Проведення гематологічного обстеження риб

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

МІНІСТЕРСТВО
СІЛЬСЬКОГО ГОСПОДАРСТВА
І ПРОДОВОЛЬСТВА Департаменту ветеринарії
(Мінсільгосппрод Росії)
Заступник керівника
РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ Селіверстов В.В.
Департаменті ветеринарії

02.02.99 р. № 13-4-2-/1487
МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
з проведення гематологічного обстеження риб
1. Загальні положення
Необхідною умовою успішного ведення інтенсивного рибництва та відтворення цінних видів риб є ретельний контроль за фізіологічним станом об'єктів вирощування. Кров, як найбільш лабільна тканину, швидко реагує на дію різних факторів і призводить до відновлення рівноваги між організмом і середовищем. Тому для ранньої діагностики захворювання, в тому числі і незаразних, поряд з паразитологічні, мікробіологічними і вірусологічними дослідженнями важливе значення має аналіз крові.
У рибництві при гематологічному дослідженні прийнято визначати такі показники крові:
- Кількість гемоглобіну,
- Величину гематокритного числа,
- Вміст загального білка в сироватці крові,
- Кількість еритроцитів,
- Вміст гемоглобіну в одному еритроциті,
- Середній об'єм еритроцитів,
- Швидкість осідання еритроцитів,
- Число лейкоцитів,
- Лейкоцитарну формулу,
- Кількість метгемоглобіну.
У додатку наведена таблиця, яка містить показники крові здорових риб, і малюнки формених елементів крові.
2. Взяття крові
2.1. Обладнання і реактиви:
- Шприц з ін'єкційними голками - стерильні,
- Пастерівські піпетки - стерильні,
- Годинне скло,
-5% Розчин натрію цитрату або 0,2% розчин гепарину (1.000 ОД / мл),
- Анестстікі,
- Спирт,
- Мардо, вата.
2.2. Матеріал для дослідження, хід роботи Кров беруть у голодної риби, витриманої в добре аерірованной воді протягом 5-10 хвилин після вилову. Якщо це неможливо, то спійману рибу слід відразу поміщати у відро з водою з водоймища у співвідношенні 1:10, містить релаксуючу концентрацію одного з ансстетіков: пропаксат (0,6 - 0,8 мг / л), хіналдін (25 - 30 мг / л), сірчаний ефір (1-1,5%) та ін Вода, в якій знаходиться анестезированного риба, повинна постійно аерувати.
У залежності від розміру об'єкта і необхідної кількості крові кров беруть кількома способами: з серця, зябрової вени, хвостовій артерії, відсіканням хвоста.
Місце пункції після зняття луски обробляють 70 ° спиртом і висушують ватньм тампоном для видалення слизу. Для взяття крові частіше використовують шприц з ін'єкційною голкою або пастерівською піпетку. Інструменти попередньо обробляють водним розчином антикоагулянтів: цитрату натрію або гепарину. Місце взяття крові не можна стискати, щоб уникнути попадання тканинної рідини, що спотворює результати. Повторно брати кров з одного і того ж місця не рекомендується. Аналізована кров повинна бути свіжою, рідкою. Щоб уникнути руйнування еритроцитів (гемолізу) кров беруть у підготовлені пробірки (або годинникове скло), зливаючи обережно по стінці.
3. Приготування та фарбування мазків крові
За забарвленим мазкам крові ведуть оцінку активності еритропоезу та облік лейкоцитів.
3.1. Обладнання і реактиви:
- Знежирені предметні скельця,
- Шліфоване скло для виготовлення мазка,
- Фарба Травень-Грюнвальда,
- Робочий розчин фарби АЗУР-еозину (за Романовським),
- Дистильована вода з рН 6,8 - 7,1, нейтралізована фосфатними буферами.
3.2. Підготовка до дослідження
3.2.1. Підготовка предметних стекол.
- Один кінець скла розміром в 1-1,5 см шліфують на наждаку для написи простим олівцем,
- Скла кип'ятять в 1%-ном розчині двовуглекислої соди - 10 хв,
- Охолоджують і промивають водопровідною, а потім дистильованою водою - 5 хв.,
- Скла поміщають в злегка підкисляє соляною кислотою розчин дистильованої води на 2-3 хв, потім двічі промивають дистильованою водою, висушують на повітрі або в сушильній шафі і зберігають в суміші спирту з ефіром 1:1. Перед вживанням їх виймають, витирають насухо чистою серветкою або фільтрувальним папером. Вони готові до використання.
3.2.2. Приготування робочого розчину фарби азур - еозину:
- 5,5 мл концентрованої фарби азур - еозину поміщають в 250 мл нейтральної дистильованої води і ретельно перемішують.
3.3. Хід роботи.
Кров після взяття (див. п. 2.) Наносять у вигляді невеликої краплі на заздалегідь приготоване знежирене предметне скло, на відстані 1,5-2 см від його шліфованого краю. Великим і вказівним пальцями правої руки беруть шліфоване скло за бічні ребра, ставлять на предметне скло під кутом 45 ° і посувають тильною стороною до краплі, яка від зіткнення розтікається. Ковзаючим рухом просувають шліфоване скло вперед. Кров повинна рівномірно розподілятися по предметному склу у вигляді мазка. Від кожної риби готують не менше двох мазків. Після приготування мазка його висушують на повітрі протягом 10-15 хвилин.
Підсохлі мазки без фіксації забарвлюють по Паппснгсйму (Романовським - Гімза). Перший етап - фарбування і фіксація одночасно розчином Травень-Грюнвальда протягом 5 хвилин, потім промивають нейтральній дистильованою водою. Другий етап - докрашіваніе в робочому розчині Романовського 30-40 хвилин. Якість фарбування клітин контролюють під малим збільшенням мікроскопа. Пофарбований мазки промивають водопровідною водою і висушують на повітрі.
4. Визначення вмісту гемоглобіну
Гемоглобін - це дихальний пігмент, який міститься в еритроцитах. Його кількість в організмі виражається в м / л і має важливе діагностичне значення. Визначати зміст гемоглобіну можна двома способами: за Салі і ціанметгемоглобіновим методом. Найбільш поширеним і простим є метод визначення гемоглобіну за Салі. Однак він дає ряд об'єктивних (поступове посилення забарвлення) і суб'єктивних (візуальне порівняння кольору) помилок. Ціанметге-моглобіновьга метод є найбільш точним.
