Реферат на тему:
Приготування сорбентів і колонок для високоефективної рідинної хроматографії
1. Сорбенти для ВЕРХ
Сорбенти для ВЕРХ представляють собою, як правило, дуже вузько фракціоновані силікагелі різного типу з хімічно щепленими фазами. Хоча вихідний кусковий силікагель або розмелений і грубо сепарований для ТШХ коштують недорого, ціни на сорбенти для ВЕРХ досить високі. Це пов'язано з високою вартістю і малою продуктивністю установок для отримання вузьких фракцій силікагелю, з високими цінами на реактиви для отримання щеплених фаз і складністю щеплення. Слід також зазначити, що технологія щеплення конкретної фази до певного виду силікагелю може сильно відрізнятися і давати при тих же вихідних компонентах абсолютно різний кінцевий сорбент. Тому технологія отримання сорбентів кожного виду складає «ноу-хау» фірм-виробників і тримається в строгому секреті. Не слід тому, не маючи сорбенту, використаного в методиці, яку ви маєте намір відтворити, дивуватися і засмучуватися тим, що методику не вдається відтворити. Поняття «силікагель з щепленим октадецілсіланом» є таким же загальним і невизначеним, як в повсякденній мові, наприклад, поняття «прилад».
Навіть той же сорбент, отриманий від одного виробника, як і кожен складний хімічний продукт, може в певних межах змінюватись за своїми властивостями і хроматографічним якостям в залежності від партії, часу випуску і т.д. Часто фірми, що випускають сорбенти і заповнені ними колонки, використовують для заповнення колонок сорбент поліпшеного фракційного складу або просто більш дрібний з метою переконати хроматографістов у неможливості полудня «саморобних» стовпчиків із такими ж високими параметрами ефективності, симетрії піків, проникності і т.д.
Слід взяти за правило, що найкращим шляхом для отримання відтворюваних результатів аналізу є використання для заповнення колонок одного і того ж сорбенту, бажано однієї партії. Технологія упаковки колонок цим сорбентом також не повинна змінюватися. Якщо є можливість одержувати готові заповнені колонки, це істотно спрощує роботу і дозволяє зосередитися на самій хроматографії. Те ж відноситься і до використання готових сорбентів для ВЕРХ.
На жаль, навіть добре оснащені лабораторії рідко мають широкий вибір сорбентів та колонок для ВЕРХ зважаючи на їх високу вартість і дуже широкого асортименту. Крім того, часто в науковій практиці виникає необхідність мати, наприклад, силікагель з певним розміром і об'ємом пор і силікагель зі специфічними щепленими фазами, які можуть забезпечити необхідний поділ. У цьому випадку найбільш швидким і раціональним є отримання сорбенту та упаковка колонок своїми силами, що вимагає, звичайно, певної кваліфікації.
1.1 ОТРИМАННЯ вузьких фракцій ДЛЯ ВЕРХ З Силікагель ДЛЯ ТШХ І ПРОМИСЛОВОГО Силікагель КСК-2
Обладнання, необхідне для отримання вузьких фракцій силікагелю в кількостях, достатніх для ВЕРХ, може бути дуже нескладним: кілька однакових термостійких хімічних склянок, скляні палички з гумовими наконечниками, секундомір або годинник, сушильний шафа, дистилятор для отримання води в достатніх для роботи кількостях. Бажано, але не обов'язково мати систему для ультразвукової обробки суспензій. Якщо вихідний силікагель кусковий, потрібно мати для помелу млин достатньої продуктивності, не забруднює розмелюються силікагель (наприклад, дарову фарфорову).
Якщо вихідний силікагель беруть в готовому вигляді, наприклад, силікагель для ТШХ марки Л 5 / 40 виробництва ЧССР (він повинен бути без сполучного гіпсу і без УФ-індикатора), то процес його розмелювання відпадає. Перед тим, як починати седиментацію цього чи іншого меленого силікагелю, бажано розглянути під мікроскопом краплю його суспензії при збільшенні в 100-500 разів з мірною шкалою з метою встановити, чи присутні в достатній кількості частинки розміром від 3 до 2 мкм. Якщо вони практично відсутні, отже, необхідний додатковий розмел.
Сорбент одержують у такий спосіб. У склянку місткістю близько 1 л засипають вихідний силікагель шаром близько 3 см, заливають його водою, ретельно перемішують і доводять висоту шару суспензії точно до 12 см. Ретельно перемішавши суспензію, залишають її стояти 15 хв, що випав осад відкидають, а суспензію переливають в іншу склянку . Додавши воду знову до висоти шару суспензії 12 см, залишають її стояти 1 ч. випав осад залишають у стакані, суспензію переливають в іншу склянку, додають воду до висоти шару 12 см. Ретельно перемішавши, залишають суспензію стояти ще 2 ч. випав осад залишають у склянці, суспензію переливають у новий склянку і додають воду до висоти шару суспензії 12 см. Перемішують, залишають на 4 год, що випав осад залишають у стакані, а суспензію виливають. У результаті виконаних операцій отримують одно-, двох-і чотиригодинні опади.
Одногодинний осад суспендують, обережно перемішуючи скляною паличкою з гумовим наконечником у воді, доливають воду до висоти шару 12 см і залишають на 20 хв. Осад відкидають, суспензію переливають в іншу склянку, доливають воду до 12 см, перемішують і залишають на 1 год випав одночасово (другий) осад залишають у стакані, суспензію переливають в іншу склянку, доливають воду до висоти шару 12 см, перемішують і залишають на 2 ч. випав осад залишають, а суспензію виливають. Випали за 20 хв і за 2 год опади, які вже мають помітно звужений фракційний склад, збирають окремо і надалі, в міру їх накопичення, звужують далі або ж використовують для високоефективної ТШХ або препаративної ЖХ.
Другий одночасово осад обробляють як перший одночасово, отримуючи кінцевий сорбент - третій одночасово осад, який має середній розмір частинок близько 14 мкм і вузький фракційний склад, що добре видно при розгляді під мікроскопом краплі його суспензії при збільшенні в 100-200 разів.
Аналогічна обробка двогодинного осаду (інтервали часу відповідно змінюються на 40 хв, 2 і 4 год) дозволяє отримати кінцевий сорбент - третій двогодинної осад, який має середній розмір часток близько 9 мкм і вузький фракційний склад. При такій самій обробці чотиригодинного осаду (інтервали часу 80 хв, 4 та 8 годин) отримують третій чотиригодинний осад, що представляє собою вузько фракціонований кінцевий сорбент з частинками розміром близько 5 мкм.
Отримані сорбенти сушать у склянках при температурі близько 150 ° С у сушильній шафі 6 год до постійної маси, після чого охолоджують у ексикаторі і акуратно пересипають у широкогорлі склянки, щільно закриваються пробкою. Пересипати сорбенти слід під витяжкою, так як вони порошать, а пил шкідливий для органів дихання.
З 1 кг вихідного силікагелю для ТШХ виходить по 20-40г. кожного з сорбентів, тобто близько 70-80 г. При подальшому звуженні проміжних фракцій тим же способом вихід їх ще трохи підвищується. Проміжні фракції можна використовувати і для інших видів хроматографії (ТШХ) або інших варіантів ЖХ (полупрепаратівние або препаративні поділу, очищення зразків і т. п.).
Опис отримання сорбентів для ВЕРХ, представлене вище, показує, що процес нескладний і досить продуктивний. Отримані сорбенти за якістю не поступаються доступне на ринку, а іноді перевершують їх.
Однак при отриманні сорбентів цим способом слід ретельно дотримуватися ряду умов. Перш за все, всі операції необхідно проводити з однією партією вихідного силікагелю. Треба суворо дотримуватися сталість висоти шару суспензії у склянках і інтервали часу. У випадку помилки завжди краще знову взмутіть суспензію і повторити седиментацію правильно. Не слід застосовувати більших зусиль при взмучивания осаду, тому що це може призвести до роздавлюванню великої кількості частинок і погіршення фракційного складу осаду. Нарешті, при нагоді потрібно проводити ультраліву обробку кожної суспензії, так як це сприяє руйнуванню злиплих часток (грудочок) і відокремлення від частинок прилиплих до них субмікронних пиловидних частинок наявність яких погіршує проникність і ефективність колонок з таким сорбентом.
З силікагелю марки КСК-2 вузькі фракції сорбентів для ВЕРХ отримують аналогічним способом, додаючи стадію розмелювання вихідного кускового силікагелю. Вибираючи млин для розмелювання, завжди звертайте увагу не тільки на її продуктивність і ступінь подрібнення, а й на матеріал її конструкції. Продукти зносу корпусу і мелють тел млини повинні бути присутніми в розмеленому силікагелі у мінімальній кількості. Вимоги до матеріалів млини кілька менш жорсткі, якщо передбачається надалі хімічне облагороджування отриманих сорбентів кип'ятінням з хлороводородной, азотною кислотами або їх сумішшю. При цьому віддаляються з'єднання металів змінної валентності, присутні у вихідному
силікагелі (в першу чергу заліза, окрашивающего КСК-2 у кольори від світло-жовтого до коричневого), і внесені в процесі розмелювання. Таку демінералізацію силікагелю часто проводять фірми, що виробляють сорбенти: при цьому колір сорбенту стає білим, його каталітична активність зводиться до мінімуму і водночас гідроксилюється поверхню, що необхідно для подальшої повної хімічної щеплення.
Чи будь-який силікагель можна використовувати для отримання сорбентів для ВЕРХ таким чином? Ні, не будь-хто. Слід враховувати не тільки фізико-хімічні характеристики, наведені в паспорті і важливі для використання силікагелю в якості осушувача, носія каталізаторів або сорбентів для ГХ. Дуже важливою характеристикою є його стабільність у водних суспензіях і механічна міцність, тому що, якщо силікагель неміцний чинності технології його одержання або втрачає міцність у процесі розмелювання і приготування суспензії, він непридатний для ВЕРХ. Перш за все це відноситься до силікагелем, що знайшли широке застосування в ГХ в якості адсорбентів, які добувають з частинок аеросилу і мають марки сілохром С-80, С-120 та ін приступає до роботи з новим видом силікагелю слід звернути особливу увагу на розмір пор, обсяг пір і технологію отримання силікагелю даного виду. Чим більше об'єм пор і їх розмір, тим, як правило, менш міцний силікагель, але і тим більший інтерес він становить для такого застосування, як отримання сорбентів для Ексклюзійна хроматографії, для аналізу великих молекул в іонообмінному і обернено-фазному варіантах ВЕРХ (білки, поліпептиди та ін.) Іноді сорбенти з однаковими або близькими характеристиками за розміром та обсягом пір, але отримані за різною технологією (або при порушеннях технології), можуть відрізнятися за міцністю в 2-10 разів. Особливо це відноситься до сорбентам, які добувають з тетраетоісісілана формуванням мікросфер з наступним затвердінням (сорбенти типу ліхросфер фірми «Мерк»).
Тому можна взяти за правило, починаючи роботу з отримання сорбентів для ВЕРХ з силікагелю нових видів або партій, не робити відразу велику порцію, а отримати 4-6 г сорбенту і випробувати його, заповнивши кілька колонок при різних тисках і випробувавши їх характеристики. Якщо, наприклад, вже при тиску набивання близько 20 МПа колонка має різко збільшене (в порівнянні з іншим сорбентом із механічно міцного силікагелю тієї ж фракції) опір потоку розчинника, то важко розраховувати на те, що вдасться отримати високоефективні колонки, заповнені сорбентом цього виду з частинками розміром близько 5 мкм. Якщо ж колонки, заповнені при 20, 40 і 60 МПа, мають близьку проникність, можна робити велику партію сорбенту і бути впевненим в її якості.
1.2 суспензійним методом ПРИГОТУВАННЯ КОЛОНОК ДЛЯ ВЕРХ
Приготування колонок для ВЕРХ з частинок сорбенту розміром від 3 до 12 мкм довго було для фахівців з ВЕРХ труднопреодолімим проблемою. Так як при подрібненні будь-яких твердих тіл їх поверхню контакту різко зростає, дрібні частинки набувають здатність заряджатися, злипатися в важко руйновані грудочки або відштовхуватися один від одного з утворенням нерівномірно розподілених порожнеч.
