Патологічна анатомія: введення в предмет, загальні аспекти, методи дослідження в патології.
ПАТОЛОГІЧНА АНАТОМІЯ ТА ЇЇ МІСЦЕ СЕРЕД МЕДИКО-БІОЛОГІЧНИХ ДИСЦИПЛІН
Патологічна анатомія є складовою частиною патології - науки, що вивчає закономірності виникнення і розвитку хвороб, окремих патологічних процесів і станів.
В історії розвитку патологічної анатомії виділяють чотири основних періоди: анатомічний (з давнини до початку XIX століття), мікроскопічний (з першої третини XIX століття до 50-х років XX століття), ультрамікроскопічний (після 50-х років XIX століття); сучасний, четвертий період розвитку патологічної анатомії можна охарактеризувати як період патологічної анатомії живої людини.
Для сучасної медицини характерний постійний пошук найбільш об'єктивних матеріальних критеріїв діагностики і пізнання суті хвороби. Серед цих критеріїв морфологічний набуває виняткового значення як найбільш вірогідний. Сучасна патологічна анатомія широко використовує досягнення інших медико-біологічних дисциплін, узагальнюючи фактичні дані біохімічних, морфологічних, генетичних, патофізіологічних та інших досліджень з метою встановлення закономірностей, що стосуються роботи того чи іншого органу, системи при різних захворюваннях. Завдяки завданням, які вирішує в даний час патологічна анатомія, вона займає особливе місце серед медичних дисциплін. З одного боку, патологічна анатомія - це теорія медицини, яка, розкриваючи матеріальний субстрат хвороби, безпосередньо служить клінічній практиці, з іншого - це клінічна морфологія для діагнозу, що дає матеріал субстрат теорії медицини - загальної та приватної патології людини [Сєров В.В., 1982].
Під загальною патологією розуміють найбільш загальні, тобто властиві всім хвороб, закономірності їх виникнення, розвитку та наслідків. Йдучи своїм корінням у приватні прояви різних хвороб і грунтуючись на цих деталях, загальна патологія одночасно синтезує їх, дає уявлення про типові процесах, характерних для тієї або іншої хвороби.
У результаті прогресу медико-біологічних дисциплін (фізіологія, біохімія, генетика, імунологія) і зближення з ними класичної морфології стало очевидним існування єдиного матеріального субстрату проявів життєдіяльності, що включає весь діапазон рівнів організації - від молекулярного до организменного, і ніякі, навіть незначні функціональні порушення не можуть виникнути і зникнути, не позначившись у відповідних структурних змінах на молекулярному чи ультраструктурному рівні. Таким чином, подальший прогрес загальної патології не може бути поставлений в залежність від розвитку якої-небудь однієї дисципліни або їх групи, так як загальна патологія сьогодні являє собою концентрований досвід усіх галузей медицини, оцінений з широких біологічних позицій.
Кожну із сучасних медичних і медико-біологічних дисциплін вносить свою лепту в побудову теорії медицини. Біохімія, ендокринологія та фармакологія розкривають тонкі механізми процесів життєдіяльності на молекулярному рівні; у патологоанатомічних дослідженнях закони загальної патології отримують морфологічну інтерпретацію; патологічна фізіологія дає їх функціональну характеристику; мікробіологія і вірусологія є найважливішими джерелами розробки етіологічного та імунологічного аспектів загальної патології; генетика розкриває секрети індивідуальності реакцій організму та принципи їх внутрішньоклітинного регулювання; клінічна медицина завершує оформлення законів загальної патології людини на основі власного багатющого досвіду та остаточної оцінки одержуваних експериментальних даних під кутом зору психологічних, соціальних та інших факторів. Отже, загальна патологія увазі такий підхід до оцінки явищ, що спостерігаються, який характеризується їх широким медико-біологічним аналізом. Для сучасного етапу розвитку медицини характерно те, що дисципліни, які раніше були переважно або навіть виключно експериментальними (генетика, імунологія, біохімія, ендокринологія, патологічна фізіологія тощо), стають в рівній мірі і клінічними.
Таким чином, сучасна загальна патологія включає:
- Узагальнення фактичних даних, отриманих за допомогою методів дослідження, що використовуються в різних медико-біологічних дисциплінах;
- Вивчення типових патологічних процесів;
- Розробку проблем етіології, патогенезу, морфогенезу хвороб людини;
- Розвиток філософсько-методологічних аспектів біології та медицини (проблеми доцільності, співвідношення структури і функції, частини і цілого, внутрішнього і зовнішнього, соціального та біологічного, детермінізму, цілісності організму, нервизма і інших) на основі осмислення всієї сукупності фактів, отриманих у різних областях медицини;
- Формування теорії медицини взагалі і вчення про хворобу зокрема.
Швидкий розвиток клінічної фізіології, клінічної морфології, клінічної імунології, клінічної біохімії та фармакології, медичної генетики, принципово нових методів рентгенологічного дослідження, ендоскопії, ехографії і надзвичайно збагатило наші знання про фактичні деталях і загальні закономірності розвитку хвороб людини. Все більш широке використання неінвазивних методів дослідження (комп'ютерна томографія, ультразвукова діагностика, ендоскопічні методи та ін) дозволяє візуально визначати локалізацію, розміри і навіть певною мірою характер патологічного процесу, що по суті відкриває шляхи розвитку прижиттєвої патологічної анатомії - клінічної морфології, якій присвячено курс спеціальної патологічної анатомії.
Сфера застосування морфологічного аналізу в клініці постійно розширюється завдяки все зростаючою хірургічної активності та успіхам медичної техніки, а також у зв'язку з удосконаленням методичних можливостей морфології. Вдосконалення медичних інструментів призвело до того, що практично не залишилося таких областей організму людини, які були б недоступні для лікаря. При цьому особливе значення для вдосконалення клінічної морфології набуває ендоскопія, що дозволяє клініцисту займатися морфологічним вивченням хвороби на макроскопічному (органному) рівні. Ендоскопічні дослідження служать і цілям біопсії, за допомогою якої патологоанатом отримує матеріал для морфологічного дослідження і стає повноцінним учасником вирішення питань діагностики, терапевтичної або хірургічної тактики і прогнозу захворювання. Використовуючи матеріал біопсії, патологоанатом вирішує і багато теоретичні питання патології. Тому біоптат стає основним об'єктом дослідження при вирішенні практичних і теоретичних питань патологічної анатомії.
Методичні можливості сучасної морфології задовольняють прагнення патологоанатома до все зростаючої точності морфологічного аналізу порушених процесів життєдіяльності і все більш повної і точної функціональної оцінки структурних змін. Сучасні методичні можливості морфології величезні. Вони дозволяють вивчати патологічні процеси і хвороби на рівні організму, системи, органу, тканини, клітини, клітинної органели і макромолекули. Це макроскопічні та світлооптичних (мікроскопічні), електронно-мікроскопічні, цито-і гістохімічні, імуногістохімічні та авторадіографіческіе методи. Спостерігається тенденція до комплексування ряду традиційних методів морфологічного дослідження, в результаті чого виникли електронно-мікроскопічна гістохімія, електронно-мікроскопічна імуноцитохімії, електронно-мікроскопічна авторадіографія, які суттєво розширили можливості патологоанатома в діагностиці і пізнанні сутності хвороб.
Поряд з якісною оцінкою процесів, що спостерігаються і явищ з'явилася можливість кількісної оцінки і при використанні новітніх методів морфологічного аналізу. Морфометрія дала в руки дослідників можливості застосування електронної техніки і математики для судження про достовірність результатів і правомочність трактування виявлених закономірностей. За допомогою сучасних методів дослідження патологоанатом може виявити не тільки морфологічні зміни, властиві розгорнутій картині того чи іншого захворювання, але й початкові зміни при хворобах, клінічні прояви яких ще відсутні в силу спроможності компенсаторно-пристосувальних процесів [Саркісов Д.С., 1988]. Отже, початкові зміни (доклінічний період хвороби) випереджають їх ранні клінічні прояви (клінічний період хвороби). Тому головним орієнтиром у діагностиці початкових стадій розвитку захворювання служать морфологічні зміни клітин і тканин. Патологічна анатомія, маючи в своєму розпорядженні сучасними технічними та методичними можливостями, покликана вирішувати завдання як клініко-діагностичного, так і науково-дослідного характеру. Виростає значення експериментального напрямку, коли відповіді на складні питання етіології та патогенезу захворювань шукають і клініцист, і патолог. Експеримент використовується насамперед для моделювання патологічних процесів і хвороб, з його допомогою розробляються і випробовуються нові методи лікування. Проте морфологічні дані, отримані в експериментальній моделі хвороби, повинні бути співвіднесені з подібними даними при тієї ж хвороби у людини.
Незважаючи на те, що в останні роки у всіх країнах число розтинів неухильно знижується, патологоанатомічне дослідження залишається одним з головних методів наукового пізнання хвороби. З його допомогою здійснюється експертиза правильності діагнозу і лікування, встановлюються причини смерті. У зв'язку з цим розтин трупа як завершальний етап діагностики необхідно не тільки клініцисту і патологоанатома, але і медичному статистику і організатору охорони здоров'я. Цей метод є базою наукових досліджень, викладання фундаментальних і прикладних медичних дисциплін, школою лікаря будь-якої спеціальності. Аналіз результатів розтину грає важливу роль у вирішенні ряду великих науково-практичних проблем, наприклад проблеми мінливості, або патоморфозу, хвороб. Значення цієї проблеми постійно зростає, тому що все частіше і частіше перед клініцистом і патологоанатомом постає питання: де закінчується патоморфоз і де починається патологія терапії?
ЗАГАЛЬНА ПАТОЛОГІЯ ЛЮДИНИ, ЇЇ ОСНОВНІ ПОЛОЖЕННЯ І ЗНАЧЕННЯ ДЛЯ ПРАКТИЧНОЇ МЕДИЦИНИ
В умовах наростаючої диференціації біологічних і медичних наук, а також прагнення розкрити молекулярні механізми розладів життєдіяльності особливо важливого значення набуває інтеграція найбільш істотних досягнень різних галузей знань для створення цілісного вчення про хворобу, що відображає найбільш загальні закономірності її виникнення, розвитку і завершення. Цією найважливішій задачі служить загальна патологія. Вбираючи головні положення мікробіології, біології, біохімії, генетики, імунології, гігієни, патофізіології та патоморфології, а також клінічних дисциплін, загальна патологія є по суті науковим фундаментом медицини. Вона використовує і експериментальні, і клінічні факти, аналізує розлади та їх прояви на всіх рівнях - від молекулярного до системного та, що особливо важливо, оцінює значення цих розладів для організму як цілого.
Загальна патологія встановлює універсальні закони, відповідно до яких у тваринному організмі відбуваються всілякі відхилення від норми; вона створює таким чином ряд типів хворобливих процесів і є дійсно спільну частиною всього обсягу патології. Тут слід враховувати дві обставини.
- Перше: загальна патологія грунтується на вивченні типових форм патології та загальнопатологічних процесів (дистрофії, гіпоксія, пухлини та інші, а також тромбоз, запалення, лихоманка і т.п.), при обліку певних закономірностей складаючи з них різні хвороби. Інакше кажучи, вона визначає те загальне, що об'єднує всі хвороби і призводить до розуміння їх сутності.
- Друге: загальна патологія використовує закономірності виникнення, розвитку і результату загальнопатологічних процесів у тих органах і системах, де вони сформувалися, знайшли свою мішень. Інакше кажучи, - в залежності від функції та структури органів і систем, а також їх значення у підтримці гомеостазу і життєдіяльності організму. Від приватних органосістемних проявів загальна патологія піднімає патологічні процеси до узагальнення стереотипності, і в той же час вона розглядає роль органосістемних особливостей у розвитку загальнопатологічних процесів і типових форм патології. Для практичної медицини важливе значення має і перше, і друге. Перше дає підставу для розуміння сутності хвороби взагалі, а друге - для розуміння природи формування груп хвороб та їх окремих нозологічних форм.
