Реферат з біотехнології
"Перенесення чужорідної ДНК в протопласти. Підвищення стабільності протопластів"
Введення
Фітобіотехнологія - складова частина біотехнології, об'єктами якої є клітини і тканини рослин - фотоавтотрофної еукаріот, а також біоактивні молекули рослинного походження (ферменти, нуклеїнові кислоти, стероїди і деякі інші складні органічні речовини).
Назва фітобіотехнологія складається з чотирьох слів грецького походження: phyton - рослина, bios - життя, teken - мистецтво, logos - наука, слово. Отже, це наука про використання рослинних об'єктів в техніці та промисловому виробництві.
На перший погляд вирощування рослин (злакових, лікарських, декоративних і т.д.) в польових умовах підпадає під рубрику «фітобіотехнологія», проте, як і з тваринами, тут відсутні специфічні методи промислового культивування цілісних рослин в біореакторах.
Таким чином, до фітобіотехнологіческім процесів відносять ті з них, які базуються на клітинному рівні, якщо навіть клітини несуть генетичну інформацію, сприйняту ними в результаті генно-інженерного експерименту.
Клітини і тканини вищих рослин, що вирощуються на поживних середовищах in vitro в строго контрольованих умовах, все ширше використовують в фітобіотехнологіі.
Обширні царство рослин - потенційно необмежений джерело клітин і тканин, які можуть бути введені в культуру і, як наслідок, існують необмежені можливості для створення нових фітобіотехнологіческіх процесів, в яких потребує людство.
Хоча рослинні клітини і тканини належать до більш диференційованим організмам у порівнянні, наприклад, з бактеріями, тим не менш, вони здатні культивуватися у формі неорганізованої клітинної маси - калюсу.
Калюсна тканину можна «змусити» формувати зародишеподобние структури, нирки, пагони, а на їх основі - рослини-регенерату. Все це відбувається завдяки тотипотентності рослинних клітин (від лат. Totus - все, цілий, potentia - сила, потенція). Поняття «тотіпотентность» є клітинної характеристикою; в ньому відбито потенціал клітини відтворювати всі типи клітин, властивих дорослому організму. Іншими словами клітина має здатність відтворювати цілий організм.
Якщо в якості біооб'єкту застосовують ізольований зародок, меристему верхівкових або пазушних бруньок, тобто інтегровану систему, то всі одержувані рослини-регенеранти будуть повністю відповідати вихідного рослини, з якої була взята будь-яка інтегрована система з числа вищезгаданих. Цим добиваються клонування цікавлять справжніх рослин. [2]
У випадках застосування ізольованих клітин і протопластів вдається отримувати змінені варіанти вихідної форми, які передають отримані нові ознаки потомству. Цим добиваються можливостей штучного створення нових форм рослин, придатних для вибірки, або селекції (див. малюнок нижче).
Протягом останніх років біотехнологам вдалося масове розмноження культивованих рослин з унікальними характеристиками, а вирощування рослинних клітин стало основою для одержання багатьох природних речовин, утворених різними рослинами в якості продуктів вторинного обміну (глікозиди, алкалоїди та інші речовини).
Таким чином, клітинна та молекулярна біологія рослин становить основу фітобіотохнологіі, а головними напрямками стали створення нових форм корисних рослин для сільського та лісового господарства, а також розробка промислового виробництва хімічних речовин з рослин.
Тим не менш, вже тепер досягнуто певних успіхів з рослинними об'єктами і за прогнозами вчених США до 2010 року очікується приріст врожайності сільськогосподарських культур приблизно на 60-70% в порівнянні з початком 80-х років поточного сторіччя в основному на основі використання методів генетичної інженерії, коли став можливим перенесення окремих генів від одного рослини іншому (на противагу природному статевою процесу, при якому відбувається заміна цілих блоків зчеплених генів).
Протопласти (від грец. Protos - перший, plastos - виліплений, утворений) - це клітини, позбавлені клітинних стінок, здатні зберігатися і метаболізувати, так само як і реконструювати клітинну стінку у відповідних умовах.
Протопласти можна отримувати за допомогою механічних і біохімічних (ензиматичних) методів. У перших випадках досягають плазмолізу рослинних тканин, наприклад, за допомогою 0,1% розчину сахарози з наступним розрізанням епідермісу та звільненням протопластів у навколишнє живильне середовище.