Рис .5.1. Схема пристрою для суспензійного заповнення колонок:
1-капіляр для подачі розчинника від насоса; 2-верхній фітінг резервуара; 3-резервуар для суспензії; 4-нижній фітінг резервуара; 5-предколонка; 6-розсвердлений під зовнішні діаметри колонки і предколонкі фітінг; 7-колонка; 8-фітінг колонки ; 9-злив розчинника в мірний циліндр
Сорбент в заповненій традиційним методом «насипай та ущільнюваного постукуванням» колонці для КХ після того, як у неї подавали розчинник, ущільнювався з утворенням порожнин на початку колонки, при цьому форма піків виходила неправильною, а ефективність колонки - низькою.
Розробка суспензійних методів приготування колонок дозволила різко підняти ефективність і використовувати сорбенти розміром 10 мкм і менше. Однак суспензійний метод ще недостатньо відпрацьований, і існує безліч його варіантів, кожен з яких має свої особливості. Часто той варіант, який описаний в літературі, не дає в інших руках добрих результатів, оскільки неможливо описати і відтворити всі деталі процесу суспензійний упаковки.
Коротенько процес суспензійний упаковки виглядає наступним чином. Зважують необхідну для колонки даного розміру кількість сорбенту, заливають його розчинником і готують суспензію, ретельно перемішуючи суміш, нередKO з використанням ультразвуку. Після цього суспензію поміщають в резервуар, сполучений з колонкою, на кінці якої встановлений фітінг з фільтром (рис. 5.1), і під тиском 20-60 МПа продавлюють суспензію через колонку, подаючи резервуар насосом розчинник. Суспензія фільтрується на фільтрі колонки, формуючи упорядкований шар сорбенту, що забезпечує ефективне розділення при ВЕРХ. Зупиняють потік розчинника, дають тиску впасти до нуля і знімають колонку. Акуратно видаляють надлишок сорбенту з кінця колонки, що приєдналася до резервуару, і приєднують другу фітінг з фільтром. Отриману таким чином колонку встановлюють на хроматограф, прокачують через неї до встановлення рівноваги робочий розчинник, після чого вона готова до роботи.
При всій удаваній простоті процесу суспензійний упаковки колонок для ВЕРХ у початківця хроматографіста, так само як і в який має досвід, але початківця працювати з новим сорбентом, виникає ряд питань. Який розчинник взяти для приготування суспензії? Яку концентрацію суспензії використовувати? Як краще диспергувати сорбент? Якої форми та об'єму застосувати резервуар для суспензії? Який насос краще для подачі розчинника? Який напрямок потоку розчинника вибрати і який взяти розчинник? Який тиск використовувати і скільки розчинника подавати? Скільки часу знижувати тиск? Як вирівнювати шар сорбенту і встановлювати фітінг і фільтр? На кожне питання існує ряд відповідей, а вибір вдалої комбінації варіантів завжди обумовлений не тільки власним досвідом, а й будь-якими загальними уявленнями, літературними даними і, нарешті, що є в наявності обладнанням.
Почати доцільно з сорбенту, який упаковують в колонку. Перш за все бажано під мікроскопом при збільшенні в 200-600 раз розглянути краплю суспензії сорбенту у відповідному розчиннику. Цей простий тест покаже, чи є в сорбенті пил (вона може бути з-за недостатньо вузького сепарування на фірмі-виробнику або внаслідок подрібнення сорбенту в процесі транспортування або щеплення фази), вузько чи сорбент сепарувати, яка форма частинок. Якщо багато пиловидних або великих часток, доцільно провести седиментацію сорбенту з метою звуження фракційного складу.
Розчинник для приготування суспензії часто є визначальним фактором для якості упаковки. Так як суспензія повинна зберігати стабільність, починаючи від перенесення її в резервуар протягом всієї упаковки, необхідно уповільнити седиментацію або виключити її. Для цього існує ряд способів. Один, званий «методом збалансованої щільності» і широко використовуваний, полягає у виборі розчинника з тією ж щільністю, що має силікагель. Цей розчинник складається з суміші полігалогензамещенних вуглеводнів (звичайно суміш тетраброметана і тетрахлориду вуглецю); так як густина його дорівнює щільності силікагелю, седиментації не відбувається як завгодно довго. Недоліком цього способу є висока токсичність, дорожнеча і труднощі видалення з колонки полігалогенірованних розчинників. Інший спосіб, званий «методом високої в'язкості», полягає у виборі розчинника з високою в'язкістю, в якому седиментація сорбенту відбувається досить довго. Зазвичай це розчинники, що містять гліцерин, етиленгліколь або циклогексанол. Недоліком цього способу є тривалість упаковки, яка доходила до декількох годин. Третій спосіб, званий «динамічним», полягає у використанні розчинників малої в'язкості, упаковка при цьому протікає швидко; для покращення стабільності та зменшення седиментації іноді використовують перемішування суспензії магнітною мішалкою в процесі всієї упаковки.
Існує безліч комбінованих методів, в яких використовують елементи трьох зазначених способів в різному поєднанні і з додаванням ПАР, кислих і лужних агентів, солей та ін При виборі розчинника слід мати на увазі, що він може давати з різними сорбентами істинні суспензії, що воюють у відповідності з законом Стокса (у них частки розподілені у вигляді індивідуальних частинок), і «склеєні» суспензії, осідає багато швидше і містять грудочки з декількох часток сорбенту. Приготування сорбентів і колонок для високоефективної рідинної хроматографії
1. Сорбенти для ВЕРХ
Сорбенти для ВЕРХ представляють собою, як правило, дуже вузько фракціоновані силікагелі різного типу з хімічно щепленими фазами. Хоча вихідний кусковий силікагель або розмелений і грубо сепарований для ТШХ коштують недорого, ціни на сорбенти для ВЕРХ досить високі. Це пов'язано з високою вартістю і малою продуктивністю установок для отримання вузьких фракцій силікагелю, з високими цінами на реактиви для отримання щеплених фаз і складністю щеплення. Слід також зазначити, що технологія щеплення конкретної фази до певного виду силікагелю може сильно відрізнятися і давати при тих же вихідних компонентах абсолютно різний кінцевий сорбент. Тому технологія отримання сорбентів кожного виду складає «ноу-хау» фірм-виробників і тримається в строгому секреті. Не слід тому, не маючи сорбенту, використаного в методиці, яку ви маєте намір відтворити, дивуватися і засмучуватися тим, що методику не вдається відтворити. Поняття «силікагель з щепленим октадецілсіланом» є таким же загальним і невизначеним, як в повсякденній мові, наприклад, поняття «прилад».
Навіть той же сорбент, отриманий від одного виробника, як і кожен складний хімічний продукт, може в певних межах змінюватись за своїми властивостями і хроматографічним якостям в залежності від партії, часу випуску і т.д. Часто фірми, що випускають сорбенти і заповнені ними колонки, використовують для заповнення колонок сорбент поліпшеного фракційного складу або просто більш дрібний з метою переконати хроматографістов у неможливості полудня «саморобних» стовпчиків із такими ж високими параметрами ефективності, симетрії піків, проникності і т.д.
Слід взяти за правило, що найкращим шляхом для отримання відтворюваних результатів аналізу є використання для заповнення колонок одного і того ж сорбенту, бажано однієї партії. Технологія упаковки колонок цим сорбентом також не повинна змінюватися. Якщо є можливість одержувати готові заповнені колонки, це істотно спрощує роботу і дозволяє зосередитися на самій хроматографії. Те ж відноситься і до використання готових сорбентів для ВЕРХ.
На жаль, навіть добре оснащені лабораторії рідко мають широкий вибір сорбентів та колонок для ВЕРХ зважаючи на їх високу вартість і дуже широкого асортименту. Крім того, часто в науковій практиці виникає необхідність мати, наприклад, силікагель з певним розміром і об'ємом пор і силікагель зі специфічними щепленими фазами, які можуть забезпечити необхідний поділ. У цьому випадку найбільш швидким і раціональним є отримання сорбенту та упаковка колонок своїми силами, що вимагає, звичайно, певної кваліфікації.
1.1 ОТРИМАННЯ вузьких фракцій ДЛЯ ВЕРХ З Силікагель ДЛЯ ТШХ І ПРОМИСЛОВОГО Силікагель КСК-2
Обладнання, необхідне для отримання вузьких фракцій силікагелю в кількостях, достатніх для ВЕРХ, може бути дуже нескладним: кілька однакових термостійких хімічних склянок, скляні палички з гумовими наконечниками, секундомір або годинник, сушильний шафа, дистилятор для отримання води в достатніх для роботи кількостях. Бажано, але не обов'язково мати систему для ультразвукової обробки суспензій. Якщо вихідний силікагель кусковий, потрібно мати для помелу млин достатньої продуктивності, не забруднює розмелюються силікагель (наприклад, дарову фарфорову).
Якщо вихідний силікагель беруть в готовому вигляді, наприклад, силікагель для ТШХ марки Л 5 / 40 виробництва ЧССР (він повинен бути без сполучного гіпсу і без УФ-індикатора), то процес його розмелювання відпадає. Перед тим, як починати седиментацію цього чи іншого меленого силікагелю, бажано розглянути під мікроскопом краплю його суспензії при збільшенні в 100-500 разів з мірною шкалою з метою встановити, чи присутні в достатній кількості частинки розміром від 3 до 2 мкм. Якщо вони практично відсутні, отже, необхідний додатковий розмел.
Сорбент одержують у такий спосіб. У склянку місткістю близько 1 л засипають вихідний силікагель шаром близько 3 см, заливають його водою, ретельно перемішують і доводять висоту шару суспензії точно до 12 см. Ретельно перемішавши суспензію, залишають її стояти 15 хв, що випав осад відкидають, а суспензію переливають в іншу склянку . Додавши воду знову до висоти шару суспензії 12 см, залишають її стояти 1 ч. випав осад залишають у стакані, суспензію переливають в іншу склянку, додають воду до висоти шару 12 см. Ретельно перемішавши, залишають суспензію стояти ще 2 ч. випав осад залишають у склянці, суспензію переливають у новий склянку і додають воду до висоти шару суспензії 12 см. Перемішують, залишають на 4 год, що випав осад залишають у стакані, а суспензію виливають. У результаті виконаних операцій отримують одно-, двох-і чотиригодинні опади.
Одногодинний осад суспендують, обережно перемішуючи скляною паличкою з гумовим наконечником у воді, доливають воду до висоти шару 12 см і залишають на 20 хв. Осад відкидають, суспензію переливають в іншу склянку, доливають воду до 12 см, перемішують і залишають на 1 год випав одночасово (другий) осад залишають у стакані, суспензію переливають в іншу склянку, доливають воду до висоти шару 12 см, перемішують і залишають на 2 ч. випав осад залишають, а суспензію виливають. Випали за 20 хв і за 2 год опади, які вже мають помітно звужений фракційний склад, збирають окремо і надалі, в міру їх накопичення, звужують далі або ж використовують для високоефективної ТШХ або препаративної ЖХ.
Другий одночасово осад обробляють як перший одночасово, отримуючи кінцевий сорбент - третій одночасово осад, який має середній розмір частинок близько 14 мкм і вузький фракційний склад, що добре видно при розгляді під мікроскопом краплі його суспензії при збільшенні в 100-200 разів.
Аналогічна обробка двогодинного осаду (інтервали часу відповідно змінюються на 40 хв, 2 і 4 год) дозволяє отримати кінцевий сорбент - третій двогодинної осад, який має середній розмір часток близько 9 мкм і вузький фракційний склад. При такій самій обробці чотиригодинного осаду (інтервали часу 80 хв, 4 та 8 годин) отримують третій чотиригодинний осад, що представляє собою вузько фракціонований кінцевий сорбент з частинками розміром близько 5 мкм.
Отримані сорбенти сушать у склянках при температурі близько 150 ° С у сушильній шафі 6 год до постійної маси, після чого охолоджують у ексикаторі і акуратно пересипають у широкогорлі склянки, щільно закриваються пробкою. Пересипати сорбенти слід під витяжкою, так як вони порошать, а пил шкідливий для органів дихання.
З 1 кг вихідного силікагелю для ТШХ виходить по 20-40г. кожного з сорбентів, тобто близько 70-80 г. При подальшому звуженні проміжних фракцій тим же способом вихід їх ще трохи підвищується. Проміжні фракції можна використовувати і для інших видів хроматографії (ТШХ) або інших варіантів ЖХ (полупрепаратівние або препаративні поділу, очищення зразків і т. п.).
Опис отримання сорбентів для ВЕРХ, представлене вище, показує, що процес нескладний і досить продуктивний. Отримані сорбенти за якістю не поступаються доступне на ринку, а іноді перевершують їх.
