниками, що рятують хромосому від втрати генів.
1. На першій стадії теломераза знаходить 3'-кінець тіломірна ДНК, до якого частина матричного ділянки теломеразной РНК утворює комплементарний комплекс. При цьому теломераза використовує 3'-кінець хромосомної ДНК в якості праймера.
2. Далі настає черга РНК-залежною ДНК-полімеразної активності теломерази. Вона забезпечується спеціальною субодиницею теломерази, яка по влаштуванню свого каталітичного центру багато в чому схожа з зворотними транскриптаза ретровірусів і ретротранспозонів.
3. Коли синтез ДНК-повтору закінчується, відбувається транслокація, тобто переміщення матриці і білкових субодиниць ферменту на заново синтезований кінець тіломірна ДНК, і весь цикл повторюється знову.
Знайомство навіть з дуже схематичним описом механізму теломеразной реакції (див. рис. 3) призводить до висновку, що двома компонентами - зворотного транскриптазою і теломеразной РНК - для її здійснення обійтися не можна.
Немає сумнівів у тому, що в його складі повинні бути субодиниця, що відповідає за пошук і зв'язування 3'-кінця хромосоми (і виконує таким чином своєрідну якірну функцію); субодиниця, відповідальна за транслокацію; субодиниці, що зв'язують продукт реакції (однотяжевую ДНК). У складі теломерази зазвичай виявляється і білкова субодиниця з нуклеазну активністю, яка, мабуть, відщеплює від 3'-кінця тіломірна ДНК один за одним кілька нуклеотидів до тих пір, поки на цьому кінці не виявиться послідовність, комплементарна потрібної ділянки матричного сегмента теломеразной РНК . Ці субодиниці теломерази, що виконують різноманітні функції в ході синтезу G-ланцюга тіломірна ДНК, зображені на рис. 4, на якому наведена гіпотетична структура теломерази дріжджів. Потрібно ще раз підкреслити, що повний білковий склад ферменту не відомий до цього часу ні в одному випадку. Тому в табл. 1 наведені характеристики тільки добре вивчених білкових субодиниць декількох теломерази.
Широке поширення теломерази серед еукаріот говорить про те, що механізм синтезу тіломірна ДНК, який ми спостерігаємо у сучасних організмів, виник дуже давно. Більш того, еволюційно-генетичний порівняльний аналіз нуклеотидних послідовностей генів каталітичних субодиниць теломерази та інших зворотних транскриптаз показує, що цей механізм міг існувати ще до появи перших еукаріотичних клітин.
З-ланцюг тіломірна ДНК синтезується за допомогою звичайної ДНК-полімерази (див. рис. 2). Тому 3'-кінцевий ділянку G-ланцюга, на якому, мабуть, спочатку була РНК-запал, в кінцевому підсумку залишається в однотяжевом стані (тобто в принципі він готовий до того, щоб теломераза наростила на ньому новий повтор).
Активність теломерази у вищих еукаріот виявлена лише в трьох типах клітин:
- Генеративних,
- Ракових
- Лініях імморталізованних клітинних культур.
статевих і стовбурових клітинах. В інших типах клітин синтез цього ферменту припиняється ще в ембріональний період розвитку
В організмі при диференціювання клітин теломераза репресуються. Експресію теломерази вважають фактором імморталізаціі клітин.
У соматичних клітинах, культивованих in vitro, теломераза не працює і теломери поступово скорочуються. Довжина теломер достовірно корелює з проліферативним потенціалом (наприклад, у фібробластах людини). Скорочення теломер може грати роль мітотичних годин, які відлічують кількість поділів клітини. Після досягнення критичної довжини тіломірна ДНК запускаються процеси зупинки клітинного циклу [5]. Блок клітинних поділів настає ще до того, як теломера зникла зовсім. Існує деяка мінімальна довжина теломери, коли поділ ще дозволено. Іншими словами, припинення поділу наступає до того, як почав руйнуватися смислової текст геному. Таким способом еукаріоти страхують себе від появи монстрів внаслідок недореплікаціі ДНК.