Ензиматичні методи по-різному ефективні в одержанні протопластів. Тут необхідно підбирати ферменти для кожного виду рослин, однак найбільш часто використовують целюлази, пектиназу, гемицеллюлаза як індивідуально, так і в комбінаціях. Наприклад, для отримання протопластів з листя Nicotiana tabacum листову тканина без епідермісу занурюють у суміш ферментів, що включає 0,5% пектиназу і 2% целюлази в 0,7 М розчині маніту або сорбіту; для отримання протопластів з листя конюшини і люцерни використовують 2-5% суміш гліканаз з пептідаза, і т.д. [5]
У порівняльному плані більш відповідним є ензиматичні метод отримання протопластів як більш щадний. Однак при будь-якому способі важливий підбір осмотичного стабілізатора, без якого може настати швидкий плазмоптіз протопластів (з лат. Plasma - плазма, option - альтернатива). В якості таких стабілізаторів можуть бути застосовані розчини неорганічних солей (СаСl 2, КСl, NaHPO 4), органічних гликолей (маніту, сорбіту), моно-і дисахаридів (глюкози, ксилози, сахарози) в орієнтовних концентраціях 0,3-0,8 М / л. Однак стосовно до виду рослини, з якої отримують протопласти, необхідно підбирати індивідуальні умови для «протопластірованія» (осмотичний стабілізатор, рН середовища). Ці вимоги зберігаються і у випадках отримання протопластів з калюсних культур і клітинних суспензій.
У життєздатності виділених протопластів велику роль грає фізіологічна повноцінність вихідного рослинного матеріалу. Суспензійні культури найбільш прийнятні для цих цілей, будучи в кінці логарифмічної фази росту (розмноження).
Отримані тим чи іншим шляхом протопласти або використовують для регенерації рослини, або їх можна піддати злиття з утворенням гетерокаріотіческіх гібридів.
З рослин, відносно легко регенеруючих з протопластів, можна назвати картопля, люцерну, маніок, ріпак, тютюн. Для отримання рослин - регенерантів, висаджених в грунт, потрібно, як мінімум, 16-18 тижнів.
Рослини, отримані з протопластів, можуть відрізнятися досить вираженою мінливістю по ряду цікавлять нас ознак: урожайності, величиною (розміром), морфології окремих частин, фотоперіодічності та ін Як правило, це пов'язують із зміною числа і перебудовами хромосом. Тому протопласти рослин представляють собою цікаві об'єкти і для вивчення процесів мутагенезу.
Гібридизація протопластів вдається не тільки в тих випадках, коли вихідні рослини (джерела клітин для протопластірованія) здатні гібрідізоваться статевим шляхом, але і тоді, коли наперед відомо, що клітини, що підлягають злиттю, відносяться до організмів зі статевим несумісністю. Тим не менш, у всіх випадках соматичної гібридизації один з партнерів повинен нести будь-якої маркерний ознака (біохімічний або іншої), за яким можливо підтвердити достовірність отримання гібрида. У цьому сенсі зручні ауксотрофние мутанти.
Гетерокаріотіческіе соматичні гібриди виділяють або вручну за допомогою мікроманіпулятори, капілярної піпетки та шприца, або автоматично на основі застосування флуоресцентних систем.
Для біотехнології також важлива цібрідізація, коли виникають гетерозиготи за внеядерним (цитоплазматическим) генам, визначальним, наприклад, стійкість до гербіцидів або ознака цитоплазматичної чоловічої стерильності (малюнок).
До теперішнього часу з ряду рослинних протопластів отримано їх без'ядерні фрагменти - мікропласти, оточені тонопластной мембраною і включають частину внеядерного генетичного матеріалу. Використовуючи прийоми соматичної гібридизації, мікропласти можна зливати з реципієнтного протопластами. [1]
Таким чином, мікропласти є резервним матеріалом для розширення можливостей клітинної інженерії в фітобіотехнологіі. Більше того, тепер вдається гібридизація рослинних протопластів з протопластами мікроорганізмів і тваринними клітинами.
Стосовно до хромосомної інженерії вдалося довести проникнення ізольованих метафазних хромосом в оброблені поліетиленгліколем реципієнтного протопласти таких однодольних рослин, як пшениця і кукурудза.
Також відкриваються шляхи привнесення додаткової генетичної інформації за бажанням експериментатора з метою створення трансгенних рослин. Прямий перенесення чужорідної ДНК в протопласти можливий також за допомогою мікроін'єкції, трансформації, упаковки до ліпосом з подальшим їх ендоцитозу рослинними протопластами, і електропорації (високовольтних електричних імпульсів).
Практикуються також методи перенесення генів у рослини шляхом електропорації, трансформації рослинних протопластів чужорідної ДНК в присутності поліетиленгліколю, мікроін'єкцій ДНК, біологічної бомбардуванням золотими або вольфрамовими частинками, покритими молекулами ДНК, введенням плазмідної ДНК за допомогою голчастих кристалів карбіду або нітриду кремнію та ін
Але всі ці способи отримання трансгенних рослин так чи інакше засновані на використанні селективних маркерних генів, якими зазвичай служать бактеріальні гени стійкості до антибіотиків або гербіцидів.
Іншими словами, той фрагмент ДНК, який дослідник вводить в геном трансформованого рослини, крім потрібного гена, містить і маркерний ген.
Ці селективні маркерні гени потрібні для того, щоб в лабораторії в процесі регенерації відокремити поодинокі трансформовані клітини від нетрансформованих (яких більшість) і дати першого перевагу при розподілі.