Однак при отриманні сорбентів цим способом слід ретельно дотримуватися ряду умов. Перш за все, всі операції необхідно проводити з однією партією вихідного силікагелю. Треба суворо дотримуватися сталість висоти шару суспензії у склянках і інтервали часу. У випадку помилки завжди краще знову взмутіть суспензію і повторити седиментацію правильно. Не слід застосовувати більших зусиль при взмучивания осаду, тому що це може призвести до роздавлюванню великої кількості частинок і погіршення фракційного складу осаду. Нарешті, при нагоді потрібно проводити ультраліву обробку кожної суспензії, так як це сприяє руйнуванню злиплих часток (грудочок) і відокремлення від частинок прилиплих до них субмікронних пиловидних частинок наявність яких погіршує проникність і ефективність колонок з таким сорбентом.
З силікагелю марки КСК-2 вузькі фракції сорбентів для ВЕРХ отримують аналогічним способом, додаючи стадію розмелювання вихідного кускового силікагелю. Вибираючи млин для розмелювання, завжди звертайте увагу не тільки на її продуктивність і ступінь подрібнення, а й на матеріал її конструкції. Продукти зносу корпусу і мелють тел млини повинні бути присутніми в розмеленому силікагелі у мінімальній кількості. Вимоги до матеріалів млини кілька менш жорсткі, якщо передбачається надалі хімічне облагороджування отриманих сорбентів кип'ятінням з хлороводородной, азотною кислотами або їх сумішшю. При цьому віддаляються з'єднання металів змінної валентності, присутні у вихідному
силікагелі (в першу чергу заліза, окрашивающего КСК-2 у кольори від світло-жовтого до коричневого), і внесені в процесі розмелювання. Таку демінералізацію силікагелю часто проводять фірми, що виробляють сорбенти: при цьому колір сорбенту стає білим, його каталітична активність зводиться до мінімуму і водночас гідроксилюється поверхню, що необхідно для подальшої повної хімічної щеплення.
Чи будь-який силікагель можна використовувати для отримання сорбентів для ВЕРХ таким чином? Ні, не будь-хто. Слід враховувати не тільки фізико-хімічні характеристики, наведені в паспорті і важливі для використання силікагелю в якості осушувача, носія каталізаторів або сорбентів для ГХ. Дуже важливою характеристикою є його стабільність у водних суспензіях і механічна міцність, тому що, якщо силікагель неміцний чинності технології його одержання або втрачає міцність у процесі розмелювання і приготування суспензії, він непридатний для ВЕРХ. Перш за все це відноситься до силікагелем, що знайшли широке застосування в ГХ в якості адсорбентів, які добувають з частинок аеросилу і мають марки сілохром С-80, С-120 та ін приступає до роботи з новим видом силікагелю слід звернути особливу увагу на розмір пор, обсяг пір і технологію отримання силікагелю даного виду. Чим більше об'єм пор і їх розмір, тим, як правило, менш міцний силікагель, але і тим більший інтерес він становить для такого застосування, як отримання сорбентів для Ексклюзійна хроматографії, для аналізу великих молекул в іонообмінному і обернено-фазному варіантах ВЕРХ (білки, поліпептиди та ін.) Іноді сорбенти з однаковими або близькими характеристиками за розміром та обсягом пір, але отримані за різною технологією (або при порушеннях технології), можуть відрізнятися за міцністю в 2-10 разів. Особливо це відноситься до сорбентам, які добувають з тетраетоісісілана формуванням мікросфер з наступним затвердінням (сорбенти типу ліхросфер фірми «Мерк»).
Тому можна взяти за правило, починаючи роботу з отримання сорбентів для ВЕРХ з силікагелю нових видів або партій, не робити відразу велику порцію, а отримати 4-6 г сорбенту і випробувати його, заповнивши кілька колонок при різних тисках і випробувавши їх характеристики. Якщо, наприклад, вже при тиску набивання близько 20 МПа колонка має різко збільшене (в порівнянні з іншим сорбентом із механічно міцного силікагелю тієї ж фракції) опір потоку розчинника, то важко розраховувати на те, що вдасться отримати високоефективні колонки, заповнені сорбентом цього виду з частинками розміром близько 5 мкм. Якщо ж колонки, заповнені при 20, 40 і 60 МПа, мають близьку проникність, можна робити велику партію сорбенту і бути впевненим в її якості.
1.2 суспензійним методом ПРИГОТУВАННЯ КОЛОНОК ДЛЯ ВЕРХ
Приготування колонок для ВЕРХ з частинок сорбенту розміром від 3 до 12 мкм довго було для фахівців з ВЕРХ труднопреодолімим проблемою. Так як при подрібненні будь-яких твердих тіл їх поверхню контакту різко зростає, дрібні частинки набувають здатність заряджатися, злипатися в важко руйновані грудочки або відштовхуватися один від одного з утворенням нерівномірно розподілених порожнеч.
Рис .5.1. Схема пристрою для суспензійного заповнення колонок:
1-капіляр для подачі розчинника від насоса; 2-верхній фітінг резервуара; 3-резервуар для суспензії; 4-нижній фітінг резервуара; 5-предколонка; 6-розсвердлений під зовнішні діаметри колонки і предколонкі фітінг; 7-колонка; 8-фітінг колонки ; 9-злив розчинника в мірний циліндр
Сорбент в заповненій традиційним методом «насипай та ущільнюваного постукуванням» колонці для КХ після того, як у неї подавали розчинник, ущільнювався з утворенням порожнин на початку колонки, при цьому форма піків виходила неправильною, а ефективність колонки - низькою.
Розробка суспензійних методів приготування колонок дозволила різко підняти ефективність і використовувати сорбенти розміром 10 мкм і менше. Однак суспензійний метод ще недостатньо відпрацьований, і існує безліч його варіантів, кожен з яких має свої особливості. Часто той варіант, який описаний в літературі, не дає в інших руках добрих результатів, оскільки неможливо описати і відтворити всі деталі процесу суспензійний упаковки.
Коротенько процес суспензійний упаковки виглядає наступним чином. Зважують необхідну для колонки даного розміру кількість сорбенту, заливають його розчинником і готують суспензію, ретельно перемішуючи суміш, нередKO з використанням ультразвуку. Після цього суспензію поміщають в резервуар, сполучений з колонкою, на кінці якої встановлений фітінг з фільтром (рис. 5.1), і під тиском 20-60 МПа продавлюють суспензію через колонку, подаючи резервуар насосом розчинник. Суспензія фільтрується на фільтрі колонки, формуючи упорядкований шар сорбенту, що забезпечує ефективне розділення при ВЕРХ. Зупиняють потік розчинника, дають тиску впасти до нуля і знімають колонку. Акуратно видаляють надлишок сорбенту з кінця колонки, що приєдналася до резервуару, і приєднують другу фітінг з фільтром. Отриману таким чином колонку встановлюють на хроматограф, прокачують через неї до встановлення рівноваги робочий розчинник, після чого вона готова до роботи.
При всій удаваній простоті процесу суспензійний упаковки колонок для ВЕРХ у початківця хроматографіста, так само як і в який має досвід, але початківця працювати з новим сорбентом, виникає ряд питань. Який розчинник взяти для приготування суспензії? Яку концентрацію суспензії використовувати? Як краще диспергувати сорбент? Якої форми та об'єму застосувати резервуар для суспензії? Який насос краще для подачі розчинника? Який напрямок потоку розчинника вибрати і який взяти розчинник? Який тиск використовувати і скільки розчинника подавати? Скільки часу знижувати тиск? Як вирівнювати шар сорбенту і встановлювати фітінг і фільтр? На кожне питання існує ряд відповідей, а вибір вдалої комбінації варіантів завжди обумовлений не тільки власним досвідом, а й будь-якими загальними уявленнями, літературними даними і, нарешті, що є в наявності обладнанням.
Почати доцільно з сорбенту, який упаковують в колонку. Перш за все бажано під мікроскопом при збільшенні в 200-600 раз розглянути краплю суспензії сорбенту у відповідному розчиннику. Цей простий тест покаже, чи є в сорбенті пил (вона може бути з-за недостатньо вузького сепарування на фірмі-виробнику або внаслідок подрібнення сорбенту в процесі транспортування або щеплення фази), вузько чи сорбент сепарувати, яка форма частинок. Якщо багато пиловидних або великих часток, доцільно провести седиментацію сорбенту з метою звуження фракційного складу.
Розчинник для приготування суспензії часто є визначальним фактором для якості упаковки. Так як суспензія повинна зберігати стабільність, починаючи від перенесення її в резервуар протягом всієї упаковки, необхідно уповільнити седиментацію або виключити її. Для цього існує ряд способів. Один, званий «методом збалансованої щільності» і широко використовуваний, полягає у виборі розчинника з тією ж щільністю, що має силікагель. Цей розчинник складається з суміші полігалогензамещенних вуглеводнів (звичайно суміш тетраброметана і тетрахлориду вуглецю); так як густина його дорівнює щільності силікагелю, седиментації не відбувається як завгодно довго. Недоліком цього способу є висока токсичність, дорожнеча і труднощі видалення з колонки полігалогенірованних розчинників. Інший спосіб, званий «методом високої в'язкості», полягає у виборі розчинника з високою в'язкістю, в якому седиментація сорбенту відбувається досить довго. Зазвичай це розчинники, що містять гліцерин, етиленгліколь або циклогексанол. Недоліком цього способу є тривалість упаковки, яка доходила до декількох годин. Третій спосіб, званий «динамічним», полягає у використанні розчинників малої в'язкості, упаковка при цьому протікає швидко; для покращення стабільності та зменшення седиментації іноді використовують перемішування суспензії магнітною мішалкою в процесі всієї упаковки.
Справжні суспензії осідають у вигляді щільного, важко Диспергованість осаду. «Склеєні» суспензії осідають у вигляді пухкого і легко Диспергованість осаду. Перевагу слід віддавати розчинників, що дає з даними сорбентом справжню суспензію. Розчинник не повинен хімічно взаємодіяти з прищепленої фазою і міняти її природу. Так, прищеплена амінопропільная фаза легко вступає в реакцію з альдегідної і кетонами групами, даючи підстави Шиффа. Застосовуючи кислі або лужні агенти, слід враховувати Хибність гідролізу прищепленої фази, розчинення сілікагелевой матриці. Полібром-і поліхлорсодержащіе з'єднання можуть у присутності вологи піддаватися розкладанню або гідролізу (особливо при дії світла і тепла) з виділенням токсичних і реакційноздатних речовин. Утворюються при розкладанні полігалогенуглеводородов агресивні хімічні речовини викликають корозію високоякісної нержавіючої сталі та інших корозійно-стійких матеріалів. Особливо обережно слід застосовувати полігалогенпроізводние в комбінації зі спиртами, кетонами та іншими гігроскопічними полярними добавками. Хімічна взаємодія полігалогенуглеводородов з прищепленими сильними аніонообмінником руйнує їх.
Вибираючи розчинник для приготування суспензії, необхідно враховувати умови роботи колонки. Так, силікагель роззує стійкі суспензії у воді, особливо при додаванні до неї для стабілізації аміаку до 0,001 М розчину. Однак після упаковки силікагель буде повністю дезактивірован водою і для застосування в якості адсорбенту потрібно його тельная активація з використанням великих обсягів абсолютного метанолу або інших розчинників.
Думки про концентрацію суспензії, оптимальною для упаковки колонок розходяться: деякі автори отримують найкращі результати з дуже розведеними суспензіями (1-5%), інші - з концентрованими (10-30%). Очевидно, для кожної системи розчинник-сорбент існує діапазон концентрацій суспензії, що дає найкращу упаковку шару сорбенту.
Для диспергування сорбенту в суспензії успішно застосовують енергійне струшування або перемішування, яке не повинно призводити до подрібнення сорбенту. Для кращого диспергування застосовують ультразвукові ванни, при цьому вказують як на перевагу на дегазацію суспензії. Однак тривале використання ультразвукового випромінювача великої потужності, зануреного в суспензію для диспергування, небажано з огляду на можливе подрібнення частинок сорбенту при зіткненні і погіршення при цьому фракційного складу сорбенту.
