Поширення мікроорганізмів роду Clostridium в природі і харчових про

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

ФГТУ ВПО «Астраханський Державний Технічний Університет»

Кафедра «Прикладна біологія та мікробіологія»

Курсова робота

на тему: «Поширення мікроорганізмів роду Clostridium в природі і харчових продуктах»

Астрахань, 2007

Зміст
Введення
Глава 1
1. Характеристика роду Clostridium
1.2 Патогенні мікроорганізми роду Clostridium
1.2.1 Збудник ботулізму
1.2.2 Clostridium perfringens
1.2.3 Збудник емфізематозного карбункула
1.2.4 Збудник правця
1.3 Значення мікроорганізмів роду Clostridium в промисловості
1.3.1 Збудники псування баночних консервів
1.3.2 Отримання ацетону і бутанолу в ході бактеріального бродіння представників роду Сlostridium
1.4 Застосування ботулінічного токсину в медицині
Глава 2 Об'єкти та методи досліджень
2.1. Об'єкти дослідження
2.2 Виявлення мезофільних анаеробних мікроорганізмів
2.3 Виявлення термофільних анаеробних мікроорганізмів
2.4 Виявлення збудників бродіння пектинових
2.5 Виявлення збудників бродіння целюлози
2.6 Виявлення анаеробних азотфіксуючих мікроорганізмів, що викликають маслянокислое бродіння
3. Виділення бактерій роду Clostridium з різних об'єктів
3.1 Результати посівів у рідке середовище Кітт-Тароцці для виявлення мезофільних і термофільних анаеробних мікроорганізмів
3.2 Результати посівів для виявлення збудників бродіння пектинових речовин
3.3 Результати посівів у рідке середовище Омелянського для виявлення збудників бродіння целюлози
3.4 Результати посівів на рідке середовище Виноградського
Висновки
Список літератури
Додаток

Введення
З життєдіяльністю клостридій пов'язані різні процеси, що протікають в природі: розкладання (гниття) азотовмісних сполук (білків, нуклеїнових кислот) в анаеробних умовах; анаеробне розкладання рослинних матеріалів, таких як клітковина, хітин. Ще наприкінці ХIX століття було виявлено, що деякі клостридії патогенні, тобто викликають захворювання людини і тварин. В основі патогенності клостридій лежить їх здатність синтезувати і виділяти з клітки високоефективні токсини.
Деякі бактерії роду Clostridium входять до складу нормальної мікрофлори шлунково-кишкового тракту і жіночих статевих шляхів, іноді їх виявляють на шкірі і в порожнині рота. З матеріалу, отриманого від хворих людей, виділені, принаймні, 30 видів клостридій. Подібно деяким іншим патогенним анаеробів, клостридії на повітрі не гинуть, але на поживних середовищах у присутності кисню не ростуть. Для бактерій цього роду характерно рясне виділення газу при культивуванні і субтермінально розташування спір (Ассонов, 1989).
Бактерії групи Clostridium знаходять і практичне застосування. Їх використовують у виробництві масляної кислоти, необхідної для парфумерної промисловості. Ацетонобутилове бродіння, здійснюване деякими видами клостридій, використовують для отримання в промисловому масштабі ацетону і бутанолу (Воробйова, 1989).
Метою даної курсової роботи є вивчення бактерії роду Clostridium, виділених з різних середовищ їх проживання.
Були поставлені наступні завдання:
1. Виявлення з різних типів грунтів азотфіксуючих мікроорганізмів роду Clostridium.
2. Виявлення з різних типів грунтів мікроорганізмів роду Clostridium, що беруть участь в маслянокислом бродінні.
3. Виявлення з різних типів грунтів мікроорганізмів роду Clostridium, що беруть участь у бродіння целюлози.
4. Виявлення мікроорганізмів роду Clostridium, з волокон рослин і викликають бродіння пектинових речовин.
5. Виявлення мезофільних і термофільних мікроорганізмів роду Clostridium з харчових продуктів.

Глава 1
1. Характеристика роду Clostridium
Бактерії роду Clostridium, грампозитивні спороутворюючі облігатні анаероби, повсюдно поширені в природі. Цей рід налічує більше 60 видів, багато з яких є сапрофіти. Деякі цукролітичні клостридії можуть використовувати в якості субстрату бродіння пектинові речовини, складові покриви рослинних клітин. Клостридії, що належать до виду З l. Felsineum, містять активну пектиназу і можуть тому отримувати енергію, здійснюючи маслянокислое бродіння пектинових речовин. Цей вигляд відіграє важливу роль у процесі мацерації волокон при мочці льону.
До роду Clostridium відносяться мікроорганізми, що не використовують як акцептора водню молекулярний кисень повітря. Деякі з них можуть розвиватися при зниженому парціальному тиску кисню. Оптимальними значеннями окислювально-відновного потенціалу середовища для їх розвитку є Eh від 50 до 200 МЛВ. Клостридії не володіють каталазообразующей здатністю.
Мікроорганізми роду Clostridium широко поширені в природі. Один з найпоширеніших видів - Clostridium perfringens. Ця бактерія нерухома, має капсулу і на поживних середовищах суперечки утворює рідко. При кип'ятінні суперечки гинуть. До складу нормальної мікрофлори товстої кишки входить більше 30 видів клостридій. У 1 г калу їх міститься 10 у степені 9-10. Clostridium ramosum за поширеністю трохи поступається Cl. perfringens. Ці два види повсюдно виявляються грунті, де їх концентрація досягає 10000 1 / р. Клостридії грампозитивних, але в матеріалі, отриманому від хворих, а також у старіючих культурах нерідко бувають грамнегативними. Тому результати мікроскопії пофарбованих за Грамом мазків слід оцінювати з обережністю.
Багато з них є постійними мешканцями грунту [Є.М. Мішустін, М.І. ПЕРЦОВСЬКИЙ та ін (1979); Г. В. Меренюк, Г.І. Пономаренко (1979)]. Разом з грунтом, що залишилася на сировину, клостридії потрапляють в процесі виробництва в готові продукти - сухі картопляні і овочеві.
Л.Є. Прохорович, Л.А. Салтикова і ін (1975), М.М. Мазохіна-Поршнякова, Л.П. Найдьонова (1977) повідомляють про високу обсіменіння коренеплодів клостридиями.
І.Я. Овруцька, В.Є. Новицька (1983) виявили анаероби роду Clostridium на сирій картоплі і овочах, на напівфабрикатах, в сухому картопляному пюре, сушеному картоплі і овочах.
Клітини мають форму паличок різної довжини і ширини. Довжина клостридіальна клітин залежить від умов культивування та фази розвитку.
Розташування клітин в препараті іноді можна використовувати як діагностична ознака. Так, клітини Сl. perfringens можуть розташовуватися паралельно одна одній, клітини Сl. beijerinkii слабо вигнуті.
Клостридії в основному рухливі, крім Сl. perfringens. Здатність до спороутворення у них неоднакова: Сl. sporogenes добре утворює спори (85-90% клітин дають спори), Сl. perfringens на звичайних поживних середовищах, як правило, суперечка не дає, але іноді все ж зустрічаються поодинокі спори, інші клостридії в цьому відношенні займають проміжне положення.
У таблиці 1 наведено диференційні ознаки мікроорганізмів роду Clostridium.

