Перші кроки електробіологіі
о было охарактеризовать так: Италия, XVIII век, то теперь происходит "смена декораций" - на сцене Германия, XIX век. Якщо в першій половині нашої розповіді місце і час дії мо жн про було охарактеризувати так: Італія, XVIII століття, то тепер відбувається "зміна декорацій" - на сцені Німеччина, XIX століття.
Але міняються не тільки час і місце, змінюється і сам характер науки. У XVIII столітті наукою займалися в основному одинаки і серед них - багато любителів. У XIX столітті вчений - це професія: їх робота менше залежить від милості меценатів або особистого стану, працюють вчені в лабораторіях або навіть спеціальних наукових інститутах. Це полегшує їх особисті контакти, сприяє обміну думками, прискорює поширення нових ідей. Наведемо один важливий для нас приклад.
У 30-ті роки XIX століття в Берлінському університеті працювали два молодих вчених - М. Шлейден і Т. Шванн. Ботанік Шлейден при одній із зустрічей розповів своєму приятелеві зоолога Шван, що, виявляється, у всіх клітинах рослин є ядра і вони грають важливу роль у життєдіяльності клітин. Тоді зоолога Шванна спало на думку, що "бульбашки", які він бачив у тканинах тварин і які клітинами не вважали, тому що вони не відокремлюються один від одного добре видимими стінками, як у рослин, насправді, ймовірно, і є справжні клітини - адже у них теж є ядра! Звернувшись до мікроскопа, обидва вчених переконалися, що спільність картини безсумнівна. Таким чином, особистий контакт двох біологів прискорив створення клітинної теорії, 150-річчя якої відзначатиметься в 1989 р.
Взагалі, поява наукових колективів, наукових шкіл є характерною рисою, що відрізняє науку XIX століття. Вчені однієї школи виробляли спільну позицію, мали спільних учнів, обмінювалися результатами; наукова школа - це в певному сенсі колективний розум.
Подальший розвиток електробіологіі тісно пов'язане з науковим колективом, родоначальником якого був професор Берлінського університету І. Мюллер. Його учнями були Т. Шванн - творець клітинної теорії, Р, Вірхов - один з творців клітинної фізіології, Е. Геккель - знаменитий дарвініст, сформулювавши біогенетичний закон, Г. Гельмгольц - один з відкривачів закону збереження енергії і багато інших. Його учнем був і Еміль Дюбуа-Реймон - "батько" електрофізіології, Дюбуа-Реймон і його друзі
Ще в студентські роки Е. Дюбуа-Реймон разом зі своїми друзями К. Людвігом, Е. Брюкке і Г. Гельмгольцем виробили чітку наукову програму; створити нову фізико-хімічну біологію.
В одному зі своїх ранніх листів Дюбуа писав: "Брюкке і я - ми поклялися виявити правду, що в організмі не діють ніякі інші сили, крім фізичних і хімічних".
Слова "інші сили" - це натяк на "життєву силу", за допомогою якої в той час більшість учених пояснювали життєві процеси. На противагу цій точці зору четверо друзів стверджували, що фізика повинна не просто служити зразком експериментального підходу до природи і строгості міркувань, але і прямо використовуватися для пояснення біологічних явищ. Вони вважали, що знання фізики необхідно для біолога, і підручники з фізіології, які вони напишуть, ставши маститими і знаменитими, будуть починатися з викладу фізичних законів. У всіх своїх роботах при вивченні самих різних фізіологічних явищ друзі залишалися вірними своїй біофізичної програмі.
Наукове життя Дюбуа була дуже вдалою. Вже у віці 33-х років він став членом Прусської академії наук. Йому вдалося створити спеціальний інститут, де були відділи фізики хімії мікроскопічних дослідження спеціальні майстерні, де виготовлялися прилади в обладнання. У цьому інституті бували і працювали багато німецьких і приїжджі вчені, наприклад, з Росії приїжджали І.М. Сєченов, Н.Є. Введенський, В.М. Бехтерєв, знаменитий лікар С.П. Боткін і ін Саме в результаті робіт Дюбуа виник новий відділ фізіології - фізіологія м'язів і нервів.