4.1. Метод визначення гемоглобіну за Салі.
4.1.1. Підготовка до дослідження
Приготування 0,1 н. розчину соляної кислоти:
- На 1 л дистильованої води додають хімічно чистої 8,2 см 3 соляної кислоти з питомою вагою 1,19, або 0,1 н. фіксанал соляної кислоти.
4.1.2. Обладнання і реактиви
- Гемометра Салі,
- Капілярна піпетка від гемометра Салі,
- Очна піпетка,
- Скляна паличка,
- Годинне скло,
- 0,1 н. розчин соляної кислоти,
- Дистильована вода.
4.1.3. Хід визначення і облік результатів У градуйовану піпетку гемометра Салі до мітки "2" очної піпеткою наливають децінормальньгй розчин соляної кислоти. У капілярну піпетку від гемометра Салі набирають кров до мітки 20 мкл і видувають її в розчин соляної кислоти. Отриману суміш перемішують скляною паличкою і залишають на 10 хвилин. Після закінчення цього часу в пробірку по краплях доливають дистильовану воду і, перемішуючи скляною паличкою, підбирають колір робочого розчину до збігу з кольором рідини в стандартних пробірках. Кількість ге-моглобіна відраховують по нижньому меніску робочого розчину на градуйованою пробірці (показники в г% висловлюють в г / л), 1 г% дорівнює 10 г / л.
4.2. Ціанметгемоглобіновий фотометричний метод
4.2.1. Підготовка до дослідження.
Приготування розчину Драбкіна, на 1 л реактиву беруть:
Бікарбонат натрію - 1 г, червона кров'яна сіль
- 0,2 г, ціаністий калій або натрій - 0,05 г, дистильована вода
-Інший обсяг.
4.2.2. Обладнання і реактиви:
- Фотоелектроколориметр (ФЕК) або спектротометр із зеленим світлофільтром і кюветами товщиною 1 см;
- Хімічні пробірки з пробками;
- Капілярна піпетка від гсмометра Салі об'ємом 20 мкл;
- Градуйована піпетка на 5 мл;
- Розчин Драбкіна.
4 2.3. Хід визначення та врахування результатів.
Мірної піпеткою у пробірку наливають 5 мл трансформуючого розчину Драбкіна. Піпеткою від гемометра Салі додають 20 мкл крові. Вміст пробірки добре перемішують і залишають у холодильнику на 20 хвилин. По закінченню цього часу робочий і трансформуючий розчини наливають у кювети і, використовуючи зелений світлофільтр, проводять вимірювання на ФЕКе. Розрахунок концентрації гемоглобіну (г / л) на основі даного визначення проводять за формулою:
x = d540 x 367,1 г / л,
де: d 540 - свідчення ФЕК; 367,1 - коефіцієнт перерахунку, що враховує розведення крові, міллімолярний вага гемоглобіну та інші показники.
5. Визначення гематокритного величини
Гематокритное число - це відношення обсягу еритроцитів до загального об'єму крові, виражене в л / л (1 л / л дорівнює 100%).
5.1. Підготовка до дослідження.
Приготування розчинів антикоагулянту:
- Розчин Геллера і Пауля:
- На 100 мл води: щавлевокислий амоній -], 2 г, щавлевокислий калій - 0,8 г;
- 5% розчин трсхзамсщенного лимоннокислого натрію.
5.2. Обладнання і реактиви:
- Мікрокапіляри,
- Центрифуга, при масовому відборі проб зручніше використовувати спе ціальні центрифугу МГЦ - 8,
- Розчини антикоагулянтів: розчин гепарину 1000 ОД / мл або 7,7 мг / мл, або розчин Геллера і Пауля, або 5% розчин лимоннокислого натрію.
5.3. Хід визначення та врахування результатів.
Мікрокапіляри попередньо обробляють одним з розчинів антикоагулянту. Можна кілька разів сполоснути їх розчином гепарину і висушити при кімнатній температурі або ж у капіляри насмоктують на 1 / 10 частина розчину Геллера і Пауля і висушують у сушильній шафі при 60 ° С. У підготовлені таким чином капіляри набирають кров. Кінець капіляра закупорюють за допомогою замазки і ставлять центрифугувати до отримання постійного обсягу еритроцитів. Час цснтрі4) угірованія залежить від швидкості обертання центрифуги. Досягають ефекту повного осадження еритроцитів. Відлік об'єму еритроцитів і плазми роблять за допомогою міліметрової лінійки. Процентне відношення стовпа еритроцитів до висоті всього стовпа крові є гематокритного величиною, яке переводять у розмірність л / л.
6. Визначення білка в сироватці крові
Вміст білка в сироватці крові риб служить експрес - тестом для визначення рівня фізіологічного стану риб при вирощуванні в сучасних риб у господарстві. Концентрацію білка виражають у г% або в г / л; 1 г / л дорівнює 10 г%.
6.1. Обладнання і реактиви:
- Уленгуткі або невеликі пробірки,
- Штатив,
- Центрифуга,
- Рефрактометр,
- Пастерівські піпетки,
- Спирт.
6.2. Хід визначення і облік результатів
2-3 мл крові, отриманої одним з методів (див. п.2.), Поміщають у підготовлені уленгуткі або невеликі пробірки. Після цього кров центрифугують 5 хвилин при 3000 об. / хв. У разі відсутності центрифуги проводять відстоювання крові в холодильнику 30 - 45 хвилин. Отримана після центрифугування або відстоювання сироватка відсмоктується чистої пастерівською піпеткою і кілька се крапель поміщають на пластинку рефрактометра. Реєструють показник заломлення за його шкалою. По таблиці 1, наведеної нижче, визначають содержаніебелка в сироватці крові. Після кожного дослідження обидві поверхні призм протирають марлевим тампоном, змоченим у спирті.
7. Визначення числа еритроцитів пробіркових методом у камері Горяєва
Число еритроцитів (у млн. в 1 мкл) - важливий показник фізіологічного стану риб, який характеризує наявність анемії.
7.1. Підготовка до дослідження.