Загальна патологія - найбільш складна частина медицини, так як вона забезпечує вищу медичну узагальнення знань на основі останніх досягнень приватних дисциплін, включаючи клінічні. Загальна патологія розробляє теорію хвороби, що в даний час набуває принципово важливе значення не тільки для медицини, але і для життя нашого суспільства, в якому поширюються астрологія, окультні уявлення про хворобу, пропагуються лжетерапевтіческіе можливості окремих осіб і т.п.
Методологічною основою розробки теорії патології є діалектичний матеріалізм; на його базі загальна патологія створила ряд принципових положень, які дозволяють по-новому аналізувати проблему хвороби та здоров'я. Серед таких принципових положень необхідно назвати наступні: зв'язок структури і функції, системний підхід у розгляді явищ патології, принцип рекомбінаційних перетворень, роль регуляції в процесах ушкодження і пристосування, загальнобіологічий підхід до оцінки процесів при патології і значення їх індивідуальних варіацій і ін
Структура і функція в патології, їх зв'язок. При будь-якому патологічному процесі або хвороби виявляються функціональні та структурні зміни. Хоча вважається загальноприйнятим, що дві сторони всіх життєвих процесів - біологічна функція та біологічна структура - взаємопов'язані, взаємозалежні і взаімообусловлівают один одного, постійно зустрічаються твердження про "первинність функціональних і вторинності структурних розладів", наявності чисто функціональних стадій хвороби, "функціональних" захворювань, про "примат функції" і "інертності структури". Навіть при аналізі механізмів розвитку хвороби, підкреслюючи відмінність функціональних і структурних розладів, виділяють відповідно патогенез та морфогенез. Ці уявлення були засновані на спробі використовувати в якості методологічної бази для аналізу зв'язку структури і функції категорій "форма і зміст", хоча єдино правильно застосовувати категорії "матерія і рух". Їх зв'язок і взаємозумовленість відображені у відомому вислові великого вітчизняного терапевта В. Х. Василенко: "Функція без структури немислима, а структура без функції безглуздий".
Біологічна структура - це певним чином організована у просторі жива матеріальна система або її частина, що забезпечує виконання тієї чи іншої діяльності (молекула, субклітинних органела, клітина, орган, система, організм). Біологічна функція - це діяльність, тобто зміну в часі стану та / або властивостей живої матеріальної системи або її частини, спрямоване на отримання корисного для неї результату і самозбереження.
Будь-яка біологічна система організована, певним чином структурована, - від молекул різних речовин до організму в цілому. Така структурованість, що забезпечує доцільність функції, результат тривалої еволюції живих істот у процесі їх взаємодії з середовищем проживання, і саме вона є базою, яка визначає виконання організмом спеціалізованих форм діяльності. У складних організмах різноманітні структури виконують свої спеціалізовані функції (виділення секрету, скорочення / розслаблення, передача збудження і багато іншого). При цьому діяльність - не тільки видима зміна стану структури - скорочення (скорочення) м'язи, наприклад, це і зміна її властивостей, зокрема, для м `язи без видимого укорочення - ізометричне напругу. Функції організму в еволюції розвивалися і удосконалювалися зв'язано з розвитком і вдосконаленням структур, також купуючи доцільний характер.
Диференціація структур забезпечила "поділ праці", тобто диференціацію функцій. Ця спеціалізація структур (функцій) поставила їх у залежність один від одного; необхідність взаімосодействія структур визначила формування різних систем управління, у тому числі нервової системи, які стали важливим механізмом єдності, цілісності організму і його взаємодії із середовищем проживання. В еволюції корисні (доцільні) для виживання древні структури зберігалися і зберігалися їх функції, в результаті чого в складних організмах склалися різні структурні і функціональні рівні життєдіяльності: молекулярному, субклітинному, клітинний, органний і системний. Разом з тим на всіх рівнях життєдіяльності має місце взаємозв'язок, спряженість змін структури і функції як двох нероздільних сторін будь-якого життєвого процесу. На всіх рівнях структура і функція можуть сопряженно змінюватися в широких межах як у мікро-, так і в макроінтервалах часу. Зміна структури під впливом якого-небудь фактора (наприклад, мембрановстроенного рецептора) одночасно відображається на її функціональні властивості (афінності рецептора до медіатора і передачі внутрішньоклітинного сигналу). Функція клітин і їх кооперацій може послаблюватися чи навіть припинятися (резервні нефрони, альвеоли і т.п.) і паралельно відбувається відновлення їх ультраструктур. Структурно-функціональна взаємодія на різних рівнях та їх підпорядкованість (субординаційні відносини) є основою регулювання процесів нижчого рівня вищими: це також вносить істотний внесок у забезпечення цілісності організму і його взаємодія з навколишнім середовищем. Неструктурованих біологічних систем не існує; зміни структури на будь-якому рівні пов'язані зі зміною її стану і властивостей, тобто функції, а зміни функції пов'язані зі зміною організації системи, тобто структури. Конформаційні зміни рецептора, наприклад, вбудованого в мембрану клітини, або навіть окремої молекули, ферменту зокрема, - це одночасно трансформація їх властивостей, тобто афінності рецептора і активності ферменту, інакше кажучи, функції. У даному випадку слід говорити швидше не про злиття біохімії з морфологією та фізіологією, а їх взаємопроникненні; морфологія приймає все більш функціональний характер, а біохімія і фізіологія стають все більш структурованими (Д. С. Саркісов).
Принципова позиція про єдність функції і структури знімає питання про можливість існування "функціональних" хвороб і "функціональної стадії" захворювань. Виникнення нервового імпульсу супроводжується зміною організації певних молекул-ферментів, а при психічних захворюваннях виявляється порушення організації синапсів, "укладання" ферментів, нейромедіаторів і везикул. У живому організмі кожна його функція може з'явитися і змінитися внаслідок дії фізіологічних або патогенних факторів на відповідні структури. Жоден з факторів середовища не може надавати прямого впливу на ту або іншу функцію, не інакше як тільки опосередковано, через вплив на структури, що формують ці функції. ПАТОЛОГІЧНА АНАТОМІЯ ТА ЇЇ МІСЦЕ СЕРЕД МЕДИКО-БІОЛОГІЧНИХ ДИСЦИПЛІН
Патологічна анатомія є складовою частиною патології - науки, що вивчає закономірності виникнення і розвитку хвороб, окремих патологічних процесів і станів.
В історії розвитку патологічної анатомії виділяють чотири основних періоди: анатомічний (з давнини до початку XIX століття), мікроскопічний (з першої третини XIX століття до 50-х років XX століття), ультрамікроскопічний (після 50-х років XIX століття); сучасний, четвертий період розвитку патологічної анатомії можна охарактеризувати як період патологічної анатомії живої людини.
Для сучасної медицини характерний постійний пошук найбільш об'єктивних матеріальних критеріїв діагностики і пізнання суті хвороби. Серед цих критеріїв морфологічний набуває виняткового значення як найбільш вірогідний. Сучасна патологічна анатомія широко використовує досягнення інших медико-біологічних дисциплін, узагальнюючи фактичні дані біохімічних, морфологічних, генетичних, патофізіологічних та інших досліджень з метою встановлення закономірностей, що стосуються роботи того чи іншого органу, системи при різних захворюваннях. Завдяки завданням, які вирішує в даний час патологічна анатомія, вона займає особливе місце серед медичних дисциплін. З одного боку, патологічна анатомія - це теорія медицини, яка, розкриваючи матеріальний субстрат хвороби, безпосередньо служить клінічній практиці, з іншого - це клінічна морфологія для діагнозу, що дає матеріал субстрат теорії медицини - загальної та приватної патології людини [Сєров В.В., 1982].
Під загальною патологією розуміють найбільш загальні, тобто властиві всім хвороб, закономірності їх виникнення, розвитку та наслідків. Йдучи своїм корінням у приватні прояви різних хвороб і грунтуючись на цих деталях, загальна патологія одночасно синтезує їх, дає уявлення про типові процесах, характерних для тієї або іншої хвороби.
У результаті прогресу медико-біологічних дисциплін (фізіологія, біохімія, генетика, імунологія) і зближення з ними класичної морфології стало очевидним існування єдиного матеріального субстрату проявів життєдіяльності, що включає весь діапазон рівнів організації - від молекулярного до организменного, і ніякі, навіть незначні функціональні порушення не можуть виникнути і зникнути, не позначившись у відповідних структурних змінах на молекулярному чи ультраструктурному рівні. Таким чином, подальший прогрес загальної патології не може бути поставлений в залежність від розвитку якої-небудь однієї дисципліни або їх групи, так як загальна патологія сьогодні являє собою концентрований досвід усіх галузей медицини, оцінений з широких біологічних позицій.
Кожну із сучасних медичних і медико-біологічних дисциплін вносить свою лепту в побудову теорії медицини. Біохімія, ендокринологія та фармакологія розкривають тонкі механізми процесів життєдіяльності на молекулярному рівні; у патологоанатомічних дослідженнях закони загальної патології отримують морфологічну інтерпретацію; патологічна фізіологія дає їх функціональну характеристику; мікробіологія і вірусологія є найважливішими джерелами розробки етіологічного та імунологічного аспектів загальної патології; генетика розкриває секрети індивідуальності реакцій організму та принципи їх внутрішньоклітинного регулювання; клінічна медицина завершує оформлення законів загальної патології людини на основі власного багатющого досвіду та остаточної оцінки одержуваних експериментальних даних під кутом зору психологічних, соціальних та інших факторів. Отже, загальна патологія увазі такий підхід до оцінки явищ, що спостерігаються, який характеризується їх широким медико-біологічним аналізом. Для сучасного етапу розвитку медицини характерно те, що дисципліни, які раніше були переважно або навіть виключно експериментальними (генетика, імунологія, біохімія, ендокринологія, патологічна фізіологія тощо), стають в рівній мірі і клінічними.
Таким чином, сучасна загальна патологія включає:
- Узагальнення фактичних даних, отриманих за допомогою методів дослідження, що використовуються в різних медико-біологічних дисциплінах;
- Вивчення типових патологічних процесів;
- Розробку проблем етіології, патогенезу, морфогенезу хвороб людини;
- Розвиток філософсько-методологічних аспектів біології та медицини (проблеми доцільності, співвідношення структури і функції, частини і цілого, внутрішнього і зовнішнього, соціального та біологічного, детермінізму, цілісності організму, нервизма і інших) на основі осмислення всієї сукупності фактів, отриманих у різних областях медицини;
- Формування теорії медицини взагалі і вчення про хворобу зокрема.
Швидкий розвиток клінічної фізіології, клінічної морфології, клінічної імунології, клінічної біохімії та фармакології, медичної генетики, принципово нових методів рентгенологічного дослідження, ендоскопії, ехографії і надзвичайно збагатило наші знання про фактичні деталях і загальні закономірності розвитку хвороб людини. Все більш широке використання неінвазивних методів дослідження (комп'ютерна томографія, ультразвукова діагностика, ендоскопічні методи та ін) дозволяє візуально визначати локалізацію, розміри і навіть певною мірою характер патологічного процесу, що по суті відкриває шляхи розвитку прижиттєвої патологічної анатомії - клінічної морфології, якій присвячено курс спеціальної патологічної анатомії.
Сфера застосування морфологічного аналізу в клініці постійно розширюється завдяки все зростаючою хірургічної активності та успіхам медичної техніки, а також у зв'язку з удосконаленням методичних можливостей морфології. Вдосконалення медичних інструментів призвело до того, що практично не залишилося таких областей організму людини, які були б недоступні для лікаря. При цьому особливе значення для вдосконалення клінічної морфології набуває ендоскопія, що дозволяє клініцисту займатися морфологічним вивченням хвороби на макроскопічному (органному) рівні. Ендоскопічні дослідження служать і цілям біопсії, за допомогою якої патологоанатом отримує матеріал для морфологічного дослідження і стає повноцінним учасником вирішення питань діагностики, терапевтичної або хірургічної тактики і прогнозу захворювання. Використовуючи матеріал біопсії, патологоанатом вирішує і багато теоретичні питання патології. Тому біоптат стає основним об'єктом дослідження при вирішенні практичних і теоретичних питань патологічної анатомії.