У результаті трансгенні рослини, отримане з таких трансформованих клітин, стає стійким до певного антибіотику (найчастіше до канаміцину) або до якого-небудь гербіциду на зразок гліфосату. При подальшому вирощуванні трансгенних рослин в польових умовах з'являється теоретична можливість переміщення генів резистентності до гербіциду в родинні бур'яни або генів резистентності до антибіотика тому в бактерії грунту. Саме тут і полягає певна екологічна небезпека через ймовірності появи, зокрема, так званих супербур'янів.
Однак у цілому ряді робіт було показано, що така подія вкрай малоймовірно. Більш того, вирощування так званих транспластомних рослин (на яких зупинимося трохи нижче) зводить частина цих побоювань до нуля, з огляду на те, що пилок в таких рослин залишається не трансгенної. [8]
До того ж процеси переносу генів, хоча і з надзвичайно низькою частотою, але відбуваються в самій природі за допомогою бактерії Agrobacterium tumefaciens, яку навіть називають «природним генним інженером», і тому такі змінені самою Природою рослини нас вже давно оточують.
Було виявлено, що стійкість рослин до шкідників можна запрограмувати генетично - введенням в геном рослин чужорідних генів, продукти яких викликають загибель шкідника. Традиційно для цього використовують ген bt, продуктом якого є бактеріальний токсин, який виробляється бактерією Bacillus thuringiensis. Цей великий білок (протоксін), контрольований геном bt, потрапляючи в кишечник личинок комах, руйнується під дією ферментів, а його фрагмент (ендотоксин) призводить до загибелі комах. Трансгенні рослини картоплі, бавовни, кукурудзи з геном bt вже виробляються фірмами «Monsanto», «Ciba Seeds» і успішно продаються на світовому ринку.
Відомо, що рослини, подібно до тварин, здатні виробляти імунітет. Однак цим чудовим властивістю володіють лише стійкі рослини, у яких при атаці патогенів різко змінюється метаболізм. В результаті у цих рослин накопичуються такі хімічні сполуки, як пероксид водню), саліцилова кислота і фітоалексинів. Підвищений вміст цих сполук сприяє протистоянню рослини в боротьбі з патогенами.
Наприклад, трансгенні рослини тютюну, які містять бактеріальний ген, що контролює синтез саліцилату гідролази (цей фермент руйнує саліцилову кислоту), були нездатні до імунної відповіді. Тому зміна генно-інженерним шляхом рівня саліцилової кислоти або вироблення і рослинах у відповідь на патоген пероксиду водню може бути перспективним для створення стійких трансгенних рослин.
Багатообіцяючим напрямком в генній інженерії рослин є отримання трансгенних рослин, що містять комбінацію певних гормональних генів бактерій. Виявилося, що плоди деяких з таких трансгенних рослин є партенокарпічний, тобто сформованими без запилення. Ці плоди характеризуються або повною відсутністю насіння, або дуже невеликою їх кількістю, що дозволяє вирішити проблему «зайвих кісточок», наприклад, у кавуні, у цитрусових і т.д. Вже отримані трансгенні рослини кабачків, які в цілому не відрізняються від контрольних, але практично не містять насіння.
У всьому світі активно ведуться роботи зі створення на основі трансгенних рослин так званих «їстівних вакцин», які в подальшому можна буде використовувати для попередження найбільш небезпечних хвороб людини. [4]
Наприклад, вченими СО РАН успішно ведеться розробка протитуберкульозної вакцини. При створенні вакцини вчені використовують гени людини, що кодують синтез специфічних антитіл до білків збудника хвороби - Mycobacterium tuberculosis. Ці антитіла і забезпечують імунітет до даного захворювання. Гени, що кодують антитіла проти туберкульозу, вбудували в геном рослинних клітин. З клітин, і яких вдало сталося вбудовування захисних генів, регенерували повноцінні рослини, які мають здатність синтезувати антитіла проти туберкульозу. [3]
Традиційні методи лікування туберкульозу не завжди нешкідливі і ефективні, і вчені сподіваються, що використання трансгенних рослин дає шанс не тільки позбутися від хвороби, а й уникнути побічних ефектів. Також в Інституті фізіології і біохімії рослин СО РАН створюється вакцина проти СНІДу гепатиту на основі трансгенеза томата й огірка. Групі німецьких вчених-генетиків з Giessen University у Франкфурті вдалося виростити генетично модифіковану морква, яка містить вакцину проти гепатиту В, що дозволяє значно знизити витрати на профілактику цього захворювання (за офіційною статистикою ВООЗ близько 350 млн людей у світі інфіковані вірусом гепатиту В, який призводить до важких пошкоджень печінки, хронізації процесу і смертельних результатів, щорічно забираючи 1 млн людських життів).