А почалося все з того, що в 1841 Г.І. Мюллер дав йому, тоді 22-річному студентові третього курсу, тему для самостійної роботи - повторити досліди Меттеучі, який до цього часу став вже академіком.
Дюбуа захопився цією темою, і хоча надалі він іноді займався іншими питаннями, фактично всю свою наукову життя присвятив електрофізіології.
Продумуючи отримане від Мюллера завдання, Дюбуа зрозумів, що "повторити" досліди Маттеучі не так-то просто: у цей час кожен вчений мав прилади власної конструкції, і зіставляти їх показання було практично неможливо. Тому Дюбуа, виконуючи курсову роботу, одночасно поставив своїм завданням розробити спеціальне обладнання, яке дозволило б у різних лабораторіях отримувати порівнювані результати. У підсумку він створив комплекс приладів, що обслуговує всі основні моменти досліджень: роздратування м'язів і нервів, відведення виникають у них потенціалів, тобто, як їх прийнято називати, біопотенціалів, та їх реєстрацію.
Прилад для роздратування, який називався "санний апарат Дюбуа-Реймона", дозволяв суворо дозувати дратівливу дію. Він являв собою дві котушки з великим числом витків; одна котушка могла висуватися з іншої, ковзаючи по спеціальним полозах. До внутрішньої - первинної - котушці приєднали джерело струму - гальванічний елемент Даніеля з відомим значенням е.. д. с. У ланцюг був включений трамблер струму - молоточок нефа, такий, який зараз використовують в електричному дзвінку. У вторинній котушці виникав індукційний струм; цим індукційним струмом дратували нерв або м'яз. Якщо одну з котушок висували далеко з іншої, то дратівливий струм був слабшим, ступінь висунення котушок відзначалася на спеціальній лінійці. І якщо в статтях з біології було написано: "Сила роздратування була дорівнює 12 см", всі розуміли це однозначно. Індукційні котушки використовувалися в біологічних лабораторіях ще в 50-х роках ХХ століття; тільки років двадцять п'ять тому їх витіснили електронні генератори струму, так звані електростимулятори.
Удосконалення, введене Дюбуа для відведення біопотенціалів, було дуже істотним: він зрозумів, що біопотенціали не можна відводити просто мідними тяганиною, оскільки в місці зіткнення металу з тканиною виникають потенціали, цілком порівнянні з тими, які хочуть виміряти. Розроблені Дюбуа спеціальні електроди не створювали такої різниці потенціалів.
Труднощі, пов'язані з вимірюванням біопотенціалів, подібні багато в чому з труднощами виміру е.. д. с. джерела; їх не усунути тільки підвищенням чутливості приладів, необхідно ще, щоб внутрішній опір приладу було набагато вище внутрішнього опору джерела струму. Дюбуа дотепно обійшов ці труднощі, придумавши так званий компенсаційний метод вимірювання потенціалу, що виникає в м'язі.
Усі ці, здавалося б, технічні і тому другорядні удосконалення насправді зіграли важливу роль у тому, що дослідження Дюбуа-Реймона, розпочаті ним на студентській лаві, стали видатним досягненням науки того часу. Більше того, вони мали істотний вплив і на рівень усіх проведених у той час робіт з електробіологіі, так як Дюбуа-Реймон широко пропагував свої прилади, дарував їх своїм колегам. Словом, як би тепер сказали, займався впровадженням свого комплексу, домагаючись стандартизації електричних вимірювань в біології.
Слід зазначити, що така стандартизація абсолютно необхідна для дотримання загальноприйнятого в сучасній науці вимоги до експерименту - вимоги відтворюваності. Так що увага Дюбуа до "технічною", методичної стороні справи слід розглядати як серйозний внесок у розробку загальних принципів методології природничих наук.
Роботи Дюбуа-Реймона йшли у двох основних напрямах: по-перше, він вивчав струми, що генеруються живими тканинами, по-друге, він вивчав закони дії електричного струму як подразника нервів і м'язів.