Методичні можливості сучасної морфології задовольняють прагнення патологоанатома до все зростаючої точності морфологічного аналізу порушених процесів життєдіяльності і все більш повної і точної функціональної оцінки структурних змін. Сучасні методичні можливості морфології величезні. Вони дозволяють вивчати патологічні процеси і хвороби на рівні організму, системи, органу, тканини, клітини, клітинної органели і макромолекули. Це макроскопічні та світлооптичних (мікроскопічні), електронно-мікроскопічні, цито-і гістохімічні, імуногістохімічні та авторадіографіческіе методи. Спостерігається тенденція до комплексування ряду традиційних методів морфологічного дослідження, в результаті чого виникли електронно-мікроскопічна гістохімія, електронно-мікроскопічна імуноцитохімії, електронно-мікроскопічна авторадіографія, які суттєво розширили можливості патологоанатома в діагностиці і пізнанні сутності хвороб.
Поряд з якісною оцінкою процесів, що спостерігаються і явищ з'явилася можливість кількісної оцінки і при використанні новітніх методів морфологічного аналізу. Морфометрія дала в руки дослідників можливості застосування електронної техніки і математики для судження про достовірність результатів і правомочність трактування виявлених закономірностей. За допомогою сучасних методів дослідження патологоанатом може виявити не тільки морфологічні зміни, властиві розгорнутій картині того чи іншого захворювання, але й початкові зміни при хворобах, клінічні прояви яких ще відсутні в силу спроможності компенсаторно-пристосувальних процесів [Саркісов Д.С., 1988]. Отже, початкові зміни (доклінічний період хвороби) випереджають їх ранні клінічні прояви (клінічний період хвороби). Тому головним орієнтиром у діагностиці початкових стадій розвитку захворювання служать морфологічні зміни клітин і тканин. Патологічна анатомія, маючи в своєму розпорядженні сучасними технічними та методичними можливостями, покликана вирішувати завдання як клініко-діагностичного, так і науково-дослідного характеру. Виростає значення експериментального напрямку, коли відповіді на складні питання етіології та патогенезу захворювань шукають і клініцист, і патолог. Експеримент використовується насамперед для моделювання патологічних процесів і хвороб, з його допомогою розробляються і випробовуються нові методи лікування. Проте морфологічні дані, отримані в експериментальній моделі хвороби, повинні бути співвіднесені з подібними даними при тієї ж хвороби у людини.
Незважаючи на те, що в останні роки у всіх країнах число розтинів неухильно знижується, патологоанатомічне дослідження залишається одним з головних методів наукового пізнання хвороби. З його допомогою здійснюється експертиза правильності діагнозу і лікування, встановлюються причини смерті. У зв'язку з цим розтин трупа як завершальний етап діагностики необхідно не тільки клініцисту і патологоанатома, але і медичному статистику і організатору охорони здоров'я. Цей метод є базою наукових досліджень, викладання фундаментальних і прикладних медичних дисциплін, школою лікаря будь-якої спеціальності. Аналіз результатів розтину грає важливу роль у вирішенні ряду великих науково-практичних проблем, наприклад проблеми мінливості, або патоморфозу, хвороб. Значення цієї проблеми постійно зростає, тому що все частіше і частіше перед клініцистом і патологоанатомом постає питання: де закінчується патоморфоз і де починається патологія терапії?
ЗАГАЛЬНА ПАТОЛОГІЯ ЛЮДИНИ, ЇЇ ОСНОВНІ ПОЛОЖЕННЯ І ЗНАЧЕННЯ ДЛЯ ПРАКТИЧНОЇ МЕДИЦИНИ
В умовах наростаючої диференціації біологічних і медичних наук, а також прагнення розкрити молекулярні механізми розладів життєдіяльності особливо важливого значення набуває інтеграція найбільш істотних досягнень різних галузей знань для створення цілісного вчення про хворобу, що відображає найбільш загальні закономірності її виникнення, розвитку і завершення. Цією найважливішій задачі служить загальна патологія. Вбираючи головні положення мікробіології, біології, біохімії, генетики, імунології, гігієни, патофізіології та патоморфології, а також клінічних дисциплін, загальна патологія є по суті науковим фундаментом медицини. Вона використовує і експериментальні, і клінічні факти, аналізує розлади та їх прояви на всіх рівнях - від молекулярного до системного та, що особливо важливо, оцінює значення цих розладів для організму як цілого.
Загальна патологія встановлює універсальні закони, відповідно до яких у тваринному організмі відбуваються всілякі відхилення від норми; вона створює таким чином ряд типів хворобливих процесів і є дійсно спільну частиною всього обсягу патології. Тут слід враховувати дві обставини.
- Перше: загальна патологія грунтується на вивченні типових форм патології та загальнопатологічних процесів (дистрофії, гіпоксія, пухлини та інші, а також тромбоз, запалення, лихоманка і т.п.), при обліку певних закономірностей складаючи з них різні хвороби. Інакше кажучи, вона визначає те загальне, що об'єднує всі хвороби і призводить до розуміння їх сутності.
- Друге: загальна патологія використовує закономірності виникнення, розвитку і результату загальнопатологічних процесів у тих органах і системах, де вони сформувалися, знайшли свою мішень. Інакше кажучи, - в залежності від функції та структури органів і систем, а також їх значення у підтримці гомеостазу і життєдіяльності організму. Від приватних органосістемних проявів загальна патологія піднімає патологічні процеси до узагальнення стереотипності, і в той же час вона розглядає роль органосістемних особливостей у розвитку загальнопатологічних процесів і типових форм патології. Для практичної медицини важливе значення має і перше, і друге. Перше дає підставу для розуміння сутності хвороби взагалі, а друге - для розуміння природи формування груп хвороб та їх окремих нозологічних форм.
Загальна патологія - найбільш складна частина медицини, так як вона забезпечує вищу медичну узагальнення знань на основі останніх досягнень приватних дисциплін, включаючи клінічні. Загальна патологія розробляє теорію хвороби, що в даний час набуває принципово важливе значення не тільки для медицини, але і для життя нашого суспільства, в якому поширюються астрологія, окультні уявлення про хворобу, пропагуються лжетерапевтіческіе можливості окремих осіб і т.п.
Методологічною основою розробки теорії патології є діалектичний матеріалізм; на його базі загальна патологія створила ряд принципових положень, які дозволяють по-новому аналізувати проблему хвороби та здоров'я. Серед таких принципових положень необхідно назвати наступні: зв'язок структури і функції, системний підхід у розгляді явищ патології, принцип рекомбінаційних перетворень, роль регуляції в процесах ушкодження і пристосування, загальнобіологічий підхід до оцінки процесів при патології і значення їх індивідуальних варіацій і ін
Структура і функція в патології, їх зв'язок. При будь-якому патологічному процесі або хвороби виявляються функціональні та структурні зміни. Хоча вважається загальноприйнятим, що дві сторони всіх життєвих процесів - біологічна функція та біологічна структура - взаємопов'язані, взаємозалежні і взаімообусловлівают один одного, постійно зустрічаються твердження про "первинність функціональних і вторинності структурних розладів", наявності чисто функціональних стадій хвороби, "функціональних" захворювань, про "примат функції" і "інертності структури". Навіть при аналізі механізмів розвитку хвороби, підкреслюючи відмінність функціональних і структурних розладів, виділяють відповідно патогенез та морфогенез. Ці уявлення були засновані на спробі використовувати в якості методологічної бази для аналізу зв'язку структури і функції категорій "форма і зміст", хоча єдино правильно застосовувати категорії "матерія і рух". Їх зв'язок і взаємозумовленість відображені у відомому вислові великого вітчизняного терапевта В. Х. Василенко: "Функція без структури немислима, а структура без функції безглуздий".
Біологічна структура - це певним чином організована у просторі жива матеріальна система або її частина, що забезпечує виконання тієї чи іншої діяльності (молекула, субклітинних органела, клітина, орган, система, організм). Біологічна функція - це діяльність, тобто зміну в часі стану та / або властивостей живої матеріальної системи або її частини, спрямоване на отримання корисного для неї результату і самозбереження.
Будь-яка біологічна система організована, певним чином структурована, - від молекул різних речовин до організму в цілому. Така структурованість, що забезпечує доцільність функції, результат тривалої еволюції живих істот у процесі їх взаємодії з середовищем проживання, і саме вона є базою, яка визначає виконання організмом спеціалізованих форм діяльності. У складних організмах різноманітні структури виконують свої спеціалізовані функції (виділення секрету, скорочення / розслаблення, передача збудження і багато іншого). При цьому діяльність - не тільки видима зміна стану структури - скорочення (скорочення) м'язи, наприклад, це і зміна її властивостей, зокрема, для м `язи без видимого укорочення - ізометричне напругу. Функції організму в еволюції розвивалися і удосконалювалися зв'язано з розвитком і вдосконаленням структур, також купуючи доцільний характер.
Диференціація структур забезпечила "поділ праці", тобто диференціацію функцій. Ця спеціалізація структур (функцій) поставила їх у залежність один від одного; необхідність взаімосодействія структур визначила формування різних систем управління, у тому числі нервової системи, які стали важливим механізмом єдності, цілісності організму і його взаємодії із середовищем проживання. В еволюції корисні (доцільні) для виживання древні структури зберігалися і зберігалися їх функції, в результаті чого в складних організмах склалися різні структурні і функціональні рівні життєдіяльності: молекулярному, субклітинному, клітинний, органний і системний. Разом з тим на всіх рівнях життєдіяльності має місце взаємозв'язок, спряженість змін структури і функції як двох нероздільних сторін будь-якого життєвого процесу. На всіх рівнях структура і функція можуть сопряженно змінюватися в широких межах як у мікро-, так і в макроінтервалах часу. Зміна структури під впливом якого-небудь фактора (наприклад, мембрановстроенного рецептора) одночасно відображається на її функціональні властивості (афінності рецептора до медіатора і передачі внутрішньоклітинного сигналу). Функція клітин і їх кооперацій може послаблюватися чи навіть припинятися (резервні нефрони, альвеоли і т.п.) і паралельно відбувається відновлення їх ультраструктур. Структурно-функціональна взаємодія на різних рівнях та їх підпорядкованість (субординаційні відносини) є основою регулювання процесів нижчого рівня вищими: це також вносить істотний внесок у забезпечення цілісності організму і його взаємодія з навколишнім середовищем. Неструктурованих біологічних систем не існує; зміни структури на будь-якому рівні пов'язані зі зміною її стану і властивостей, тобто функції, а зміни функції пов'язані зі зміною організації системи, тобто структури. Конформаційні зміни рецептора, наприклад, вбудованого в мембрану клітини, або навіть окремої молекули, ферменту зокрема, - це одночасно трансформація їх властивостей, тобто афінності рецептора і активності ферменту, інакше кажучи, функції. У даному випадку слід говорити швидше не про злиття біохімії з морфологією та фізіологією, а їх взаємопроникненні; морфологія приймає все більш функціональний характер, а біохімія і фізіологія стають все більш структурованими (Д. С. Саркісов).
Системний підхід до оцінки нормальних і патологічних явищ. Прагнення науки пізнати все більш глибинні, молекулярні і субмолекулярному основи фізіологічної і патологічної життя здається природним, закономірним і перспективним. Однак будь-яка реакція організму або процес як у нормі, так і при патології на будь-якому рівні - від молекулярного до организменного, є багатокомпонентним, тобто представляється системним і має свій результат. Система - це сукупність пов'язаних і взаємодіючих елементів, що дає такий результат, який не може бути обумовлений жодним з цих елементів окремо, причому біологічне значення результату будь-якої біологічної системи може бути об'єктивно оцінено лише на організмовому рівні. Таким чином, виявляється, що і симптоми, і синдроми, а також що лежать в їх основі патологічні або пристосувальні процеси представляють собою системи зі своїми результатами. Відповідно і здоров'я, і хвороба є стан системи, в даному випадку організму як цілого. Тим часом у медицині постійно використовується понятійний апарат, що суперечить системним принципом; хоча поняття "хвороба" застосовне лише до організму як цілого, в багатьох випадках пишуть про хвороби молекул (гемоглобіну, наприклад), лізосом, мітохондрій, цитоскелету і т.д. Слід обмежитися хоча б тим, що стало загальноприйнятим у відповідності з органосістемним принципом у медицині (хвороби серця, шлунка, ендокринної системи тощо). Поза системного принципу - єдино об'єктивного інструменту аналізу "цілого" - пізнання хвороби неможливо, так як вона є форма життєдіяльності організму, а не його частин.