Таблиця 1
Диференційні ознаки мікроорганізмів роду Clostridium
Вид бацил
Форма і розміри колоній в анееробних умовах
Розмір клітин, мкм
спори
Загальні властивості
Зростання на середовищі Кітт-Тароціі
Зростання на лакмусовим молоці
Температура зростання, С 0
Освіта токсину
форма
роздутість
Розта-
ження
С. botulinum типу А і В
На поверхні агару - круглі колонії діаметром 3 - 8 мм , Плоскі, сірого кольору, з ущільненим центром і різоідни ми краями. Поверхня матова, в глибині агару - колонії у вигляді грудки вати, білого кольору, діаметром 5-10 мм
0,8-1,3 Х
X 4,4-8,6
0
+
СТ
Суворі анаероби грампозитивні в молодій культурі, ка-талазоположнтельние, в основному рухливі, мають суль-фітредуцнрующей здатністю, індол не утворюють, ферментують глюкозу, мальтозу, сахарозу. Не ферментують манить, рамнозу, сорбіт. Розріджують желатин
Помутніння середовища і газоутворення через 18-24 ч. Розм'якшення шматочків м'яса, освіта Облаковідний осаду
Пентонізіруют, не коагулюють
30-40
+
С, beijerinkii
У глибині агару - колонії кулясті, з гладкою поверхнею, білого або кремового кольору, діаметром 2,5-3,0 мм
03-1,5 Х
Х3 ,0-7, 5
0
+
ЕКС до СТ
Помутніння середовища, помірне газоутворення через 14-18 год
Коагулюють, слабо фраг-регламентують, не пептонізіруют
25-30
-
Продовження таблиці 1
С. pasteu-rianum
У глибині агару - колонії дрібні, у вигляді двоопуклих лінз, злегка опушені, діаметром 1,0 - 1,5 мм
0,5-0,8 Х
Х3 ,4-13, 2
0
+
СТ
Те ж
Помутніння середовища, сильне газоутворення через 8 - 14 год
Не змінюють
25-37
-
С. butyri-cum
У глибині агару - колонії двоопуклі, щільні, жовто-білі, діаметром 3,0-5,0 мм
0,6-1,2 Х
X 3,0-7,0
0
+
ЕКС до СТ
Суворі анаероби, рухливі, грампозитивні в молодій культурі, каталазоот-еіцательние, не розріджують желатин, сірководень і індол не утворюють. Ферменти галактозу, глюкозу, рафіноза, саха-еозу, фруктозу. Чи не рерментіруют дульцит, рамнозу
Помутніння середовища, рясне газоутворення, запах масляної кислоти через 8 - 14 год Зростання слабкий за відсутності глюкози
Бурхлива ферментація, фраг-ментірованное згортання, не пептонізіруют
25-37
-
Прийняті скорочення: СТ - субтермінально розташування; ЕКС - ексцентральное розташування, Е - еліптичні або циліндричні; Ц-центральне; Т - термінальне і субтермінально; ЦТ - розташування від центрального до термінального; «+» позитивна реакція; «-» негативна реакція.
Суперечки в клітинах розташовані субтермінально, у Сl. beijerinkii і С. butyricum іноді спостерігається ексцентральное розташування суперечка. Суперечки у всіх клостридії, за винятком Сl. perfringens, роздмухують клітку: залежно від форми й розташування суперечки клітина набуває вигляду тенісної ракетки (Сl. botulinum, Сl. sporogenes), веретена чи сигари (Сl. beijerinkii, Сl. pasteurianum, Сl. butyricum).
Спори всіх клостридій стійкі до дії багатьох хімічних речовин і високої температури, а також до висушування.
Характер зростання активно розвиваються вегетативних клітин на рідких м'ясних середовищах може служити диференціальною ознакою. Сl. perfringens володіє короткою лаг-фазою, максимум зростання настає через 4-6 ч. Інші види володіють більш тривалої лаг-фазою і максимум росту в них спостерігається через 18-24 ч.
Всі представлені клостридій ростуть на середовищі Кітт-Тароцці з помутнінням середовища та газоутворенням, але зростання Сl. perfringens і Сl. sporogenes супроводжується рясним газоутворенням, а Сl. pasteurianum і Сl. butyricum не ростуть на цих середовищах у відсутності глюкози.
За біохімічним особливостям клостридій розділені на дві групи. У першу входять Сl. botulinum типів А і В, Сl. perfringens типу А, Сl. sporogenes, що розріджують желатин, у другу групу - Сl. pasteurianum, Сl. butyricum, Сl. beijerinkii, не розріджують желатин.
Усередині цих груп є клостридій, володіють добре вираженими цукролітичних властивостями (Сl. butyricum, Сl. Pasteurianum, Сl. Beijerinkii) і клостридій, що володіють незначною сахаролитический активністю (Сl. sporogenes, Сl. Botulinum типу А), а також клостридій, що займають проміжне положення за цією ознакою (Сl. botulinum типу В, Сl. perfnngens).
Однією з ознак є характер зростання клостридій на лакмусовим молоці. Сl. perfringens і Сl. butyricum бурхливо зброджують молоко, процес супроводжується відділенням згустку від сироватки. У посівах Сl. perfringens сироватка освітлюється, а в посівах Сl. butyricum залишається мутною. Зростання Сl. perfringens на цьому середовищі відбувається при температурі 47 ° С за 4-5 год, при 37 ° С - за 6-8 год
Зростання Сl. butyricum відбувається тільки при 37 ° С за 18-20 год Сl. sporogenes і Сl. botulinum згортають молоко і пептонізіруют при 37 ° С, а Сl. pasteurianum і Сl. beijerinkii молоко не згортають або згортають не по всьому стовпчика, лакмус редукується.
З клостридій, що зустрічаються в сухих картопляних і овочевих продуктах, Сl. botulinum і Сl. perfringens утворюють токсини, небезпечні для людини.
Ця ознака для Сl. botulinum є постійним, тому при ідентифікації доцільно використовувати метод постановки біологічної проби, заснований на нейтралізації токсину ботулізму протівоботулініческой сироваткою відповідного типу.
Морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні особливості анаеробних бактерій роду Clostridium лежать в основі виділення та ідентифікації цих мікроорганізмів з різних об'єктів дослідження, в тому числі із сировини, напівфабрикатів сухих і кулінарно підготовлених картопляних і овочевих продуктів (Овруцька, 1983).
Clostridium pasteurianum здатний активно фіксувати азот. Це облігатно анаеробна велика спорова паличка, рухлива в молодому стані, в ув'язненні циклу розвитку утворює спори. При утворенні суперечки клітка роздувається у вигляді веретена і наповнюється резервним крахмалоподобним речовиною - гранульози. Ця речовина синіє при впливі розчином йоду в йодистим калії. Cl. pasteurianum живе за рахунок зброджування цукрів з утворенням масляної та оцтової кислот і газів СО 2 і Н 2; потребує вітамінів. На середовищі Виноградського швидко вироджується, втрачаючи здатність до спороутворення, а потім і до зростання.
Отримати Cl. pasteurianum в чистому вигляді важко, так як він живе в досить тісному симбіозі з аеробної спорової паличкою Bacillus closteroides. Цей супутник убезпечує анаероба від кисню повітря, перехоплюючи його на свої потреби і постачає його необхідними вітамінами, а сам отримує азотисте харчування від азотфиксаторов. Чистий культура може бути отримана з накопичувальної при отриманні ізольованих колоній на твердому середовищі. Це може бути середу Виноградського з додаванням автолізат дріжджів. Колонії Cl. pasteurianum виростають тільки в ексикаторі, з якого викачано повітря до залишкового тиску 5 - 10 мм , Так як Cl. pasteurianum облігатний анаероб і не може рости на поверхні твердих середовищ на повітрі. Чистий культура добре розвивається на середовищі Виноградського з додаванням автолізат дріжджів і загущеною невеликою кількістю агару для створення більш анаеробних умов внаслідок уповільнення дифузії кисню повітря (Работнова, 1966).
Азотфіксація інтенсивніше відбувається на безазотистих середовищі. Якщо в середовищі є азот, особливо амонійний, то азотфіксація слабшає або зовсім припиняється. Cl. pasteurianum живе в широкому діапазоні рН від 4,5 до 9,0. Фіксує 10-20 мг азоту на 1 г збродженого цукру. У більш слабкою мірою, ніж Cl. pasteurianum, здатністю до азотфіксації має вся велика група Clostridium. Це було доведено Вільсоном методом із застосуванням N 15 у 15 видів цього роду.
Cl. pasteurianum розповсюджений дуже широко. Він зустрічається практично у всіх грунтах, у вигляді паличок або спір. Але в найбільшій кількості і в найбільш активному стані Cl. pasteurianum знаходиться в ризосфері рослин. Цей мікроб живе разом з рослинами, забезпечуючи їх азотом і отримуючи від них органічні речовини і вітаміни.
Цікаво, що цей облігатний анаероб мешкає головним чином у верхніх шарах грунту, найбільш багатих органічними речовинами, пронизаних корінням рослин. Кисень повітря йому не шкодить, так як Cl. pasteurianum живе під захистом аеробів, що перехоплюють кисень повітря і не допускають його до анаероба (Ємцев, 1966).
Clostridium perfringens є санітарно-показовим мікроорганізмом., так як ці бактерії живуть в кишечнику теплокровних тварин і людини. Виявлення Cl. perfringens свідчить про колись мав місце фекального забруднення (ці бактерії утворюють спори, що дозволяє їм довго збережуться в навколишньому середовищі). У вітчизняній практиці кількісний облік клостридій передбачений при дослідженнях грунту, лікувальних грязей, води відкритих водойм. Визначення цього мікроорганізму проводять і в деяких харчових продуктах, але вже як збудника харчових отруєнь.
При санітарно-мікробіологічному дослідженні грунту враховують комплекс показників, серед яких такий як перфрінгенс-титр. Для визначення перфрінгенс-титру користуються разведениями грунтової суспензії (чистий грунт засівають у розведенні 10 -1 - 10 -3, забруднену від 10 -4 до 10 -5). По 1 мл з вибраних розведень засівають у пробірки з 5 мл стерильного знежиреного молока або железосульфітной середовищем Вільсона-Блера. Посіви інкубують при 43 ° С протягом 24-48 год, після чого враховують результати по характерному згортання молока (освіта губчастого згустку у верхній частині пробірки і просвітління сироватки) або за освітою колоній Clostridium perfringens в агаровому стовпчику середовища Вільсона-Блера (колонії чорного кольору різної інтенсивного забарвлення, що мають форму двоопуклої лінзи, грудочки вати або «літачка»). З колоній роблять мазки, фарбують за Грамом, мікроскопують і обчислюють перфрінгенс-титр. Клітини Cl. perfringens - рухливі (рідше нерухомі) короткі товсті палички з закругленими кінцями. Утворюють овальні або круглі ендоспори, розташовані центрально і надають клітинам веретеноподібну форму () спори також можуть розташовуватися термінально або субтермінально). У мазках розташовані поодиноко, попарно, у вигляді ланцюжків або паралельно один до одного, грампозитивні, каталазоотріцательни. Граничне розведення грунтової суспензії, яке дає на молочній середовищі розмноження Cl. perfringens, означає титр цього мікроорганізму в грунті. Для чистої води перфрінгенс-титр складає 0,01 і вище, для забрудненої - 0,009-0,0001, для сильно забрудненої - 0,0009 і нижче (Нетрусов, 2005).
1.2 Патогенні мікроорганізми роду Clostridium
1.2.1 Збудник ботулізму
Ботулізм викликає Clostridium botulinum, це важке харчове отруєння бактеріальне з переважним ураженням центральної нервової системи і високою летальністю. Збудник хвороби відкритий у Голландії Е. ван Ерменгемом в 1896 р. Тимчасовим інтервал між попаданням токсину в організм і появи перших ознак ботулізму, зазвичай не перевищує 24 год, але може варіювати від 4-6 до 96 годин і більше. Ботулізм пов'язаний, головним чином, з продуктами домашнього приготування, заготовленими про запас. Загальноприйняті в домашніх умовах способи обробки харчових продуктів, такі як консервація в банках, копчення, маринування, соління, не призводять до знищення збудників ботулізму і їх суперечка і при тривалому зберіганні в цих продуктах може утворитися токсин.
Збудники ботулізму широко поширені в природі, нормальні мешканці кишечнику тварин і людини, потрапляють у грунт з фекаліями. Природний резервуар-грунт. Широке поширення збудників ботулізму в грунті веде до потрапляння цих мікробів на овочі та фрукти, а також до обсіменіння сировини, що йде для приготування консервів, ковбас та інших продуктів.
Серологічна ідентифікація Cl.botulinum заснована на виявленні екзотоксинів. У залежності від антигенних властивостей яких поділяють на 7 сероварів: А, В, С, D, E, F, G. Оптимальна температура для токсиноутворення варіабельна: для бактерій типів А, В, С, D - 35 ° С, для типів Е і F - 28 - 30 ° С. Патогенність Cl. botulinum для різних теплокровних різна. Захворювання у людини викликають бактерії типів А, В, Е, F; бактерії типів С, D викликають захворювання тварин і птахів (в окремих випадках від хворих тварин виділяють бактерії типів А і В). Патогенність типу G для людини і тварин не доведена. Головні фактори патогенності Cl.botulinum - екзотоксини, надають нейротоксична дію на організм, в організмі збудник практично не розмножується. Ботулінічний токсини досить стійкі до температурних впливів. Токсин іноді руйнується тільки при кип'ятінні протягом 10-15 хвилин і не руйнується в шлунково-кишковому тракті під впливом травних ферментів. Ботулінічний токсин - найсильніший з усіх біологічних отрут.
Cl.botulinum типів А, В, С, D, E, F - дуже близькі за морфології, культуральними властивостями і за дією їх токсинів на організм людини і тварин. Всі вони дають однакову клінічну картину хвороби. Різні типи ботулінічного мікроба відрізняються за антигенними властивостями вироблюваних ними токсинів, токсин кожного типу нейтралізується сироваткою того ж типу.
По морфології збудники ботулізму є невеликі палички 0,6-1,0 х 3,0-9,0 мкм із закругленими кінцями. Палички утворюють субтермінально або термінальні суперечки, палички зі спорою мають вигляд тенісної ракетки, легко забарвлюються різними аніліновими фарбами, молоді клітини грампозитивних, при старінні культури (через 4-5 доби росту) палички фарбуються грамнегативних, мікроби рухливі, мають від 4 до 35 джгутиків, капсул не утворюють.
Збудники ботулізму - строгі анаероби, вони ростуть без доступу повітря, тому зазвичай розмножуються і утворюють токсин всередині великих шматків риби, шинки, ковбаси, або в герметично закритих банках консервів. Збудники ботулізму типу Е, а також непротеолітіческіе штами типу В і деякі штами типу F утворюють на живильних середовищах і в харчових продуктах крім токсину і нетоксичний попередник токсину - протоксін, який, не вбиваючи мишей при парентеральному введенні, проявляє свою біологічну активність при попаданні в шлунково -кишковий тракт людини і тварин у результаті впливу на нього протеолітичних ферментів.
При додаванні протеолітичних ферментів (трипсину, панкреатину) in vitro також відбувається активація протоксіна, який переходить у токсин. Цей феномен слід враховувати при проведенні лабораторної діагностики ботулізму.
Нерідко консервні банки, куди разом з продуктами потрапляє і збудник ботулізму, виявляються бомбажних за рахунок утворення мікробом газу, проте, часто при наявності мікробів ботулізму і ботулинических токсинів харчові продукти виглядають абсолютно доброякісними і консервні банки не дають «бомбажа». Іноді відзначається специфічний запах згірклого масла.
Критерії діагностики. Лабораторна діагностика ботулізму має на меті виявлення та ідентифікації ботулінічного токсину і виділення збудника. Лабораторному дослідженню підлягають залишки харчових продуктів, матеріал отриманий від хворого (кров, випорожнення, сеча, промивні води шлунка, блювотні маси) і секційний матеріал. Кров беруть з вени пацієнта в кількості 5-10 мл, промивні води шлунка забирають в обсязі 50-100 мл, кал 50-60 р. На секції забирають шматочки печінки (50-60 г), відрізки кишечника і шлунку і їх вміст. До вступу в лабораторію зразки зберігають на холоді. Кров досліджують тільки на наявність токсину (для чого проводять біологічну пробу), випорожнення тільки на наявність збудника (проводять посів на поживні середовища), весь інший матеріал на наявність збудника та його токсину.
Морфологія. Клостридії ботулізму - великі, поліморфні, із закругленими кінцями палички; довжина їх 4-9 мкм, ширина 0,6-0,8 мкм. Утворюють спори овальної форми, які разом з вегетативною клітиною нагадують тенісну ракетку. За Грамом забарвлюються позитивно, рухливі (перитрихи).
Культивування. Збудник ботулізму - суворий анаероб. Краще росте на нейтральній і слабощелочной середовищі. На середовищі Китта - Тароцці спочатку відбувається помутніння бульйону, потім, після осідання мікробів на дно, настає просвітлення. Клостридії ботулізму розріджують желатину, пептонізіруют молоко. Культура ботулінуса під час росту набуває запах згірклого масла.
Токсиноутворення. Клостридії ботулізму утворюють токсин в кормах і продуктах. Він витримує кип'ятіння протягом 10-15 хв. Травні ферменти (пепсин, трипсин) не руйнують токсини типів А, В, С, D, F і у багато разів підсилюють активність типу Е. Патогенність мікроба обумовлюється виключно його токсиноутворення. Ботулінічний токсин - найсильніший з усіх мікробних отрут. Одного грама токсину (за даними різних авторів) достатньо, щоб знищити 20-60 млрд. мишей.
У таблиці 2 показано токсичність ботулінічного токсину в порівнянні з іншими отрутами (дані О. В. Фоміна, А. Ф. Коломієць, 1985).
Таблиця 2
Токсичність ботулінічного та деяких інших отрут для миші
Речовина
Мінімальна летальна доза, мікромоль / кг
Ботулінічний токсин
3,3-10 -17
Дифтерійний токсин
4,2-10 -12
Кураре
7,2-10 -7
Стрихнін
1,5 - 10 -4
Патогенність. До ботулінічного токсину чутливі тварини всіх видів. У коней настає параліч ковтальної і дихальної мускулатури, смертність досягає 100%. У великої рогатої худоби клініка аналогічна. У курей спостерігається розслаблення шийної мускулатури і парез ніг. З лабораторних тварин до токсину чутливі морські свинки, білі миші. Через 3-4 дні після захворювання вони гинуть. До ботулінічний токсикоінфекції чутливий і людина.
Смертельна доза токсину для людини становить близько 1 мкг (10 -6 г) Стійкість. Завдяки утворення спор клостридії ботулізму стійкі до несприятливих дій середовища. У висушеному стані зберігають життєздатність десятиліттями. Добре переносять високі температури. До низьких температур також малочутливі, зберігають життєздатність при - 190 ° С. Температуру - 16 ° С витримують протягом року, але при відтаванні руйнуються і виділяють токсин.
Під дією 20%-ного формаліну суперечки гинуть через 24 год, 10%-ного розчину соляної кислоти - за годину, етилового спирту - через 2 міс. (С.244)
Мікробіологічний діагноз грунтується на виявленні токсину в залишках корми (їжі) або в органах полеглого тварини. Фільтрат підозрюваного матеріалу вводять піддослідним тваринам і по їхній клініці визначають хворобу.
Імунітет при ботулізмі антитоксичний. Людини лікують специфічної протівоботулініческой сироваткою. Тваринам сироватку вводять рідко. Надійний метод профілактики хвороби-імунізація ботулініческнм анатоксином (Ассонов, 1989).
1.2.2 Clostridium perfringens
Clostridium perfringens - вид бактерій роду Clostridium - один з найбільш поширених патогенних видів. За здатністю утворювати чотири головних токсину (α-, β-, ε-, τ-) мікроорганізми поділяють на шість сероварів: А, В, С, D, E і F. Cl. perfringens поширені повсюдно; бактерії виділяють з води грунту, стічних вод. Вони колонізують кишечник тварин і людини (виділяють у 25-35% здорових осіб). Інших природних резервуарів крім травного тракту Cl. perfringens не мають, грунт та інші об'єкти зовнішнього середовища обсеменяются ними тільки фекальним шляхом. У людини Cl.perfringens викликає два типи поразок - газову гангрену і харчові токсикоінфекції.
Вегетативні клітини Cl рerfringens представлені короткими великими паличками з обрубаними під прямим кутом кінцями (0,6-1,0 х1х1, 5 мкм). Відмінні особливості бактерій - строго позитивна забарвлення за Грамом та відсутність рухливості. In vivo утворюють капсулу. Бактерії добре забарвлюються аніліновими барвниками, в старих культурах можуть бути грамнегативними. Спори великі овальні розташовані центрально або субтермінально. Термостійкість суперечка сероварів В і D відносно невисока, гинуть при кип'ятінні протягом 15-30 хв, суперечки типів А і З більш стійкі і виживають при кип'ятінні протягом 1-6 годин. Cl.рerfringens типу А щодо толерантна до короткочасних кисневим впливів і здатна рости в високих стовпчиках середовищ, без герметизації вазеліновим маслом. На щільних середовищах бактерії утворюють S-і R-колонії. S-колонії круглі, соковиті, куполоподібні, з гладкими рівними краями. Спочатку вони прозорі, пізніше стають каламутними сірувато-білими, R-колонії неправильної форми, горбисті з нерівними краями шорсткими; в глибині агару нагадують грудочки вати. На агарі з кров'ю зазвичай оточені зоною гемолізу. Характерна властивість колоній Cl.perfringens типу А, службовці дифференцирующим ознакою, - здатність змінювати сірувато-білий колір на зеленувато-оливковий після короткочасного перебування в анаеробних умовах. На жовтковому агарі бактерії утворюють колонії, оточені зоною перламутрового преципітату, що утворюється з лецитину курячого жовтка під дією лецитинази. Культури Cl.рerfringens типу А мають характерний запах масляної кислоти. Оптимум рН 7,2-7,4, але можуть рости в інтервалі 5,0-8,5. На середовищах містять глюкозу зростання відбувається дуже бурхливо, з утворенням Н 2 і СО 2 і закінчується через 8-12 годин. Перші ознаки зростання на середовищі Кітт-Тароцці можуть виявлятися вже через 1-2 години (особливо при 43 ° С) і проявляються помутнінням і появою пухирців газу. Бактерії ферментують вуглеводи з утворенням кислоти і газу. Від інших Cl.рerfringens відрізняє здатність відновлювати нітрати, розщеплювати лактозу, утворювати лецитиназу. Протеолітична активність слабка: расжіжает желатину, не розкладає казеїн, інтенсивно створаживается молоко. Cl.рerfringens утворює 12 токсинів (ферментів) і ентеротоксинів. Продуцентами ентеротоксину є бактерії типів А і С, що викликають харчові токсикоінфекції.
Cl.perfringens, типів В, Д, Е викликають важкі ентеротоксемію у дрібної та худоби, а також у птахів, можна припускати їх етіологічне значення при харчових отруєннях у людей, у разі вживання в їжу м'яса тварин, обсіменіння штамами цих типів.
Cl.рerfringens типу А викликає токсикоінфекції легкого та середнього ступеня тяжкості. Захворювання розвивається гостро, з болями в животі, блювотою і діареєю (до 20 разів на добу). Симптоми зникають в наступні 12-24 год, летальні випадки спостерігаються рідко. Встановлено, що при харчових токсикоінфекціях, що викликаються Cl.perfringens типу А, основну роль у патогенезі захворювання відіграє ентеротоксин, що виробляється in vivo спорулірующімі клітинами цих мікроорганізмів, які потрапляють в шлунково-кишковий тракт при інтенсивному обсеменении харчових продуктів (10 5 і більше в м / см 3) зазначеними бактеріями.
Cl.рerfringens типу С викликає некротичний ентерит. При гострих формах хвороба може закінчитися смертю пацієнта, протягом 18-24 ч. Симптоми аналогічні поразок, що викликаються бактеріями серовара А. Харчові отруєння найчастіше мають місце після вживання готових м'ясних страв, а також продуктів рослинного походження, які виявляються значно обсіменіння клітинами Cl.perfringens типу А в результаті порушення правил приготування та зберігання їжі.
Критерії діагностики. При наявності клінічних симптомів захворювання результати бактеріологічного дослідження підтверджують діагноз харчового отруєння, якщо отримані такі дані аналізу: висока забрудненість Cl.perfringens (більше 10 5 у г / см 3) харчових продуктів або 10 6 в 1 г фекалій (ІНСТРУКЦІЯ 4.2.10-15-21-2006).
1.2.3 Збудник емфізематозного карбункула
Емфізематозний, або шумливий, карбункул (ЕМКАР) викликають Clostridium cnauvoel, це інфекційна гостроплинна неконтагіозная хвороба великої рогатої худоби віком від 3 міс. до 4 років. Іноді емфізематозних карбункулом хворіють вівці і кози. Хвороба характеризується появою в м'язовій тканині газових набряків, які при натисканні крепитирующих. ЕМКАР зустрічається майже в усіх країнах світу.
Морфологія. Збудник має форму палички з закругленими кінцями, її довжина 4-8 мкм, ширина 0,6-0,9 мкм (рис. 45). Клостридія Шово - перітріх. Як у культурі, так і в патологічному матеріалі утворює спори, які надають паличці форму веретена або лимона. Молоді культури забарвлюються за Грамом позитивно, старі - негативно.
Культивування. Збудник емфізематозного карбункула - суворий анаероб, росте при температурі 36 - 38 ° С. Культуру мікроба вирощують на мясопептонном-ном печінковому бульйоні (МППБ). На середовищі Китта - Тароцці спочатку з'являється каламуть, потім, після осідання спір на дно пробірки, настає її просвітління. Під вазеліновим або парафіновим маслом утворюються бульбашки газу. Культура набуває запах згірклого масла. На глюкозокровяном агарі колонії частіше утворюють зону гемолізу і піднесення в центрі, нагадує перламутрову гудзик. Розріджує желатину. Молоко згортає повільно. Зброжує глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, галактозу, левулозу з утворенням кислоти і газу.