Роботи Дюбуа і його школи по першому напрямку дали можливість виділити з різноманіття окремих розрізнених експериментальних даних два основних явища електробіологіі.
Основні явища електробіологіі: біопотенціали
Якщо надрізати м'яз упоперек волокон, то між розрізом і недоторканою поверхнею м'язи виявляється різниця потенціалів. Струм, що реєструється при цьому, Дюбуа-Реймон назвав струмом ушкодження.
Якщо дратувати нерв або м'яз, то в місці подразнення виникає електричний сигнал, який поширюється по нерву або м'язі; цей сигнал Л. Герман назвав струмом дії.
З усією властивою йому ретельністю Дюбуа застосував розроблений ним комплекс приладів до вивчення цих явищ. Так, він не просто повторив досліди Маттеучі, який показав, що в пошкодженій м'язі виникає електричний струм, а перевірив, як змінюється картина, якщо електроди поміщати ближче до місця пошкодження або далі, що буде, якщо обидва електроди ввести в ушкоджений кінець мишцИа чи залежить струм повре; кденія від напрямку розрізу і його величини, чи однаково явище в різних м'язах і т.д.
Виявляється, що у всіх м'язах спостерігається приблизно однакова картина: по зовнішній поверхні пошкодженої м'язи йде електричний струм у напрямку до місця розрізу, причому з плином часу сила струму слабшає. Цей процес досить тривалий: струм зникає через кілька годин після пошкодження.
Дюбуа пробував виявити подібні явища і на інших тканинах і отримував вже зовсім нові результати. У 1843 р. він відкрив струм пошкодження в нерві. Зробивши ці відкриття, Дюбуа досліджував нерви самих різних тварин: омара, щуки, жаби, качки, кролика, кішки, собаки - так що його можна вважати засновником порівняльної електрофізіології. У всіх випадках значення потенціалу ушкодження виявилися приблизно однаковими, і Дюбуа зробив висновок, що нерви самих різних тварин влаштовані досить така сама. Він перший отримав своєрідну електроенцефалограму, виявивши струм пошкодження в корі великих півкуль.
Крім того, в 1848 р. Дюбуа виявив різницю потенціалів між зовнішньою і внутрішньою поверхнями шкіри жаби. Цю різницю потенціалів він пояснив роботою шкірних залоз і, як ви далі дізнаєтесь, був недалекий від істини.
Результати своїх досліджень Дюбуа-Реймон виклав у трьох великих томах "Дослідження з тварині електрики". Зрозуміло, в цих томах не всі дані були отримані особисто Дюбуа. Але саме він був тією людиною, яка призвела всі відомості про "тваринну електрику" в систему провів колосальну роботу по їх уточненню і поповненню відсутніх деталей. Він описав, за яких умов, де, на яких об'єктах можна спостерігати біопотенціали, привів їх характеристики і т.д., словом, як це прийнято говорити,, дав повну феноменологічну картину "
І.М. Сєченов писав про Дюбуа-Реймона: "Промовляючи ім'я знаменитого берлінського професора Дюбуа-Реймона, не можна не сказати відразу, що він належав до числа тих обранців, які прокладають шляхи в темні області не для одного, а для кількох поколінь".
Подразнюючу дію струму: Дюбуа-Реймон
Ще Вольта намагався "внести міру" у вивчення дратівної дії струму, але у нього нічого не вийшло, тому що лапка жаби була куди більш чутлива, ніж кращі його електроскопа. Дюбуа починає заново вивчення цього питання: в нього є нові джерела подразнення - гальванічні елементи або санний апарат - і чутливі гальванометри.
Перш за все Дюбуа пробує дратувати м'яз, включаючи постійний дратівливий струм різної сили. Йому вдається виміряти ту мінімальну силу струму, яка змушує м'яз скоротитися. Цю мінімальну силу струму Дюбуа назвав постійною силою роздратування. Тим самим він увів одне з основних понять електробіологіі. З'ясувалося, що поріг не є абсолютною константою: наприклад, різні м'язи мають різні пороги.