Приготування розчину Хендрікса:
- Сульфат натрію - 20 г, хлористий натрій - 5 г, цитрат натрію тризаміщені - 3 г, крижана оцтова кислота - 100 мл, вода дистильована до 1 ()()() мл.
7.2. Обладнання і реактиви;
- Хімічні пробірки з пробками,
- Градуйована піпетка на 5 мл,
- Капілярна піпетка від гемометра Салі,
- Пастерівська піпетка,
- Камера Горяєва,
- Мікроскоп,
- Розчин Хендрікса.
7.3. Хід визначення і облік результатів
Градуйованою піпеткою в хімічну пробірку наливають 4 мл розчину Хендрікса. У капілярну піпетку від гемометра Салі набирають кров до мітки 20 мкл і видувають у пробірку, обережно промиваючи капіляр кілька разів. Покривне скло притирают до камери Горяєва до появи ньютонівських кілець. Вміст пробірки ретельно перемішують і пастерівською піпеткою заповнюють камеру Горяєва. Через 1-2 хвилини починають підрахунок числа еритроцитів під мікроскопом в 5 великих або 80 малих квадратах, розташованих по діагоналі. Для визначення кількості еритроцитів в 1 мкл досить помножити отримане при підрахунку кількість еритроцитів на 10000.
Таблиця 1
Концентрація білка (в г%) при різному показнику заломлення *
Концентрація білка (в г%)
Показу-
тель заломлення
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1,337
0,60
0,66
0,72
0,77
0,83
0,89
0,95
1,01
1,07
1.12
1,338
1,18
1,24
1,30
1,36
1,41
1,47
1,53
1,59
1,65
1,70
1,339
1,76
1,82
1,88
1,94
2,00
2,05
2,11
2,17
2,23
2,29
1,340
2,34
2,40
2,46
2,52
2,58
2,63
2,69
2,75
2,81
2,87
1,341
2,93
2,98
3,04
3,10
3,16
3,22
3,27
3,33
3,39
3.46
1,342
3,51
3,57
3,62
3,68
3,74
3,80
3,86
3,91
3,97
4,03
1,343
4,09
4,15
4,20
4,26
4,32
4,38
4,44
4,50
4,55
4,61
1,344
4,67
4,73
4,79
4,84
4,90
4,96
5,02
5,08
5,13
5,19
1,345
5,25
5,31
5,37
5,43
5,48
5,54
5,60
5,66
5,72
5,77
1,346
5,83
5,89
5,95
6,01
6,07
6,12
6,18
6,24
6,30
6,36
1,347
6,41
6,47
6,53
6,59
6,65
6,70
6,76
6,82
6,88
6,94
1,348
7,00
7,05
7,1)
7,17
7,23
7,29
7,34
7,40
7,46
7,52
1.349
7.58
7,63
7,69
7,75
7,81
7,87
7.93
7,98
8,04
8,10
1,350
8,16
8,22
8,27
8,33
8,39
8,46
8,51
8,57
8,62
8,68
1,351
8.74
8,80
8,86
8,91
8.97
9,03
9,09
9,15
9,20
9,26
1,352
9,32
9,38
9,44
9,50
9,55
9,61
9,67
9,73
9,79
9,84
1,353
9,90
9,96
10,02
10,08
10,13
10,19
10,25
10,31
10,37
10,4
* За наявності гемолізу необхідно з результатів визначення загального вмісту білка відняти експеріменталию встановлену поправку на ступінь гемолізу: при "l" - 0,6 -0,7; при "+ +" 1,2 - 1,4; сільногемоліеірованная сироватка для визначення загального вмісту білка використана бути не може.

8. Визначення середнього вмісту гемоглобіну в одному еритроциті (СГЕ)
Показник середнього вмісту гемоглобіну в одному еритроциті дуже важливий для виявлення гіпо-та гіперхромачіі. СГЕ в одному еритроциті прийнято виражати в пікограмів (синонім - мікромікрограмм), 1 пг-КГ 1912
8.1. Хід визначення та врахування результатів.
СГЕ в одному еритроциті визначають діленням концентрації гемоглобіну в 1 мкл крові, вираженої в грам-відсотках, на кількість еритроцитів у цьому ж обсязі. Для спрощення розрахунків можна розділити вміст гемоглобіну, виражене в г / л, на кількість еритроцитів у мільйонах.
9. Визначення середнього об'єму еритроцитів
Для з'ясування наявності мікро-і макроцитозом поряд з безпосереднім вимірюванням розмірів еритроцитів на мазках зручніше обчислювати середній обсяг еритроцитів побічно, який виражають у кубічних мікрометрах (мкм 3).
9.1. Хід визначення та врахування результатів.
Для визначення середнього об'єму еритроцитів свідчення гематокритного числа ділять на кількість еритроцитів в 1 мкл крові.
Практично середній обсяг еритроцитів визначають за формулою:
А х 1000 / Б,
де: А - гематокритное число, л / л; Б - кількість еритроцитів, млн / мкл.
10. Визначення швидкості осідання еритроцитів
У залежності від фізичних і хімічних властивостей крові еритроцити осідають у мікрокапіляри з різною швидкістю. Швидкість осідання еритроцитів визначається в апаратах Панченкова і виражається в міліметрах за 1 год (мм / год).
10.1. Обладнання і реактиви:
- Годинне скло, - апарат Панченкова, що складається з штатива і спеціальних капілярних піпеток, на яких нанесена міліметрова шкала довжиною К) см; верхнє поділ шкали зазначено літерами О і К (кров), проти поділки 50 є буква Р (реактив),
- Профільтрований 5 -% розчин тризаміщені лимоннокислого натрію.
10.2. Хід визначення та врахування результатів.
Промивають капілярну піпетку розчином лимоннокислого натрію, потім набирають цей розчин до мітки Р і виливають його в годинне скло. Тим же капіляром набирають кров 2 рази до мітки К і спускають в годинне скло. Добре перемішують і, набравши суміш у капіляр до мітки К, ставлять в штатив на! ч. Після закінчення цього часу визначають швидкість осідання еритроцитів. Величину стовпчика плазми, що звільнився від еритроцитів, враховують по розподілам на капілярної піпетці.