Трансгенна морква може рости в різних кліматичних поясах і на різних грунтах, добре зберігається, транспортується, може вживатися в сирому вигляді. Споживаючи цей продукт з їжею, людина як би постійно вводить вакцину маленькими дозами, чим підтримує активність імунітету до вірусу гепатиту В.
Повсюдне використання там генетично модифікованих рослин (від загальної кількості, взятого за 100%) становить: 40% вирощуваної в країні кукурудзи, 81% сої, 65% каноли (рапсу) і 73% бавовни, і воно продовжує рости. Отриманням і випробуванням таких рослин займаються сотні комерційних фірм із сукупним капіталом більше 100 млрд дол
На сьогодні лідером з вирощування трансгенної бавовни, стійкого до комах, є Китай. В Аргентині, уряд якої підтримує вирощування генетично модифікованих культур, частка трансгенної сої становить 90%, а кукурудзи і бавовни - 50%.
Південно-Африканська Республіка - єдина африканська країна з масштабними посадками трансгенних культур - 80% бавовни, 20% кукурудзи і 11% сої тут генетично модифіковані. Іншу частину Африки агробіотехнологіческіе фірми розглядають насамперед як полігон майбутніх випробувань.
Японія одним із пріоритетів свого наукового бюджету зробила агробіотехнологій, незважаючи на те, що застосування генетично модифікованих продуктів зустрічає тут сильний опір громадськості.
У Європі після прийняття ЄС в 1998 р. правил застосування генетично модифікованої продукції Франція, Італія, Данія, Греція і Люксембург заборонили ці продукти. Зараз ЄС прийняв нові правила сертифікації та маркування останніх і значно пом'якшив свою позицію. Однак тільки в Іспанії в незначних обсягах вирощують трансгенну кукурудзу.
У Росії до вирощування на полях не дозволили ані одне трансгенні рослини.
Виняток становить трансгенна соя, і то тільки в якості харчової сировини або компонента продуктів (її можна їсти, але не вирощувати).
Незважаючи на приголомшливі успіхи біотехнології зі створення трансгенних рослин з одночасним проведенням усіх необхідних тестів на токсичність, алергенність, мутагенність, в суспільстві існує насторожене ставлення до генетично модифікованих продуктів. Є цілком реальні побоювання з приводу того, що пилок і насіння трансгенних рослин і бур'янів можуть схрестити і в кінцевому рахунку виросте такий супербур'янів, який не зможе знищити жоден гербіцид. [4]
Разом з тим неконтрольоване розповсюдження («горизонтальний перенесення») чужорідних генів в популяції культурних, традиційних сортів і дикорослих форм рослин може призвести до порушення рівноваги в біоценозах, а також до засмічення традиційних сортів трансгенними вставками і надалі до їх повного знищення.
Поліпшення поживних властивостей картоплі, кукурудзи, сої може стати причиною важких алергічних реакцій у людини. Деякі вчені висловлюють серйозну стурбованість з приводу можливості утворення нових вірулентних штамів в результаті генетичної рекомбінації між трансгенами і генами природних вірусів.
2. Бейлі Дж., Олліс Д. Основи біохімічної інженерії, в 2-х частинах. М., Мир, 1989.
3. Біотехнологія рослин. Під ред. С. X. Мантелла і X. Сміта. М., ВО Агропромиздат, 1987.
4. Генна інженерія рослин. Лабораторне керівництво. - М.: Світ, 1991. - 408 с.
5. Іммобілізовані клітини і ферменти. Методи. Під ред. Дж. Вудворда. М., Мир, 1988.
6. Миколаїв В. Біотехнологія - пріоритетний напрям / / Фармацевтичний вісник. http://www.pharmvestnik.ru/cgi-bin/statya.pl? sid = 3782.
7. Сазикін Ю.О. Біотехнологія: навчальний посібник для студентів вищ. навч. закладів / Ю.О. Сазикін, С.М. Орєхов, І.І. Чакалева; під ред. А.В. Катлінского. - 3-е вид., Стер. - М.: Видавничий центр «Академія», 2008.
8. Сучасна генетика / під ред. Ф. Айала, Д. Кайчур. - М.: Світ, 1987.
"Перенесення чужорідної ДНК в протопласти. Підвищення стабільності протопластів"
Введення
Фітобіотехнологія - складова частина біотехнології, об'єктами якої є клітини і тканини рослин - фотоавтотрофної еукаріот, а також біоактивні молекули рослинного походження (ферменти, нуклеїнові кислоти, стероїди і деякі інші складні органічні речовини).
Назва фітобіотехнологія складається з чотирьох слів грецького походження: phyton - рослина, bios - життя, teken - мистецтво, logos - наука, слово. Отже, це наука про використання рослинних об'єктів в техніці та промисловому виробництві.
На перший погляд вирощування рослин (злакових, лікарських, декоративних і т.д.) в польових умовах підпадає під рубрику «фітобіотехнологія», проте, як і з тваринами, тут відсутні специфічні методи промислового культивування цілісних рослин в біореакторах.