Резервуар, в який заливають суспензію для подальшої подачі її в колонку, перш за все, повинен бути міцним. Його розраховують і спресовують при тиску, не менше ніж на 20 МПа перевищує тиск при упаковці колонки. Його виготовляють зазвичай з трубки діаметром в 2-4 рази більше, ніж у колонки, і стандартних фітингів-з'єднувачів для трубок різного діаметра з застосуванням обтиснених конусів. Знаючи кількість сорбенту в колонці і концентрацію суспензії, розраховують необхідний обсяг резервуара і відрізають трубку потрібної довжини. Доцільно мати кілька резервуарів з трубок різної довжини, але одного діаметра, до яких підходять два фітинга-з'єднувача. Переставляючи фітинги, ви завжди будете мати резервуар потрібного для даної колонки обсягу.
Широко поширені резервуари для суспензії, виточені з нержавіючої сталі. Він являє собою стакан з кришкою, до якої приварені або приєднані на конічній різьбленні фітинги для приєднання колонки і підведення розчинника. Кришка може з'єднуватися з корпусом за допомогою прокладок з інертних пластмас або м'яких металів або на конусах. Кришка з'єднується з корпусом і герметизується затягуванням болтів або ж за допомогою різьби. Такі резервуари іноді влаштовують за типом автоклавів з магнітними або механічними мішалками. Мішалку використовують для приготування суспензії в резервуарі і для підтримки її у стабільному стані в процесі упаковки колонки. Це дозволяє уникнути седиментації сорбенту з малов'язких розчинників в процесі набивання, підвищує однорідність набивання і спрощує вибір розчинника.
Важливо правильно вибрати насос для набивання колонки. Можна використовувати для набивання насоси постійної витрати або насоси постійного тиску. Однак як той, так і інший тип насоса має забезпечувати визначені мінімальні дані по витраті і тиску розчинника.
Перший і найбільш поширений питання, яке доводиться чути від початківця хроматографіста, - чи можна застосовувати для упаковки колонок і предколонок той насос, який вже є в хроматографі. На сучасних хроматографах зазвичай встановлюють насос, здатний подавати розчинник при тиску 30 - 50 МПа і витраті 5-10 мл / хв. Безумовно, за допомогою такого насоса можна упакувати сучасну високоефективну аналітичну колонку і предколонку. Однак врахуйте, що доведеться на якийсь час набивання відмовитися від аналітичної роботи; насос при набиванні буде працювати на граничних режимах по тиску; отримані колонки будуть стабільно працювати при тисках, приблизно на 10-15 МПа нижче максимально можливих для вашого насоса. Тому вирішуйте самі, набувати чи окрему систему, спеціально розраховану на роботу у форсованому режимі для набивання колонок. Така система включає насос постійної витрати, розрахований на подачу розчинника з тиском 20-150 МПа і витратою 200-300 мл / хв. Такий насос працює за принципом пневмогідравлічного посилення тиску, як джерело енергії використовується стиснене повітря під тиском 0,6 - 1,2 МПа при коефіцієнті посилення тиску від 30 до 150. Він дозволяє упаковувати колонки будь-якого типу (аналітичні, препаративні полупрепаратівние і микроколонки).
Який напрямок потоку краще при набиванні колонок - знизу нагору або зверху вниз - жваво обговорюється. Однак отримані результати не дозволяють віддати перевагу ні той, ні інший варіант. Невідомо, який розчинник краще для подачі суспензії в колонку - той же, що використаний для приготування суспензії, або інший. Найкращим слід визнати такий розчинник, який дає упаковку хорошого
якості і дозволяє швидко врівноважити колонку з робочим розчинником. Однак коли стоїть конкретне питання про вибір розчинника - тільки літературні дані або досвід можуть дати відповідь.
Вибрати тиск при набиванні колонки дуже складно. Є автори, які заявляють про чудову упаковці при тиску 3 МПа, інші наполягають на необхідності працювати при 100-200 МПа. Початківець дослідник намагається вибрати високий тиск, вважаючи, що упаковка при цьому буде більш щільною, а стовпчик - більш ефективною. Виходити треба з таких уявлень. Конусні ущільнення на сучасних аналітичних колонках досить надійно працюють (при правильній затягуванні) до тиску 40-60 МПа. Деякі силікагелі, використовувані в якості матриці, руйнуються при тиску 20-30 МПа. Органічні гелі, як правило, можуть працювати при тисках, що не перевищують 5-10 МПа. Виходячи з цього, слід прийняти для набивання колонок тиск 20-60 МПа при використанні сорбенту з сілікагелевой матрицею.
При роботі з новим видом сорбенту або з новою партією слід упакувати спочатку коротку колонку (10-12 см) при відносно невисокому тиску (20-25 МПа). При доброму результаті можна спробувати упакувати довшу (200-250 мм) колонку при високому тиску (40-60 МПа). Якщо ефективність збільшиться приблизно вдвічі одночасно зі збільшенням опору потоку в два рази, значить сорбент міцний, його можна використовувати при таких параметрах набивання. Якщо опір потоку зросте в 2,5-6 разів, це означає, що сорбент неміцний і руйнується, утворюється пил різко збільшує опір колонки, потрібно знижувати тиск при набиванні. Особливу обережність слід проявляти при виборі тиску для набивання силікагелів з широкими порами (більше 10 нм) і з великим обсягом пір, які знаходять все більш широке застосування в Ексклюзійна хроматографії полімерів і в аналізі біологічних об'єктів - білків, поліпептидів і ін
При упаковці колонки можна вважати оптимальним обсяг поданого розчинника, в 4-6 разів перевищує об'єм резервуару для суспензії.
Після того як потрібний об'єм розчинника поданий при упаковці колонки, слід перекрити відповідний кран. Потік розчинника зупиняється тим повільніше, чим дрібніше грануляція сорбенту, довше колонка, в'язкіший розчинник і більше об'єм резервуару для суспензії. До повної зупинки потоку з колонки, що забирає зазвичай 1-6 хв, ні в якому разі не слід від'єднувати колонку, так як шар сорбенту в колонці може бути розпушений при різкому зниженні тиску. Після зупинки потоку розчинника слід від'єднати колонку від системи набивання, обережно лезом бритви зрізати виступаючий шар сорбенту врівень з кінцем колонки, зняти надлишки сорбенту з трубки і конуса, покласти фільтр на сорбент, акуратно одягнути фітінг, загорнути і затягнути гайку спочатку від руки, а потім за допомогою двох ключів. Потім встановлюють дві заглушки, що запобігають висиханню сорбенту, після чого колонка вважається готової до зберігання або тестування.
При переході до нової системи розчинників слід пам'ятати, що вона повинна змішуватися з попередньою системою, не викликаючи при цьому поділу на дві незмішувані фази. Якщо це може відбутися (наприклад, при переході від системи метанол - вода до системи гексан-ізопропанол або від системи фосфатний буферний розчин до системи метанол - вода або ацетонітрил-вода), треба промити колонку проміжним розчинником, повністю змішується з обома системами розчинників. В іншому випадку виділилася гетерофазні (в наведених прикладах - це вода і сіль) викличе безліч проблем: нестабільність характеристик утримування; дрейф і нестабільність нульової лінії детектора; підвищення тиску на вході в колонку; спотворення форми піків; забивання капілярів і інжектора; «залипання» клапанів і т.д. Вибираючи проміжний розчинник, слід брати до уваги його в'язкість, поглинання в УФ-області та інші характеристики. Іноді доводиться вести промивку навіть двома проміжними розчинниками, щоб уникнути поділу старої і нової систем розчинників на гетерогенні фази.
Розглянемо використання при набиванні предколонкі, яку встановлюють між резервуаром для суспензії і набиваємо колонкою. Деякі дослідники вважають, що така предколонка грає важливу роль в підвищенні якості одержуваної колонки, оскільки вона служить продовженням колонки і, маючи той же самий діаметр і з'єднання з колонкою «впритул», дозволяє уникнути порушення однорідності шару набивання на початку колонки, забирає надлишок сорбенту , запобігає (частково) можливість випадання сорбенту з кування назад у резервуар і утримує всі домішки, що потрапляють з розчинника при його прокачування. Нам не вдалося відзначити помітної різниці в якості колонок, заповнених з такою предколонкой і без неї, а проте в деяких випадках застосування такої предколонкі доцільно. Її можна використовувати як предколонку, яку заповнюють одночасно з колонкою. Якщо при тривалій роботі такої системи верхній шар сорбенту забруднюється або просідає, майже завжди можна від'єднати предколонку і, одягнувши фітінг вже на колонку, відновити її працездатність без заміни сорбенту.
Зазначимо три однаково ефективних методу набивання колонок силікагелем.
I Вибійку проводять при направленні потоку «знизу вгору», використовуючи малов'язкі розчинники.
1. Зважити в конічній колбі місткістю 50 мл 2,6 - 3,0 г (для колонки розміром 4,6 мм Х25 см) силікагелю грануляція 5, 7 або 10 мкм, додати 20 мл метанолу і закрити кришкою.
2. Ретельно промити і висушити колонку, резервуар для суспензії і всі фітинги, позначити фітинги і кінці колонки «до детектора» і «до інжектора».
3. Приєднати до колонки фітінг «до детектора», з'єднати його тефлоновим капіляром з мірним циліндром вместімост'ю 100 мл.
4. Зібрати резервуар, приєднати його знизу до насоса капіляром і закріпити в лещатах за верхній фітінг.
5. Ретельно перемішати силікагель і метанол, струшуючи І обробляючи в ультразвуковій ванні колбу 3-4 хв.
6. Перевірити, чи всі ключі, колонка і лійка для заливання суспензії знаходяться в зручному положенні і на місці.
7. Вимкнути ультразвукову ванну, ретельно перемішати суспензію і через лійку залити її в резервуар.
8. Негайно приєднати колонку до верху резервуара, затягнути гайку ключем і подати метанол при тиску 20-50 МПа. Якщо течі немає, продовжувати подачу розчинника до тих пір, поки у мірному циліндрі не збереться 80 мл метанолу.
9. Вимкнути насос, почекати 1-4 хв до повної зупинки потоку, від'єднати верхній тефлоновий капіляр.
10.Отвернуть нижню гайку колонки, обережно від'єднати колонку від резервуара, зняти надлишки силікагелю з торця колонки бритвою (якщо при роз'ємі утворився «кратер» на торці колонки-заповнити його шпателем з шару ущільненого силікагелю з верху резервуара і зрізати бритвою).
11.Установіть фітінг «до інжектора».
12.Поставіть заглушки на фітинги колонки, встановити табличку з вказівкою напряму потоку сорбенту, номера колонки, дати заповнення і т.п.
У такому вигляді колонку зберігають до тестування або роботи з обраним розчинником.
II Вибійку проводять при направленні потоку «зверху вниз», використовуючи розчинники підвищеної в'язкості.
1. Зважити в конічній колбі місткістю 100 мл 4 - 4,2 г силікагелю, додати 50 мл 20%-ного розчину гліцерину в метанолі.
2. До колонці приєднати фітінг «до детектора», встановити заглушку, приєднати до резервуару колонку і предколонку і закріпити в лещатах для подачі розчинника «зверху вниз».
3. Заповнити колонку розчином гліцерину в метанолі.
4. Приготувати суспензію, ретельно перемішавши силікагель і розчинник і помістивши колбу на 5 хв в ультразвукову ванну.
5. Залити суспензію в резервуар, долити до верху розчином гліцерину в метанолі, щоб не залишалося повітря, загорнути фітінг резервуара і приєднати до нього капіляр від насоса.
6. Зняти заглушку з колонки і одразу подати воду насосом під тиском 70 МПа.
7. Через 4-5 хв (для сорбенту з частинками 10 мкм) вся суспензія буде продавлена через колонку. Подачу води припинити, дати тиску впасти до атмосферного і від'єднати колонку з предколонкой.
8. Від'єднати предколонку, вирівняти сорбент на торці колонки шпателем і приєднати фітінг «до інжектора».
9. Пропустити через колонку 200 мл абсолютного метанолу для видалення води та гліцерину.
10. Поставити заглушки на колонку і встановити табличку з даними колонки. III Вибійку проводять при направленні потоку «зверху вниз», використовуючи
розчинник збалансованої щільності.
1. Зважити в конічній колбі місткістю 100 мл 4 - 4,2 г силікагелю, додати 50 мл розчинника (60% мас. Тетраброметана і 40% мас. Тетрахлоретилену).
2. До колонці приєднати фітінг «до детектора», встановити заглушку, приєднати предколонку, заповнити колонку і предколонку тим же розчинником, приєднати до резервуару і закріпити в лещатах для подачі розчинника «зверху вниз».