При роботі з молоддю риб допускається набирати менший об'єм крові (1 / 2 або 1 / 4 К), при цьому співвідношення лимоннокислого натрію і крові необхідно строго зберігати на рівні 1:2.
11. Оцінений еритроцитарної картини крові риб
За співвідношенням молодих і зрілих форм еритроцитів оцінюють активність еритропоезу. Співвідношення еритроцитів виражають у відсотках (%).
11.1. Обладнання:
- Мікроскоп,
- Забарвлені мачка крові (див. п. 3.),
- Іммерсійне масло.
11.2. Хід визначення та врахування результатів. Під мікроскопом на мазку крові переглядають нс менше 1000 еритроцитів при збільшенні х 630 (під іммерсіей). Клітини ідентифікують, використовуючи "Атлас клітин крові риб" (Іванова, 1983) і виводять відсоток різних стадій дозрівання еритроцитів за формулою:
Х = • (А х 100) / 1000 = А х-0, 1%,
де: А - число незрілих еритроцитів, що зустрічаються при підрахунку 1000 еритроцитів;
Х - шуканий відсоток незрілих еритроцитів.
12. Визначення загального числа лейкоцитів
Лейкоцити, як клітини білої крові риб, виконують різноманітні фізіологічні та імунологічні функції. Вони беруть участь в регенерації пошкоджених тканин, руйнуванні чужорідних тіл, синтезі білка і антитіл, інкапсуляції паразитів і т.д. Існує непрямий (непрямий) і прямий спосіб обліку лейкоцитів у периферичній крові риб. Число лейкоцитів висловлюють в 1 мкл крові (тис. шт. / Мкл).
12.1. Непрямий метод
12.1.1.Оборудованіе:
- Мікроскоп,
- Забарвлені мазки крові (див. п. 3),
- Іммерсійне масло.
12.1.2. Хід визначення та врахування результатів. Визначають кількість лейкоцитів, що зустрічаються при підрахунку 1000 еритроцитів у мазку крові, і потім перераховують їх кількість на 1 мкл за формулою:
Х = (А х В) / 1000,
де: Х - загальна кількість лейкоцитів в 1 мкл крові;
А - кількість еритроцитів в 1 мкл крові, визначене в камері Го-ряева:
В - кількість лейкоцитів, визначене при підрахунку 1000 еритроцитів на мачка крові.
12.2. Прямий метод підрахунку кількості лейкоцитів 12.2.1
12.2.1. Підготовка до дослідження.
Приготування розчинів А і В
- 25 мг нейтральрота і 0,6 г натрію хлористого розчиняють в 100 мл дистильованої води (розчин А можна використовувати одну добу);
- 12 мг крісталлвіолет, 3,8 мг натрію цитрату і 0,4 мл формаліну розчиняють в 100 мл дистильованої води (розчин У використовувати близько тижня).
12.2.2. Обладнання і реактиви:
- Мікроскоп,
- Лічильна камера формених елементів крові,
- Змішувач для підрахунку еритроцитів ссавців,
- Пастерівські піпетки - стерильні,
- Годинне скло,
-2 -% Розчин натрію цитрату,
- Розчини А і В.
12.2.3. Хід визначення та врахування результатів.
Взяття крові проводять відповідно до п.2 цих Методичних вказівок. Кров з часового скла набирають в змішувач для підрахунку еритроцитів ссавців до позначки 0,5 або 1. Кінчик змішувача витирають ватою, набирають в змішувач розчин А до половини розширення змішувача, потім до мітки 101 заповнюють розчином Б.
Якщо кров набирають до позначки 0,5, то виходить розведення в 200 разів, якщо до мітки 1 - у 100 разів.
Після наповнення зі змішувача знімають гумову трубку, затискають його між великим і середнім пальцем і перемішують кров з разбавляющей рідиною. Змішувач залишають у горизонтальному положенні на 5-10 хвилин, потім знову перемішують. Перші 2-3 краплі, що виходять із змішувача, струшують і тільки наступної краплею заряджають лічильну камеру. Покривне скло повинне бути заздалегідь притертою до лічильної камері до появи кілець Ньютона. Під дією розчинів А і В відбувається вітальна забарвлення формених елементів крові. Ядра лейкоцитів фарбуються в темний фіолетово-червоний колір, а протоплазма - в рожевий. В еритроцитах слабо забарвлюються тільки ядра. Завдяки цьому еритроцити і лейкоцити помітні в камері.
Кількість лейкоцитів підраховують в 80 великих квадратах і визначають їх кількість за формулою:
x = mx250xУ / п, дe:
Х - кількість лейкоцитів в 1 мкл,
М-загальна кількість клітин у підрахованих квадратах,
У - ступінь розведення крові,
п - число переглянутих квадратів.
13. Виведення лейкоцитарної формули.
Для характеристики лейкоцитозів і лейкопеній, що виникають у риб при різних захворюваннях, використовують диференціальний підрахунок лейкоцитів, тобто виводять лейкоцитарну формулу. Кількість різних груп лейкоцитів виражають у відсотках (%).
Лейкоцитарний склад, представлений у риб еозинофілами, нейтрофіл-лами, базофілами, що відносяться до гранулоцитів; лімфоцитами і моноцитами, що відносяться до агранулоцитам, а також бластів.
13.1. Обладнання:
- Мікроскоп,
- Забарвлені мазки крові (див. п. 3.),
- Іммерсійне масло.
13.2. Хід визначення та врахування результатів.
Для визначення лейкоцитарної формули проводять підрахунок 200 клітин білої крові в мазку під збільшенням мікроскопа об.90 х ок.7 (з іммерсіей). Підрахунок лейкоцитів краще проводити в центральних і декілька віддалених від бічного краю ділянках початковій третини частини мазка. Всі зустрічаються клітини білої крові записують у спеціальну таблицю відповідно до класифікації клітинних форм (Іванова, 1983) і розраховують процентне співвідношення клітин білої крові, тобто груп лейкоцитів у відсотках. Для цього використовують формулу:
Х = (А х 100) / 200, де:
Х - відсоток визначається групи клітин в лейкоцитарній формулі; А - кількість цих клітин, знайдене при підрахунку 200 лейкоцитів (за показаннями лічильника).