Регулювання життєдіяльності в нормі та при патології; антагоністична регуляція. Використання системного принципу при аналізі хвороби в свою чергу неможливо без правильного розуміння закономірностей регуляції життєдіяльності, оскільки регулюючі механізми визначають зв'язок елементів системи і відносини, які складаються між різними системами. При цьому велику роль відіграють дослідження молекулярних і структурних основ регулювання фізіологічних процесів, значення ступеня та рівня ушкодження у порушенні роботи керуючих систем, виявлення особливих, відмінних від норми форм управління життєдіяльністю та ін Основний принцип саморегуляції - будь-яке відхилення від норми - є стимулом повернення до нормі на певних етапах розвитку патології і на певному, наприклад вищому, рівні управління може втрачатися. Проте механізми саморегуляції життєдіяльності не зникають повністю до тих пір, поки зберігається життя; з наростанням тяжкості розладів провідними стають механізми саморегуляції низьких рівнів життєдіяльності аж до процесів в обміні речовин. У вкрай важких станах, що загрожують смертю, може змінюватися форма регуляції і виникати так звана екстремальна регуляція. Поряд з цим правильне використання системного підходу та визначення ролі регулюючих механізмів незалежно від їх рівня та складності принципово неможливі без розуміння природи і значення основи будь-якої форми управління, яка полягає в реципрокного регуляції. Саме антагоністична регуляція, тобто ± впливу - впливу протилежного знаку, чи лежать вони в основі прямих чи зворотних, внутрішньо-або міжсистемних зв'язків, визначає організацію будь-яких систем і їх відносини в нормі і при патології (Д. С. Саркісов). З точки зору Д. С. Саркісова, протилежність регулюючих впливів створює єдність, цілісність всього управління життєдіяльністю організму, а базою такого управління є єдність і протилежність анаболічних і катаболічних процесів в організмі.
Вимагають осмислення з сучасних позицій уявлення про місце нервової регуляції серед усього розмаїття керуючих систем, їх взаємозв'язку, а також особливості роботи в умовах патології перш за все при формуванні пристосувальних процесів. Від вирішення цих питань залежить правильне розуміння тих відносин, які складаються між місцевими та загальними процесами в умовах патології, і, крім цього, правильне розуміння цілісності організму взагалі в процесі розвитку хвороби при її несприятливому перебігу і в термінальних станах. Що відбувається з інтегративними процесами і пристосувальними реакціями в подібних умовах наростаючої по важкості хвороби і при вмиранні? Інтегративні зв'язки можуть бути менш складними і різноманітними, але вони існують і забезпечують адаптивні реакції до тих пір, поки зберігається життя. Очевидно, що цілям пристосування служать не тільки розширення інтеграційних зв'язків із зростанням тих чи інших функцій (П. К. Анохін), але і звуження цих зв'язків (ізоляція клітин, органів або систем) з мінімізацією функцій. Мінімізація функцій дозволяє зменшити енерговитрати і зберегти енергозабезпечення біогенезу структур - матеріальних носіїв даних функцій. Дійсно, в будь-якій спеціалізованій клітині основна маса енергії АТФ йде на виконання функції і реалізацію керуючих сигналів; значно менша частина енергії витрачається на пластичні процеси та підтримання структури. При зниженні внутрішньоклітинної регенерації АТФ спочатку знижуються енерговитрати на реалізацію регулюючих впливів, що призводить до ізоляції (автономізації) клітини або сукупності клітин, в тому числі тому, що утворення вторинних месенджерів, наприклад цАМФ і цГМФ, пов'язане з використанням АТФ. Надалі відбувається припинення функції, а в пейсмекера серця та дихальних нейронах - мінімізація функції до межі, сумісного з життям. Функціональна ізоляція і мінімізація функції дозволяють певний час зберегти на нормальному рівні пластичні процеси і структури клітин. Пошкодження ультраструктур клітин починаються з того моменту, коли ступінь падіння енергозабезпечення перевищує рівень, необхідний для виконання функції. Це не означає, що при важкому енергетичному дефіциті зміни функції клітин відбуваються без трансформації ультраструктур, навпаки, ультраструктурні та функціональні зміни протікають сопряженно, зміни структури мають пристосувальне значення. Крім сказаного вище, системність реагування організму і роль антагоністичної регулювання можуть бути правильно зрозумілі і використані при вирішенні проблеми хвороби лише на основі принципу комбінації (рекомбінації) структур і функцій, сформульованого Д. С. Саркісови. Відповідно до цього принципу пристосування організму в нормі і при патології або його вдосконалення у філогенезі та онтогенезі досягається не лише за рахунок включення або створення нових елементів біологічних систем, але і внаслідок оптимальних комбінацій і рекомбінації елементів з числа наявних. З зазначених позицій стають зрозумілими висока швидкість і специфічність пристосувальних реакцій на безмежне число патогенних факторів при великій економії витрат енергії і пластичного матеріалу в будь-якій біологічній системі. З'являються також нові аспекти в розумінні виникнення різноманітних форм патології та стадійності їх перебігу. Зокрема, відносно невелике число загальнопатологічних процесів внаслідок своєрідного їх поєднання в кожен даний момент і в динаміці розвитку хвороби визначають велика кількість її нозологічних форм при практично нескінченної варіації індивідуального перебігу захворювання. Разом з тим рекомбінаційний принцип формування систем не може реалізуватися без антагоністичної регуляції, так як будь-яка перегрупування вимагає включення одних структур (функцій) при виключенні інших; порушення антагоністичної регуляції при патології призводить до розладу системних пристосувальних процесів.
Загальнобіологічий підхід до оцінки явищ патології. Цей підхід до світу патології найбільш об'ємно і аргументовано застосований І. В. Давидовським. Вироблені і закріплені в генотипі організмів комбінації, які ми спостерігаємо в індивіда у формі того чи іншого процесу і неправильно називаємо загальнопатологічними, не є патологічними по суті, за їх походженням. У індивіда вони можуть стати ушкоджувальними, а частіше набувають подвійне значення (і позитивне, і негативне) нерідко одночасно внаслідок якого порушення генетичної програми, або розладів її реалізації. З точки зору висловлених раніше концептуальних положень і общебиологического підходу, необхідно повністю переглянути фундаментальні аспекти теорії патології: вчення про загальнопатологічних (типових патологічних) процесах, загальну етіологію, патогенез, хвороба тощо
Так звані типові патологічні процеси, їх роль у пристосуванні і розладах життєдіяльності. Серед різноманітних процесів у розвитку хвороби є особлива група так званих типових (стереотипних, загальнопатологічних) процесів, які займають особливе місце в патології, так як вироблені в процесі еволюції, закріпилися, розвивалися і вдосконалювалися, забезпечуючи пристосування і виживання видів. До них зазвичай відносять гіперплазію (регенерацію), гіпертрофію, тромбоз, запалення, лихоманку, імунітет, інфекційний процес і ін Ці процеси характеризуються тим, що викликаються різними патогенними факторами, мають стереотипні прояви і лежать в основі багатьох захворювань або супроводжують ім. Крім таких типових патологічних процесів, існують також типові форми патології - дистрофія, гіпоксія, набряк, пухлинний процес та інших, які представлені на всіх етапах еволюційного розвитку, але виникають внаслідок недостатності природних історичних механізмів пристосування, що підтримують обмін речовин (дистрофія), кисневий і енергетичний режим (гіпоксія), а також сталість клітинного складу організму (пухлина). Деякі автори і ці явища відносять до типових патологічних процесів.
Запалення - типовий патологічний процес, що сформувався в еволюції як захисно-пристосувальною реакції організму на місцеве пошкодження тканин, яка забезпечує локалізовану фіксацію, знищення та елімінацію патогенного агента і продуктів розпаду тканин, а також відновлення їх цілісності. Якщо запалення не формується чи знижується його бар'єрна роль, виникає загроза генералізації процесу та розвитку сепсису. Разом з тим еволюційно вироблений пристосувальний процес запалення, як і інші (тромбоз, лихоманка, інфекційний процес), можуть призводити окремі організми до загибелі. Таким чином, реалізація генетично детермінованих (еволюційно закріплених) потенційно корисних програм реагування у окремих індивідів може порушуватися. Частіше за все результат реалізації таких програм набуває подвійне, і корисне, і шкідливий, значення для організму, що вимагає лікарської корекції. Порушення реалізації цих пристосувальних програм пов'язано з особливостями патогенних факторів, локалізацією їх дії і властивостями організму, його реактивністю.
У теорії патології можна виділити ряд аспектів, що мають найбільш істотне значення, без розкриття яких неможливо сформувати вчення про хворобу. Перш за все це проблема причинності в патології і рішення вузлових питань загальної етіології хвороб людини. У даному розділі слід визначити роль зовнішніх і внутрішніх чинників у виникненні хвороби, так званого пускового значення патогенного подразника, факторів ризику і т.п. Необхідно усвідомити, що слід вкладати в поняття "патогенний" (надзвичайний, або хворобливий) подразник; якими властивостями володіють патогенний подразник і конкретний організм, наслідком чого при їх взаємодії виникає хвороба; що являє собою процес взаємодії патогенного агента і організму з методологічної та медичної точок зору? Важливо віддавати собі звіт в тому, що один і той же патогенний подразник може викликати різні захворювання (наприклад, один алерген - різні алергічні хвороби), а одне і те ж захворювання може виникати під впливом багатьох патогенних факторів (гіпертонічна хвороба). Не виключено, що з розвитком медичної науки даний постулат може піддаватися істотному коригуванню. Гіпертонічна хвороба, наприклад, розпадеться на різні нозологічні форми. У кожному з цих захворювань будуть виявлені специфічні особливості, пов'язані з властивостями патогенного (их) фактора (ів). Разом з тим у ряді випадків у виникненні хвороби певну роль набувають хвороботворні умови (наприклад, доза, частота, кратність і місце введення алергену); вони ж можуть визначати специфічні риси хвороби.
Розробка різних питань патогенезу хвороби в даний час зберігає свою актуальність. У цьому напрямку істотну роль грають визначення сутності ушкодження, виділення його форм, рівнів і механізмів, визначення критеріїв фізіологічного і патологічного пошкодження, а також оборотності останнього і багато інших питань. Крім переосмислення з сучасних позицій механізмів зміни причинно-наслідкових відносин, перш за все нейрогенних, формування
порочних кіл та самозаглиблення ушкодження, вимагає пильної уваги питання про методологічні засади розвитку хвороби; хвороба - "фільм", а не "фотографія". Вона постійно розвивається, іноді затухаючи, а потім поновлюючись. Як відповісти на питання: що є методологічною основою розвитку хвороби, її стадійності? З позиції самого ушкодження відповідь на це питання отримати неможливо. Суперечливість хвороби та методологічна основа її розвитку полягають у наявності та протидію ушкодження й пристосування (патогенезу і саногенезу). У розробці всіх аспектів патогенезу, як і саногенезу, принципове значення має правильне рішення проблеми зв'язку структури і функції в сучасному розумінні даних біологічних категорій. Хоча очевидно, що ця проблема повинна вирішуватися на основі взаємообумовленості та спряженості структурних та функціональних змін, в порушення цього положення нерідко в хвороби поряд з патогенезом виділяють морфогенез. Якщо слідувати положенням про нерозривність структури і функції, то в патогенезі (як і саногенезу) необхідно бачити не тільки морфогенез, але і функціогенез (Д. С. Саркісов).
Найважливішим напрямом в загальній патології є вивчення саногенезу, прояви якого у формі реакцій негайно включаються при дії патогенних факторів, і розлади життєдіяльності не виникають до тих пір, поки досить ефективно функціонують саногенетичні механізми. Загальна патологія повинна відповісти не тільки на питання, чому хвороба виникає, а й чому хвороба не виникає або чому вона виникає тільки в окремих осіб при дії на багатьох з них патогенних факторів. Прояви саногенезу виявляються в усі періоди хвороби і будуються на принципах саморегуляції, як і в нормі, проте при хворобі вони можуть купувати якісні особливості, пов'язані з пошкодженням. Загальна патологія повинна розкривати істота і значення цих особливостей пристосувальних процесів.