Таким чином, до фітобіотехнологіческім процесів відносять ті з них, які базуються на клітинному рівні, якщо навіть клітини несуть генетичну інформацію, сприйняту ними в результаті генно-інженерного експерименту.
Клітини і тканини вищих рослин, що вирощуються на поживних середовищах in vitro в строго контрольованих умовах, все ширше використовують в фітобіотехнологіі.
Обширні царство рослин - потенційно необмежений джерело клітин і тканин, які можуть бути введені в культуру і, як наслідок, існують необмежені можливості для створення нових фітобіотехнологіческіх процесів, в яких потребує людство.
1. Загальні відомості про фітобіотехнологіі
В даний час царство рослин на земній кулі включає близько 300 000 видів. Від раціонального та дбайливого ставлення до рослин залежить благополучне виживання людства на планеті Земля.Хоча рослинні клітини і тканини належать до більш диференційованим організмам у порівнянні, наприклад, з бактеріями, тим не менш, вони здатні культивуватися у формі неорганізованої клітинної маси - калюсу.
Калюсна тканину можна «змусити» формувати зародишеподобние структури, нирки, пагони, а на їх основі - рослини-регенерату. Все це відбувається завдяки тотипотентності рослинних клітин (від лат. Totus - все, цілий, potentia - сила, потенція). Поняття «тотіпотентность» є клітинної характеристикою; в ньому відбито потенціал клітини відтворювати всі типи клітин, властивих дорослому організму. Іншими словами клітина має здатність відтворювати цілий організм.
Якщо в якості біооб'єкту застосовують ізольований зародок, меристему верхівкових або пазушних бруньок, тобто інтегровану систему, то всі одержувані рослини-регенеранти будуть повністю відповідати вихідного рослини, з якої була взята будь-яка інтегрована система з числа вищезгаданих. Цим добиваються клонування цікавлять справжніх рослин. [2]
У випадках застосування ізольованих клітин і протопластів вдається отримувати змінені варіанти вихідної форми, які передають отримані нові ознаки потомству. Цим добиваються можливостей штучного створення нових форм рослин, придатних для вибірки, або селекції (див. малюнок нижче).
Протягом останніх років біотехнологам вдалося масове розмноження культивованих рослин з унікальними характеристиками, а вирощування рослинних клітин стало основою для одержання багатьох природних речовин, утворених різними рослинами в якості продуктів вторинного обміну (глікозиди, алкалоїди та інші речовини).
Таким чином, клітинна та молекулярна біологія рослин становить основу фітобіотохнологіі, а головними напрямками стали створення нових форм корисних рослин для сільського та лісового господарства, а також розробка промислового виробництва хімічних речовин з рослин.
2. Протопласти. Характеристика та отримання
Рослини - як багатоклітинні організми з величезною ємністю геномів, з статевим шляхом розмноження і багатоступінчатими програмами розвитку - є більш складними об'єктами для генноінженерних експериментів, ніж, наприклад, віруси, бактерії і дріжджі.Тим не менш, вже тепер досягнуто певних успіхів з рослинними об'єктами і за прогнозами вчених США до 2010 року очікується приріст врожайності сільськогосподарських культур приблизно на 60-70% в порівнянні з початком 80-х років поточного сторіччя в основному на основі використання методів генетичної інженерії, коли став можливим перенесення окремих генів від одного рослини іншому (на противагу природному статевою процесу, при якому відбувається заміна цілих блоків зчеплених генів).
Протопласти (від грец. Protos - перший, plastos - виліплений, утворений) - це клітини, позбавлені клітинних стінок, здатні зберігатися і метаболізувати, так само як і реконструювати клітинну стінку у відповідних умовах.
Протопласти можна отримувати за допомогою механічних і біохімічних (ензиматичних) методів. У перших випадках досягають плазмолізу рослинних тканин, наприклад, за допомогою 0,1% розчину сахарози з наступним розрізанням епідермісу та звільненням протопластів у навколишнє живильне середовище.
Ензиматичні методи по-різному ефективні в одержанні протопластів. Тут необхідно підбирати ферменти для кожного виду рослин, однак найбільш часто використовують целюлази, пектиназу, гемицеллюлаза як індивідуально, так і в комбінаціях. Наприклад, для отримання протопластів з листя Nicotiana tabacum листову тканина без епідермісу занурюють у суміш ферментів, що включає 0,5% пектиназу і 2% целюлази в
У порівняльному плані більш відповідним є ензиматичні метод отримання протопластів як більш щадний. Однак при будь-якому способі важливий підбір осмотичного стабілізатора, без якого може настати швидкий плазмоптіз протопластів (з лат. Plasma - плазма, option - альтернатива). В якості таких стабілізаторів можуть бути застосовані розчини неорганічних солей (СаСl 2, КСl, NaHPO 4), органічних гликолей (маніту, сорбіту), моно-і дисахаридів (глюкози, ксилози, сахарози) в орієнтовних концентраціях 0,3-0,8 М / л. Однак стосовно до виду рослини, з якої отримують протопласти, необхідно підбирати індивідуальні умови для «протопластірованія» (осмотичний стабілізатор, рН середовища). Ці вимоги зберігаються і у випадках отримання протопластів з калюсних культур і клітинних суспензій.