3. Приготувати суспензію, ретельно перемішавши силікагель і розчинник і помістивши колбу на 5 хв в ультразвукову ванну.
4. Залити суспензію в резервуар, обережно долити до верху гептаном, не залишаючи повітря.
5. Загорнути фітінг резервуара, приєднати капіляр від насоса, зняти заглушку колонки і негайно подати гептан насосом під тиском 50 МПа.
6. Припинити подачу розчинника і дати тиску впасти до нуля як тільки вся суспензія буде продавлена через колонку і з'явиться гептан.
7. Від'єднати колонку з предколонкой, від'єднати предколонку, вирівняти шар силікагелю на торці колонки і приєднати фітінг «до інжектора».
8. Пропустити через колонку 200 мл абсолютного метанолу.
9. Поставити на колонку заглушки і табличку з її даними.
Усі три методи дають можливість отримати колонки з силікагелем, заповнені однорідний і забезпечують високу ефективність розділення. З сорбентом грануляція 10 мкм вдається отримати колонки довжиною 25 см, що мають ефективність зазвичай від 4 до 8 тис. т. т., що мають наведену висоту теоретичної тарілки від 3 до 6. При використанні наявних у продажу не дуже вузько сепарованих сорбентів це є гарним результатом. Якщо використовувати дуже вузькі фракції силікагелю і добре їх знепилити седиментацією, вдається отримати колонки з ефективністю до 12 тис. т. т., що мають наведену висоту теоретичної тарілки, що наближається до 2.
Значно складніше набивання колонок сорбентами з хімічно щепленими фазами. Вибір методики заповнення колонок такими сорбентами засновують на використанні даних по набиванню фірми-виробника або застосовують оригінальні методики, описані в літературі.
Останні є найбільш надійними, але часто не містять подробиць, і тому дають незадовільні результати при спробі їх відтворити. Так як хімія поверхні сорбентів з прищепленими фазами, особливо обернено-фазних, складна, можна обговорювати метод упаковки тільки конкретного сорбенту. Спроба застосувати описаний в літературі профіль або дослідником метод упаковки іншого сорбенту «з тієї ж хімічно прищепленої фазою на тій же матриці» (наприклад, октадецілхлорсілан, щеплений до силікагель), як правило, призводить до невдачі і лише як виняток - дає хороший результат.
Досвід автора підтверджує, що навіть для нових партій одного сорбенту тієї ж фірми може знадобитися серйозне коригування методики заповнення колонок, так як хімія їх поверхні розрізняється в деталях від партії до партії. Треба також враховувати той факт, що фірми, що виробляють та колонки, і сорбенти, не зацікавлені в розголошуванні секретів упаковки своїх сорбентів. Слід з обережністю ставитися до «чудодійним» рідин для приготування суспензій обернено-фазних та деяких інших сорбентів, склади яких не розкриваються фірмами-виробниками. Твердження про «універсальності» цих рідин для будь-якого обернено-фазного сорбенту та про отримання «гарантовано високоефективних» колонок є не більше, ніж рекламою. Вона нерідко вельми далека від реальних результатів, які вдається отримати, а відтворити їх складу у разі успіху (особливо якщо мова йде про повний склад) досить важко.
1.3 ЗАПОВНЕННЯ КОЛОНОК «сухим» МЕТОДОМ
Заповнення колонок «сухим» способом можливо тільки старими поверхнево-пористими (пеллікулярнимі) сорбентами, що мають розмір часток 35-60 мкм, а також пористими сорбентами на основі силікагелю з розміром частинок 25-40 мкм і більше. Колонки, заповнені сорбентами першого типу, мають невисоку ефективність у порівнянні з колонками, заповненими сучасними сорбентами з розміром частинок 5-10 мкм, і мають малу ємність по пробі. Колонки з сорбентами другого типу також мають невисоку ефективність, але допускають значно більше навантаження пробою і застосовуються для препаративної роботи. Через дії поверхневих сил не вдається ефективно упакувати колонку сухим способом мікрочастинками розміром 3-20 мкм.
Заповнення колонок сухим способом проводять таким чином.
1. Колонку ретельно промити розчинниками і висушити, приєднати кінцевий фітінг «до детектора».
2. До вільного кінця колонки приєднувати (на різьбі або за допомогою гумової трубки) невелику воронку.
3. Засипати сорбент в колонку через лійку невеликими порціями, достатніми для заповнення колонки на 2-4 мм по висоті; колонку при цьому тримати вертикально.
4. Ущільнити сорбент, обережно постукуючи колонкою по дерев'яній поверхні, повільно обертаючи її і постукуючи дерев'яною паличкою по стінці колонки приблизно на рівні шару сорбенту. Постукувати колонкою кілька разів по дерев'яній поверхні без постукування по стінці.
5. Додати наступну порцію і повторювати всі операції, поки колонка не заповниться доверху.
6. Кілька хвилин обережно постукувати заповненої колонкою по дерев'яній поверхні, не постукуючи по стінці.
7. Від'єднати воронку, вирівняти шар сорбенту та встановити фітінг «до інжектора».
Деякі автори рекомендують використовувати механічну вібрацію в комбінації з ручним обертанням і постукуванням по стінці колонки, інші - комбінувати механічну вібрацію і обертання на спеціальному стенді.
1.4 ТЕСТУВАННЯ І ОЦІНКА якість приготування КОЛОНОК
Приготовлені колонки тестують на модельній суміші речовин і стандартних розчинниках з метою оцінки їх якості.
Для тестування колонок c силікагелем, щепленими фазами «нітрил» і «діол» рекомендується розчинник гексан - ізопропанол (100:2 за обсягом), проба-по 0,5% (мас.) о-крезолу і фенолу в розчиннику.
Для тестування колонок з обернено-фазними сорбентами (С2, C8 і C18) рекомендується розчинник метанол-вода або ацетонітрил-вода (70:30 за обсягом), проба - по 0,5% (мас.) толуолу і n-ксилолу в метанолі (ацетонітрилі). Якщо компоненти проби виходять занадто швидко (для обернено-фазних сорбентів з малим вмістом прищепленої фази), розчинник слід замінити на новий із співвідношенням компонентів 50:50.
Нова колонка, як правило, містить розчинник набивання, що відрізняється від розчинника тестування за складом. Тому нову колонку встановлюють на хроматограф і подають розчинник тестування зі швидкістю 1 мл / хв для колонок діаметром 4,6 мм (стандартних, аналітичних). Час, протягом якого встановлюється рівновага колонки з новим розчинником, визначається за стабільності нульової лінії детектора і параметрів утримування тест-речовин і зазвичай коливається від 1 до 2 ч. Після встановлення рівноваги вводять кілька разів тест-суміш і отримують тест-хроматограми.
Розгляд тест-хроматограм починають з форми отриманих піків. Піки повинні бути достатньо симетричними, не мати «носів» і «хвостів» - це найбільш частий дефект. Неприпустимо двоїння піків - свідчення наявності каналів або порожнеч в колонці. Коефіцієнт асиметрії піків на 1 / 10 їх висоти повинен наближатися до 1, і для колонок хорошої якості повинен становити 0,8-1,3. Далі перевіряють час утримування тест-речовин на хроматограмі: сталість цієї величини свідчить про встановлення рівноваги у колонці і можливості розрахунку ефективності колонки. Розрахунок ефективності колонки - числа теоретичних тарілок і наведеної висоти еквівалентної теоретичної тарілки - проводять за відомим формулами (див. розд. 1.1). Для наявних у продажу сорбентів середньої якості при добре підібраною методикою набивання колонок вдається отримати значення ПВЕТТ від 3 до 6, що відповідає ЧТТ для стандартної колонки довжиною 25 см від 4 до 8 тис. (сорбент розміром 10 мкм), від 5,5 до 11 тис. (7,5 мкм) і від 8 до 16 тис. (5 мкм).
Починаючому хроматографісту не слід засмучуватися, якщо параметри колонки, особливо ефективність і симетрія, виходять значно гірше. Це майже неминуче до тих пір, поки не буде отриманий досвід роботи.
1.5 ЗБЕРІГАННЯ, РЕГЕНЕРАЦІЯ ТА РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЕРХ
Колонки для високоефективної рідинної хроматографії є тонким інструментом, серцем хроматографа і вимагають дбайливого звернення. Помилка оператора, передусім, позначається на колонці, вона може повністю або частково втратити свої якості в результаті перевищення тиску, введення нефільтрованого розчинника або проби, необережного удару, занадто сильною затягування різьблення тощо Тому правильному зберіганню колонок, їх регенерації і ремонту необхідно приділяти увагу.
Почнемо зі зберігання колонок. Фірми, що виробляють тестовані і не тестовані, а також порожні колонки для ВЕРХ поставляють їх у спеціальних коробках, які мають м'який пінополіуретановий вкладиш з гніздом для колонки або такі ж прокладки. Іноді колонку додатково поміщають в трубку із пластику й фіксують на кінцях власниками. Кінці колонки герметично закривають заглушками різного типу, що запобігають висиханню сорбенту. На самій колонці є специфікація, у якій дано каталожний і порядковий номер колонки, її розміри, сорбент і його грануляція, напрямок потоку розчинника та інші дані. Якщо колонка тестована, то в коробці лежить тест-хроматограмма з умовами випробування колонки і його результатами, якщо не тестована, то, як правило, інструкція з тестування.
Зберігати колонку бажано в коробці, в якій вона одержана; в ній же слід зберігати всю відповідну інформацію. Бажано перенумерувати всі шпальти та на кожну завести паспорт, в якому слід відзначати всі види аналізів і розчинників, приблизну тривалість роботи, тиск при роботі та інші відомості. Зберігати всі коробки з колонками бажано в одному місці, надійно захищеному від ударів, вібрації, нагріву.
Перед початком експлуатації нової колонки слід, передусім, зняти і покласти в коробку заглушки, так як вони для різних колонок різні, і якщо будуть переплутані - порушиться герметичність при подальшому використанні. Коробка повинна мати ту ж маркування, що і сама колонка. Завжди бажано провести ретестірованіе колонки в тих же умовах, в яких її тестували. Це дозволяє встановити, чи не втратила чи колонка ефективність при транспортуванні, перевірити ефективність вашої хроматографічної системи в цілому (в порівнянні з системою, використаної фірмою-виробником) і отримати свою тест-хроматограму для нової колонки, яка служить еталоном при наступних перевірках в процесі експлуатації колонки .
Якщо ви переходите на нову систему розчинників, уточніть, яким розчинником заповнена колонка - це зазвичай вказує фірма-виготовлювач або зазначено в паспорті колонки. Пам'ятайте про можливість утворення гетерофазної системи при зміні розчинника, завжди використовуйте в сумнівних випадках проміжні, повністю змішуються розчинники, наприклад ізопропанол.
Після роботи колонку слід підготувати до зберігання: її промивають і заповнюють розчинником для зберігання (для обернено-фазних сорбентів - метанолом, для силікагелю - гексаном або гептаном, для іонообмінників - метанолом, для інших колонок - за рекомендацією фірми-виробника). Промиту колонку герметично закривають заглушками і поміщають в коробку для зберігання, зробивши запис у паспорті про проведену роботу та розчиннику для зберігання. Дуже дбайливо слід поводитися з таблицями, прикріпленими до колонки і містять всі дані про неї. Якщо таблиця відклеюється або з яких-небудь причин псується (змивається розчинником напис), необхідно відразу ж виготовити і встановити на колонку дублікат. Якщо таблицю знімають (наприклад, при установці в термостат), її надійно зберігають, а потім знову встановлюють на колонку. Пам'ятайте, що колонка без таблиці і паспорта (особливо пролежала якийсь час) практично марна, бо встановити її сорбент неможливо або вимагає великої праці. Особливо слід застерегти від поспіху при зміні колонок, коли, не прибравши одну колонку, дістають іншу для установки, кладуть поруч, чимось відволікаються і ... не можуть пригадати, яку колонку потрібно поставити, а яку колонку прибрати.