Розробка розглянутих вище аспектів є обов'язковою передумовою для формулювання ясної та чіткої теорії хвороби - концепції про вузлових закономірності її виникнення, якісні особливості, що відрізняють хвороба від здоров'я, значення її для виду й індивіда, тобто ролі з общебиологической та медичної точок зору. Існуючі дефініції хвороби або акцентують увагу на якому-небудь одному її прояві ("відхилення від норми", "порушення врівноваження організму з середовищем", "ушкодження структур" і т.п.), або настільки громіздкі, що не дозволяють показати головне, що становить істота хвороби і не можуть служити керівництвом до дії в практичній медицині. Навіть у клініці зараз спостерігається тенденція до домінування сімптомологіі і сіндромологіі над нозологій; нозологічний принцип повинен бути головним у мисленні лікаря, визначаючи його стратегію і тактику в практичній діяльності.
Важливий і складний питання еволюції хвороб людини; його рішення входить у сферу стратегічних напрямів сучасної теоретичної та практичної медицини. Освоєння раніше необжитих регіонів Землі, космічного простору, поява нових технологій і у зв'язку з усім цим нових патогенних факторів, з якими людство не контактувало, загрожує появою раніше не існували хвороб. Широке поширення, особливо при неправильному використанні, сульфаніламідів та антибіотиків призводить до появи хвороб зі стертою або незвичайної картиною, резистентних форм інфекцій, алергії, а застосування стероїдів - до виникнення різного роду ендокринопатій та імунних дефіцитів. Трансформація властивостей патогенних факторів і поява їх нових видів, особливості патологічних процесів у різні періоди розвитку людства, а також їх терапія - обов'язкова сфера уваги патолога і лікаря (еволюційна патологія, екологічна патологія, лікарська патологія). Важливе значення з практичної точки зору мають питання, що стосуються виділення і істоти стадій захворювань, особливо неінфекційних, розшифровки механізмів їх закономірною зміни. Тут особливо серйозну роль для медичної практики відіграє аналіз доклінічних форм захворювання та закономірностей одужання організму. Розробка основних напрямків вчення про хвороби і створення її концепції мають стати новою базою для теорії визначення діагнозу, тобто визначення його обов'язкової адекватної структури. Вивчення проблеми причинності в патології та етіології, а також патогенезу і саногенезу хвороб з поглибленим аналізом ролі загальнопатологічних процесів у їх розвитку створює необхідні передумови для створення сучасних принципів профілактики і терапії.
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ В ПАТОЛОГІЇ
Цілі, що стоять перед будь-якою наукою, можуть бути досягнуті тільки в тому випадку, якщо вона володіє методами та методиками, адекватними поставленим завданням. Тому й патологія протягом століть розробляла й удосконалювала свої методики. Саме нові можливості, які виникали з появою нових методів дослідження, дозволяли робити відкриття, радикально змінювали погляди на патологію, починати якісно нові етапи її розвитку.
Патологічна анатомія використовує три основні методи дослідження - розтин трупів людей, померлих від хвороб (1); мікроскопічні методи вивчення тканин (2); експеримент, що дозволяє моделювати на тварин патологічні процеси і хвороби (3). Кожен з цих методів має безліч методик, які в сукупності дозволяють спостерігати патологічні процеси не тільки на рівні організму, але і на клітинному, субклітинному та молекулярному рівнях. Завдяки цим методам патолог може спостерігати єдність структури і функції і в фізіологічних умовах, і в умовах патології, що якісно відрізняє сучасну патологію від патологічної анатомії та патологічної фізіології навіть першої половини XX ст.
Аутопсія
Розтин трупів (аутопсія) - один з найбільш старих методів морфологічного дослідження. З давніх часів розтин (спочатку окремих органів, а потім і трупів) використовували для визначення причин хвороб і виявлення тих змін органів і тканин, які виникають при захворюванні і призводять хворого до смерті. Саме розтин трупів померлих дозволяє говорити про те, що являє собою хворобу, якою морфологічний субстрат відповідає порушень функцій і клінічних проявів хвороби в її динаміці, при одужанні, інвалідизації чи смерті хворого. По змін органів і тканин, виявленим при розтині, можна судити про ефективність тих чи інших лікувальних заходів, про індукований патоморфозі хвороб, а також про лікарські помилки і ятрогенних. Нерідко лише на розтині виникають підозри на те чи інше інфекційне захворювання, що дозволяє провести відповідні дослідження спільно з інфекціоністами, епідеміологами, фтизіатрами та іншими фахівцями. Інколи під час розтину трупа виявляються погрішності в оперативному втручанні або в проведених маніпуляціях, а також кримінальні причини смерті. Нарешті, саме результати розтину, ретельне дослідження всіх змін органів і систем померлого дозволяють скласти найбільш повне та об'єктивне уявлення про те захворюванні, яким страждав хворий за життя. Тому розтин обов'язково передбачає складання патологоанатомічного діагнозу, який будується за тими ж принципами, що і клінічний діагноз. Це дозволяє порівнювати клінічний і патологоанатомічний діагнози, констатувати їх збіг або розбіжність і в останньому випадку оцінювати значення лікарської помилки і шукати разом з клініцистами її причину. Тим самим розтин трупів померлих служить цілям контролю лікувально-діагностичної діяльності лікарні чи поліклініки та підвищення кваліфікації лікарського персоналу.
Разом з тим результати аутопсії, зафіксовані в протоколі розкриття, дозволяють проводити аналіз ведення хворого в клініці в тих випадках, коли мова може йти про лікарські злочини, дають можливість вести наукові дослідження і розробляти статистичні дані. За результатами патологоанатомічних досліджень медична статистика аналізує причини і характер смертності населення.
У зв'язку із зазначеним аутопсія не втрачає свого значення і при широкому використанні біопсійної діагностики захворювань. Тільки розтин трупа дозволяє побачити і оцінити всю історію хвороби людини від початку і до кінця, разом з клініцистами проаналізувати всі етапи лікування хворого, підсумувати як позитивний, так і негативний досвід лікарів і обговорити всі аспекти лікування та помилок на клініко-анатомічних конференціях лікувальних установ.
Патологоанатомічні розтину трупів виробляє лікар-прозектор в патологоанатомічному відділенні лікарні. Іноді прозектором називають патологоанатомами. Тут немає принципових відмінностей, але патологоанатомами офіційно є викладачі кафедр патологічної анатомії та співробітники відповідних підрозділів науково-дослідних інститутів. В управліннях і комітетах охорони здоров'я міського рівня, а також у міністерствах охорони здоров'я обласного, крайового і республіканського рівнів є патологоанатомічна служба і посаду головного патологоанатома.
Результати аутопсії багато в чому залежать від методу розтину трупа. Існує кілька методів, які використовує патологоанатом в залежності від конкретної ситуації та умов, в яких проводиться аутопсія. Одним з перших спеціальний метод розтину запропонував Рудольф фон Вірхов, видаляли органи окремо. При цьому, однак, порушуються анатомічні зв'язки між органами, що в ряді випадків може привести прозектора до помилки. Пізніше А.І. Абрикосов запропонував вести розтин, слідуючи топографическому розташуванню органів, які при цьому діляться на п'ять систем і витягуються в п'ять прийомів. Недоліком методу є те, що він приводить до розчленування анатомо-фізіологічних систем на фрагменти. Іноді при цьому доводиться розсікати пухлина або оперовані органи. Найбільше поширення в практиці отримав спосіб Г.В. Шора, при якому органи виділяють не поодинці, а цілим органокомплексах. При евісцераціі зберігаються природні зв'язки між органами, а також зміни в їх топографії, що виникли в результаті операції, визначаються межі проростання пухлини і т.п. Використання методу розтину по Шору не перешкоджає застосуванню спеціальних способів розкриття окремих систем організму (наприклад, ендокринної). Особливості різних способів розтину трупів описані в спеціальній літературі.
Біопсія
Біопсія - прижиттєве взяття тканин, органів або суспензії клітин для мікроскопічного дослідження з діагностичною метою, а також для вивчення динаміки патологічного процесу і впливу на нього лікувальних заходів. У залежності від способу взяття матеріалу виділяють інцизійною, пункційну, ендоскопічну і аспіраційну біопсії.
Інцизійна біопсія
При інцизійною біопсії частину тканини з органу або цілий орган січуть хірургічним шляхом. Біоптат фіксують у розчині формаліну або інший фіксує рідини, після чого проводять гістологічне дослідження. Нерідко характер патологічного процесу (наприклад, характер пухлини) необхідно встановити під час операції. У цих випадках показана термінова біопсія. Тканина фіксують швидко, звичайно шляхом заморожування її в рідкому азоті або за допомогою вуглекислого газу. Потім з біоптату готують гістологічні зрізи, забарвлюють і досліджують під мікроскопом з метою термінової діагностики. Це надзвичайно важливо для визначення обсягу оперативного втручання.
Пункційна біопсія
При пункційної біопсії стовпчик тканини з органу отримують за допомогою спеціальної голки або троакара. Різновидом пункційної біопсії є трепанобиопсия, при якій отримують тканину кісток або кісткового мозку за допомогою спеціального інструменту - тріпатися.
Ендоскопічна біопсія
Завдяки розвитку ендоскопічних методів дослідження з'явилася ендоскопічна біопсія. Особливо широке поширення отримала ендоскопічна біопсія шлунка, кишечника і бронхів. Обсяг матеріалу, отриманого за допомогою ендоскопа, дуже малий, тому високий ступінь верифікації патологічного процесу може бути забезпечена тільки при дослідженні 4-6 біоптатів.
Аспіраційна біопсія
Аспіраційну біопсію застосовують для дослідження рідкого вмісту порожнистих органів або аспірату, отриманого з порожнин тіла за допомогою спеціальних інструментів. З цією ж метою вивчають діалізний розчин з бронхів, шлунка, плевральної або черевної порожнин, з порожнини матки. Отриманий матеріал піддають в основному цитологічному дослідженню.
Підготовка матеріалу
Отримані тим чи іншим шляхом шматочки тканини для подальшої світловій мікроскопії (СМ) зазвичай фіксують у 10% нейтральному забуференной формаліні. Для виявлення окремих компонентів клітин використовують спеціальні фіксують рідини - Буена, Карнуа та ін Фіксований матеріал ріжуть на мікротому, після чого застосовують оглядові забарвлення зрізів або проводять різні гістохімічні реакції. Для електронної мікроскопії (ЕМ) існують спеціальні методи приготування біопсійного матеріалу, який потім ріжуть на ультратоме, домагаючись товщини зрізу в 30-50 нм.
Біопсію застосовують і в поліклініці, де широке поширення отримали інцизійною біопсії шийки матки, шкіри, пункційні біопсії поверхнево розташованих пухлин, аспіраційні біопсії вмісту порожнини матки, верхньощелепних (гайморових) пазух і деяких інших порожнин.
Біопсійний матеріал може бути отриманий і для ЕМ-вивчення. Цей метод найбільш широко використовують в онкології. Іноді тільки дослідження ультраструктури клітин пухлини дозволяє встановити її гістогенез.
Мікроскопічні методи дослідження
Мікроскопічні методи дослідження - способи вивчення різних об'єктів з допомогою мікроскопа. У біології та медицині цими методами вивчають будову мікроскопічних об'єктів, розміри яких лежать за межами роздільної здатності ока людини. Основу мікроскопічних методів дослідження становлять СМ і ЕМ. СМ має кілька різновидів, кожна з яких використовує різні властивості світла: фазово-контрастна, інтерференційна, люмінесцентна, поляризаційна, стереоскопічний, ультрафіолетова, інфрачервона. У ЕМ зображення об'єктів дослідження виникає в результаті направленого потоку електронів.