Патогенність. Емфізематозний карбункул хворіє рогату худобу. Збудник в організм потрапляє з кормом, частіше в літній час, коли тварини знаходяться на пасовищі. Мікроб зі шлунково-кишкового тракту проникає у підшкірну клітковину та м'язи, де, розмножуючись, утворює вуглецю діоксид, водень та інші гази, що й обумовлює крепітація.
З лабораторних тварин найбільш сприйнятливі морська свинка, вона є гарною біологічної моделлю 'для відтворення хвороби. Її заражають патологічним матеріалом внутрішньом'язово у сфері поверхні стегна. Смерть морської свинки настає через 16-72 р. На місці ін'єкції м'язи темно-червоного кольору, геморрагически інфільтровані, іноді крепитирующих (освіта газу). Збудник утворює токсини, які можуть викликати загибель лабораторних та домашніх тварин.
Стійкість. Спори мікроба стійкіші, ніж вегетативні форми, при кип'ятінні вони зберігаються до 2 год, при 110 ° С - до 40 хв, у висушеному вигляді - до 18 років. Розчин сулеми (1:500) руйнує спори через 10 хв, 3%-ний розчин формаліну - через 15 хв.
Мікробіологічний діагноз ставлять комплексно: на підставі мікроскопії, вирощування культури збудника і біологічної проби. Для дослідження направляють уражені м'язи. З них роблять препарати, посіви на середу Китта - Тароцці і готують суспензію для зараження морської свинки. Виділення культури збудника з матеріалу від полеглої морської свинки служить підтвердженням правильності постановки діагнозу.
Вакцинація. В даний час застосовують концентровану гідроокісьалюмініевую вакцину, яка була вдосконалена Ф. І. Коган і А. І. Колесова в 1959 р. Великому рогатій худобі та вівцям вакцину вводять внутрішньом'язово одноразово в дозі 2 мл. Тривалість імунітету не менше 6 міс. Телятам, вакцинованим до 6-місячного віку, вакцину вводять повторно. Проти ЕМКАР є сироватка, але її використовують рідко.
Лікування не завжди досягає своєї мети, запізнюється, тому що хвороба протікає гостро. В окремих випадках у загальноприйнятих дозах застосовують антибіотики: стрептоміцин, дибиомицин, пеніцилін.
1.2.4 Збудник правця
Правець викликає Clostridium tetani, це ранова неконтагіоеная інфекція, відома з часів Гіппократа. Збудник хвороби відкритий в 1884 р. А. Ніколайераі, чиста культура отримана в 1889 р. Ш. Китазато. Клініка хвороби - судоми, ущільнення м'язів (жувальних, тулуба), викривлення шиї, хвоста - наслідок ураження нервової системи, утвореного мікробом екзотоксину. Зараження тварин і людини відбувається при травмах і пораненнях. Збудник в рани потрапляє з грунту, де і розвивається. Токсин правця - один з сильних мікробних отрут.
Морфологія. Збудник правця - тонка, рухлива (перітріх) паличка, довжина її 4-8 мкм, ширина - 0,4-0,6 мкм. Утворює округлі суперечки, які розташовуються на кінці клітини, надаючи їй вигляд барабанної палички. Раніше такі бацили називали плектрідіямі.
Культивування. Бацили правця - строгі анаероби. На середовищі Китта - Тароцці збудник росте повільно, утворює газ з неприємним запахом. Після осідання мікробних клітин на дно пробірки середу просвітлюється. На агарі стовпчиком або желатині росте, за уколу ялинкою, причому верхівка не досягає поверхні середовища. Оптимальна температура росту 35-37 ° С.
Стійкість. Вегетативні форми збудника правця гинуть при температурі 60-70 ° С протягом 30 хв. Суперечки витримують нагрівання до 80 ° С протягом 6 год, у киплячій воді зберігаються до 40-50 хв, у висушеному стані - до 11 років. При дії розчину сулеми (1:100) або 5%-ного розчину фенолу суперечки гинуть лише через 10-12 ч.
Мікробіологічний діагноз на правець зазвичай не проводять, так як клініка хвороби дуже характерна. При необхідності з місця поранення готують мазки, роблять посів на середу Китта - Тароцці, а також заражають білу мишу. Симптоми правця у білої миші розвиваються на 2-3-й день.
Активна імунізація проти правця. Імунітет у тварин і людини проти правця (його токсину) створюється шляхом введення анатоксину. Його готують з нативного правцевого токсину, у який додають 0,3-0,5% формаліну, алюмокалієвий галун, фенол і витримують при 37 ° С протягом 2-3 тижнів.
Квасцовий (депонований) анатоксин створює імунітет тривалістю від 3 до 6 років. Його вводять великим тваринам у дозі 1 мл, молодняку ​​і дрібним тваринам - 0,5 мл. Протиправцеву сироватку застосовують у невідкладних випадках. Дія її наступає швидко і буває ефективним (Ассонов, 1989).
1.3 Значення мікроорганізмів роду Clostridium в промисловості
Роль мікроорганізмів у мікробіологічній, харчовій промисловості, в сільському господарстві та інших областях важко переоцінити. Особливо важливо відзначити те, що багато мікроорганізмів для виробництва цінних продуктів використовують відходи промислового виробництва, нафтопродукти і тим самим роблять їх руйнування, оберігаючи навколишнє середовище від забруднення.
1.3.1 Збудники псування баночних консервів
Спільними для всіх видів консервів є такі дефекти, як бомбаж, плоске скисання, а також дефекти тари: іржа, деформація корпусу, денець, фальців і поздовжнього шва жерстяних банок як гострих граней, званих "пташками", деформація і перекіс кришок скляних банок, тріщини і відкол скла, пробоїни, патьоки, Хлопушу. До бомбажних консервам на відміну від хлопуша, банок з вібруючими кінцями відносяться постійно роздуті банки, що не міняють свого становища при натиску на неї пальцями руки.
Бомбаж - це здуття банок з боку дна і кришки. Залежно від походження бомбаж буває мікробіологічний, хімічний та фізичний (помилковий) (Ассонов, 1989).
Мікробіологічний бомбаж - здуття банок газами (аміак, сірководень), що утворилися в результаті розвитку термостійких мікроорганізмів. У процесі їхньої життєдіяльності утворюються гази, що викликають здуття банки і навіть порушення герметичності, і токсини, небезпечні для здоров'я споживача. Бомбаж є результатом недостатньо ефективного режиму стерилізації, незадовільного санітарного стану технологічного обладнання, використання сильно обсіменіння мікроорганізмами сировини, тари, порушення герметичності банок.
До строгих гнильним бактеріям відносяться в основному грунтові клостридії: путріфікус (Clostridiuum putrificum) і спорогенес (Clostridiuum sporogenes). Обидва види клостридій відомі як збудники псування баночних консервів - м'ясних, рибних.
Гнильні мікроорганізми відіграють велику роль у кругообігу речовин у природі, розкладаючи білкові речовини потрапляють у грунт трупів тварин та рослинних залишків. Минерализуя білкові речовини з утворенням аміаку, вони збагачують тим самим грунт потрібними для рослин формами азоту. Однак під впливом тих же гнильних мікроорганізмів може відбуватися псування м'яса і м'ясопродуктів, риби і рибопродуктів, яєць, молока та інших багатих білками продуктів. Одним з показників псування служить наявність в них продуктів розпаду білка (підвищений вміст амінів, NH3, H2S, жирних кислот).
Банки з мікробіологічним бомбажем підлягають знищенню або технічної утилізації. Характерними ознаками бомбажа, викликаного бактеріями Clostridium botulinum, є утворення в консервах великої кількості газів, при цьому може порушуватися герметичність банок, змінюватися зовнішній вигляд продукту, з'являтися каламуть. Утворені токсини руйнуються тільки при кип'ятінні більше 10 хв. Токсини ботулінуса викликають отруєння, часто зі смертельним результатом (до p5%).
Псування плодоовочевих консервів викликається і іншими термофільних бактеріями, наприклад Cl. soroqenes, Cl. jrasterianum, які також виділяють багато газу, але токсинів не утворюють. Зіпсовані консерви набувають запах згірклого масла. Останні є кислотостійкими і можуть викликати псування томатного соку і консервованих томатів.
Попередження псування консервів зазначеними бактеріями можливо шляхом дотримання санітарно-гігієнічного режиму при виробництві, а також подкислением консервів лимонною кислотою.
"Пласке скисання" викликається термостійким бактеріями, які обумовлюють мікробіологічну псування (бродіння) продукту без газоутворення та здуття банок. Дефект можна виявити лише після розтину банки. При цьому спостерігається помутніння продукту, поява неприємних кислого запаху і смаку, розм'якшення консистенції. Причинами псування є повільне охолодження після стерилізації, укладання в щільні штабелі неохолоджуваних консервів, підвищені температури транспортування і зберігання.
Мікробіологічна псування консервів може також виявлятися у вигляді пліснявіння, прогоркания, ослизнення продукту, випадання осаду, коагуляції вмісту та інших змін продукту.
Консерви з хімічним бомбажем, в яких виявляються солі олова, заліза, алюмінію, додають м'яса металевий присмак і викликають зміну кольору продукту, органолептично визначають наявністю шорсткості на внутрішній поверхні банки; вони підлягають використанню за вказівкою саннадзора. Хімічний бомбаж наголошується в банках, що мають зовнішню чи внутрішню корозію. Відсутність у цих місцях захисних покриттів, контакт металу банок з продуктом призводять до взаємодії кислот і металів, виділення водню. У продукті при цьому накопичуються важкі метали (олова і заліза в банках з білої жерсті, хрому та заліза - з хромованої жерсті, алюмінію - із сплавів алюмінію).
Фізичний бомбаж консервів є наслідком здуття банок у результаті заморожування їх вмісту, деформації корпуса або переповнювання банок; такі консерви підлягають реалізації за вказівкою саннадзора.
Фізичний бомбаж викликається розширенням продукту при заморожуванні, переповненні тари. На відміну від консервів з мікробіологічними та хімічними бомбажем, які відносяться до критичних дефектів і не дозволяються для реалізації, консерви з фізичним бомбажем реалізуються з дозволу органів охорони здоров'я після відповідної перевірки.
Банки Хлопуши і з вібруючими кінцями відносять до фізичного, шлюбу консервів. Хлопуши - це консерви з постійно роздутими кінцями, що здобувають нормальне положення при натиску, за рахунок чого здувається протилежний кінець (кришка) і лунає характерний клацали звук. Банки з вібруючими кінцями набувають здуття на протилежному кінці лише при натиску на них. Після зняття тиску банки повертаються у вихідне положення, а здуття зникає.
Крім загальних дефектів, консерви можуть мати і специфічні, характерні лише для окремих груп або видів. До них відносять потемніння консервів внаслідок меланоидинообразования, зміна кольору при взаємодії фенольних сполук з металами, сульфідних груп білків з металами (мармуровість тари у зеленого горошку), помутніння сиропу, заливки у натуральних консервів, компотів і маринадів за рахунок розм'якшення сировини і переходу твердих частинок в рідку фракцію консервів (Рогачова, 1953).
1.3.2 Отримання ацетону і бутанолу в ході бактеріального бродіння представників роду З lostridium
Ацетон і бутанол - єдині важливі хімічні речовини, які у великих кількостях отримують шляхом бактерійного бродіння.
Ацетон-бутилового бродіння викликають бактерії роду Сlostridium, а саме З lostridium acetobutylicum та інші види. Бутанол-ізопропаноловое бродіння викликає З l. butulicum, а олійно-уксуснокислое бродіння - З l. buturicum.
Продуценти. Майже всі види роду Сlostridium здійснюють ацетону-бутанол-етанольних ферментацію. Але для отримання розчинників використовують два види - це З l. Acetobutulicum McCoy et. al. і С l. beijerinckii Donker. Нещодавно виявлені нові види, корисні для отримання ацетону і бутанолу: З l. Aurantibutyricum і С l. Tetanomorphum (Група Накамури, Японія). Штам З l. Tetanomorphum утворює бутанол як головний продукт бродіння при невеликій кількості етанолу, оцтової та масляної кислоти, але не ацетону.
Спори клостридій широко поширені в грунті. Велике число штамів (240) виділено з рідини рубця. Бактерії ферментують глюкозу, целлобіозу, крохмаль. Відомі три штами з целлюлазной активністю.
Сl. acetobutylicum - Спороутворюючих, облігатний анаероб, має форму сигарети, розміри клітин 0,6 - 0,9 X 2,4 - 4,7 мкм. Грампозитивні клітини, рухомі за рахунок перитрихиально жгутікованія, діляться поперечною перегородкою, утворюючи ланцюжки. Хоча суперечки не утворюють розчинники, найбільш сильні спорообразователі синтезують найбільшу кількість розчинників. Сl. acetobutylicum при висіві на щільне середовище утворюють колонії 4 типів: I - з темним центром і звели краєм, після декількох пасажів на багатій середовищі з'являються колонії типу II - з коричневим центром і вузькою зоною периферичного зростання, типу III - з коричневим центром без світлого краю і типу IV - світло-коричневі без периферичного росту. Здатність до утворення розчинників знижується в ряду I> II> III. Колонії IV типу практично не утворюють розчинників. З колоній типу II і III реверсі до типу I не виявляється.
Оптимальна температура для росту 37 ° С, рН 6,5. Сl. acetobutylicum зброжує крохмаль, гексози або пентози з перетворенням їх приблизно на 30% в суміш розчинників, а решту складають гази Н 2 і СО 2 у співвідношенні 40: 60. Суміш розчинників складається з н-бутанолу (60%), ацетону (30%) і близько 5-10% припадає на етанол. Сl. beijerinckii зброжує глюкозу та крохмаль з утворенням головним чином н-бутанолу та в менших кількостях ізопропанолу і етанолу. Незвичайний варіант З l. Saccharo - butyl - liquefaciens погано зброжує меляси, але дає прекрасний вихід продуктів у крохмальному середовищі і високу освіту бутанолу; співвідношення ацетон: бутанол: етанол одно 19: 78: 3. У З l. Toanum при зростанні в цукровій середовищі з додаванням знежирених рисових висівок вихід розчинників складає ~ 30%, а їх співвідношення як 52,9 (бутанол): 42,5 (ізопропанол): 3,2 (етанол): 1,4 (ацетон). Для виробництва бутанолу в промисловості використовують Сl. acetobutylicum. При зростанні, у фазі утворення кислот і бутанолу, одночасно з глюкози і реассімілірованного бутирата Сl. acetobutylicum утворює позаклітинний полімер, який може реутілізіроваться культурою як резервне джерело вуглецю. Імовірно полімер представлений ацетильованим полисахаридом.
Виявлено, що промисловий штам наприкінці експоненційної фази росту виділяє речовину аутобактеріоміцін, що володіє антибіотичну дію по відношенню до продуценту, а також до чотирьох штамів сем. Baciallaceae. Бактеріологічний ефект аутобактеріоміціна зростає з віком клітин і концентрації бутанолу. Це аутолізін. Аутобактеріоміцін впливає на концентрацію біомаси та освіта розчинників. Причому встановлено, що якщо аутолізін прикріплений до клітинної стінки, то він грає позитивну роль для зростання. Якщо він звільняється і виділяється в середу в кінці експоненційної фази, то він викликає лізис клітин. Звільнення аутолізіна відбувається у зв'язку з відсутністю дивалентні катіонів у середовищі. Якщо в середу додати Mg 2 +, то збільшується стійкість культури до бутанолу. Той же результат отримують за допомогою ультрафільтрації, яка дозволяє термально денатурувати аутолізін протягом всієї ферментації.
Інгібування синтезу бутанолу аутолізіном служить першорядним обмеженням типовою ацетону-бутаноловой ферментації. Тому ведуться дослідження щодо отримання Lyt - - штамів, і один такий «без аутолізіновий» штам отриманий.
Методом хімічного мутаногенеза нітрозогуанідіном у присутності бутанолу отриманий мутант Сl. acetobutulicum штам 77. У мутанта більш висока питома швидкість, в два рази більше накопичення біомаси у порівнянні з вихідним типом. У процесі ферментації дикий штам споживає 65г глюкози, утворюючи при цьому 20 г · л -1 розчинників протягом 53 ч. Зростання мутантного штаму менш схильний ингибирующем дії бутанолу.
Отримання розчинників у промисловості. Для приготування інокуляту є різні способи. Наприклад, проводять тепловий шок, а потім послідовні пересівання для знищення вегетативних клітин, слабких суперечка, а також для індукції проростання спор. Нагрівання здійснюють по-різному: 100 ° С - 50 с, 100 ° С - 2 хв, 95 ° С - 30 хв, 80 ° С - 5 хв, 75 ° С - 2 хв і 70 ° С - 90 с. Вважають, що збільшення часу теплового шоку при кожному субкультівірованіі сприяє відбору найбільш «сильних» суперечка і, можливо, самих активних бродільщіков. На виробництві культура бактерій зберігається у вигляді спор. Інокулят вноситься в незначній кількості 1: 3000, але його спеціальна підготовка має вирішальне значення для процесу. Помічено, що кращими продуцентами нейтральних продуктів служать культури, спори яких витримують найбільш високу температуру. Вважають, що клітини інокуляту повинні бути рухливими. З сильно рухомими клітинами отримують більше розчинників. Важливо також послідовні маніпуляції робити під час максимальної рухливості клітин і мінімального значення рН. Якщо в якості посівного матеріалу використовують клітини в стадії максимальної рухливості, то вихід бутанолу збільшується 2,5 - 3 рази. Першу, другу і третю генерації проводять в лабораторії. Для Сl. acetobutulicum перший генерація проводиться в середовищі, приготованої на 5% сухих злаків і без поживних добавок, при температурі 37 ° С протягом 24 год Вміст пролбіркі вносять в 300 мл мелассного чи крохмальної середовища з поживними добавками, налитої в колбу на 500 мл і інкубують протягом 24 ч. Далі вміст колби вносять до 4-літрову колбу, що містить 2900 мл того ж середовища. Одна з таких колб з культурою служить інокуляти для першого судини на заводі. Через колби інтенсивно продувають інертний газ і рН знижується до 3,9-4,5. Коли посівний матеріал переносять з колби, кількість вуглеводів має бути наполовину спожито.
Культивування. Періодичне вирощування. При періодичному вирощуванні стежать за рівнем джерела вуглецю і рН. Певний початковий рівень джерела вуглецю обумовлений токсичністю утворених з нього продуктів. Розчинники, і в першу чергу бутанол, інгібують процес, тому при періодичному вирощуванні рідко утворюються понад 20 кг розчинників в 1 м 3. Типові виходи для цього режиму: 0,2 - 0,6 кг / м 3 * год залежно від субстрату і умов культивування. Для видалення кінцевих продуктів ферментації в якості екстрактантов в ферментер додають несмещівающіеся органічні розчинники. Найкращі результати отримані при додаванні олеілового спирту та суміші олеілового спирту (50%) у бензилбензоату. У звичайній ферментації в періодичних умовах поглинання глюкози приблизно 80 кг / м 3. Видалення бутанолу в процесі в процесі екстракції збільшило швидкість його утворення, і максимальна об'ємна продуктивність по бутанолу збільшилася більш ніж на 60% в порівнянні зі звичайною періодичної ферментацією.
Проточне культивування. Щоб збільшити продуктивність і знизити ціни на продукти ферментації, запропоновано проточное культивування.
При одностадійному проточному культивуванні з низькими швидкостями протоки можна одночасно досягати росту клітин і максимального перетворення цукрів у розчинники. Але при низьких швидкостях розведення, сприятливих для синтезу розчинників, виникає нестабільність процесу і досягти стаціонарного стану буває дуже важко. Для промислового застосування такої проточний процес не підходить, так як він повинен бути стабільним протягом кількох тижнів або краще кількох місяців. Стабільність - один з найважливіших критеріїв безперервного процесу.
Причину нестабільності вбачають в токсичності бутанолу на клітини при його високої концентрації і в флоккуляции бактерій. Для усунення флоккуляции клітин, яка виникає в умовах високої концентрації розчинників, рекомендовано додавання до синтетичної середовищі солей хлору (NaCl, KCl, CaCl 2).
При високій концентрації розчинників стабільність ферментації можна поліпшити в двустадійность проточною культурі: ріст клітин оптимізують в першій стадії, а продукцію розчинників - під второй.В оптимальних умов така конфігурація призводить до тривалої стабільності на більш ніж один місяць, навіть при високій концентрації розчинника (21 г / л). При одностадійному проточному культивуванні 20% глюкози не використовується клітинами і залишається в середовищі. У двустадійность процесі 87,5% глюкози перетворюється в розчинники. Комбінуючи дві техніки: двустадійность проточний реактор і рециклювання клітин у другому ферментере, досягають як збільшену продуктивність, так іхорошо стабільність з високою концентрацією розчинників (17 г / л).
Проточний процес ведуть при лімітізаціі по фосфатам (або за сульфатам, але не по азоту або субстрату) у синтетичному середовищі. Розчинники утворюються в межах рН 4,3 - 4,7. Перша стадія - це індукція до синтезу розчинників, друга - безпосередньо освіта розчинників. Оскільки фосфор майже повністю вичерпаний до часу другої фази, ріст клітин зупиняється. При низькій концентрації протоки вихід розчинників в безперервній культурі такий же, як в періодичній: 0,29 г / г глюкози.
При культивуванні Сl. acetobutylicum в хемостате на синтетичному середовищі з вітамінами - біотином (0,01 мг / л) і р-амінобензойної кислотою (1 мг / л) - встановили, що зростання та освіта розчинників лімітується вітамінами. продуктивність збільшується в 4 рази пріувеліченіі концентрації вітамінів у середовищі. У строго анаеробних умовах вихід розчинників в 1,5 рази вище, ніж при доступі повітря. В оптимальних умовах продуктивність розчинників дорівнює ~ 2,0 г / л · год
Середовища. Ферментація. Використовують три типи сировини як джерел вуглецю та енергії: зерно (крохмаль), патокової (неочищену мелясу) і очищену мелясу. В якості субстратів майбутнього розглядають різні відходи, гидролизованную деревину, гідролізати покидьків, сироватку, сульфітні рідини: гідролого - побічний продукт виробництва глюкози із зерна. Середовища із зернового крохмалю готують наступним чином. Борошно вноситься в кількості 60% до води, туди ж додають зброджених залишок ферментації після відгонки розчинників. Кінцева концентрація повинна скласти 8,5% вихідного зерна.
При використанні меляси концентрація цукру повинна бути 5,5-7,5%. До середи додають суперфосфат і амоній. Останній вносять поступово у разі очищених меляси для підтримки рН на рівні 5,6-6,0 в кількості 2,2-1,3% NH 3 по відношенню до концентрації цукру або відразу в разі патокових меляси, які сильно забуферени. У середу вносять 25-50% гарячого залишку після відгонки розчинників. Це збільшує вихід розчинників, знижує кількість додаються поживних речовин, скорочує витрати на нагрівання і дає велику економію пари, необхідної для випаровування залишку. Ферментер і середу стерилізують. Бродіння протікає під надлишковим тиском газів для створення анаеробних умов. Початковий рН 6,0, який знижується до ~ 5,4 через 24 ч.
Концентрація розчинників (при використанні крохмальної середовища) через 50-56 год ферментації 22,5 г / л, а співвідношення ацетону, бутанолу та етанолу 30: 60: 10. Ферментація в мелассного середовищах завершується за 40-45 год, а в крохмальних (з поживними добавками) - за 50-60 год, в крохмальної без поживних добавок за 70-80 год Проточне вирощування бактерій ведеться з роботою серії з п'яти ферментерів. За 18 днів отримують продуктивність в 3 рази вище, ніж при періодичному культивуванні, але виходи розчинників низькі у зв'язку з високою освітою кислот у початковій фазі.
Виділення продуктів. Дистиляція - традиційний спосіб виділення етанолу, ацетону, бутанолу з розлучених водних розчинів. При дистиляції продуктів ацетону-бутилового бродіння можна використовувати тепло, що виділяються при охолодженні стерилізованого нагріванням ферментера. Дистиляція - досить гнучкий процес, при якому можливе фракціонування та виділення кожного продукту.
Більш сучасними методом виділення продуктів є мембранні процеси, наприклад ультрафільтрація і зворотний осмос. Виділення продуктів проводяться за принципом первапорации; це мембранний процес, у якому рушійною силою служить великий вакуум з одного боку мембрани, властивості якої визначають ефективність розділення.
Гарні результати отримують при селективної адсорбції розчинниками на силікаті (цеоліті). Цей процес можна інтегрувати з ферментацією і працювати з більш концентрованими розчинами. Комбінування ферментації і виділення продуктів можливе тільки при проточному культивуванні. Можливо застосування хімічної виділення. Це новий метод, заснований на оборотної хімічної реакції.
Хоча багато хто з перерахованих методів застосовують в лабораторіях і на пілотних установках, у великій промисловості вони не впроваджені в силу недостатності даних або високої вартості. Найбільш реальне впровадження в промисловість способу попереднього видалення води (зворотний осмос) з подальшою традиційної дистиляцією (Воробйова, 1989).