Опублікована в 1998 році в журналі "Science" стаття американських дослідників завдяки засобам масової інформації привернула увагу не лише науковців (а в першу чергу не на науковців) у зв'язку з проблемами старіння і "клітинного безсмертя". У цій прекрасній роботі колективу, очолюваного Джеррі Шеем, вдалося на 40% збільшити число поділів нормальних соматичних клітин людини в культурі. За допомогою генно-інженерних методів у клітини був введений ген каталітичної білкової субодиниці теломерази і прилеглий до нього ділянку ДНК, що регулює його роботу. При активній роботі гена збільшувався як розмір тіломірна ДНК, так і тривалість життя клітинних культур. Понад звичайних 50 поділів клітини пройшли додатково 20 поділок.
Скорочення теломер можна розглядати як молекулярний індикатор кількості поділів, але не старіння клітини. Так, на культурі нормальних фібробластів людини, взятих від донорів у віці від 0 до 93 років, виявили кореляцію між початковою довжиною теломер і проліферативної здатністю клітини у всьому діапазоні віків. А розмір тіломірна ДНК сперматозоїдів не зменшувався відповідно до віку чоловіки, що говорить про експресії теломерази у лінії статевих клітин. Припинення роботи теломерази, що відзначається в переважній більшості диференційованих соматичних клітин тварин, є свідченням їх зрілості, а отже, і неминуче наступних потім процесів в'янення та загибелі.
Старіння особини - це нормальна біологічна функція, яка сприяє прогресивної еволюції виду, розмножується статевим шляхом. Тиск природного відбору слабшає після досягнення тваринам репродуктивного успіху, оскільки існування особини після цього має менше значення для вигляду. Смерть від старості видаляє з популяції виконали свою роль предків і дає простір нащадкам - носіям нових корисних ознак. Як будь-яка важлива біологічна функція, старіння обумовлене паралельним дією декількох молекулярних механізмів [6]. Вимкнення теломерази - лише один з них.
Не варто розглядати гени, що кодують білкові субодиниці теломерази і входить до її складу РНК, як "гени безсмертя". Підтримання довжини тіломірна ДНК на певному рівні залежить не тільки від взаємодії з нею теломерази і теломерсвязивающіх білків, але і деяких, поки невідомих факторів, що регулюють освіту самих компонентів теломеробразующего комплексу.
Навряд чи безсмертя, досягнуте раковими клітинами, що розмножуються в культурі десятиліттями без укорочення теломер, - це те, до чого потрібно прагнути. Ліки від смерті немає. Але той факт, що введення в такі клітини препаратів, що зв'язують РНК-компонент теломерази, призводить до вкорочення теломер з подальшою загибеллю клітин, вселяє надію на появу нових засобів боротьби з раком.
Розуміння механізму роботи теломерази, а головне, регуляції експресії її в клітці наблизить нас до розуміння процесів і злоякісної трансформації і старіння.
Теломераза, РАК І СТАРІННЯ
Питання про те, якою мірою теломерні механізм бере участь в старінні багатоклітинних організмів. Цілком можливо, що вони винайшли зовсім інші програми старечого феноптоза. Але немає сумніву, що у людей - рекордсменів за довгожительством зменшення довжини теломер вже наближається до тієї фатальної межі, за якою наступає заборона на розмноження клітин. Так, за даними групи К. Сасаджіми з Японії, теломери в клітинах печінки старих старше 80 років виявляються майже вдвічі коротше, ніж у дітей до 8 років. Мабуть, продовжити життя тим, кому за 100, можна лише за умови, що вдасться наростити їх теломери, включивши на якийсь час теломеразу в печінці та інших тканинах, де цей фермент виключився ще під час ембріонального розвитку.
Розглянемо дані про довжину тіломірна ДНК і активності теломерази у різних клітинах людини, наведені в табл. 2.