Світлова мікроскопія
СМ грунтується на таких визначальних чинниках, як роздільна здатність мікроскопа, спрямованість світлового променя, а також особливості досліджуваного об'єкта, який може бути прозорим і непрозорим. У залежності від властивостей об'єкта змінюються фізичні властивості світла - його колір і яскравість, пов'язані з довжиною і амплітудою хвилі, фаза, площину і напрям розповсюдження хвилі. Для СМ біологічні об'єкти зазвичай забарвлюють для виявлення тих або інших їх властивостей. При цьому тканини повинні бути фіксовані, так як забарвлення виявляє певні структури тільки загиблих клітин. У живій клітині барвник відокремлюється в цитоплазмі у вигляді вакуолі і не профарбовують клітинні структури. Тим не менше в СМ можна вивчати і живі біологічні об'єкти (вітальна мікроскопія). У цьому випадку застосовують темнопольний конденсор.
Фазово-контрастна мікроскопія застосовується для дослідження живих і нефарбованих біологічних об'єктів. Вона заснована на методах променя світла в залежності від особливостей об'єкта вивчення, від яких залежить зміна довжини і фази світлової хвилі. У патології фазово-контрастна мікроскопія знаходить застосування при дослідженні найпростіших, клітин рослин і тварин, при підрахунку і диференціювання клітин кісткового мозку і периферичної крові, при вивченні клітин культури тканин та ін
Поляризаційна мікроскопія дозволяє вивчати біологічні об'єкти в світі, утвореному двома променями, поляризованими у взаємно перпендикулярних площинах, тобто в поляризованому світлі. Цього досягають за допомогою плівчастих поляроїдів або призм Ніколя, які поміщають в мікроскопі між джерелом світла і препаратом. Поляризація змінюється при проходженні (або віддзеркаленні) променів світла через різні і оптично різнорідні структури. У так званих ізотропних структурах швидкість поширення поляризованого світла не залежить від площини поляризації, а в анізотропних структурах швидкість його розповсюдження змінюється в залежності від напрямку світла по поздовжньої або поперечної осі об'єкту. Якщо показник заломлення світла вздовж структури більше, ніж у поперечному напрямку, виникає позитивне подвійне променезаломлення, при зворотних взаєминах - негативне подвійне променезаломлення. Багато біологічні об'єкти мають сувору молекулярну орієнтацію, є анізотропними та мають позитивний подвійне променезаломлення. Такими властивостями володіють міофібрили, війки миготливого епітелію, колагенові волокна і ін Зіставлення характеру променезаломлення поляризованого світла і величини анізотропії об'єкту дозволяє судити про молекулярної організації його структури. Поляризаційна мікроскопія є одним з гістологічних, а також цитологічних методів дослідження, способом мікробіологічної діагностики та ін Важливо, що в поляризованому світлі можна дослідити як пофарбовані, так і незабарвлені і нефіксовані (нативні) зрізи тканин.
Люмінесцентна мікроскопія заснована на властивості багатьох речовин давати свічення - люмінесценцію в УФ-променях або в синьо-фіолетової частини спектра світла. Ряд біологічних речовин, таких як прості білки, коферменти, деякі вітаміни, лікарські засоби (ЛЗ) мають власної (первинної) люмінесценцією. Інші речовини починають світитися при додаванні до них спеціальних барвників - флюорохромом (вторинна люмінесценція). Флюорохромом можуть розподілятися в клітці дифузно, але можуть вибірково забарвлювати окремі клітинні структури або певні хімічні сполуки. На цьому грунтується використання люмінесцентної мікроскопії в цитологічних і гістохімічних дослідженнях. Імунофлюоресценція в люмінесцентному мікроскопі дозволяє виявляти різні Аг і їх концентрацію в клітках, при цьому можлива ідентифікація вірусів, визначення AT і імунних комплексів, гормонів, різних продуктів метаболізму і др.Люмінесцентную мікроскопію застосовують для діагностики вірусних інфекцій, за допомогою вторинної люмінесценції діагностують злоякісні пухлини в гістологічних та цитологічних препаратах, визначають вогнища ішемії м'яза серця при ранніх термінах інфаркту міокарда, виявляють амілоїд в біоптатах тканин і т. д.
Ультрафіолетова й інфрачервона мікроскопія заснована на здатності поглинання УФ-та інфрачервоних променів певних довжин хвиль деякими речовинами, що входять до складу живих клітин, мікроорганізмів або фіксованих, але не забарвлених тканин, прозорих у видимому світлі. Властивістю поглинати УФ-промені мають високомолекулярні сполуки, такі як нуклеїнові кислоти, білки, ароматичні амінокислоти (тирозин, триптофан, метілаланін), пуринові і піримідинові підстави та ін За допомогою УФ-мікроскопії вивчають локалізацію і кількість таких речовин, а при дослідженні живих об'єктів - їх зміни в процесі життєдіяльності. Інфрачервона мікроскопія застосовується в медицині переважно в нейроморфологии та офтальмології.
Для спеціальних цілей в патології використовуються і інші мікроскопічні методи - інтерференційна, стереоскопічний мікроскопія та ін
Електронна мікроскопія
ЕМ застосовують для вивчення структури клітин, мікроорганізмів і вірусів на субклітинному і макромолекулярному рівнях. Значну роздільну здатність ЕМ забезпечує потік електронів, що проходять у вакуумі через електромагнітні поля, створювані електромагнітними лінзами. При трансмісійної ЕМ електрони проходять через структури досліджуваного об'єкта, а при скануючої ЕМ вони відбиваються від цих структур, відхиляючись під різними кутами. У результаті виникає зображення на люминесцирующей екрані мікроскопа. При трансмісійної (просвічує) ЕМ отримують площинне зображення внутрішньоклітинних структур, при скануючої - об'ємне. Дуже корисно поєднання ЕМ з іншими методами - авторадіографія, гістохімічними, імунологічними методами. Виникає можливість спостерігати перебіг біохімічних і імунологічних процесів в клітці в поєднанні із змінами внутрішньоклітинних структур. ЕМ вимагає спеціальної хімічної або фізичної фіксації тканин. Для дослідження беруть в основному біопсійний матеріал. Може бути використаний і секційний матеріал, але в максимально короткі терміни після смерті, зазвичай обчислюються хвилинами. Після фіксації тканини зневоднюють, заливають в епоксидні смоли, ріжуть скляними або алмазними ножами на ультратомах. При цьому отримують ультратонкі зрізи тканин товщиною 30-50 нм. Їх контрастують, переносять на спеціальні металеві сітки і потім вивчають у ЕМ.
При ультратомірованіі препарату можна отримати так звані напівтонких зрізи товщиною 1,5 мкм, які після забарвлення метиленовим синім досліджують у РМ. Це дозволяє одержати уявлення про стан тієї тканини, клітини якої будуть потім вивчені в ЕМ. Метод може мати і самостійне значення.
У скануючому (растровому) ЕМ досліджують поверхню біологічних і небіологічних об'єктів, напиляя у вакуумній камері на їх поверхню електроноплотние речовини і вивчаючи ці репліки, що повторюють контури об'єкта дослідження.
Методи фарбування
Мікроскопічні методи використовують у медицині в поєднанні з гістологічними методами дослідження клітин і тканин. Для цього, як правило, фіксовані тканинні зрізи повинні бути пофарбовані з метою виявлення різних клітинних структур. Останні сприймають барвники в залежності від їх фізико-хімічних властивостей. Тому барвники поділяють на основні, кислі і нейтральні.
Основні, або базофільні, барвники є фарбувальними підставами або їх солями (гематоксилін, метиленовий синій, толуїдиновим синій та ін.) У колірній гамі цих барвників переважають відтінки синього кольору. Інтенсивність забарвлення (базофілія) залежить від числа кислотних груп у структурах клітини, здатних взаємодіяти з основними барвниками. Кислі, або ацидофільні, барвники - фарбувальні кислоти або їх солі, що забарвлюють клітинні структури в різні відтінки червоного (еозин, еритрозин, Конго червоний, оранж та ін.) Нейтральні, барвники містять і базофільні, і ацидофільні речовини (наприклад, суміш Романовського-Гімзи). Такі барвники можуть мати здатність розчинятися в певних речовинах, фарбуючи їх (судан III, шарлах та ін.) Нерідко для контрастування структур клітин або тканин використовують методи, засновані на здатності цих тканин утримувати або відновлювати солі важких металів (срібла, золота, осмію, свинцю та ін.) Ці методи контрастування називаються імпрегнацією, вони використовуються як в СМ, так і в ЕМ.
За допомогою різних барвників в повсякденному житті та науковій практиці застосовують оглядові забарвлення для складання загального уявлення про стан досліджуваної тканини (гематоксилін і еозин, АЗУР-фукселін та ін), а також спеціальні забарвлення для виявлення особливостей процесів, що протікають в тканинах і клітинах. Так, використовують забарвлення Суданом III для виявлення жирової дистрофії клітин, Конго червоним - для визначення відкладень амілоїду, імпрегнацію сріблом - для дослідження нервової тканини і т.п. Живі і нефарбовані об'єкти досліджують за допомогою спеціальних мікроскопічних методів, описаних вище.
Гістохімічні методи
Гістохімічні та гістоферментохімічне методи дозволяють простежити і оцінити обмін речовин у тканинах і клітинах в нормі і висловах патології; вибірково оцінити метаболізм білків, ліпідів, вуглеводів та інших метаболітів, локалізацію та активність ферментів і гормонів, проаналізувати особливості окисно-відновних процесів, що протікають у клітинах і тканинах в умовах патології, при пристосуванні і компенсації. Діапазон застосування гістохімічних методів в патології надзвичайно широкий. Для гістохімічних досліджень використовують зрізи свіжозаморожених тканин, приготовані в криостате, що дозволяє зберегти прижиттєву локалізацію тієї чи іншої хімічної сполуки. Гістохімічні методи часто поєднують з іншими методами СМ і ЕМ. Для кількісної оцінки результатів гістохімічних реакцій застосовують гістофотометрію, цитофотометрії, мікрофлюорометрію та ін
Цитологічне дослідження мазків, зіскрібків і відбитків
Традиційними методами, використовуваними патологоанатомами для діагностики різних захворювань, є цитологічне дослідження мазків, зіскрібків і відбитків тканини з різних органів і морфологічне вивчення заморожених чи укладених в парафін біоптатів органів і тканин. Цитологічні дослідження дозволяють дати попередній діагноз протягом 20-30 хв, вони широко застосовуються в поліклінічної і хірургічній практиці. Однак при цитологічному дослідженні порушуються взаємини між різними клітинами і позаклітинним матриксом. Крім того, в цитологічному зразку можуть бути відсутні окремі типи клітин. Тому цитологічні дані часто носять попередній характер, а остаточний діагноз ставлять після морфологічного дослідження біоптату через 4-5 днів. Використання зрізів, отриманих із замороженої тканини (кріостатних зрізів), дозволяє прискорити обробку матеріалу до 1-2 год, але за рахунок погіршення морфологічної картини. У зв'язку з цим дослідження біопсійного матеріалу, укладеного в парафін, залишається основним підходом у патологоанатомічної діагностики. Дуже інформативна імуноцитохімії. Використовуючи специфічні AT і ефективні системи їх візуалізації, можна отримати дані, що визначають вибір терапії захворювання та його прогноз. Особливо ефективно використання цих методик при діагностиці пухлин, імунних, аутоімунних та запальних процесів.
Авторадіографія
Близька до гастохіміческім методам дослідження авторадіографія, заснована на виявленні в клітинах і в субклітинних структурах в РМ чи ЕМ локалізації радіоактивних ізотопів. Метод дозволяє візуально оцінити інтенсивність метаболізму в клітинах і у внутрішньоклітинних структурах, а також в структурах різних мікробних і вірусних збудників хвороб. Авторадіографія дозволяє спостерігати динаміку процесів метаболізму, так як α-і β-частки використовуваних ізотопів, локалізуючи і переміщаючись у певних структурах, залишають слід на фотоемульсії, якою покривають гістологічний або ультратонкий зріз тканини.
МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНІ МЕТОДИ
Бурхливий розвиток і прогрес в області імунології, генетики, біотехнології, клітинної та молекулярної біології призвели до подальшого удосконалення методичного арсеналу патолога. В області цитології з'явилися цитологічні центрифуги (цітоспіни), що дозволяють сконцентрувати клітини з різних біологічних рідин і отримати якісний клітинний моношар, придатний для цитологічного і іммуноцітологіческого досліджень в мінімальні терміни.
Проточна цитофлюориметрії
Важливим досягненням в області цитології з'явилося використання проточної цитофлюориметрії. Проточний цитофлюориметр - прилад, що дозволяє виробляти якісний і кількісний аналізи фізичних та біологічних параметрів клітин, фенотипування лейкоцитів, ДНК-аналіз. Прилад автоматично вимірює кількість світла з флюорохромом, пов'язаного зі специфічними AT (CD3, CD4, CD8, CD19 і т.д.) або певними речовинами (наприклад, етідіумом броміду - 4 ',6-діамідинів-2-феніліндолом [DAPI]), фарбуючими ДНК або РНК. Використовуючи різні флюорохромом, можна отримати многопараметровие дані з одного зразка. Сигнал з кожної клітини збирається протягом декількох мікросекунд при проходженні клітини через лазерний пучок, обробляється комп'ютером та подається на дисплеї у вигляді кількісних даних. Зразки, що містять суспензію або дрібні агрегати клітин, готуються протягом 2-3 ч. Найбільш широко проточна цитофлюориметрії стала використовуватися в цитологічної практиці після розвитку ультразвукової діагностики та застосування техніки тонкоголкової аспіраційної біопсії. На відміну від звичайної біопсії, тонкоголкової аспіраційної біопсії менш травматична, не вимагає спеціальної підготовки хворого і стерильних умов. З одержуваного аспіраційного матеріалу готують мазок для цитологічного дослідження і клітинну суспензію для проточної цитофлюориметрії. Недоліком тонкоголкової аспіраційної біопсії є її менша інформативність і неможливість отримання суспензії клітин із солідних тканин для проточної цитофлюориметрії.
Метод подвійний або потрійний мітки
Удосконалення систем візуалізації флюоресцентних і ферментних міток дозволило використовувати кілька помічених різними мітками різних AT на одному препараті при імуногістохімічному дослідженні. Це метод подвійний або потрійний мітки.
Цей методичний підхід особливо важливий при дослідженні гетерогенної за складом тканини і дозволяє виявити розподіл різних популяцій клітин при інфільтративному рості пухлин, розвитку локального імунної відповіді і т.д. За певних умов одна і та ж клітина може експресувати кілька Аг (коекспресій), що виявляються зазвичай на різноманітних клітинах. У таких випадках використовують флюоресцентний мікроскоп, зображення з якого передається в комп'ютер.
Ще більш ефективно дослідження таких препаратів за допомогою конфокальної скануючої лазерної мікроскопії. Монохромний джерело освітлення (лазер) не дає оптичних спотворень і дозволяє сканувати клітини в зрізі або мазку в одній площині на різній глибині. Спеціальна комп'ютерна програма дозволяє поєднувати зображення одних і тих же ділянок, що містять клітини з різними флюорохромами, і аналізувати розподіл різних міток на клітинах. При збігу міток і накладення їх один на одного з'являється псевдоцветное світіння жовтого кольору.
Гібридизація in situ
В останнє десятиліття в патології активно використовують гібридізаційного іммуногістохімію, або гібридизацію in situ. Ця техніка, на відміну від описаних вище, здатна продемонструвати розподіл специфічних послідовностей ДНК або РНК в індивідуальних клітках на зрізах тканини, в мазку, в культурі клітин, хромосомних препаратах.
Гібридизація in situ здатна визначати 20-50 копій певних послідовностей ДНК або РНК в одній клітці. Таким чином, цей метод дозволяє судити про биосинтетической активності окремих клітин при їх прямої візуалізації і широко використовується в діагностиці інфекційних захворювань та неопластичних процесів, включаючи онкогени, гени-супресори, ростові фактори і чинники, що регулюють клітинний цикл. Наприклад, ця техніка використовується для ідентифікації експресії РНК в пухлинах ендокринної системи, негативних при імуногістохімічної забарвленні. Гібридизація in situ є також важливим інструментом у моніторингу генної терапії, оскільки дозволяє виявляти локалізацію та розподіл терапевтичних генів, трансфецірованних вірусними або плазмідними векторами в клітини або органи. Недоліком гібридизації in situ є її відносно низька чутливість. Цей недолік з успіхом компенсується використанням полімеразної ланцюгової реакції.
Полімеразна ланцюгова реакція
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - метод, в основі якого лежить ферментне накопичення специфічних ДНК-послідовностей. У ПЛР використовуються олігонуклеотидно праймери (короткі ДНК-послідовності), які розташовуються збоку від ланцюга ДНК і тим самим визначають цікавить область у досліджуваній ДНК. Процедура включає повторні серії циклів, кожен з яких складається з шаблонної денатурації, відпалу праймера і подовження прайм-міра термостабільної ДНК-полімеразою до створення експоненціального накопичення специфічного фрагмента ДНК, кінець якого визначається 5'-кінцем праймера. Після 20 циклів кількість копій зростає в 10 6 -10 8 разів. Для ПЛР, крім ДНК, може бути в якості стартового матеріалу використана РНК. Ця процедура відома як ПЛР із зворотною транскрипцією. За допомогою зворотної транскрипції відбувається побудова комплементарної ДНК, яка і визначається ПЛР. ПЛР є надзвичайно чутливим методом, здатним збільшувати 1-2 копії генів до рівня, легко визначається гель-електрофорезом або блот-гібридизацією за Е. Саузерн (англ. назва методу - southern blotting). Ця підвищена чутливість ПЛР часто здатна давати хибно позитивні результати при контамінації зразків. Сучасна лабораторна техніка максимально запобігає подібне забруднення. Найбільш важливим правилом ПЛР є роздільне проведення пре-і пост-ПЛР етапів. Крім того, кожна ПЛР включає негативний ПЛР-контроль
В даний час ПЛР отримала подальший розвиток у вигляді ПЛР в реальному часі, здатної давати кількісну оцінку досліджуваних нуклеїнових кислот. При проведенні ПЛР потрібно руйнування клітин і тканин для ізоляції нуклеїнових кислот і переведення їх в рідку фазу. Отже, результати ПЛР неможливо пов'язати з конкретним гістологічним типом клітини, визначити відсоток клітин, що містять досліджувану послідовність.
Молекулярна техніка, що об'єднала високу чутливість ПЛР і клітинну локалізацію послідовностей, що виявляються гібридизацією in situ, отримала назву ПЛР in situ. Часто ця техніка використовується для визначення вірусних або провірусних послідовностей нуклеїнових кислот. Крім цього, ПЛР in situ застосовують для вивчення ендогенних послідовностей ДНК, включаючи перестроювання клітинних генів, хромосомні транслокації та картування геномних послідовностей з невеликим числом копій в метафазних хромосомах. Проте ця техніка не знаходить широкого застосування із-за легкості отримання псевдопозитивні результати та необхідності проведення великої кількості контролів, складності інтерпретації отриманих результатів та їх низькою відтворюваності.
Мікродіссекція
У зв'язку з вищевикладеним, був запропонований метод мікродіссекціі, що дозволяє вирізувати окремі ідентифіковані клітини або групи клітин з наступним їх аналізом за допомогою звичайної ПЛР. Перші кроки в цьому напрямку були зроблені шляхом вирізання бритвою або зіскрібків цікавлять ділянок тканини на зрізі під мікроскопом. Надалі стали використовувати мікроманіпулятори, що дозволяють точно виділити окремі скупчення клітин. В обох методах процес мікродіссекціі дуже довгий і багато в чому залежить від майстерності оператора. В даний час для точної і відтворної мікродіссекціі все частіше використовують лазери. У ряді приладів застосований принцип лазерної мікропучковой мікродіссекціі, коли точно сфокусованим пучком ультрафіолетового лазера вирізують клітини або область, захищену фотопігментом, що запобігає руйнування ДНК в УФ-світлі. В інших приладах використовують принцип лазерного захоплення. Цей принцип заснований на селективному прилипанні вибраних клітин чи фрагментів тканини до термопластичній мембрані, активованої пульсами низькоенергетичного інфрачервоного лазера. Термопластична мембрана, що використовується для перенесення вибраних клітин, має діаметр близько 6 мм і розташовується на дні оптично прозорої кришки, яка закриває 0,5 мл мікроцентріфужную пробірку з розчином для екстракції ДНК або РНК. Морфологія вирізаних клітин добре зберігається і може бути документована на всіх стадіях процедури. Оскільки мікродіссекція з лазерним захопленням не руйнує навколишні тканини, 2-3 ділянки, що містять різнорідні морфологічні структури (нормальні, прикордонні та пухлинні клітини), можуть бути взяті для аналізу з одного препарату. В даний час мікродіссекція з лазерним захопленням широко використовується для аналізу генетичних змін ДНК, визначення втрати гетерозиготності в інвазивних пухлинах.
Таким чином, сучасний патолог володіє можливістю використати значний арсенал методів, починаючи з рутинних і закінчуючи молекулярно-біологічними, для діагностики цитологічного та біопсійного матеріалів.
Вибір тих чи інших методів обумовлюється видом матеріалу (мазок, кріостатних або парафіновий зріз), особливостями його фіксації, гістоархітектурнимі особливостями тканини і кінцевими цілями дослідження.
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ В ПАТОЛОГІЇ
Цілі, що стоять перед будь-якою наукою, можуть бути досягнуті тільки в тому випадку, якщо вона володіє методами та методиками, адекватними поставленим завданням. Тому й патологія протягом століть розробляла й удосконалювала свої методики. Саме нові можливості, які виникали з появою нових методів дослідження, дозволяли робити відкриття, радикально змінювали погляди на патологію, починати якісно нові етапи її розвитку.
Патологічна анатомія використовує три основні методи дослідження - розтин трупів людей, померлих від хвороб (1); мікроскопічні методи вивчення тканин (2); експеримент, що дозволяє моделювати на тварин патологічні процеси і хвороби (3). Кожен з цих методів має безліч методик, які в сукупності дозволяють спостерігати патологічні процеси не тільки на рівні організму, але і на клітинному, субклітинному та молекулярному рівнях. Завдяки цим методам патолог може спостерігати єдність структури і функції і в фізіологічних умовах, і в умовах патології, що якісно відрізняє сучасну патологію від патологічної анатомії та патологічної фізіології навіть першої половини XX ст.
Аутопсія
Розтин трупів (аутопсія) - один з найбільш старих методів морфологічного дослідження. З давніх часів розтин (спочатку окремих органів, а потім і трупів) використовували для визначення причин хвороб і виявлення тих змін органів і тканин, які виникають при захворюванні і призводять хворого до смерті. Саме розтин трупів померлих дозволяє говорити про те, що являє собою хворобу, якою морфологічний субстрат відповідає порушень функцій і клінічних проявів хвороби в її динаміці, при одужанні, інвалідизації чи смерті хворого. По змін органів і тканин, виявленим при розтині, можна судити про ефективність тих чи інших лікувальних заходів, про індукований патоморфозі хвороб, а також про лікарські помилки і ятрогенних. Нерідко лише на розтині виникають підозри на те чи інше інфекційне захворювання, що дозволяє провести відповідні дослідження спільно з інфекціоністами, епідеміологами, фтизіатрами та іншими фахівцями. Інколи під час розтину трупа виявляються погрішності в оперативному втручанні або в проведених маніпуляціях, а також кримінальні причини смерті. Нарешті, саме результати розтину, ретельне дослідження всіх змін органів і систем померлого дозволяють скласти найбільш повне та об'єктивне уявлення про те захворюванні, яким страждав хворий за життя. Тому розтин обов'язково передбачає складання патологоанатомічного діагнозу, який будується за тими ж принципами, що і клінічний діагноз. Це дозволяє порівнювати клінічний і патологоанатомічний діагнози, констатувати їх збіг або розбіжність і в останньому випадку оцінювати значення лікарської помилки і шукати разом з клініцистами її причину. Тим самим розтин трупів померлих служить цілям контролю лікувально-діагностичної діяльності лікарні чи поліклініки та підвищення кваліфікації лікарського персоналу.