1.4 Застосування ботулінічного токсину в медицині
Про існування ботулінічного токсину було відомо протягом сотень років, проте його благотворний вплив була оцінена по достоїнству лише в останні десятиліття. У 1895 році бельгійський професор Еміль П'єр Ван Ерменгем (Emile Pierre van Ermengem) з містечка Елізель, Бельгія, ідентифікував бактерію Bacillus botulinus. Ця бактерія, згодом перейменована на Clostridium botulinum, виробляє нейротоксин, який є основною частиною комплексу токсину ботулізму типу А.
У 1946 році доктор Едвард Шанц (Edward J. Schantz) і його колеги отримали очищений токсин ботулізму типу А в кристалічній формі. Таким чином, у дослідників вперше з'явився необроблений матеріал, який був необхідний їм для більш детального вивчення. Перший серйозний результат досліджень з'явився в 1950-х роках, коли доктор Вернон Брукс (Vernon Brooks) виявив, що при введенні в гіперактивну м'яз токсин ботулізму типу А блокує вивільнення ацетилхоліну із закінчень рухових нервів, викликаючи тим самим тимчасове розслаблення ін'єкційованого м'язи. Відкриття доктора Брукса викликало новий інтерес до ботулінічного токсину як до потенційно значущого терапевтичному засобу.
У 1960-1970-х роках офтальмолог Алан Скотт (Alan B. Scott) з Центру дослідження ока Сміта Кеттлуелла (Каліфорнія, США) провів на приматах ряд дослідів по введенню токсину ботулізму типу А для лікування косоокості. Метою дослідів було визначити можливість застосування препарату для лікування косоокості типу «офтальмологічної дистонії» в людей.
В кінці 1970-х років доктор Скотт організував власну компанію - Oculinum, Inc., Де продовжив вивчення токсину ботулізму типу А. У 1978 році доктор Скотт отримав дозвіл FDA (Управління з контролю за продуктами і ліками) на дослідження використання ботулінічного токсину типу А на людях-добровольцях.
У 1988 році компанія Allergan придбала права на розповсюдження розробленого доктором Скоттом препарату Oculinum, заснованого на токсини ботулізму типу А, і проведення клінічних досліджень ефективності препарату при інших показаннях, включаючи цервикальную дистонію.
У 1989 році компанія Oculinum, Inc. отримала дозвіл FDA на продаж препарату Oculinum в США, як препарату для лікування косоокості та блефароспазму, включаючи ідіопатичний блефароспазм або порушення VII нерва у пацієнтів у віці від 12 років.
Незабаром після цього компанія Allergan Inc. придбала компанію доктора Скотта. На основі успішного застосування токсину ботулізму типу А в лікуванні косоокості і блефароспазму, пов'язаних з дистонією, компанія Allergan отримала дозвіл FDA на зміну назви препарату на BOTOX ®. Ця заміна назви відбила стратегію Allergan, що стосується розвитку інших галузей застосування препарату.
BOTOX ® використовується в Росії вже більше 10 років з моменту його першої реєстрації в 1994 році для лікування блефароспазму і геміфаціального спазму. Протягом останніх 10 років незмінно зростала кількість свідчень для застосування BOTOX ®. В даний час вони включають цервикальную дистонію, дитячий церебральний параліч, спастичність, що виникла в результаті інсульту, і пахвовий гіпергідроз.
Перед вживанням нейротоксин ботулізму проходить спеціальне очищення і зв'язується з альбумінами. Такий зв'язок робить токсин більш стійким, зберігає його біологічну активність, забезпечує локальна дія препарату. Нейротоксин блокує передачу рухового імпульсу з нерва на м'язове волокно. Після введення препарату наступає виражене розслаблення мімічних м'язів. Атрофії м'язів не спостерігається, так як їх кровопостачання залишається тим самим. У середньому максимум терапевтичного ефекту проявляється на 14-15 день. Нейротоксин блокує передачу імпульсу не тільки на м'язи, але й на потові залози і, таким чином, зменшує потовиділення. Препарати успішно застосовуються для лікування підвищеного потовиділення на долонях, у пахвових западинах і на стопах.
Тривалість дії становить 6-9 місяців, іноді - до 1 року. Рухливість мускулатури частково відновлюється через 3-4 місяці, повне відновлення спостерігається через 5-8 місяців. Після повторних ін'єкції тривалість ефекту доходить до 6-12 місяців. Для досягнення стійкого і тривалого ефекту рекомендується введення препаратів 2-3 рази протягом року. При місцевому введенні в терапевтичних дозах ботулінічний токсин типу А не викликає системного (на весь організм) дії, тривалість лікування ним необмежена.
Відносні протипоказання: міастенія, порушення згортання крові, запальний і / або інфекційний процес у областях передбачуваних ін'єкцій, загальні захворювання у стадії загострення, прийом лікарських засобів (антибіотиків, антикоагулянтів, антиагрегантів, реланиума, баклофену), хронічні обструктивні захворювання легень, вагітність і період грудного вигодовування, вік до 12 років, небажано проводити процедуру в перші дні менструального циклу.
Можливі ускладнення, такі як оборотне опущення верхньої повіки (частота виникнення 0,14%), опущення брів (менше 1%), двоїння в очах (2%), набряк вік (0,14%), не пов'язані з самими препаратами, вони можуть виникнути при неправильному виборі способу і місця введення, неадекватною дозі або при недотриманні стерильності. Важливо пам'ятати, що всі вони безслідно зникають з часом. Побічні ефекти: болючість у місці ін'єкції (частота виникнення 1,3%), головний біль (2%), крововиливи у місці введення (6%), оніміння в місці ін'єкції (менше 1%), алергія (менше 1%). Нечутливість до нейротоксину зустрічається рідко (менше 0,1%) (www. BOTOX.com).
Рід Clostridium включає анаеробні, грампозитивні спороутворюючі палички, широко поширені в зовнішньому середовищі. Вони виявляються у грунті, відкладеннях морських і прісних вод, кишковому тракті людей і тварин. Представники роду можуть бути патогенні для людини і тварин, викликаючи ранову інфекцію або кишкові захворювання, однак знаходять і практичне застосування в промисловості (в парфумерній промисловості, для одержання в промисловому масштабі ацетону і бутанолу), в медицині (для лікування блефароспазму, геміфаціального спазму, цервікальної дистонії, дитячого церебрального паралічу, спастичності, що виникла в результаті інсульту, і пахвового гіпергідрозу). Описано багато видів, їх кількість в даний час перевищує 100, проте багато з них залишаються слабко вивчені (Пивоваров, 2000).