Питання про те, чи потрібно при зберіганні герметично закривати кінці колонок, деякими фірмами вирішується позитивно, а іншими-негативно. Перші вказують, що при висиханні сорбенту в колонці утворюються канали, порушується рівномірність шару; це веде до погіршення ефективності, двоїння піків, погіршення симетрії піків. Другі, навпаки, стверджують повну ідентичність колонок до і після висихання сорбенту в разі повторного тестування. Враховуючи, що деякі сорбенти, наприклад, полімерні при висиханні зменшуються в об'ємі і при цьому рівномірність шару в колонці порушується (особливо якщо така колонка в процесі транспортування піддається трясці і вібрацій), доцільно герметично закривати кінці колонок. Перейдемо тепер до регенерації колонок, під якою розуміють відновлення розділових і експлуатаційних характеристик колонки, втрачених у процесі експлуатації. Втрата початкових характеристик колонки проявляється в помітному збільшенні робочого тиску при тому ж потоці, у погіршенні поділу піків за рахунок втрати ефективності, появі хвостів піків, зміну порядку виходу компонентів, в різкому зменшенні або збільшенні часу утримування компонентів і т.д. Як правило, колонка втрачає свої властивості в процесі експлуатації в силу наступних причин. По-перше, це порушення допустимих параметрів роботи колонки по потоку і тиску розчинника, що виникає через помилки оператора (неправильна завдання витрати, використання високов'язких розчинників і т. п.). При цьому, якщо тиск перевищить значення, що використовувалося при набиванні колонки, сорбент неминуче ущільниться, просяде, на початку колонки з'явиться порожнеча (мертвий об'єм), піки будуть розмиватися і ефективність колонки буде втрачена. По-друге, це помилки оператора, пов'язані з вибором розчинника, тобто використання розчинника з рН нижче 3 або вище 8. У цьому випадку відбувається прискорене руйнування, особливо при підвищених температурах, сілікагелевой матриці з розчиненням силікагелю, зменшенням його механічної міцності, хімічним відщепленням прищепленої фази. Зміна природи сорбенту, природно, змінює параметри утримування речовин і приводить до порушення хроматографічного процесу, а також до просідання сорбенту на початку колонки через погіршення його міцності. По-третє, це забруднення вхідного фільтра колонки частками, що потрапляють у потік внаслідок застосування нефільтрованим розчинників, що містять суспензії проб, а також з'являються за рахунок зносу ущільнень поршнів, клапанів, інжектора. Це призводить до зменшення числа пор фільтра, зростанню його гідравлічного опору і зростанням тиску на колонці. Необхідно фільтрувати розчинники і проби і встановлювати додаткові фільтри в лінії для уловлювання частинок, що утворюються в процесі роботи поршнів, клапанів, інжектора. По-четверте, це хімічне забруднення колонки. Його уникнути повністю не вдається, тому що навіть високочисті розчинники для ВЕРХ, не кажучи про технічні видах, містять деяку кількість домішок, продуктів фотохімічної я окисної деструкції розчинників, їх стабілізаторів, домішок, тари та ін Проби також містять домішки, склад яких часто встановлений не повністю. Ці домішки, якщо вони не елюіруются за умов аналізу, поступово накопичуються на сорбенті на початку колонки і, граючи роль нанесеною активної фази, починають вибірково утримувати деякі компоненти проби аж до їх незворотною сорбції. Якщо ці домішки елюіруются з великим часом утримування, вони призводять до нестабільності положення нульової лінії у вигляді дрейфу в ту або іншу сторону, широких «горбів» у найнесподіваніші моменти і т.д. До такого ж «хімічному» забруднення, що зраджує параметри утримування, призводить використання силікагелю, а в якості рухомої фази - вологого гексану або гептан, поступово «забруднюючих» безводний силікагель водою. Регенерацію вийшла з ладу колонки (на відміну від ремонту колонки) проводять без зняття кінцевих фітингів. Вибирають комплекс розчинників і хімікатів, який дозволяє видалити небажані забруднення з сорбенту і фільтрів хімічним або фізико-хімічним впливом. Регенерація успішна тільки в тому випадку, якщо в процесі експлуатації колонки не сталося фізичної або хімічної деградації шару сорбенту, тобто утворення каналів, пустот або відщеплення прищепленої фази. Перше питання, яке виникає при регенерації, - це можна для прискорення і поліпшення процесу змінити напрям потоку через колонку, щоб забруднення з сорбенту і фільтра на вході відразу віддалялися, не проходячи через весь шар сорбенту. Питання не просте, тому що деякі досвідчені фахівці вважають це можливим, а інші рішуче заперечують, вказуючи на можливість порушення щільності упаковки, утворення каналів і т.д. Фірми-виробники також не одностайні: деякі вважають зміну напрямку потоку через колонку небезпечним; інші, навпаки, рекламують свої колонки як здатні працювати при будь-якому-напрямку потоку, треті навіть не вказують для своїх колонок напрямку потоку, вважаючи, що це байдуже.
Шар сорбенту в колонці, на нашу думку, не остаточно сформований і однорідний після упаковки колонки. Якщо після упаковки і зняття тиску верхній шар сорбенту в колонці вирівнюється і закривається фітінгом при атмосферному тиску, то нижній шар (з боку детектора) продовжує залишатися під тиском через тертя шару сорбенту об стінки колонки; якщо зняти нижній фітінг, цей тиск видавлює сорбент з колонки (навіть жорсткий на основі силікагелю, не кажучи вже про напівжорстких на полімерній основі) досить помітно, у разі силікагелю на 1-1,5 мм. Тому зміна напрямку потоку при регенерації колонки недоцільно »особливо при підвищених швидкостях потоку і високому тиску. Якщо це все ж здійснюється, слід зменшити витрату розчинника і знизити тиск так, щоб вони не перевищували 1 / 2 або 1 / 3 від значень робочих параметрів.
Якими розчинниками і в якій послідовності вести регенерацію колонок-це залежить від типу сорбенту і від передбачуваних забруднень, які слід видалити. Є багато рекомендацій, які розчинники, в якій послідовності і для яких сорбентів використовувати, проте ніхто краще хроматографіста не знає, які забруднення він «посадив» на колонку і який розчинник придатний для їх видалення. Якщо забрудненнями є солі, то для їх видалення найкраще вода, якщо полімери - хлороформ або тетрагідрофуран, якщо вода - безводні спирти, хлорвуглеводнів і т.д. Для трудноудаляємиє забруднень, особливо біологічних, використовують диметилформамід, диметилсульфоксид, сильні буферні розчини. Не слід забувати про принцип повної смешиваемости подальшого і даного розчинників, інакше можливе утворення гетерофазних систем. Для регенерації сілікагелевих колонок рекомендується використовувати наступний ряд розчинників: тетрагідрофуран, метанол, тетрагідрофуран, метиленхлорид, гексан. Ряд для обернено-фазних колонок і нітрильних фаз: вода, діметілсуль-фоксід, метанол, хлороформ, метанол. Ряд для амінофаз і сильних аніонообмінником: вода, метанол, хлороформ, метанол, вода (якщо амінофазу використовують у водних системах розчинників). Ряд для амінофаз (неполярні розчинники): хлороформ, метанол, вода, метанол, хлороформ. Ряд для сильних катіонітів; вода, тетрагідрофуран, вода. Ряд для органічних гелів - кополімерів стиролу і дівінілбензола (Ексклюзійна хроматографія): толуол, тетрагідрофуран, 1%-ний розчин меркаптоуксусной кислоти в толуолі або тетрагідрофурані, тетрагідрофуран, толуол. Наведені рекомендації можуть доповнюватися і змінюватися відповідно до досвіду, накопичуються в процесі роботи. Якщо в результаті регенерації не вдалося відновити працездатність колонки, слід спробувати провести її ремонт. Ремонт колонки починають з того, що з неї знімають вхідні заглушку, обережно, двома ключами послаблюють затягування вхідного фітинга і знімають його. Якщо фітінг має впрессованной фільтр, а колонка мала високий тиск при роботі, вірогідним є закупорювання фільтра твердими частинками. Такий фітінг приєднують до насосної системі, що створює високий тиск і витрата розчинника, і прокачують через нього розчинник у напрямку, протилежному робочому, і при максимально можливому витраті і тиску для видалення частинок-забруднювачів. Потім фітінг поміщають в ультразвукову баню з гарячим розчином ПАР і обробляють 5 - 10 хв, після чого промивають розчинником і знову прокачують розчинник при високому витраті і тиску. Як правило, таким шляхом вдається видалити більшу частину забруднень з фільтру і відновити працездатність фітинга. Якщо фільтр не запресований, його чистять механічно, обережно зчищаючи частки з поверхні жорсткої щіткою, потім обробляють з ПАР в ультразвуковій бані і знову механічно чистять. Найкращим рішенням є заміна фільтра новим, проте слід дотримуватися обережності і використовувати новий фільтр такої ж товщини і конструкції. Якщо товщина нового фільтру менше, утворюється порожнеча спочатку колонки, і піки будуть розмиватися. Підготувавши фільтр і фітінг, їх і кінець колонки очищають від забруднень (часток сорбенту, іржі та ін) механічно і розчинниками і сушать. На час робіт з фітінгом кінець колонки, щоб він не висихав і з нього не випадав сорбент, закривають пластмасовим ковпачком, а колонку затискають за нижній фітінг в лещата відкритим кінцем вгору. Далі переходять до огляду верхнього шару сорбенту: у процесі роботи може відбутися його просідання, чим воно більше, тим важче відремонтувати колонку і менше шансів на успіх ремонту. Якщо просідання невелике, то найпростіший спосіб ремонту - заповнення порожнечі скляними мікрошарікамі розміром 40 мкм, що засипаються всуху, або ж пеллікулярним сорбентом з такою ж за типом прищепленої фазою. При цьому мертвий обсяг практично зникає і дозвіл колонки відновлюється. Якщо просідання велике, можна або спробувати заповнити порожнечу скляними кульками або пеллікулярним сорбентом, або спробувати дозаполніть колонку суспензійним методом. В останньому випадку готують суспензію сорбенту у відповідному розчиннику і, наливаючи її в порожнечу, дають сорбенту осісти, потім видаляють розчинник і повторюють операцію до тих пір, поки рівень сорбенту не зрівняється з верхнім краєм колонки. Тоді надягають верхній фітінг з фільтром, приєднують колонку до хроматограф і прокачують розчинник, поступово збільшуючи його витрата і тиск до максимально можливих, витримуючи при цих-значеннях і потім плавно зменшуючи до нуля. Давши потоку зупинитися, знімають верхній фітінг і оглядають верх шару сорбенту. Як правило, шар сорбенту кілька просідає, але порожнеча вже значно менше. Суспензійний заповнення повторюють до тих пір, поки не буде отримано стабільний шар сорбенту. Після цього колонку тестують і визначають, відновлені чи її властивості.
Іноді, оглядаючи верхній шар сорбенту, виявляють, що він забруднений механічними або хімічними домішками, змінився колір сорбенту, з'явилися канали. У цьому випадку невеликим шпателем обережно видаляють верхній шар сорбенту до того рівня, де (візуально) сорбент не зазнав змін; утворюється порожнечу заповнюють одним із зазначених методів. Колонки також ремонтують, якщо сталася поломка механічна: заїдання і псування різьби на колонці, відламуванням капіляра з конусом, порушення форми конуса, відламуванням частини фітинга та ін Відламані заклинений капіляр з конусом іноді вдається вибити вузьким пробійником, попередньо знявши фітінг з колонки, якщо канал досить широкий. Якщо потрібно поставити новий кінцевий фітінг, слід взяти новий фітінг того ж типу й тієї ж фірми. При цьому слід виміряти глибиноміром, однакова чи їх глибина, і у разі різниці компенсувати її товщиною фільтра. Після обережного обтиснення нового фільтру та фасонної колонку приєднують до хроматограф, і, включивши потік розчинника, перевіряють герметичність. Якщо ремонт не дає очікуваного відновлення розділових характеристик та ефективності колонки, її залишають для проведення менш кваліфікованої роботи (приблизний аналіз невідомих зразків, аналіз забруднених проб, мікропрепаратівная робота тощо) або заповнюють новим сорбентом суспензійним методом, попередньо видаливши відпрацьований старий сорбент.
Література
1. Drott EE / / in Chromatographic Science Series, v. 8, Liquid Chromatography of Polymers and Related Materials, ed. J. Gazes. NY, M. Dekker, 1977, p. 41.