Висока теломеразной активність спостерігається в статевих клітинах людини протягом всього його життя. Відповідно їх теломери складаються з найбільшого числа ДНК-повторів та містять усі необхідні білки для нормальної проліферації клітин. Аналогічна ситуація спостерігається і для стовбурових клітин. Нагадаємо, що стовбурові клітини діляться необмежено довго. Однак у стовбурної клітини завжди є можливість дати дві дочірні клітини, одна з яких залишиться стовбурової ("безсмертну"), а інша вступить у процес диференціювання. Завдяки цьому стовбурові клітини служать постійним джерелом різноманітних клітин організму. Наприклад, стовбурові клітини кісткового мозку дають початок гемопоезу - процесу утворення клітин крові, а з базальних клітин епідермісу відбуваються різноманітні клітини шкірного покриву. Як тільки нащадки статевих або стовбурових клітин починають диференціюватися, активність теломерази падає і їх теломери починають зменшуватися. У клітинах, диференціювання яких завершена, активність теломерази падає до нуля, і, як ми вже відзначали, з кожним клітинним поділом вони з неминучістю наближаються до стану сенесенса (перестають ділитися). Слідом за цим настає криза, і більшість клітин гинуть (рис. 5). Ця картина характерна для переважної більшості відомих культур клітин еукаріот. Однак і тут є рідкісні, але важливі винятки: теломеразной активність виявляється в таких "смертних" клітинах, як макрофаги і лейкоцити.
Нещодавно було встановлено, що нормальні соматичні клітини тому позбавлені теломеразной активності, що в них повністю пригнічена експресія гена її каталітичної субодиниці (зворотної транскриптази). Інші ж складові теломерази, включаючи теломеразной РНК, утворюються в цих клітинах, хоча і в менших кількостях, ніж у їх "безсмертних" прабатьків, але постійно (або, як кажуть, конститутивно). Відкриття цього важливого факту Дж. Шеем, В. Райтом і їхніми співробітниками і стало основою для тієї сенсаційної роботи щодо подолання "ліміту Гейфліка". Дійсно, все інше було вже справою техніки (хоча й дуже непростий).
У нормальні соматичні клітини були внесені гени теломеразной зворотної транскриптази за допомогою спеціальних векторів, сконструйованих з вірусних ДНК. Рівень експресії гена в еукаріотичної клітці залежить від багатьох факторів, в тому числі від білків - чинників транскрипції, зв'язуються зі спеціалізованими ділянками ДНК, розташованими в хромосомі по сусідству з цим геном. Геноми вірусів, яким потрібно швидко розмножитися в клітці-хазяїні, несуть в собі ділянки ДНК, здатні в багато разів підсилити експресію того чи іншого гена. Дослідники подбали про те, щоб в їх конструкціях ген теломеразной зворотної транскриптази людини опинився в оточенні саме таких ділянок вірусної ДНК. Результати їхніх експериментів можна підсумувати коротко: клітини, в яких теломераза підтримувала довжину теломер на рівні, характерному для молодих клітин, продовжували ділитися і тоді, коли контрольні клітини (без теломерази) старіли і вмирали.
У цій та аналогічної їй роботах особливо ретельно контролюється відсутність в культурі клітин ракових клітин. Відомо, що клітини більшості досліджених на сьогодні ракових пухлин характеризуються досить високою активністю теломерази, яка підтримує довжину теломер на постійному рівні (див. табл. 2). Цей рівень помітно нижче, ніж, наприклад, у ембріональних клітин, але він достатній, щоб забезпечити безмежне ділення ракових клітин в культурі. Існує гіпотеза, у якої чимало прихильників, що припускає, що втрата теломеразной активності соматичними клітинами сучасних організмів є набутих в процесі еволюції властивість, що захищає їх від злоякісного переродження.