Глава 2. Об'єкти і методи досліджень
2.1 Об'єкти дослідження
Використовувалися різні об'єкти, такі як грунт з ясеневого лісу і поля, рослинні волокна, а також харчові продукти, а саме консерви: кілька в томатному соусі і баклажанна ікра.
2.2 Виявлення мезофільних анаеробних мікроорганізмів
(ГОСТ 10444.4)
Метод призначений для визначення стерильності і промислової стерильності консервів, для з'ясування причин виникнення дефектів консервів.
Проведення аналізу. Для виявлення анаеробних мікроорганізмів посів відбувається у дві пробірки з середовищем Кітт-Тароцці з додаванням 0,15% агару. Безпосередньо перед посівом агаризованому (напіврідку) середу Тароцці прогрівають 25 хв у киплячій водяній бані і потім швидко охолоджують до температури 30-40 ° С. Засіяні пробірки поміщають у термостат. Термостатування посівів консервів з рН вище 4,4 проводять при 37 ± 0,5 ° С, контролюючи щодня протягом 5 діб появи в них ознак росту мікроорганізмів. Розвиток мезофільних анаеробних мікроорганізмів у посівах супроводжується помутнінням середовища, виділенням газу, появою сторонніх запахів (гнильний, сирний, маслянокислі), в деяких випадках розкладанням печінки, рідше почорнінням середовища.
Муть з'являється майже по всій товщі стовпчика, іноді відступаючи від його поверхні на 0,5 - 1,0 см. надалі клітини мезофільних анаеробних мікроорганізмів осідають на дно і помутніння може зникнути.
При дослідженні під мікроскопом мазків з культури 18-24 віку можна виявити палички, позитивно окрашивающиеся по граму і утворюють спори. Кількість паличок зі спорами невелика, а при виявленні Cl. Perfringens суперечки зазвичай відсутні. Для підтвердження приналежності виявлених спороутворюючих мікроорганізмів до мезофільних облігатним анаеробів з роду клострідіум перевіряють відсутність у них каталази. Якщо в посівах виявлені спороутворюючі грампозитивні мікроорганізми, але каталаза не виявлено, то аналіз на виявлення припиняють і вважають, що в посівах присутні мезофільні облігатно-анаеробні мікроорганізми з роду клострідіум.
Якщо при мікроскопірованіі посівів спороутворюючі мікроорганізми не виявлені, то негативна проба на каталазу не є достатньою для висновку про присутність у посівах мезофільних облігатно-анаеробних мікроорганізмів і аналіз продовжують. Аналіз на виявлення мезофільних облігатно-анаеробних мікроорганізмів продовжують у разі присутності в посівах змішаної мікрофлори і позитивної проби на каталазу.
Після появи ознак росту. з посівів 1 мл переносять у стерильну пробірку і заливають розплавленим агаром температурою не більше 45 ° С. Пробірку заливають до верху і закривають пробкою так, щоб не залишилося бульбашок повітря. Посіви термостатують 24-48 годин при 37 ± 0,5 ° С. При виявленні розривів в агарі вважають, що в посіві присутні мезофільні облігатно-анаеробні мікроорганізми (методична розробка, АГТУ, 1998).
2.3. Виявлення термофільних анаеробних мікроорганізмів
(ГОСТ 10444.6)
Метод призначений: для визначення стерильності або промислової стерильності консервів, призначених до реалізації в умовах з температурою 30 ° С і вище; для з'ясування причин виникнення дефектів томатопродуктів та консервів з рН вище 4,6.
Суть методу: виявлення в консервах життєздатних термофільних анаеробних мікроорганізмів розмножуватися при температурі 55 ° С і давати зростання на рідких поживних середовищах з низьким окислювально-відновним потенціалом. У рідких живильних середовищах Cl. Termosaccharolyticum викликає рясне газоутворення, помутніння середовища і її підкислення.
Проведення аналізу. Безпосередньо перед посівом живильне середовище (Кітт-Тароцці) регенерують, прогріваючи її 25 хв у киплячій водяній бані і швидко охолоджуючи до 40 ° С.
Для встановлення промислової стерильності і при виявленні збудників псування по 2 см 3 проби висівають у дві пробірки з 12-13 см 3 регенерованої живильного середовища (стерильності по 30 см 3 в три флакони з 200 см 3 живильного середовища).
Посіви термостатують при 55 ± 0,5 ° С протягом 72 годин. Зростання вже виявляється через 12-14 годин. Після появи ознак росту з посівів готують мазки, фарбують за Грамом, мікроскопіруют.
Термофільні анаеробні мікроорганізми - тонкі довгі гранульовані палички, які нерегулярно утворюють спори. Забарвлення по Граму негативна у Cl. Termosaccharolyticum, позитивна у Cl. Termoaceticum і Cl. Nigrificans. З посівів з дна беруть пробу дя визначення каталази.
Якщо в культурі виявлена ​​каталаза, то в посіві присутні аеробні мікроорганізми. Для виділення зі змішаної мікрофлори 1-2 мл підозрюваної культуральної рідини вносять у стерильну пробірку і заливають розплавленим агаром з температурою не вище 47 ° С. Пробірку заливають агаром доверху і закривають пробкою, щоб не залишилося бульбашок повітря. При виявленні в агарі розривів роблять висновок про наявність термофільних анаеробів (методична розробка, АГТУ, 1998).
2.4 Виявлення збудників бродіння пектинових речовин
Постановка досвіду. Снопик лляної соломи заввишки 6-7 см перев'язують у двох місцях ниткою і вносять в пробірку краще більшого, ніж стандартний, розміру, наповнену на 2 / 3 водопровідною водою. Пробірку затискають пінцетом і кип'ятять на пальнику 2-3 хв для видалення екстрактивних (легкосбражіваемих) речовин, які можуть служити джерелом вуглецю для інших маслянокислих бактерій. Вода набуває жовто-зелений колір. Її зливають. Знову наповнюють пробірку водопровідною водою, кип'ятять кілька хвилин і зливають. Так роблять 5-6 разів. Після останнього кип'ятіння рідина не зливають. Охолоджують пробірку під краном, і в снопик вводять свіжу соломину, не піддалася нагріванню.
Пробірку із снопиків ставлять у термостат при 30-35 ° С. Через 2-3 дні в ній починається бродіння, а через 5-8 доби воно закінчується. Накопичення в культуральній рідині масляної кислоти поряд з оцтової, що утворюється при зброджуванні продуктів гідролізу пектину, можна виявити за допомогою якісних реакцій на масляну кислоту.
Мікроскопування. Видаляють снопик ізпробіркі, з його середини виймають кілька соломинок і вичавлюють з нього трохи рідини на предметне скло. Додають краплю розчину Люголя, накривають покривним склом і мікроскопують з імерсійної системою.
На препараті зазвичай видно великі паличкоподібні бактерії з плектрідіальним типом спорообразования (барабанна паличка) і переривчастим розташуванням гранульози, пофарбованої в синій колір. Це Clostridium pectinovorum. Нерідко можна знайти Cl. felsineum - палички меншого розміру сигароподібний форми зі спору на кінці. Гранулеза може заповнювати всю вегетативну частину клітини (Шільнікова, 2004).