2. Krishen A., Tucker RG / Anal. Chem., 1977, v. 49, No. 4, p. 898.
3. Mori S., Yamakctwa A. / J. Liquid Chromatogr., 1980, v. 3, No. 3, p. 329 - 342.
4. Verzele M., Geeraert E. / J. Chromatogr. Sci, 1980, v. 18, No. 10, p. 559 - 570.
5. Nettleton DE / J. Liquid Chromatogr, 1981, suppl. No. 2, p. 359-398.
6. Rable FM / International Lab, 1980, v. 10, No. 8, p. 91-98.
7. Small Bore Liquid Chromatography Columns / / ed. RPW Scott. NY, J. Wiley, 1984. 294 p.
8. Пропустити через колонку 200 мл абсолютного метанолу.
9. Поставити на колонку заглушки і табличку з її даними.
Усі три методи дають можливість отримати колонки з силікагелем, заповнені однорідний і забезпечують високу ефективність розділення. З сорбентом грануляція 10 мкм вдається отримати колонки довжиною 25 см, що мають ефективність зазвичай від 4 до 8 тис. т. т., що мають наведену висоту теоретичної тарілки від 3 до 6. При використанні наявних у продажу не дуже вузько сепарованих сорбентів це є гарним результатом. Якщо використовувати дуже вузькі фракції силікагелю і добре їх знепилити седиментацією, вдається отримати колонки з ефективністю до 12 тис. т. т., що мають наведену висоту теоретичної тарілки, що наближається до 2.
Значно складніше набивання колонок сорбентами з хімічно щепленими фазами. Вибір методики заповнення колонок такими сорбентами засновують на використанні даних по набиванню фірми-виробника або застосовують оригінальні методики, описані в літературі.
Останні є найбільш надійними, але часто не містять подробиць, і тому дають незадовільні результати при спробі їх відтворити. Так як хімія поверхні сорбентів з прищепленими фазами, особливо обернено-фазних, складна, можна обговорювати метод упаковки тільки конкретного сорбенту. Спроба застосувати описаний в літературі профіль або дослідником метод упаковки іншого сорбенту «з тієї ж хімічно прищепленої фазою на тій же матриці» (наприклад, октадецілхлорсілан, щеплений до силікагель), як правило, призводить до невдачі і лише як виняток - дає хороший результат.
Досвід автора підтверджує, що навіть для нових партій одного сорбенту тієї ж фірми може знадобитися серйозне коригування методики заповнення колонок, так як хімія їх поверхні розрізняється в деталях від партії до партії. Треба також враховувати той факт, що фірми, що виробляють та колонки, і сорбенти, не зацікавлені в розголошуванні секретів упаковки своїх сорбентів. Слід з обережністю ставитися до «чудодійним» рідин для приготування суспензій обернено-фазних та деяких інших сорбентів, склади яких не розкриваються фірмами-виробниками. Твердження про «універсальності» цих рідин для будь-якого обернено-фазного сорбенту та про отримання «гарантовано високоефективних» колонок є не більше, ніж рекламою. Вона нерідко вельми далека від реальних результатів, які вдається отримати, а відтворити їх складу у разі успіху (особливо якщо мова йде про повний склад) досить важко.
1.3 ЗАПОВНЕННЯ КОЛОНОК «сухим» МЕТОДОМ
Заповнення колонок «сухим» способом можливо тільки старими поверхнево-пористими (пеллікулярнимі) сорбентами, що мають розмір часток 35-60 мкм, а також пористими сорбентами на основі силікагелю з розміром частинок 25-40 мкм і більше. Колонки, заповнені сорбентами першого типу, мають невисоку ефективність у порівнянні з колонками, заповненими сучасними сорбентами з розміром частинок 5-10 мкм, і мають малу ємність по пробі. Колонки з сорбентами другого типу також мають невисоку ефективність, але допускають значно більше навантаження пробою і застосовуються для препаративної роботи. Через дії поверхневих сил не вдається ефективно упакувати колонку сухим способом мікрочастинками розміром 3-20 мкм.
Заповнення колонок сухим способом проводять таким чином.
1. Колонку ретельно промити розчинниками і висушити, приєднати кінцевий фітінг «до детектора».
2. До вільного кінця колонки приєднувати (на різьбі або за допомогою гумової трубки) невелику воронку.
3. Засипати сорбент в колонку через лійку невеликими порціями, достатніми для заповнення колонки на 2-4 мм по висоті; колонку при цьому тримати вертикально.
4. Ущільнити сорбент, обережно постукуючи колонкою по дерев'яній поверхні, повільно обертаючи її і постукуючи дерев'яною паличкою по стінці колонки приблизно на рівні шару сорбенту. Постукувати колонкою кілька разів по дерев'яній поверхні без постукування по стінці.
5. Додати наступну порцію і повторювати всі операції, поки колонка не заповниться доверху.
6. Кілька хвилин обережно постукувати заповненої колонкою по дерев'яній поверхні, не постукуючи по стінці.
7. Від'єднати воронку, вирівняти шар сорбенту та встановити фітінг «до інжектора».
Деякі автори рекомендують використовувати механічну вібрацію в комбінації з ручним обертанням і постукуванням по стінці колонки, інші - комбінувати механічну вібрацію і обертання на спеціальному стенді.
1.4 ТЕСТУВАННЯ І ОЦІНКА якість приготування КОЛОНОК
Приготовлені колонки тестують на модельній суміші речовин і стандартних розчинниках з метою оцінки їх якості.
Для тестування колонок c силікагелем, щепленими фазами «нітрил» і «діол» рекомендується розчинник гексан - ізопропанол (100:2 за обсягом), проба-по 0,5% (мас.) о-крезолу і фенолу в розчиннику.
Для тестування колонок з обернено-фазними сорбентами (С2, C8 і C18) рекомендується розчинник метанол-вода або ацетонітрил-вода (70:30 за обсягом), проба - по 0,5% (мас.) толуолу і n-ксилолу в метанолі (ацетонітрилі). Якщо компоненти проби виходять занадто швидко (для обернено-фазних сорбентів з малим вмістом прищепленої фази), розчинник слід замінити на новий із співвідношенням компонентів 50:50.
Нова колонка, як правило, містить розчинник набивання, що відрізняється від розчинника тестування за складом. Тому нову колонку встановлюють на хроматограф і подають розчинник тестування зі швидкістю 1 мл / хв для колонок діаметром 4,6 мм (стандартних, аналітичних). Час, протягом якого встановлюється рівновага колонки з новим розчинником, визначається за стабільності нульової лінії детектора і параметрів утримування тест-речовин і зазвичай коливається від 1 до 2 ч. Після встановлення рівноваги вводять кілька разів тест-суміш і отримують тест-хроматограми.
Розгляд тест-хроматограм починають з форми отриманих піків. Піки повинні бути достатньо симетричними, не мати «носів» і «хвостів» - це найбільш частий дефект. Неприпустимо двоїння піків - свідчення наявності каналів або порожнеч в колонці. Коефіцієнт асиметрії піків на 1 / 10 їх висоти повинен наближатися до 1, і для колонок хорошої якості повинен становити 0,8-1,3. Далі перевіряють час утримування тест-речовин на хроматограмі: сталість цієї величини свідчить про встановлення рівноваги у колонці і можливості розрахунку ефективності колонки. Розрахунок ефективності колонки - числа теоретичних тарілок і наведеної висоти еквівалентної теоретичної тарілки - проводять за відомим формулами (див. розд. 1.1). Для наявних у продажу сорбентів середньої якості при добре підібраною методикою набивання колонок вдається отримати значення ПВЕТТ від 3 до 6, що відповідає ЧТТ для стандартної колонки довжиною 25 см від 4 до 8 тис. (сорбент розміром 10 мкм), від 5,5 до 11 тис. (7,5 мкм) і від 8 до 16 тис. (5 мкм).
Починаючому хроматографісту не слід засмучуватися, якщо параметри колонки, особливо ефективність і симетрія, виходять значно гірше. Це майже неминуче до тих пір, поки не буде отриманий досвід роботи.
1.5 ЗБЕРІГАННЯ, РЕГЕНЕРАЦІЯ ТА РЕМОНТ КОЛОНОК ДЛЯ ВЕРХ
Колонки для високоефективної рідинної хроматографії є тонким інструментом, серцем хроматографа і вимагають дбайливого звернення. Помилка оператора, передусім, позначається на колонці, вона може повністю або частково втратити свої якості в результаті перевищення тиску, введення нефільтрованого розчинника або проби, необережного удару, занадто сильною затягування різьблення тощо Тому правильному зберіганню колонок, їх регенерації і ремонту необхідно приділяти увагу.
Почнемо зі зберігання колонок. Фірми, що виробляють тестовані і не тестовані, а також порожні колонки для ВЕРХ поставляють їх у спеціальних коробках, які мають м'який пінополіуретановий вкладиш з гніздом для колонки або такі ж прокладки. Іноді колонку додатково поміщають в трубку із пластику й фіксують на кінцях власниками. Кінці колонки герметично закривають заглушками різного типу, що запобігають висиханню сорбенту. На самій колонці є специфікація, у якій дано каталожний і порядковий номер колонки, її розміри, сорбент і його грануляція, напрямок потоку розчинника та інші дані. Якщо колонка тестована, то в коробці лежить тест-хроматограмма з умовами випробування колонки і його результатами, якщо не тестована, то, як правило, інструкція з тестування.
Зберігати колонку бажано в коробці, в якій вона одержана; в ній же слід зберігати всю відповідну інформацію. Бажано перенумерувати всі шпальти та на кожну завести паспорт, в якому слід відзначати всі види аналізів і розчинників, приблизну тривалість роботи, тиск при роботі та інші відомості. Зберігати всі коробки з колонками бажано в одному місці, надійно захищеному від ударів, вібрації, нагріву.
Перед початком експлуатації нової колонки слід, передусім, зняти і покласти в коробку заглушки, так як вони для різних колонок різні, і якщо будуть переплутані - порушиться герметичність при подальшому використанні. Коробка повинна мати ту ж маркування, що і сама колонка. Завжди бажано провести ретестірованіе колонки в тих же умовах, в яких її тестували. Це дозволяє встановити, чи не втратила чи колонка ефективність при транспортуванні, перевірити ефективність вашої хроматографічної системи в цілому (в порівнянні з системою, використаної фірмою-виробником) і отримати свою тест-хроматограму для нової колонки, яка служить еталоном при наступних перевірках в процесі експлуатації колонки .
Якщо ви переходите на нову систему розчинників, уточніть, яким розчинником заповнена колонка - це зазвичай вказує фірма-виготовлювач або зазначено в паспорті колонки. Пам'ятайте про можливість утворення гетерофазної системи при зміні розчинника, завжди використовуйте в сумнівних випадках проміжні, повністю змішуються розчинники, наприклад ізопропанол.
Після роботи колонку слід підготувати до зберігання: її промивають і заповнюють розчинником для зберігання (для обернено-фазних сорбентів - метанолом, для силікагелю - гексаном або гептаном, для іонообмінників - метанолом, для інших колонок - за рекомендацією фірми-виробника). Промиту колонку герметично закривають заглушками і поміщають в коробку для зберігання, зробивши запис у паспорті про проведену роботу та розчиннику для зберігання. Дуже дбайливо слід поводитися з таблицями, прикріпленими до колонки і містять всі дані про неї. Якщо таблиця відклеюється або з яких-небудь причин псується (змивається розчинником напис), необхідно відразу ж виготовити і встановити на колонку дублікат. Якщо таблицю знімають (наприклад, при установці в термостат), її надійно зберігають, а потім знову встановлюють на колонку. Пам'ятайте, що колонка без таблиці і паспорта (особливо пролежала якийсь час) практично марна, бо встановити її сорбент неможливо або вимагає великої праці. Особливо слід застерегти від поспіху при зміні колонок, коли, не прибравши одну колонку, дістають іншу для установки, кладуть поруч, чимось відволікаються і ... не можуть пригадати, яку колонку потрібно поставити, а яку колонку прибрати.