Лейкоцитарна формула вказує тільки на відносне співвідношення лейкоцитів. Для визначення їх абсолютного значення використовують формулу перерахунку, тобто з'ясовують кількість кожного виду клітин в 1 мкл крові (шт. / мкл).
Формула перерахунку:
Х = (А х В) / 100, де:
А - відсоток визначається групи лейкоцитів у лейкоцитарній формулі,%;
В - загальна кількість лейкоцитів в 1 мкл, тис. шт. / мкл;
100 - загальний відсоток всіх лейкоцитів у лейкоцитарній формулі. %.
14. Визначення метгемоглобіну
При накопиченні метгемоглобіну в крові вище певного рівня виникає патологічний стан, зване метгемоглобінемія. Внаслідок метгемоглобінемії знижується киснева ємність крові і розвивається гіпоксія, що супроводжується гальмуванням обмінних процесів і накопиченням недоокислених продуктів у тканинах.
Метод заснований на порівняльному вимірі оптичної щільності розчинів досліджуваної крові з вихідною концентрацією оксігемоглобі-ну (гемоглобіну) і паралельної проби крові, в якій весь оксиген-моглобін окислен до метгемоглобіну феррицианида калію, з використанням фотоелектроколориметри при червоному світлофільтрі.
14.1. Підготовка до дослідження 0,25% - ий розчин аміаку готують, додаючи до 1 мл аміаку 99 мл дистильованої води.
Насичений розчин фсрріціаніда калію готують, розчиняючи 70 г цієї солі в 100 мл дистильованої води, розчин зберігають не більше тижня. Розчин гепарину готують шляхом додавання до 5 мл гепарину 20 мл дистильованої води.
14.2. Обладнання і реактиви
Аміак водний (nh4ОН), ГОСТ 3760-64.
Калій залізосиньородистим (ферріціаннд калію, сіль кров'яна червона) ГОСТ 4206-65. Гепарин (25000 од.).
Хімічні пробірки.
Піпетки на 1, 10 мл.
Фотоелектроколориметр (ФЕК) з червоним світлофільтром.
14.3. Хід визначення і облік результатів
Для а налита у досліджуваних риб відбирають у пробірку 1 мл крові з серця або хвостової артерії. Кров стабілізують, додаючи в пробірку 2-3 краплі розчину гепарину. У молоді риб можливо групове взяття крові (від 2 риб і більше).
При необхідності перевезення або зберігання проб крові, закриті пробками пробірки з кров'ю поміщають у термос з льодом або в морозильну камеру холодильника з температурою - 12 ° С, кров можна зберігати протягом кількох діб.
Перед дослідженням кров розморожують і ретельно перемішують.
У дві хімічні пробірки наливають по 7,3 мл 0,25%-го розчину аміаку і додають по 0,2 мл досліджуваної проби (з однієї проби крові). В одну з пробірок (пробірка № 2) додають 1-2 краплі насиченого розчину феррицианида калію, перемішують вміст пробірок і залишають обидві пробірки на 1 годину. Через 1 годину визначають величину оптичної щільності (екстінцію) обох розчинів крові, в кюветах 10 мм при червоному світлофільтрі, використовуючи для порівняння 0,25%-ний розчин аміаку.
У першій пробірці (пробірка № 1) визначають величину світлопис-поглинання розчину крові, з вихідною концентрацією оксигемоглобіну (гемоглобіну), у другій пробірці (пробірка № 2) - величину світлопис-поглинання розчину крові, в якій весь оксигемоглобін (Нв02) перетворений в метгемоглобін (mthb).
Зміст оксигемоглобіну у вихідній пробі крові відповідає змісту гемоглобіну в ній.
Оскільки в паралельній пробі крові (пробірка № 2) весь гемоглобін повністю переводиться в метгемоглобін додаванням насиченого розчину феррицианида калію, величина светопоглощеііл розчину метгемоглобіну практично постійна і залежить від вихідного рівня гемоглобіну, тобто оксигемоглобіну.
Визначення светопоглощение розчинів крові в обох пробірках проводять на фотоелекгроколоріметре (ФЕКе) при червоному світлофільтрі.
У ФЕКов різних марок довжина хвилі, відповідна максимуму пропускання при червоному світлофільтрі, буває різною. Так, у ФЕКа - 56 при роботі з червоним світлофільтром № 8 довжина хвилі становить 597 нм, у спектрофотометрів ФЕК-56 ПМ і ФЕК КФК-2 довжини хвиль при роботі з червоним світлофільтром лежать в інтервалі 600 -670 нм,
Визначення світлопоглинання розчинів крові проводять з використанням ФЕКов різних марок при червоному світлофільтрі в наведеному вище інтервалі довжини хвиль, використовуючи для порівняння 0,25%-ний розчин аміаку в кюветах з робочою довжиною 10 мм.
Відмінності, пов'язані з вимірюванням екстінцій розчинів крові при розрізняються довжинах хвиль при роботі на ФЕКах різних марок, коригують шляхом введення в розрахункову формулу коефіцієнта - величини наведеної екстінціі розчину крові з вихідним рівнем ок-сігемоглобіна (ЕнвО2), як показано в розділі - розрахунок результатів аналізу . При розрахунку цієї наведеної величини використовують виміряні досвідченим шляхом величини світлопоглинання розчину крові з вихідним рівнем оксигемоглобіну (ЕнвО2)
- Пробірка № 1; метгемоглобіну (emthb) - пробірка № 2.
Попередньо дослідним шляхом на молоді коропових риб встановлена ​​середня величина світлопоглинання розчину крові з вихідним рівнем оксигемоглобіну (ЕнвО2) і середня величина світлопоглинання розчину крові з отриманим рівнем метгемогдобіна (ЕМthв).
Таким чином, знайдено, що середнє значення щільності розчину крові з вихідним рівнем оксигемоглобіну (ЕнвО2) становить 0,15, а метгемоглобіну (emthb) - 0,77.
Оскільки гемоглобін у пробі крові риб повністю переводиться в метгемоглобін додаванням насиченого розчину феррицианида калію, зміна світлопоглинання, рівне 0,62 (0,77-0,15) відповідає 100% вмісту метгемоглобіну.
Всі ці дані були необхідні для виведення коефіцієнтів при розрахунку вмісту метгемоглобіну в крові риб за даною методикою.