2.5 Виявлення збудників бродіння целюлози
Постановка досвіду. Для отримання накопичувальної культури целлюлозоразрушающіх бактерій використовують середу Омелянського (додаток). У високі пробірки на 2 / 3 заливають середу Омелянського, додають 1 г досліджуваної грунту, потім пастеризують 10 хв при 80 ° з метою звільнення від супутніх аеробних бесспорових бактерій. На дно пробірки поміщають смужки фільтрувального паперу шаром 1,5-2 см, доливають стерильною живильного середовища доверху і закривають пробкою. Пробірки інкубують при 30-35 ° С. Через 5-7 доби починається бродіння целюлози, в ході якого інтенсивно виділяються гази, фільтрувальний папір по мірі зброджування злегка ослизнюється, жовтіє і поступово руйнується.
Мікроскопування. При дослідженні целлюлозоразрушающіх бактерій витягають пінцетом з дна пробірки шматочок розкладається папери і розмазують по предметному склу без додавання води. Мазок сушать звичайним способом, фіксують на полум'ї пальника і забарвлюють фуксином. У пробірках розвиваються довгі тонкі палички з круглою спору на кінці - Clostridium omelianskii, також спостерігається розвиток довгих великих паличок з грушоподібної спору на кінці - Clostridium dissolvens (Шільнікова, 2004).
2.6 Виявлення анаеробних азотфіксуючих мікроорганізмів, що викликають маслянокислое бродіння
Постановка досвіду. Для виявлення в грунті анаеробних азотфіксуючих бактерій роду, які також викликають маслянокислое бродіння, Clostridium користуються методом накопичувальної культури в рідкому середовищі Виноградського (додаток). Середу наливають в пробірки високим шаром, засівають грудочками досліджуваної грунту і пастеризують 10 хв при 80 ° з метою звільнення від супутніх аеробних бесспорових бактерій. Через 2-3 доби після посіву середу каламутніє, з неї починають виділятися бульбашки газу, що свідчить про розвиток анаеробних спорових бактерій, що викликають у відповідних елективних умовах маслянокислое бродіння. Глюкоза при цьому перетворюється у масляну кислоту і вуглекислий газ, а в пробірках утворюється багато піни, з'являється запах масляної та оцтової кислот. Остання також є одним з продуктів маслянокислого бродіння. Зазвичай цей метод використовують для виявлення клітин Clostridium pasteurianum, які легко побачити при мікроскопірованіі осаду. Перед спорообразование в клітинах Clostridium pasteurianum накопичується багато гранульози, для якої характерно фарбування розчином Люголя. Краплю рідини, що містить клітини клостридій, накривають покривним склом і до одного краю скла підносять піпетку з розчином Люголя, а до іншого - фільтрувальний папір, яка засмоктує розчин під покривне скло. При мікроскопірованіі препарату видно клітини клостридій з потемнілим вмістом. Суперечки в клітці залишається при цьому незабарвленої і добре помітна на темному фоні (Зеновій, 2002).