Дюбуа пробує з'ясувати, як буде діяти па м'яз не постійний струм, а струм, поступово наростаючий за часом. Виявилося, що швидкість наростання [струму дуже важлива: якщо включати постійний струм, то м'яз збуджується при невеликих силах струму, якщо ж збільшувати силу струму поступово, починаючи з нуля, то м'яз не збуджується і при значно більш сильному струмі. Більш того, при досить повільне наростання сили струму м'яз могла взагалі не збудитися. Враження було таке, як ніби-то при повільному наростанні струму м'яз "звикає" до його дії.
Нарешті, Дюбуа-Реймон спробував з'ясувати, як впливає на м'яз час дії струму: для цього він включав постійний струм на деякий час і вимикав його. На підставі таких дослідів він прийшов до висновку, що час дії струму не грає ніякої ролі, і помилився. У цьому випадку його підвело недосконалість приладів - він не мою включати струм на соті або тисячні частки секунди.
Що ж вдалося з'ясувати Дюбуа про, може бути, найголовніше процесі - "електричної картині", що розвивається в нерві або м'язі у відповідь на роздратування? Дуже небагато. Перешкодою тут послужила та ж проблема - неможливість працювати з короткочасними електричними сигналами. Всі гальванометри Дюбуа були сильні інерційними і не дозволяли реєструвати короткочасні струми.
Ці труднощі вдалося подолати учням і послідовникам Дюбуа. А таких було багато, - і всі вони випробували на собі вплив робіт Дюбуа і його особистості, перейняли від нього не лише наукову позицію, а й стиль роботи: увага до техніки експерименту, ретельність у з'ясуванні деталей. Так що Дюбуа-Реймон був не тільки "батьком електробіологіі", але і "науковим батьком" більшості електрофізіологів того часу, тобто главою великої та дуже плідної наукової школи.
Однак не слід думати, що його послідовники сліпо і шанобливо наслідували свого метру, намагаючись підтверджувати і, може бути, трохи розвивати зроблену ним. Мабуть, якраз навпаки: наукове життя школи Дюбуа було досить бурхливим. Не зупинившись у свій час перед тим, щоб виступити з програмою, яка спростовує основну позицію свого вчителя Мюллера - прихильника "життєвої сили", Дюбуа-Реймон виростив таких же норовливих учнів.
І саме в школі Дюбуа-Реймона виник другий "велика суперечка", за своїм значенням і наслідками порівняти з суперечкою Гальвані і Вольта.
Подразнюючу дію струму: послідовники
Висновок Дюбуа, що час дії струму не впливає на ефективність його дратівної дії, - одна з його небагатьох фактичних помилок. Ця помилка була виправлена одним з його послідовників професором Цюріхського університету А. Фіком. Цікаво, як він обійшов труднощі, пов'язану з відсутністю потрібних приладів. Він розсудив, що якщо неможливо отримати досить короткі імпульси дратівної струму, тому що м'яз реагує дуже швидко, то треба пошукати м'яз, в якій порушення йде повільніше. А так як Фік займався порівняльної фізіологією, то знав, у кого шукати такі м'язи. І ось на м'язі молюска беззубки він зміг показати, що навіть дуже сильні струми не викликають збудження, якщо вони діють короткий час. Чим слабкіше струм, тим довше він повинен діяти, щоб порушити м'яз.
Ці спостереження були одним з перших законів електробіологіі, який вдалося виразити у вигляді формули. Кількісна залежність порогової сили струму від часу його дії у вигляді формули виражається так:
де а і '- константи.
Якщо подивитися на графік цієї залежності, то можна зрозуміти, чому Дюбуа вважав час дії струму несуттєвим: він працював з струмами великої тривалості, а гіпербола при таких значеннях тривалості йде практично паралельно осі абсцис. Можна сказати, що Дюбуа-Реймона підвела гіпербола!
Цікаві дані про дражливому дії постійного струму були отримані послідовником Дюбуа Е. Пфлюгер. Так, зовсім несподівано виявилося, що нерв або м'яз порушуються не тільки при включенні струму але і при виключенні! При включенні струму збудження виникає під катодом, а при вимиканні - під анодом.