У життєздатності виділених протопластів велику роль грає фізіологічна повноцінність вихідного рослинного матеріалу. Суспензійні культури найбільш прийнятні для цих цілей, будучи в кінці логарифмічної фази росту (розмноження).
Отримані тим чи іншим шляхом протопласти або використовують для регенерації рослини, або їх можна піддати злиття з утворенням гетерокаріотіческіх гібридів.
З рослин, відносно легко регенеруючих з протопластів, можна назвати картопля, люцерну, маніок, ріпак, тютюн. Для отримання рослин - регенерантів, висаджених в грунт, потрібно, як мінімум, 16-18 тижнів.
Рослини, отримані з протопластів, можуть відрізнятися досить вираженою мінливістю по ряду цікавлять нас ознак: урожайності, величиною (розміром), морфології окремих частин, фотоперіодічності та ін Як правило, це пов'язують із зміною числа і перебудовами хромосом. Тому протопласти рослин представляють собою цікаві об'єкти і для вивчення процесів мутагенезу.
Гібридизація протопластів вдається не тільки в тих випадках, коли вихідні рослини (джерела клітин для протопластірованія) здатні гібрідізоваться статевим шляхом, але і тоді, коли наперед відомо, що клітини, що підлягають злиттю, відносяться до організмів зі статевим несумісністю. Тим не менш, у всіх випадках соматичної гібридизації один з партнерів повинен нести будь-якої маркерний ознака (біохімічний або іншої), за яким можливо підтвердити достовірність отримання гібрида. У цьому сенсі зручні ауксотрофние мутанти.
Гетерокаріотіческіе соматичні гібриди виділяють або вручну за допомогою мікроманіпулятори, капілярної піпетки та шприца, або автоматично на основі застосування флуоресцентних систем.
Для біотехнології також важлива цібрідізація, коли виникають гетерозиготи за внеядерним (цитоплазматическим) генам, визначальним, наприклад, стійкість до гербіцидів або ознака цитоплазматичної чоловічої стерильності (малюнок).
До теперішнього часу з ряду рослинних протопластів отримано їх без'ядерні фрагменти - мікропласти, оточені тонопластной мембраною і включають частину внеядерного генетичного матеріалу. Використовуючи прийоми соматичної гібридизації, мікропласти можна зливати з реципієнтного протопластами. [1]
Таким чином, мікропласти є резервним матеріалом для розширення можливостей клітинної інженерії в фітобіотехнологіі. Більше того, тепер вдається гібридизація рослинних протопластів з протопластами мікроорганізмів і тваринними клітинами.
Стосовно до хромосомної інженерії вдалося довести проникнення ізольованих метафазних хромосом в оброблені поліетиленгліколем реципієнтного протопласти таких однодольних рослин, як пшениця і кукурудза.
Також відкриваються шляхи привнесення додаткової генетичної інформації за бажанням експериментатора з метою створення трансгенних рослин. Прямий перенесення чужорідної ДНК в протопласти можливий також за допомогою мікроін'єкції, трансформації, упаковки до ліпосом з подальшим їх ендоцитозу рослинними протопластами, і електропорації (високовольтних електричних імпульсів).
3. Перенесення чужорідної ДНК в протопласти
Проблема створення векторів для введення чужорідної ДНК в протопласти рослин є найбільш складною. Тут намітилися наступні підходи:
1) використання плазмід бактерій, що заражають рослини в природних умовах; при цьому частина плазміди вбудовується в ядерний геном рослини-господаря і функціонує у складі його генома;
2) використання бактеріальних плазмід, «зшитих» із фрагментами ДНК хлоропластів або мітохондрій рослин, для створення човникових векторів, здатних до реплікації в клітинах прокаріотів та експресії в еукаріотичних клітинах;
3) використання ДНК-вмісних вірусів рослин; в такій системі ДНК функціонує автономно від геному рослини-хазяїна.
Для перенесення чужорідної ДНК в рослини найбільш широко використовується агробактеріальної трансформація з допомогою бінарних плазмідних векторів. Практикуються також методи перенесення генів у рослини шляхом електропорації, трансформації рослинних протопластів чужорідної ДНК в присутності поліетиленгліколю, мікроін'єкцій ДНК, біологічної бомбардуванням золотими або вольфрамовими частинками, покритими молекулами ДНК, введенням плазмідної ДНК за допомогою голчастих кристалів карбіду або нітриду кремнію та ін
Але всі ці способи отримання трансгенних рослин так чи інакше засновані на використанні селективних маркерних генів, якими зазвичай служать бактеріальні гени стійкості до антибіотиків або гербіцидів.