3. Виділення бактерій роду Clostridium з різних об'єктів
3.1 Результати посівів у рідке середовище Кітт-Тароцці для виявлення мезофільних і термофільних анаеробних мікроорганізмів
У всіх пробірках (таблиця 1, 2, 3) спостерігається помутніння середовища, поява муті і гнильного запаху, в деяких пробірках - газоутворення і утворення піни на поверхні середовища. Мікроскопія показала наявність у всіх пробірках спороутворюючих грампозитивних і грамнегативних паличок. Тест на каталазу у всіх пробірках негативний.
3.2 Результати посівів для виявлення збудників бродіння пектинових речовин
У всіх трьох пробірках спостерігається помутніння середовища, виділення газу, невелике піноутворення. При мікроскопірованіі виявлені великі паличкоподібні спороутворюючі бактерії у вигляді барабанної палички, пофарбовані в синій колір, з добре помітними незабарвленими спорами, що свідчить про присутність імовірно Clostridium pectinovorum і Clostridium felsineum.
3.3 Результати посівів у рідке середовище Омелянського для виявлення збудників бродіння целюлози
При огляді накопичувальних культур із середовищем Омелянського через кілька діб в пробірках з різними пробами грунту отримані наступні результати.
Проба грунту № 1 (ясеневий ліс): поява неприємного гнильного запаху, невелике газоутворення, помутніння середовища, випадання осаду білого кольору, поява на папері жовтих пігментних плям. При мікроскопірованіі виявлені довгі тонкі палички з круглою спору на кінці, що свідчить про присутність імовірно Clostridium omelianskii.
Проба грунту № 2 (поле): поява неприємного гнильного запаху, рясне газоутворення, помутніння середовища, пожовтіння і руйнування паперу в деяких місцях. При мікроскопірованіі виявлені довгі тонкі палички з круглою спору на кінці, що свідчить про присутність імовірно Clostridium omelianskii.
3.4 Результати посівів на рідке середовище Виноградського
При огляді накопичувальних культур із середовищем Виноградського через кілька діб в пробірках з різними пробами грунту отримані наступні результати.
Проба грунту № 1 (ясеневий ліс): чітко видимі зміни, такі як помутніння середовища, виділення пухирців газу, утворення піни, поява запаху оцтової кислоти. При мікроскопірованіі краплі рідини накопичувальної культури, пофарбованої розчином Люголя, видно клітини з потемнілим вмістом і незабарвленими спорами, добре розрізнятися на темному тлі. Це свідчить про присутність у середовищі імовірно Clostridium pasteurianum.
Проба грунту № 2 (поле): видимих ​​змін практично немає, за винятком невеликого, ледь помітного, помутніння. Однак, при мікроскопірованіі краплі рідини накопичувальної культури, пофарбованої розчином Люголя, виявлені клітини з потемнілим вмістом і незабарвленими спорами, добре розрізнятися на темному тлі, у невеликій кількості. Це свідчить про присутність у середовищі імовірно Clostridium pasteurianum.
Таблиця 1
Результати посівів на середу Кітт-Тароцці проби № 1 (кілька в томатному соусі)
Температура
Культуральні ознаки
Морфологічні ознаки
33 ° С
Помутніння середовища, поява желеподібного помаранчевого осаду по всьому стовпчика рідини, газоутворення, поява гнильного запаху, руйнування печінки.
Дрібні Р «+» палички, суперечки.
55 ° С
Рясне газоутворення, помутніння середовища, поява желеподібного осаду по всьому стовпчика рідини, часткове руйнування печінки,
Довгі тонкі Р «+» палички, гранульовані, іноді зустрічаються скупчення Г «-» паличок.
При порівнянні морфологічних і культуральних ознак з даними в визначнику бактерій можна сказати, що дані мікроорганізми імовірно Cl. Perfringens, Cl. Termoaceticum, Cl. Nigrificans, Cl. Termosaccharolyticum.
Таблиця 2
Результати посівів на середу Кітт-Тароцці проби № 2 (кабачкова ікра)
Температура
Культуральні ознаки
Морфологічні ознаки
33 ° С
Поява каламуті по всьому стовпчика пробірки, повне руйнування печінки, невелике газоутворення,
Грамваріабельние коки, покручені, Г «+» спороутворюючі палички у вигляді барабанної палички.
55 ° С
Поява желеподібної каламуті по всьому стовпчика рідини, невелика кількість піни на поверхні рідини, часткове руйнування печінки, слабке газоутворення.
Скупчення тонких і дуже довгих Р «+» палички.
Також можна сказати про присутність імовірно Cl. Perfringens, Cl. Termoaceticum і Cl. Nigrificans.
Таблиця 3
Результати посівів на середу Кітт-Тароцці проби № 3 (кишечник свіжої риби)
Температура
Культуральні ознаки
Морфологічні ознаки
33 ° С
Помутніння середовища по всьому стовпчика рідини, руйнування печінки з виділенням крові, рясне газоутворення, поява піни на поверхні рідини.
Довгі бесспоровие Р «+» палички, Р «-» коки.
55 ° С
Поява однорідної желеподібної каламуті по всьому стовпчика рідини, невелике газоутворення, часткове руйнування печінки.
Тонкі довгі бесспоровие Р «+» палички, скупчення спорообразующих Р «+» паличок у вигляді барабанної палички.
При порівнянні морфологічних і культуральних ознак з даними в визначнику бактерій можна сказати, що дані мікроорганізми імовірно Cl. Perfringens, Cl. Termoaceticum і Cl. Nigrificans.
Таблиця 4
Результати тесту на каталазу
Об'єкт
Можливий вигляд
Результати тесту на каталазу
Остаточний вигляд
Грунт ясеневий ліс
Cl. pasteurianum, Cl. omelianskii
негативний
Cl. pasteurianum, Cl. omelianskii
Грунт полі
Cl. omelianskii,
Cl. pasteurianum
негативний
Cl. omelianskii,
Cl. pasteurianum
Рослинні волокна
Cl. pectinovorum,
Cl. felsineum
негативний
Cl. pectinovorum,
Cl. felsineum
Свіжа риба
Cl. perfringens, Cl. termoaceticum, Cl. nigrificans
негативний
Cl.perfringens, Cl. termoaceticum, Cl. nigrificans
Консерви (мезофілл)
Cl. perfringens
негативний
Cl. perfringens
Консерви (термофіли)
Cl. termoaceticum, Cl. nigrificans, Cl. termosaccharolyticum
негативний
Cl. termoaceticum, Cl. nigrificans, Cl. termosaccharolyticum