У 1876 р. французький вчений Е. Марей відтворив добре забуті до того часу досліди Фонтану, який показав, що серце протягом певного проміжку часу після порушення втрачає чутливість до електричного подразнення: в цей час його не можна порушити навіть найсильнішим струмом. Марей показав, що таким же властивістю володіють і інші м'язи. Він також виявив, що коли після деякого відпочинку серце починає знову відповідати на стимул, то поріг роздратування спочатку дуже високий, а потім поступово знижується. Цей відрізок часу Марей назвав відносним рефрактерним періодом на відміну від абсолютної рефрактерного періоду, коли серце взагалі не відповідає на стимуляцію.
Можна було б розповісти ще про десятки і десятки цікавих дослідів і привести масу фактів і виявлених у цей час закономірностей. Однак, поступі ми так, розумний читач напевно став би пропускати сторінки, а то й зовсім кинув б читати. І в певному сенсі він мав би рацію. Поступово наставав час, коли сильна сторона школи Дюбуа-Реймона стала обертатися недоліком: численні експерименти, приблизно повторюють вже десятки разів зроблене з деякою модифікацією або уточненням, вже, швидше, створювали перешкоди в роботі, чим сприяли руху науки вперед.
Експеримент - основа природничих наук, але сам по собі, не укладений як цеглинка в загальну будівлю теорії, він дає відповідь лише на запитання, що відбувається, і не може пояснити, як і, головне, чому це відбувається.
І нещасні студенти протягом ста років змушені були вчити до іспитів всі ці розрізнені факти, не маючи поняття, як вони між собою пов'язані і що за ними стоїть, в чому механізм таких явищ, як рефрактерність, акомодація, поріг роздратування, а головне, - звідки береться електрика в організмі.
Потерпіть і ви ще небагато: перш, ніж перейти до "розв'язки", розповіді про те, як нарешті була розгадана таємниця "тваринної електрики", ми розповімо ще про двох роботах, важливих не тільки по суті, а й тому, що тут виступають на сцену нові герої нашого роману про електробіологіі. Обидві ці роботи зближує те, що в них за допомогою дотепних прийомів вдалося подолати вже згадувану труднощі того періоду - складність вивчення короткочасних процесів.
Швидкість поширення порушення
У 1846 р. І. Мюллер писав: "Час, необхідний для передачі відчуття з периферії тіла в мозок і для повернення збудження до м'язів, нескінченно мало і виміряна бути не може". Проте всього через 4 роки цей час вдається виміряти.
Мюллер, як ми згадували, вважав збудження проявом "життєвої сили", а як вона поширюється - хто знає! Але і електричний сигнал по проводах теж поширюється майже миттєво - це вже було відомо. Якщо вважати, що порушення, що йде по нерву, має електричну природу, то, мабуть, безглуздо намагатися виміряти його швидкість - дуже малі відстані. І все ж знайшлася людина, яка зробила таку спробу: зто був друг Дюбуа-Реймона, чудовий вчений Герман Гельмгольц.
У 1850 р. Гельмгольц був професором фізіології Кенігсберского університету. Там він і придумав кілька варіантів дослідів для вимірювання швидкості порушення. Один з варіантів досліду виглядав так. На обертовий барабан була намотана закопчена папір. Гельмгольц брав нервово-м'язовий препарат і закріплював м'яз близько барабана. До м'язі прикріплялося перо, так що скорочення м'язи викликало слід на рухомій папері. Коли нерв дратувався, момент роздратування за допомогою спеціального пристрою відзначався на стрічці. На тій же паперовій стрічці було видно, через який проміжок часу відповідає скороченням м'яз. Так можна було дізнатися час від моменту подразнення нерва до початку скорочення м'яза. Та користі від цього було мало: адже за цей час збудження повинно було дійти по нерву до м'язи, передати м'язі сигнал до скорочення, після чого в м'язі повинен був розвинутися процес скорочення.