Іншими словами, той фрагмент ДНК, який дослідник вводить в геном трансформованого рослини, крім потрібного гена, містить і маркерний ген.
Ці селективні маркерні гени потрібні для того, щоб в лабораторії в процесі регенерації відокремити поодинокі трансформовані клітини від нетрансформованих (яких більшість) і дати першого перевагу при розподілі.
У результаті трансгенні рослини, отримане з таких трансформованих клітин, стає стійким до певного антибіотику (найчастіше до канаміцину) або до якого-небудь гербіциду на зразок гліфосату. При подальшому вирощуванні трансгенних рослин в польових умовах з'являється теоретична можливість переміщення генів резистентності до гербіциду в родинні бур'яни або генів резистентності до антибіотика тому в бактерії грунту. Саме тут і полягає певна екологічна небезпека через ймовірності появи, зокрема, так званих супербур'янів.
Однак у цілому ряді робіт було показано, що така подія вкрай малоймовірно. Більш того, вирощування так званих транспластомних рослин (на яких зупинимося трохи нижче) зводить частина цих побоювань до нуля, з огляду на те, що пилок в таких рослин залишається не трансгенної. [8]
До того ж процеси переносу генів, хоча і з надзвичайно низькою частотою, але відбуваються в самій природі за допомогою бактерії Agrobacterium tumefaciens, яку навіть називають «природним генним інженером», і тому такі змінені самою Природою рослини нас вже давно оточують.
4. Підвищення стабільності протопластів
Найбільш гостро стоїть питання про отримання рослин, стійких до шкідників сільського господарства (передусім до фітопатогенних грибів і комах), так як хвороби рослин стали основним лімітуючим фактором одержання врожаю.Було виявлено, що стійкість рослин до шкідників можна запрограмувати генетично - введенням в геном рослин чужорідних генів, продукти яких викликають загибель шкідника. Традиційно для цього використовують ген bt, продуктом якого є бактеріальний токсин, який виробляється бактерією Bacillus thuringiensis. Цей великий білок (протоксін), контрольований геном bt, потрапляючи в кишечник личинок комах, руйнується під дією ферментів, а його фрагмент (ендотоксин) призводить до загибелі комах. Трансгенні рослини картоплі, бавовни, кукурудзи з геном bt вже виробляються фірмами «Monsanto», «Ciba Seeds» і успішно продаються на світовому ринку.
Відомо, що рослини, подібно до тварин, здатні виробляти імунітет. Однак цим чудовим властивістю володіють лише стійкі рослини, у яких при атаці патогенів різко змінюється метаболізм. В результаті у цих рослин накопичуються такі хімічні сполуки, як пероксид водню), саліцилова кислота і фітоалексинів. Підвищений вміст цих сполук сприяє протистоянню рослини в боротьбі з патогенами.
Наприклад, трансгенні рослини тютюну, які містять бактеріальний ген, що контролює синтез саліцилату гідролази (цей фермент руйнує саліцилову кислоту), були нездатні до імунної відповіді. Тому зміна генно-інженерним шляхом рівня саліцилової кислоти або вироблення і рослинах у відповідь на патоген пероксиду водню може бути перспективним для створення стійких трансгенних рослин.
Багатообіцяючим напрямком в генній інженерії рослин є отримання трансгенних рослин, що містять комбінацію певних гормональних генів бактерій. Виявилося, що плоди деяких з таких трансгенних рослин є партенокарпічний, тобто сформованими без запилення. Ці плоди характеризуються або повною відсутністю насіння, або дуже невеликою їх кількістю, що дозволяє вирішити проблему «зайвих кісточок», наприклад, у кавуні, у цитрусових і т.д. Вже отримані трансгенні рослини кабачків, які в цілому не відрізняються від контрольних, але практично не містять насіння.
У всьому світі активно ведуться роботи зі створення на основі трансгенних рослин так званих «їстівних вакцин», які в подальшому можна буде використовувати для попередження найбільш небезпечних хвороб людини. [4]
Наприклад, вченими СО РАН успішно ведеться розробка протитуберкульозної вакцини. При створенні вакцини вчені використовують гени людини, що кодують синтез специфічних антитіл до білків збудника хвороби - Mycobacterium tuberculosis. Ці антитіла і забезпечують імунітет до даного захворювання. Гени, що кодують антитіла проти туберкульозу, вбудували в геном рослинних клітин. З клітин, і яких вдало сталося вбудовування захисних генів, регенерували повноцінні рослини, які мають здатність синтезувати антитіла проти туберкульозу. [3]
Традиційні методи лікування туберкульозу не завжди нешкідливі і ефективні, і вчені сподіваються, що використання трансгенних рослин дає шанс не тільки позбутися від хвороби, а й уникнути побічних ефектів. Також в Інституті фізіології і біохімії рослин СО РАН створюється вакцина проти СНІДу гепатиту на основі трансгенеза томата й огірка. Групі німецьких вчених-генетиків з Giessen University у Франкфурті вдалося виростити генетично модифіковану морква, яка містить вакцину проти гепатиту В, що дозволяє значно знизити витрати на профілактику цього захворювання (за офіційною статистикою ВООЗ близько 350 млн людей у світі інфіковані вірусом гепатиту В, який призводить до важких пошкоджень печінки, хронізації процесу і смертельних результатів, щорічно забираючи 1 млн людських життів).