Питання про те, чи потрібно при зберіганні герметично закривати кінці колонок, деякими фірмами вирішується позитивно, а іншими-негативно. Перші вказують, що при висиханні сорбенту в колонці утворюються канали, порушується рівномірність шару; це веде до погіршення ефективності, двоїння піків, погіршення симетрії піків. Другі, навпаки, стверджують повну ідентичність колонок до і після висихання сорбенту в разі повторного тестування. Враховуючи, що деякі сорбенти, наприклад, полімерні при висиханні зменшуються в об'ємі і при цьому рівномірність шару в колонці порушується (особливо якщо така колонка в процесі транспортування піддається трясці і вібрацій), доцільно герметично закривати кінці колонок. Перейдемо тепер до регенерації колонок, під якою розуміють відновлення розділових і експлуатаційних характеристик колонки, втрачених у процесі експлуатації. Втрата початкових характеристик колонки проявляється в помітному збільшенні робочого тиску при тому ж потоці, у погіршенні поділу піків за рахунок втрати ефективності, появі хвостів піків, зміну порядку виходу компонентів, в різкому зменшенні або збільшенні часу утримування компонентів і т.д. Як правило, колонка втрачає свої властивості в процесі експлуатації в силу наступних причин. По-перше, це порушення допустимих параметрів роботи колонки по потоку і тиску розчинника, що виникає через помилки оператора (неправильна завдання витрати, використання високов'язких розчинників і т. п.). При цьому, якщо тиск перевищить значення, що використовувалося при набиванні колонки, сорбент неминуче ущільниться, просяде, на початку колонки з'явиться порожнеча (мертвий об'єм), піки будуть розмиватися і ефективність колонки буде втрачена. По-друге, це помилки оператора, пов'язані з вибором розчинника, тобто використання розчинника з рН нижче 3 або вище 8. У цьому випадку відбувається прискорене руйнування, особливо при підвищених температурах, сілікагелевой матриці з розчиненням силікагелю, зменшенням його механічної міцності, хімічним відщепленням прищепленої фази. Зміна природи сорбенту, природно, змінює параметри утримування речовин і приводить до порушення хроматографічного процесу, а також до просідання сорбенту на початку колонки через погіршення його міцності. По-третє, це забруднення вхідного фільтра колонки частками, що потрапляють у потік внаслідок застосування нефільтрованим розчинників, що містять суспензії проб, а також з'являються за рахунок зносу ущільнень поршнів, клапанів, інжектора. Це призводить до зменшення числа пор фільтра, зростанню його гідравлічного опору і зростанням тиску на колонці. Необхідно фільтрувати розчинники і проби і встановлювати додаткові фільтри в лінії для уловлювання частинок, що утворюються в процесі роботи поршнів, клапанів, інжектора. По-четверте, це хімічне забруднення колонки. Його уникнути повністю не вдається, тому що навіть високочисті розчинники для ВЕРХ, не кажучи про технічні видах, містять деяку кількість домішок, продуктів фотохімічної я окисної деструкції розчинників, їх стабілізаторів, домішок, тари та ін Проби також містять домішки, склад яких часто встановлений не повністю. Ці домішки, якщо вони не елюіруются за умов аналізу, поступово накопичуються на сорбенті на початку колонки і, граючи роль нанесеною активної фази, починають вибірково утримувати деякі компоненти проби аж до їх незворотною сорбції. Якщо ці домішки елюіруются з великим часом утримування, вони призводять до нестабільності положення нульової лінії у вигляді дрейфу в ту або іншу сторону, широких «горбів» у найнесподіваніші моменти і т.д. До такого ж «хімічному» забруднення, що зраджує параметри утримування, призводить використання силікагелю, а в якості рухомої фази - вологого гексану або гептан, поступово «забруднюючих» безводний силікагель водою. Регенерацію вийшла з ладу колонки (на відміну від ремонту колонки) проводять без зняття кінцевих фітингів. Вибирають комплекс розчинників і хімікатів, який дозволяє видалити небажані забруднення з сорбенту і фільтрів хімічним або фізико-хімічним впливом. Регенерація успішна тільки в тому випадку, якщо в процесі експлуатації колонки не сталося фізичної або хімічної деградації шару сорбенту, тобто утворення каналів, пустот або відщеплення прищепленої фази. Перше питання, яке виникає при регенерації, - це можна для прискорення і поліпшення процесу змінити напрям потоку через колонку, щоб забруднення з сорбенту і фільтра на вході відразу віддалялися, не проходячи через весь шар сорбенту. Питання не просте, тому що деякі досвідчені фахівці вважають це можливим, а інші рішуче заперечують, вказуючи на можливість порушення щільності упаковки, утворення каналів і т.д. Фірми-виробники також не одностайні: деякі вважають зміну напрямку потоку через колонку небезпечним; інші, навпаки, рекламують свої колонки як здатні працювати при будь-якому-напрямку потоку, треті навіть не вказують для своїх колонок напрямку потоку, вважаючи, що це байдуже.
Шар сорбенту в колонці, на нашу думку, не остаточно сформований і однорідний після упаковки колонки. Якщо після упаковки і зняття тиску верхній шар сорбенту в колонці вирівнюється і закривається фітінгом при атмосферному тиску, то нижній шар (з боку детектора) продовжує залишатися під тиском через тертя шару сорбенту об стінки колонки; якщо зняти нижній фітінг, цей тиск видавлює сорбент з колонки (навіть жорсткий на основі силікагелю, не кажучи вже про напівжорстких на полімерній основі) досить помітно, у разі силікагелю на 1-1,5 мм. Тому зміна напрямку потоку при регенерації колонки недоцільно »особливо при підвищених швидкостях потоку і високому тиску. Якщо це все ж здійснюється, слід зменшити витрату розчинника і знизити тиск так, щоб вони не перевищували 1 / 2 або 1 / 3 від значень робочих параметрів.
Якими розчинниками і в якій послідовності вести регенерацію колонок-це залежить від типу сорбенту і від передбачуваних забруднень, які слід видалити. Є багато рекомендацій, які розчинники, в якій послідовності і для яких сорбентів використовувати, проте ніхто краще хроматографіста не знає, які забруднення він «посадив» на колонку і який розчинник придатний для їх видалення. Якщо забрудненнями є солі, то для їх видалення найкраще вода, якщо полімери - хлороформ або тетрагідрофуран, якщо вода - безводні спирти, хлорвуглеводнів і т.д. Для трудноудаляємиє забруднень, особливо біологічних, використовують диметилформамід, диметилсульфоксид, сильні буферні розчини. Не слід забувати про принцип повної смешиваемости подальшого і даного розчинників, інакше можливе утворення гетерофазних систем. Для регенерації сілікагелевих колонок рекомендується використовувати наступний ряд розчинників: тетрагідрофуран, метанол, тетрагідрофуран, метиленхлорид, гексан. Ряд для обернено-фазних колонок і нітрильних фаз: вода, діметілсуль-фоксід, метанол, хлороформ, метанол. Ряд для амінофаз і сильних аніонообмінником: вода, метанол, хлороформ, метанол, вода (якщо амінофазу використовують у водних системах розчинників). Ряд для амінофаз (неполярні розчинники): хлороформ, метанол, вода, метанол, хлороформ. Ряд для сильних катіонітів; вода, тетрагідрофуран, вода. Ряд для органічних гелів - кополімерів стиролу і дівінілбензола (Ексклюзійна хроматографія): толуол, тетрагідрофуран, 1%-ний розчин меркаптоуксусной кислоти в толуолі або тетрагідрофурані, тетрагідрофуран, толуол. Наведені рекомендації можуть доповнюватися і змінюватися відповідно до досвіду, накопичуються в процесі роботи. Якщо в результаті регенерації не вдалося відновити працездатність колонки, слід спробувати провести її ремонт. Ремонт колонки починають з того, що з неї знімають вхідні заглушку, обережно, двома ключами послаблюють затягування вхідного фітинга і знімають його. Якщо фітінг має впрессованной фільтр, а колонка мала високий тиск при роботі, вірогідним є закупорювання фільтра твердими частинками. Такий фітінг приєднують до насосної системі, що створює високий тиск і витрата розчинника, і прокачують через нього розчинник у напрямку, протилежному робочому, і при максимально можливому витраті і тиску для видалення частинок-забруднювачів. Потім фітінг поміщають в ультразвукову баню з гарячим розчином ПАР і обробляють 5 - 10 хв, після чого промивають розчинником і знову прокачують розчинник при високому витраті і тиску. Як правило, таким шляхом вдається видалити більшу частину забруднень з фільтру і відновити працездатність фітинга. Якщо фільтр не запресований, його чистять механічно, обережно зчищаючи частки з поверхні жорсткої щіткою, потім обробляють з ПАР в ультразвуковій бані і знову механічно чистять. Найкращим рішенням є заміна фільтра новим, проте слід дотримуватися обережності і використовувати новий фільтр такої ж товщини і конструкції. Якщо товщина нового фільтру менше, утворюється порожнеча спочатку колонки, і піки будуть розмиватися. Підготувавши фільтр і фітінг, їх і кінець колонки очищають від забруднень (часток сорбенту, іржі та ін) механічно і розчинниками і сушать. На час робіт з фітінгом кінець колонки, щоб він не висихав і з нього не випадав сорбент, закривають пластмасовим ковпачком, а колонку затискають за нижній фітінг в лещата відкритим кінцем вгору. Далі переходять до огляду верхнього шару сорбенту: у процесі роботи може відбутися його просідання, чим воно більше, тим важче відремонтувати колонку і менше шансів на успіх ремонту. Якщо просідання невелике, то найпростіший спосіб ремонту - заповнення порожнечі скляними мікрошарікамі розміром 40 мкм, що засипаються всуху, або ж пеллікулярним сорбентом з такою ж за типом прищепленої фазою. При цьому мертвий обсяг практично зникає і дозвіл колонки відновлюється. Якщо просідання велике, можна або спробувати заповнити порожнечу скляними кульками або пеллікулярним сорбентом, або спробувати дозаполніть колонку суспензійним методом. В останньому випадку готують суспензію сорбенту у відповідному розчиннику і, наливаючи її в порожнечу, дають сорбенту осісти, потім видаляють розчинник і повторюють операцію до тих пір, поки рівень сорбенту не зрівняється з верхнім краєм колонки. Тоді надягають верхній фітінг з фільтром, приєднують колонку до хроматограф і прокачують розчинник, поступово збільшуючи його витрата і тиск до максимально можливих, витримуючи при цих-значеннях і потім плавно зменшуючи до нуля. Давши потоку зупинитися, знімають верхній фітінг і оглядають верх шару сорбенту. Як правило, шар сорбенту кілька просідає, але порожнеча вже значно менше. Суспензійний заповнення повторюють до тих пір, поки не буде отримано стабільний шар сорбенту. Після цього колонку тестують і визначають, відновлені чи її властивості.
Іноді, оглядаючи верхній шар сорбенту, виявляють, що він забруднений механічними або хімічними домішками, змінився колір сорбенту, з'явилися канали. У цьому випадку невеликим шпателем обережно видаляють верхній шар сорбенту до того рівня, де (візуально) сорбент не зазнав змін; утворюється порожнечу заповнюють одним із зазначених методів. Колонки також ремонтують, якщо сталася поломка механічна: заїдання і псування різьби на колонці, відламуванням капіляра з конусом, порушення форми конуса, відламуванням частини фітинга та ін Відламані заклинений капіляр з конусом іноді вдається вибити вузьким пробійником, попередньо знявши фітінг з колонки, якщо канал досить широкий. Якщо потрібно поставити новий кінцевий фітінг, слід взяти новий фітінг того ж типу й тієї ж фірми. При цьому слід виміряти глибиноміром, однакова чи їх глибина, і у разі різниці компенсувати її товщиною фільтра. Після обережного обтиснення нового фільтру та фасонної колонку приєднують до хроматограф, і, включивши потік розчинника, перевіряють герметичність. Якщо ремонт не дає очікуваного відновлення розділових характеристик та ефективності колонки, її залишають для проведення менш кваліфікованої роботи (приблизний аналіз невідомих зразків, аналіз забруднених проб, мікропрепаратівная робота тощо) або заповнюють новим сорбентом суспензійним методом, попередньо видаливши відпрацьований старий сорбент.
Література
1. Drott EE / / in Chromatographic Science Series, v. 8, Liquid Chromatography of Polymers and Related Materials, ed. J. Gazes. NY, M. Dekker, 1977, p. 41.
2. Krishen A., Tucker RG / Anal. Chem., 1977, v. 49, No. 4, p. 898.
3. Mori S., Yamakctwa A. / J. Liquid Chromatogr., 1980, v. 3, No. 3, p. 329 - 342.
4. Verzele M., Geeraert E. / J. Chromatogr. Sci, 1980, v. 18, No. 10, p. 559 - 570.
5. Nettleton DE / J. Liquid Chromatogr, 1981, suppl. No. 2, p. 359-398.
6. Rable FM / International Lab, 1980, v. 10, No. 8, p. 91-98.
7. Small Bore Liquid Chromatography Columns / / ed. RPW Scott. NY, J. Wiley, 1984. 294 p.