Як розділити всі ці часи? Гельмгольц придумав такий спосіб. Він дратував нерв вдруге, але в іншому місці, наприклад на відстані 5 см від першої точки роздратування. Тепер скорочення м'язи наставало трохи пізніше, рахуючи від моменту подразнення. Різниця цих часів могла залежати тільки від того, що порушення пройшло зайві 5 см. Знаючи швидкість обертання барабана, можна було визначити час запізнювання, а так як відстань між двома точками роздратування нерва було відомо, можна було визначити і швидкість поширення збудження по волокну.
Виявилося, що порушення поширюється по нерву зі швидкістю всього 30 м / с, тобто в сто мільйонів разів повільніше, ніж електричний сигнал, і навіть у десять разів повільніше, ніж звук! Цей результат, з одного боку, був сильним ударом по уявленням про миттєво розповсюджується "життєву силу", але, з іншого боку, поставив перед електробіологіей новий складне питання: чим же пояснюється таке сильне відмінність цієї швидкості від швидкості розповсюдження електричного сигналу в металах та електролітах ? Виходить, що "тварина електрику" не так-то просто піддається поясненню з допомогою тих понять, які були вироблені для електрики "неживого", чисто фізичної. У зв'язку з цим поновилися розмови про особливі властивості "тваринної електрики", в той час як інші вчені висловлювали сумнів про електричну природу поширення збудження по нервових волокнах.
"Хвиля збудження"
Це сумнів було розвіяно вченими молодшого покоління школи Дюбуа-Реймона, в подальшому стали головними героями науки про "тваринну електрику", - Юліусом Бернштейном і Людвігом Германом. Вони сильно просунули вперед вивчення "білої плями" в явищах електробіологіі - процесу збудження в нервах і м'язах.
Як ви пам'ятаєте, "вловити" електричні характеристики збудження дуже важко - сам Дюбуа не зміг вирішити це завдання, тому що процеси збудження дуже швидкі, короткочасні. Тому з допомогою навіть дуже високочутливих, але мають велику інерцію гальванометрів, що були тоді в розпорядженні дослідників, можна було лише з достовірністю виявити сам факт електричного відповіді м'язи або нерва, але не простежити за змінами його в часі. Проте Герман і Бернштейн успішно впоралися з цією дуже важкою для того часу завданням. Ми не будемо детально описувати їх численні і дотепні хитрощі, а наведемо лише результати досліджень. Їм вдалося встановити форму хвилі збудження і виміряти швидкість поширення цього електричного сигналу вздовж по м'язі або нерву.
Виявилася картина, зображена на рис.9: спочатку збудження від дратівливих електродів підходить до першого реєструючого електроду, і він стає негативно зарядженим по відношенню до другого. Герман і Бернштейн простежили за рухом імпульсу по волокну і навіть - що дуже важливо - виміряли швидкість цього руху, тобто швидкість поширення збудження. А важливо це тому, що швидкість виявилася точнісінько в точнісінько дорівнює тій, яку за двадцять років до того виміряв Гельмгольц!
Підіб'ємо деякі підсумки. До кінця XIX століття в основному стараннями вчених школи Дюбуа-Реймона були відкриті і досліджені основні електрофізіологічні явища потенціал спокою, який спочатку називали струмом ушкодження, потенціал дії, який поширюється по волокну, а також були досліджені деякі феноменологічні закони дратівної дії струму, наприклад, було введено поняття рефрактерності.
Проте до пояснення цих явищ було ще далеко. Головна загадка полягала в тому, звідки і як виникають потенціал спокою і потенціал дії? Де та електростанція, той генератор, які їх створюють?
Незважаючи на значний розвиток теорії електрики і електротехніки природу ПП і ПД не вдавалося скільки-небудь задовільно пояснити. Електрохімія ще не мала достатньої теоретичної бази, хоча вивчення струму і почалося з появи вольтова стовпа, тобто електричних процесів на кордоні рідини.
Часом навіть складалося враження, що електричні явища в живому організмі не можна звести до тих, які зустрічаються в технічних пристроях. Наприклад, нервовий імпульс мав електричну природу, але поширювався по нерву з надзвичайно малою швидкістю, Маса накопичених фактів вимагала створення об'єднує їх теорії.