За методикою проводять визначення світлопоглинання розчинів досліджуваної крові риб з вихідним рівнем оксигемоглобіну (пробірка № 1) і отриманим рівнем метгемоглобіну (пробірка № 2) і розраховують вміст метгемоглобіну в крові по нижчеприведений формулою, використовуючи встановлений коефіцієнт і розрахункове наведене значення світлопоглинання розчину оксигемоглобіну з урахуванням корекції виміру цієї величини при червоному світлофільтрі з различающимися довжинами хвиль,
Х = (e2-e1) x 1,61 x 100, де:
Х - вміст метгемоглобіну в досліджуваній пробі крові,%; е2 - наведене значення світлопоглинання "розчину оксигемоглобіну (ЕhвО2), розрахунок його наводиться нижче е1 - середнє значення величини світлопоглинання розчину оксигемоглобіну, рівне 0,15; 1,61 - розрахунковий коеффіціенг, знайдений з середніх величин світлопоглинання розчинів оксигемоглобіну і метгемоглобіну, розрахунок його також наводиться далі. Значення Е; - наведене значення світлопоглинання розчину оксигемоглобіну
(Ehbo2) знаходять з пропорції з використанням виміряних величин світлопоглинання розчину оксигемоглобіну (пробірка № 1) і метге-моглобіна (пробірка № 2) у досвіді. e2 e4 e3xe4 - = - звідки Е2 =----, де:
e3 e5 e5
Е2 - шукана величина - наведене значення оптичної щільності розчину оксигемоглобіну - (ЕНвО2); Е3 - середнє (для риб) значення оптичної щільності розчину мет-гемоглобіну, рівне 0,77; Е4 - виміряне значення оптичної щільності розчину оксигемоглобіну (пробірка № 1); e5 - виміряне значення оптичної щільності розчину метгемоглобіну (пробірка № 2). Отримане значення Е2 підставляють у формулу для розрахунку вмісту метгемоглобіну в крові риб.
Якщо наведене значення оптичної щільності розчину оксигемоглобіну (Е2) дорівнюватиме або менше середньої величини оптичної щільності розчину оксигемоглобіну (е1 = 0,15) (що пояснюється індивідуальними коливаннями вмісту гемоглобіну в крові риб), то зміст метгемоглобіну буде дорівнює або менше 1,61% .

Гематологічні показники риб (фізіологічна норма)


Вид роботи
Короп
Вік
Сеголеток (ставки, екстенсивна технологія)
Сеголеток (ставки, екстенсивна технологія)
Сеголеток (садки)
Сеголеток (басейн)
Гемоглобін,
Г / л
3
85,1 ± 2,3
78,1 ± 4,5
89,0 ± 2,4
75,4 ± 4,3
Гематокрит,
л/лх10 '2
4
39,9 ± 1,1
36,2 ± 0,2
35,4 ± 0,3
34,1 ± 1,0
Еритроцити, млн / мкл
5
1,5 ± 0,004
1,35 ± 0,4
1 ^ 09 ± 0,4
1,3 ± 0,2
Ср, обсяг еритроцитів, мкм 3
6
268,7 ± 10,6
342,5 ± 2,8
24,7 ± 2,7
349,6 ± 7,3
Вміст гемоглобіну r еритроцитах. пг
7
56,7 ± 2,7
46,3 ± 1,9
81,6 ± 2,3
58,0 ± 4,0
Лейкоцити,
тис. / мкл
8
24,5 ± 4,3
37,5 ± 5,2
41,0 ± 4,5
39,4 ± 4,3
Тромбоцити, тис. / мкл
9
НД "
28,02 ± 3,0
НД
НД
Бласти,%
10
0,6 ± 0,4
0 "
0,3 ± 0,1
1,1 ± 0,2
Про міелоціти,
%
11
0,1 ± 0,1
0
0,1 ± 0,01
0,6 ± 0,2
Міелоціти Нейт-рофільние,%
12
0,5 ± 0,2
3,2 ± 1,1
0,5 ± 0,1
0,3 ± 0,1
Метами елоцітьт нсйтр.,%
13
0,4 ± 0,2
3,1 ± 1,0
0,7 ± 0,2
0,7 ± 0,2
11алочкоядерние нейтрофіли,%
14
0,4 ± 0,2
5,2 ± 1,4
1,0 ± 0,3
0,8 ± 0,2
Сегментоядерние Нейтрофіли,%
15
0,3 ± 0,1
4,0 ± 0,7
1,0 ± 0,5
1,0 ± О.З
Загальна кількість нейт-рофілов,%
16
1,6 ± 0,2
15,5 ± 1,6
3,2 ± 1,0
2,8 ± 0,7