Висновки
Бактерії роду Clostridium виділені з наступних об'єктів:
- З грунту - Cl. pasteurianum (що володіє азотфіксуючими властивостями і викликає маслянокислое бродіння), Cl. omelianskii, що викликає бродіння целюлози;
- З волокон рослин Cl. pectinovorum і Cl. felsineum;
- З стерильних консервів мезофільні мікроорганізми Cl. perfringens, термофільні мікроорганізми Cl. termoaceticum, Cl. nigrificans, Cl. termosaccharolytic;
- З сирої риби Cl. perfringens, Cl. termoaceticum, Cl. nigrificans.

Список літератури
1. Ассонов Н.Р. Мікробіологія. - 2-е вид., Перераб. і доп. - М.: Агропромиздат, 1989. - 350 с.
2. Воробйова Л.І. Промислова мікробіологія. - М.: Вища школа, 1989. - 293 с.
3. Ємцев В.Г. Деякі питання морфології і фізіології азотфіксуючих Clostridium. - М.: Колос, 1966. - 60 с.
4. Зенов Г.М., Степанов О.Л. Практикум з біології грунтів. Вид. Московського університету, 2002. - 120с.
5. Інструкція 4.2.10-15-21-2 Мікробіологічні методи виділення та ідентифікації збудників при бактеріальних харчових отруєннях. Міністерство охорони здоров'я Республіки Білорусь, 2004. - 62 с.
6. Методична розробка до лабораторних робіт. Санітарно-мікробіологічний контроль консервного виробництва. - Астрахань: АГТУ, 1998. - 32 с.
7. Нетрусов А.І. Практикум з мікробіології .- М.: Академія, 2005. - 600 с.
8. Овруцька І.Я., Погодяева А.Я. Мікробіологія і мікробіологічний контроль виробництва сухих картопляних і овочевих продуктів. - М:. Легка і харчова промисловість, 1983. - 88 с.
9. Пивоваров Ю.П., Королин В.В. Санітарно-значимі мікроорганізми. -М.: Видавництво ІКАР, 2000. - 268 с.
10. Практикум з мікробіології / За редакцією Шільніковой В.К. - М.: Дрофа, 2004. - 256 с.
11. Работнова І.Л. Загальна мікробіологія. - М.: Вищ. школа, 1966. - 271 с.
12. Рогачова О.І. Мікробіологічний контроль консервного виробництва. - М.: Піщепроміздат, 1983. - 95 с.
13. www. BOTOX.com
Додаток № 1
Рецепти основних поживних середовищ:
Середа Виноградського для анаеробних азотфиксаторов роду Clostridium
Глюкоза 20,0 г
До 2 НРО 4 1,0 г
MgSO 4 * 7H 2 O 0,5 г
СаСО 3 20,0 г
NaCl 0,5 г
MnSO 4 і FeSO 4 сліди
Вода дистильована 1000 мл
У середу рекомендується вносити суміш мікроелементів за Федоровим 1мл / л.
Середа Кітт-Тароцці для мезофільних і термофільних анаеробних мікроорганізмів
Для приготування середовища стерильні пробірки заповнюють на 1,0-1,5 см шматочками печінки, м'яса або риби і заливають приготовленим м'ясо-пепетонним бульйоном з глюкозою і агаром. В 1 дм 3 м'ясо-пептонний, рибо-пептонному або печінкового бульйону вносять 10 г глюкози і 1,5 г агару, який при нагріванні поступово розплавляють (висота шару бульонав звичайних пробірках 12-13 см, у високих 15-18 см) і стерилізують 20 хв при температурі (121 ± 1) ° С. Необхідну величину рН перевіряють до і після стерилізації рН середовища після стерилізації має бути (7,1 ± 0,1).
М'ясо-пептонний бульйон (МПБ)
Основою для пріготовле6нія служить м'ясна вода, яку готують таким чином: м'ясо звільняють від кісток жиру і сухожиль, дрібно нарізають або пропускають через м'ясорубку. 500 г отриманого м'ясного фаршу заливають 1 л водопровідної водою і залишають для екстракції при кімнатній температурі на 12 год або в термостат при температурі 37-39 ° С на 2 год, а при 50 ° С - на 1 ч. За цей час з м'яса екстрагуються різні речовини, в тому числі водорозчинні вітаміни. Потім м'ясо віджимають через марлю, і отриманий настій кип'ятять 30 хв. При цьому згортаються білки. Остиглу масу фільтрують через ватяний фільтр і доливають водопровідної води до початкового об'єму. До отриманої м'ясної води додають 1% пептона і 0,5 NaCl. У разі необхідності додають вуглеводів в кількості 1-2 г на 100 мл. МПБ стерилізують при 1 ати 20-30 хв.
Середа Омелянського для виділення збудників анаерробного бродіння целюлози.
МПБ 500 мл
стерильна вода 500 мл
крейда 3 г
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Курсова
207.9кб. | скачати


Схожі роботи:
Поширення мікроорганізмів роду Clostridium в природі і харчових продуктах
Роль мікроорганізмів у кругообігу хімічних елементів у природі
Усипальниця роду Романових Розповідь про Новоспаському монастирі
Формування динамічних уявлень про зміни в живій природі у старших дошкільнят
Загальні відомості про дикорослих харчових лікарських та отруйних раст
Загальні відомості про дикорослих харчових лікарських та отруйних рослинах
Поширення неправдивої інформації про товари і послуги
Реклама двигун Про лінгвістичної природі ефекту мовного впливу на текстах телереклами
Поняття про пухлини Їх поширення та історія розвитку вчення
© Усі права захищені
написати до нас