Порівняно невелика довжина теломер у більшості ракових клітин наводить на думку про те, що вони походять з нормальних клітин, досягли передкризового стану. Як ми вже відзначали, цей стан характеризується порушенням регуляції багатьох біохімічних реакцій. У таких клітинах відбуваються численні хромосомні перебудови, які в тому числі ведуть і до злоякісної трансформації (більш докладно про походження злоякісних пухлин можна знайти у статті Г. І. Абелева "Що таке пухлина": Соросівський Освітній Журнал. 1997. № 10). Більшість цих клітин гинуть, але в частини з них в результаті випадкових мутацій може активуватися постійна експресія генів теломерази, яка буде підтримувати довжину теломер на рівні, необхідному і достатньому для їх функціонування (див. рис. 5).
Деякий час викликав подив той факт, що приблизно п'ята частина проаналізованих ракових пухлин і клітин взагалі не містила активної теломерази. Виявилося, однак, що довжина теломер у них підтримується на належному рівні. Таким чином, в цих клітинах діє інший (не теломеразной, а скоріше рекомбінаційний) механізм утворення тіломірна ДНК (див. статтю В. М. Глазера "гомологичная генетична рекомбінація": Соросівський Освітній Журнал. 1998. № 7). Іншими словами, такі клітини знаходяться в тому ж ряду винятків із правила, що і дрозофіла.
ЗАМІСТЬ ВИСНОВКУ
Які ж практичні висновки випливають з того, що на сьогоднішній день вдалося дізнатися про зв'язок між активністю теломерази, раковим зростанням і старінням клітин. Здавалося б, вони лежать на поверхні: не хочеш старіти - активуй теломеразу; хочеш убити ракову пухлину - убий в ній спочатку теломеразу.
Легковажність першого висновку (а саме його підхопили засоби масової інформації) очевидна: між культурою клітин і клітинної тканиною, а тим більше організмом дистанція величезного розміру. Ще не настав час серйозно обговорювати проблему отримання трансгенних органів людини для пересадки їх хворим людям (хоча теоретично це, звичайно, можливо). А головне, процес старіння не тільки організму, але і клітини - це виключно складний комплекс змін в безлічі біохімічних реакцій, і його навряд чи можна повернути назад, впливаючи тільки на якусь одну з них. У той же час існують цілком реальні плани активувати теломеразу в клітинах шкіри, яку пересаджують пацієнтам із сильними опіками, і тим самим активувати їх зростання. Або спробувати тим же шляхом "омолодити" клітини сітківки ока, взявши їх у пацієнта, який страждає помутнінням сітківки (а це широко поширене захворювання у літніх людей, що призводить до сліпоти), і потім повернути назад.
Що ж стосується розробки методів виборчого придушення теломеразной активності в ракових пухлинах, то зараз це важливий напрямок в пошуку нових засобів боротьби із злоякісними захворюваннями. Поки більшість робіт пов'язано з випробуванням інгібіторів зворотних транскриптаз (каталітичних субодиниць теломерази). Досвід боротьби зі СНІДом, де намагаються вирішити аналогічну задачу, говорить про те, що певні надії знайти такі ліки є. Головна трудність полягає в тому, що каталітична субодиниця теломерази - це одна з ДНК-полімераз і шуканий інгібітор повинен бути спрямований саме на теломеразной ДНК-синтезуючу активність. В іншому випадку він буде токсичний для нормальних клітин.
Більш перспективними здаються недавно з'явилися роботи, в яких описано виборче придушення теломеразной РНК, що викликає загибель ракових клітин у культурі. У нормальних клітинах, як це ми зазначали вище, теломеразной РНК синтезується, але ці клітини позбавлені теломеразной активності і, швидше за все, теломеразной РНК їм не потрібна.
Вивчення тонкої структури теломер і механізму дії теломерази знаходиться ще тільки на початковій стадії. Однак вони привертають до себе величезний інтерес дослідників, що працюють в самих різних галузях біології та медицини, і тут вже найближчим часом можна чекати нових цікавих відкриттів.