Еозинофіли і псевдоеодінофіли "%
17
3,7 ± 1,2
4,0 ± 0,09
0
0
Базофіли і псев-добазофшш,%
18
3,6 ± 0,8
3,5 ± 1,4
0
1,0 ± 0.5
11еністие клітини,%
19
0,7 ± 0,3
4,0 ± 0,7
1,9 ± 0,4
1,6 ± 0,4
Моноцити,%
20
4,2 ± 0,5
8,8 ± 1,5
3,0 ± 0,5
2,7 ± 0,7
Лімфоцити,%
21
85,6 ± 1,6
64,2 ± 4,9
91,5 ± 0,9
90,2 ± 1,4
Вміст загального білка в сироватці крові, г%
22
2,5-3,0
2,5-3,0
НД
нд
1
Строкатий товстолоб
Білий товстолоб
2
Сеголеток (установка з замкнутим водообміном)
Сеголеткі (літо)
Сеголеткі (зима)
Однорічні
Двухлетки
Сеголеткі (літо)
3
59,5 ± 3,4
74,9 ± 2,2
96,9 ± 2,8
65,8 ± 3,8
85,8 ± 2,4
80,9 ± 1,4
4
30,6 ± 1,6
37,8 ± 0,7
40,7 ± 2,9
28,6 ± 1,3
40,2 ± 1,7
51,4 ± 1,3
5
1,0 ± 0,04
1,9 ± 0,05
1,8 ± 0,07
1,5 ± 0,2
1,7 ± 0,08
1,9 ± 0,04
6
303,3 ± 0,9
204,4 ± 12,9
247,08 ± 28,5
195,6 ± 8,4
243,1 ± 14,3
266,4 ± 6,2
7
59,6 ± 1,6
40,67 ± 3,4
55,2 ± 3,9
44,98 ± 1,5
51,38 ± 3,2
41,6 ± 0,9
8
52,7 ± 0,2
26,2 ± 4,6
10,6 ± 1,8
34,6 ± 2,7
39,8 ± 3,7
56,8 ± 4,0
9
НД
29,95 ± 3,6
11,5 ± 1,95
21, l ± 2,5
34,3 ± 1,4
63,6 ± 8,1
10
1,2 ± 0,3
0
0,1
0
0
1,2 ± 0,3
11
0,9 ± 0,3
0,6 ± 0,1
0,7 ± 0,2
0,1
0
1,1 ± 0,2
12
0,64 ± 0,1
0,4 ± 0,1
2,5 ± 0,2
1,3 ± 0,3
0
0,9 ± 0,2
13
0,31 ± 0,1
1,3 ± 0,3
22,9 ± 2,7
18,4 ± 2,6
2,9 ± 0,4
0,7 ± 0,2
14
0,72 ± 0,2
0,2 ± 0,1
7,7 ± 1,0
8,8 ± 1,1
0,5 ± 0,1
0,8 ± 0,3
15
0,39 ± 0,1
0
2,7 ± 0,6
2,1 ± 0,5
0
0
16
2,0 ± 0,3
2,5 ± 0,3
35,8 ± 2,7
30,6 ± 2,6
3,5 ± 0,4
2,4 ± 0,3
17
0
9,7 ± 1,1
1,5 ± 0,3
0,1 ± 0,3
6,9 ± 0,6
4,2 ± 0,6
18
1,6 ± 0,4
0,4 ± 0,1
0
0
0
0,1
19
1,2 ± 0,3
0
0
0,1
0,5 ± 0,1
0,2
20
2,5 ± 0,4
0,2 ± 0,1
1,3 ± 0,2
0,4 ± 0,1
0
0,9 ± 0,2
21
90,6 ± 0,9
Я7, 1 ± 1,4
60,6 ± 3,3
68,5 ± 4,1
88,9 ± 0,7
90,1 ± 0,8
22
Нд
НД
1,7-3,0
НД
4,41 0,2
НД

1
Білий товстолоб
Великоротий Буфалло
2
Сеголеткі (зима)
Однорічні
Двухлетки
Сеголеткі (літо)
Сеголеткі (зима)
Однорічні
Двухлетки
3
105,9 ± 2,3
82,1 ± 8,0
93,3 ± 3,1
77,0 ± 2,2
81,5 ± 3,1
90,4 ± 3,3
86,5 ± 2,0
4
56.2 ± 1,46
47,2 ± 1,8
45,13 ± 0,7
32,36 ± 2,0
40,4 ± 1,7
36,2 ± 1,6
41,6 ± 0,95
5
2,6 ± 0,07
2,37 ± 0,1
2,09 ± 0,1
1,15 ± 0,05
1,09 ± 0,03
1,2 ± 0,08
1,23 ± 0,07
6
216,1 ± 5,4
199,2 ± 8,1
219,0 ± 12,1
280,6 ± 13,1
75,79 ± 19,
304,9 ± 16,1
338,6 ± 18,8
7
40,8 ± 1,1
34,8 ± 1,6
44,63 ± 1,3
66,95 ± 1,8
75,6 ± 3,1
80,9 ± 3,9
70,3 ± 3,5
8
14,8 ± 1,8
52,9 ± 6,9
48,1 ± 2,9
6,8 ± 1,4
6,3 ± 0,9
25,9 ± 1,9
19,97 ± 1,8
9
24,27 ± 4.3
54,09 ± 6,0
55,9 ± 3,5
3,9 ± 0,8
7.3 ± 1,7
5,95 ± 1,2
17,64 ± 1,7
10
0
0
0,1
1,5 ± 0,6
0,1
0
0
11
0,2
0,2
0,2 ± 0,1
3,0 ± 1,4
0,7 ± 0,2
0,2 ± 0,1
0,5 ± 0,2
12
1,5 ± 0,2
0,9 ± 0,1
0,6 ± 0,1
1,1 ± 0,4
1,3 ± 0,3
0,2 ± 0,1
0,5 ± 0,2
13
5,9 ± 1,0
12,2 ± 1,4
3,2 ± 0,4
1,6 ± 1,1
1.4 ± 0,3
0,9 ± 0,2
1,6 ± 0,3
14
2,6 ± 0.7
3,4 ± 0,6
0,9 ± 0,4
1,1 ± 0,8
0,7 ± 0,4
2,1 ± 0,4
2,8 ± 0,4
15
0,5 ± 0,1
0,2 ± 0,01
0,2 ± 0,01
0,1 ± 0,1
2,0 ± 0.4
1,6 ± 0,4
0,7 ± 0,1
16
10,5 ± 1,0
16,7 ± 1,4
4,9 ± 0,4
3,9 ± 1,1
5,4 ± 0,4
4,8 ± 0,4
5,6 ± 0,4
17
0,3 ± 0,1
0,1
3,1 ± 0,5
6,6 ± 1,7
1,8 ± 0,4
1,3 ± 0,2
2,1 ± 0,3
18
0
0
0,1
0
0,1
0
0
19
Про
0,1
0,2 ± 0,1
6,3 ± 1,6
1,2 ± 0,3
2,0 ± 0,3
3,6 ± 0.7
20
0,3 ± 0,1
0,1
0,3 ± 0,1
3,1 ± 0,6
3,3 ± 0,2
0,5 ± 0,1
0,2
21
88,7 ± 2,0
82,9 ± 2,1