Трансгенна морква може рости в різних кліматичних поясах і на різних грунтах, добре зберігається, транспортується, може вживатися в сирому вигляді. Споживаючи цей продукт з їжею, людина як би постійно вводить вакцину маленькими дозами, чим підтримує активність імунітету до вірусу гепатиту В.
Висновок
Найбільшим у світі виробником і споживачем трансгенних рослин є США, лідируючі як за площами посівів, так і за рівнем прийняття суспільством трансгенної їжі.Повсюдне використання там генетично модифікованих рослин (від загальної кількості, взятого за 100%) становить: 40% вирощуваної в країні кукурудзи, 81% сої, 65% каноли (рапсу) і 73% бавовни, і воно продовжує рости. Отриманням і випробуванням таких рослин займаються сотні комерційних фірм із сукупним капіталом більше 100 млрд дол
На сьогодні лідером з вирощування трансгенної бавовни, стійкого до комах, є Китай. В Аргентині, уряд якої підтримує вирощування генетично модифікованих культур, частка трансгенної сої становить 90%, а кукурудзи і бавовни - 50%.
Південно-Африканська Республіка - єдина африканська країна з масштабними посадками трансгенних культур - 80% бавовни, 20% кукурудзи і 11% сої тут генетично модифіковані. Іншу частину Африки агробіотехнологіческіе фірми розглядають насамперед як полігон майбутніх випробувань.
Японія одним із пріоритетів свого наукового бюджету зробила агробіотехнологій, незважаючи на те, що застосування генетично модифікованих продуктів зустрічає тут сильний опір громадськості.
У Європі після прийняття ЄС в 1998 р. правил застосування генетично модифікованої продукції Франція, Італія, Данія, Греція і Люксембург заборонили ці продукти. Зараз ЄС прийняв нові правила сертифікації та маркування останніх і значно пом'якшив свою позицію. Однак тільки в Іспанії в незначних обсягах вирощують трансгенну кукурудзу.
У Росії до вирощування на полях не дозволили ані одне трансгенні рослини.
Виняток становить трансгенна соя, і то тільки в якості харчової сировини або компонента продуктів (її можна їсти, але не вирощувати).
Незважаючи на приголомшливі успіхи біотехнології зі створення трансгенних рослин з одночасним проведенням усіх необхідних тестів на токсичність, алергенність, мутагенність, в суспільстві існує насторожене ставлення до генетично модифікованих продуктів. Є цілком реальні побоювання з приводу того, що пилок і насіння трансгенних рослин і бур'янів можуть схрестити і в кінцевому рахунку виросте такий супербур'янів, який не зможе знищити жоден гербіцид. [4]
Разом з тим неконтрольоване розповсюдження («горизонтальний перенесення») чужорідних генів в популяції культурних, традиційних сортів і дикорослих форм рослин може призвести до порушення рівноваги в біоценозах, а також до засмічення традиційних сортів трансгенними вставками і надалі до їх повного знищення.
Поліпшення поживних властивостей картоплі, кукурудзи, сої може стати причиною важких алергічних реакцій у людини. Деякі вчені висловлюють серйозну стурбованість з приводу можливості утворення нових вірулентних штамів в результаті генетичної рекомбінації між трансгенами і генами природних вірусів.
Список літератури
1. www.mediana-eco.ru2. Бейлі Дж., Олліс Д. Основи біохімічної інженерії, в 2-х частинах. М., Мир, 1989.
3. Біотехнологія рослин. Під ред. С. X. Мантелла і X. Сміта. М., ВО Агропромиздат, 1987.
4. Генна інженерія рослин. Лабораторне керівництво. - М.: Світ, 1991. - 408 с.
5. Іммобілізовані клітини і ферменти. Методи. Під ред. Дж. Вудворда. М., Мир, 1988.
6. Миколаїв В. Біотехнологія - пріоритетний напрям / / Фармацевтичний вісник. http://www.pharmvestnik.ru/cgi-bin/statya.pl? sid = 3782.
7. Сазикін Ю.О. Біотехнологія: навчальний посібник для студентів вищ. навч. закладів / Ю.О. Сазикін, С.М. Орєхов, І.І. Чакалева; під ред. А.В. Катлінского. - 3-е вид., Стер. - М.: Видавничий центр «Академія», 2008.
8. Сучасна генетика / під ред. Ф. Айала, Д. Кайчур. - М.: Світ, 1987.