91,0 ± 0,8
75,5 ± 3,5
87,6 ± 1,5
91,2 ± 1,1
87,9 ± 1,1
22
1,7-3,0
НД
4,4 ± 0,2
НД
НД
НД
НД

1
Бестер
Білуга
Стерлядь
Райдужна форель
2
Сеголеткі
Сеголеткі
Сеголеткі
Мальки
Сеголеткі
Однорічні
Двухлетки
3
54,9 ± 2,1
40,9 ± 1,5
48,3 ± 2,3
67,0 ± 3,6
72,0 ± 1,0
97,9 ± 0,6
87,0 ± 0,8
4
НД
НД
НД
32 ± 4,0
35,0 ± 1,0
49,0 ± 2,0
33,0 ± 3,0
5
0,754 ± 0,05
0.524 ± 0,03
0,595 ± 0,12
1.08 ± 0,4
1,15 ± 0,08
1,21 ± 0,1
1,23 ± 0,04
6
НД
НД
НД
296,3 ± 4,0
304,3 ± 1,0
404,9 ± 2,0
268,3 ± 3,0
7
72,8 4 ± 5,2
56,5 ± 3,0
81,8 ± 2,3
62,0 ± 3,6
62,6 ± 1,0
80,9 ± 0,6
70,7 ± 0,8
8
4s.6 ± 5,7
40,8 ± 5,3
45,9 ± 11.8
17,0 ± 3,5
58,7 ± 6,4
58,9 ± 5,3
39,0 ± 1,4
9
НД
НД
НД "
НД
НД
НД
НД
10
НД
НД
нд
нд
НД
НД
НД
11
НД
НД
НД
НД
НД
НД
НД
12
2,1 ± 0,3
4,2 ± 0,4
1,9 ± 0.5
0
0,7 ± 0,2
0,2 ± 0,02
0,3 ± 0,1
13
1,8 ± 0,3
4,5 ± 0,4
2,1 ± 0,3
0,5 ± 0,1
0
0,3 ± 0,1
0,3 ± 0,1
14
9,5 ± 0,8
15,3 ± 1,4
2,6 ± 0,5
1,0 ± 0,2
1,0 ± 0,1
2,0 ± 0,15
1,9 ± 0,2
15
9,8 ± 1,0
14,7 ± 1,7
2,2 ± 0,9
1,1 ± 0,3
3,1 ± 0,3
2,5 ± 0,1
2,8 ± 0,2
16
23,2 ± 2.1
38,7 ± 3,4
7,8 ± 1,7
2,6 +0,1
4,8 ± 0,3
5,0 ± 0,5
5,3 ± 0,2
17
11,2 ± 1,1
26,6 ± 2,4
2,6 ± 0,7
***
-
-
18
0
0
0
-
-
-
-
19
0
0
0
-
-
-
20
1,4 ± 0,3
0,7 ± 0,2
1,9 ± 0,5
6,4 ± 0,6
5,0 ± 0,3
4,9 ± 0,8
2,1 ± 0.1
21
64,2 ± 5,1
34,0 ± 4,1
87,7 ± 2,3
91,0 +3,2
90,2 ± 2,3
90,1 ± 1,8
92,6 ± 0,9
22
1,4 ± 0,07
1,3 ± 0,05
1.8 ± 0,1
5,4
6,2
3,8
5,1

1
Каспійський лосось
Кета
Сіма
Кижуч
2
Рання молодь
Сеголеткі
Однорічні
Двухлетки
Смолт
Смолт
Смолт
3
37,0 ± 1,5
70,0 ± 2,0
80 0 ± 3,0
60,0 ± 4,0
НД
97,0 ± 3,0
109,2 ± 0,3
4
НД
НД
39,5 ± 3.5
65,3 ± 3,6
НД
НД
НД
5
0,5 ± o.o8
0,56 ± 0,06
0.65 ± 0,05
0,59 ± 0,03
1,2 ± 0,07
1,2 ± 0,08
1,13 ± 0,04
6
НД
НД
НД
НД
НД
НД
НД
7
74,0 ± 1,5
25,0 ± 14
23,01 ± 13
01,7 ± 10,
НД
81,0 ± 4,2
96,6 ± 0,6
8
25,0 ± 4,5
27,0 ± 4,8
33,0 ± 6,0
34,0 ± 6,0
2,7 ± 0,4
3,5 ± 0,7
9,6 ± 1,6
9
НД
НД
НД
НД
6,0 ± 0,1
6,0 ± 0,4
10.2 ± 1,4
10
1,0 ± 0,6
2,9 ± 0,3
0
3,6 ± 0,8
0 (1,0-1,8) *
1,4 ± 0,7
0
11
1,0 ± 0,4
0,1 ± 0,01
0
1,0 ± 0,3
НД
ЧД
НД
12
1,0 ± 0,2
0
0,2 ± 0,3
0,08 ± 0,03
НД
НД
НД
13
0,5 ± 0.3
0,4 ± 0,2
0,3 ± 0,1
0
НД

НД
14
0,4 ± 0,1
1,4 ± 0,4
1,0 ± 0,2
0,3 +0,1
НД
НД
НД
15
2,2 ± 0,3
0,7 ± 0,2
1,0 ± 0,5
4,3 ± 0,4
ПД
НД
НД
16
4,1 ± 1,3
2,5 ± 0,2
2,5 ± 0,3
4,7 ± 0,3
10,1 ± 0,3
23,7 ± 2,5
4,3 ± 0.6
17
-
-
-
-
0
21,1 ± 2,8
0
18
-
-
-
-
-
Одинично
-
19
-
-
-
-
-
-
-
20
2,0 ± 0,3
1,6 ± 0,2
0,4 ± 0,01
1,7 ± 0, l
0 (2,1-3,0)
0,5 ± 0,3
0 (0,4-0,5)
21
91,9 ± 2,1
92,9 ± 1,6
97,1 ± 2,0
89,0 ± 1,7
86,9 ± 0,5
53,0 ± 2,5
96,0 ± 3,0
22
нд
11,01 ± 0,5
НД
5,2 ± 0,4
НД
НД
нд
 
* Немає даних
** Клітинні форми у даного виду риб існують (можуть бути за певних обставин)
*** Клітинних форм у даного виду в нормі не виявлено
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Сільське, лісове господарство та землекористування | Методичка
351.1кб. | скачати


Схожі роботи:
Порядок проведення попереднього обстеження клієнта
Фізіологія риб
Будова риб
Хвороби риб
Ситуація проведення інтерв`ю рамки і схема проведення типи питань
Характеристика риб річки Уж
Опис і класифікація риб
Обмін речовин у риб
Надряд хрящових риб
© Усі права захищені
написати до нас