Разом з тим результати аутопсії, зафіксовані в протоколі розкриття, дозволяють проводити аналіз ведення хворого в клініці в тих випадках, коли мова може йти про лікарські злочини, дають можливість вести наукові дослідження і розробляти статистичні дані. За результатами патологоанатомічних досліджень медична статистика аналізує причини і характер смертності населення.
У зв'язку із зазначеним аутопсія не втрачає свого значення і при широкому використанні біопсійної діагностики захворювань. Тільки розтин трупа дозволяє побачити і оцінити всю історію хвороби людини від початку і до кінця, разом з клініцистами проаналізувати всі етапи лікування хворого, підсумувати як позитивний, так і негативний досвід лікарів і обговорити всі аспекти лікування та помилок на клініко-анатомічних конференціях лікувальних установ.
Патологоанатомічні розтину трупів виробляє лікар-прозектор в патологоанатомічному відділенні лікарні. Іноді прозектором називають патологоанатомами. Тут немає принципових відмінностей, але патологоанатомами офіційно є викладачі кафедр патологічної анатомії та співробітники відповідних підрозділів науково-дослідних інститутів. В управліннях і комітетах охорони здоров'я міського рівня, а також у міністерствах охорони здоров'я обласного, крайового і республіканського рівнів є патологоанатомічна служба і посаду головного патологоанатома.
Результати аутопсії багато в чому залежать від методу розтину трупа. Існує кілька методів, які використовує патологоанатом в залежності від конкретної ситуації та умов, в яких проводиться аутопсія. Одним з перших спеціальний метод розтину запропонував Рудольф фон Вірхов, видаляли органи окремо. При цьому, однак, порушуються анатомічні зв'язки між органами, що в ряді випадків може привести прозектора до помилки. Пізніше А.І. Абрикосов запропонував вести розтин, слідуючи топографическому розташуванню органів, які при цьому діляться на п'ять систем і витягуються в п'ять прийомів. Недоліком методу є те, що він приводить до розчленування анатомо-фізіологічних систем на фрагменти. Іноді при цьому доводиться розсікати пухлина або оперовані органи. Найбільше поширення в практиці отримав спосіб Г.В. Шора, при якому органи виділяють не поодинці, а цілим органокомплексах. При евісцераціі зберігаються природні зв'язки між органами, а також зміни в їх топографії, що виникли в результаті операції, визначаються межі проростання пухлини і т.п. Використання методу розтину по Шору не перешкоджає застосуванню спеціальних способів розкриття окремих систем організму (наприклад, ендокринної). Особливості різних способів розтину трупів описані в спеціальній літературі.
Біопсія
Біопсія - прижиттєве взяття тканин, органів або суспензії клітин для мікроскопічного дослідження з діагностичною метою, а також для вивчення динаміки патологічного процесу і впливу на нього лікувальних заходів. У залежності від способу взяття матеріалу виділяють інцизійною, пункційну, ендоскопічну і аспіраційну біопсії.
Інцизійна біопсія
При інцизійною біопсії частину тканини з органу або цілий орган січуть хірургічним шляхом. Біоптат фіксують у розчині формаліну або інший фіксує рідини, після чого проводять гістологічне дослідження. Нерідко характер патологічного процесу (наприклад, характер пухлини) необхідно встановити під час операції. У цих випадках показана термінова біопсія. Тканина фіксують швидко, звичайно шляхом заморожування її в рідкому азоті або за допомогою вуглекислого газу. Потім з біоптату готують гістологічні зрізи, забарвлюють і досліджують під мікроскопом з метою термінової діагностики. Це надзвичайно важливо для визначення обсягу оперативного втручання.
Пункційна біопсія
При пункційної біопсії стовпчик тканини з органу отримують за допомогою спеціальної голки або троакара. Різновидом пункційної біопсії є трепанобиопсия, при якій отримують тканину кісток або кісткового мозку за допомогою спеціального інструменту - тріпатися.
Ендоскопічна біопсія
Завдяки розвитку ендоскопічних методів дослідження з'явилася ендоскопічна біопсія. Особливо широке поширення отримала ендоскопічна біопсія шлунка, кишечника і бронхів. Обсяг матеріалу, отриманого за допомогою ендоскопа, дуже малий, тому високий ступінь верифікації патологічного процесу може бути забезпечена тільки при дослідженні 4-6 біоптатів.
Аспіраційна біопсія
Аспіраційну біопсію застосовують для дослідження рідкого вмісту порожнистих органів або аспірату, отриманого з порожнин тіла за допомогою спеціальних інструментів. З цією ж метою вивчають діалізний розчин з бронхів, шлунка, плевральної або черевної порожнин, з порожнини матки. Отриманий матеріал піддають в основному цитологічному дослідженню.
Підготовка матеріалу
Отримані тим чи іншим шляхом шматочки тканини для подальшої світловій мікроскопії (СМ) зазвичай фіксують у 10% нейтральному забуференной формаліні. Для виявлення окремих компонентів клітин використовують спеціальні фіксують рідини - Буена, Карнуа та ін Фіксований матеріал ріжуть на мікротому, після чого застосовують оглядові забарвлення зрізів або проводять різні гістохімічні реакції. Для електронної мікроскопії (ЕМ) існують спеціальні методи приготування біопсійного матеріалу, який потім ріжуть на ультратоме, домагаючись товщини зрізу в 30-50 нм.
Біопсію застосовують і в поліклініці, де широке поширення отримали інцизійною біопсії шийки матки, шкіри, пункційні біопсії поверхнево розташованих пухлин, аспіраційні біопсії вмісту порожнини матки, верхньощелепних (гайморових) пазух і деяких інших порожнин.
Біопсійний матеріал може бути отриманий і для ЕМ-вивчення. Цей метод найбільш широко використовують в онкології. Іноді тільки дослідження ультраструктури клітин пухлини дозволяє встановити її гістогенез.
Мікроскопічні методи дослідження
Мікроскопічні методи дослідження - способи вивчення різних об'єктів з допомогою мікроскопа. У біології та медицині цими методами вивчають будову мікроскопічних об'єктів, розміри яких лежать за межами роздільної здатності ока людини. Основу мікроскопічних методів дослідження становлять СМ і ЕМ. СМ має кілька різновидів, кожна з яких використовує різні властивості світла: фазово-контрастна, інтерференційна, люмінесцентна, поляризаційна, стереоскопічний, ультрафіолетова, інфрачервона. У ЕМ зображення об'єктів дослідження виникає в результаті направленого потоку електронів.
Світлова мікроскопія
СМ грунтується на таких визначальних чинниках, як роздільна здатність мікроскопа, спрямованість світлового променя, а також особливості досліджуваного об'єкта, який може бути прозорим і непрозорим. У залежності від властивостей об'єкта змінюються фізичні властивості світла - його колір і яскравість, пов'язані з довжиною і амплітудою хвилі, фаза, площину і напрям розповсюдження хвилі. Для СМ біологічні об'єкти зазвичай забарвлюють для виявлення тих або інших їх властивостей. При цьому тканини повинні бути фіксовані, так як забарвлення виявляє певні структури тільки загиблих клітин. У живій клітині барвник відокремлюється в цитоплазмі у вигляді вакуолі і не профарбовують клітинні структури. Тим не менше в СМ можна вивчати і живі біологічні об'єкти (вітальна мікроскопія). У цьому випадку застосовують темнопольний конденсор.
Фазово-контрастна мікроскопія застосовується для дослідження живих і нефарбованих біологічних об'єктів. Вона заснована на методах променя світла в залежності від особливостей об'єкта вивчення, від яких залежить зміна довжини і фази світлової хвилі. У патології фазово-контрастна мікроскопія знаходить застосування при дослідженні найпростіших, клітин рослин і тварин, при підрахунку і диференціювання клітин кісткового мозку і периферичної крові, при вивченні клітин культури тканин та ін
Поляризаційна мікроскопія дозволяє вивчати біологічні об'єкти в світі, утвореному двома променями, поляризованими у взаємно перпендикулярних площинах, тобто в поляризованому світлі. Цього досягають за допомогою плівчастих поляроїдів або призм Ніколя, які поміщають в мікроскопі між джерелом світла і препаратом. Поляризація змінюється при проходженні (або віддзеркаленні) променів світла через різні і оптично різнорідні структури. У так званих ізотропних структурах швидкість поширення поляризованого світла не залежить від площини поляризації, а в анізотропних структурах швидкість його розповсюдження змінюється в залежності від напрямку світла по поздовжньої або поперечної осі об'єкту. Якщо показник заломлення світла вздовж структури більше, ніж у поперечному напрямку, виникає позитивне подвійне променезаломлення, при зворотних взаєминах - негативне подвійне променезаломлення. Багато біологічні об'єкти мають сувору молекулярну орієнтацію, є анізотропними та мають позитивний подвійне променезаломлення. Такими властивостями володіють міофібрили, війки миготливого епітелію, колагенові волокна і ін Зіставлення характеру променезаломлення поляризованого світла і величини анізотропії об'єкту дозволяє судити про молекулярної організації його структури. Поляризаційна мікроскопія є одним з гістологічних, а також цитологічних методів дослідження, способом мікробіологічної діагностики та ін Важливо, що в поляризованому світлі можна дослідити як пофарбовані, так і незабарвлені і нефіксовані (нативні) зрізи тканин.
Люмінесцентна мікроскопія заснована на властивості багатьох речовин давати свічення - люмінесценцію в УФ-променях або в синьо-фіолетової частини спектра світла. Ряд біологічних речовин, таких як прості білки, коферменти, деякі вітаміни, лікарські засоби (ЛЗ) мають власної (первинної) люмінесценцією. Інші речовини починають світитися при додаванні до них спеціальних барвників - флюорохромом (вторинна люмінесценція). Флюорохромом можуть розподілятися в клітці дифузно, але можуть вибірково забарвлювати окремі клітинні структури або певні хімічні сполуки. На цьому грунтується використання люмінесцентної мікроскопії в цитологічних і гістохімічних дослідженнях. Імунофлюоресценція в люмінесцентному мікроскопі дозволяє виявляти різні Аг і їх концентрацію в клітках, при цьому можлива ідентифікація вірусів, визначення AT і імунних комплексів, гормонів, різних продуктів метаболізму і др.Люмінесцентную мікроскопію застосовують для діагностики вірусних інфекцій, за допомогою вторинної люмінесценції діагностують злоякісні пухлини в гістологічних та цитологічних препаратах, визначають вогнища ішемії м'яза серця при ранніх термінах інфаркту міокарда, виявляють амілоїд в біоптатах тканин і т. д.
Ультрафіолетова й інфрачервона мікроскопія заснована на здатності поглинання УФ-та інфрачервоних променів певних довжин хвиль деякими речовинами, що входять до складу живих клітин, мікроорганізмів або фіксованих, але не забарвлених тканин, прозорих у видимому світлі. Властивістю поглинати УФ-промені мають високомолекулярні сполуки, такі як нуклеїнові кислоти, білки, ароматичні амінокислоти (тирозин, триптофан, метілаланін), пуринові і піримідинові підстави та ін За допомогою УФ-мікроскопії вивчають локалізацію і кількість таких речовин, а при дослідженні живих об'єктів - їх зміни в процесі життєдіяльності. Інфрачервона мікроскопія застосовується в медицині переважно в нейроморфологии та офтальмології.
Для спеціальних цілей в патології використовуються і інші мікроскопічні методи - інтерференційна, стереоскопічний мікроскопія та ін
Електронна мікроскопія
ЕМ застосовують для вивчення структури клітин, мікроорганізмів і вірусів на субклітинному і макромолекулярному рівнях. Значну роздільну здатність ЕМ забезпечує потік електронів, що проходять у вакуумі через електромагнітні поля, створювані електромагнітними лінзами. При трансмісійної ЕМ електрони проходять через структури досліджуваного об'єкта, а при скануючої ЕМ вони відбиваються від цих структур, відхиляючись під різними кутами. У результаті виникає зображення на люминесцирующей екрані мікроскопа. При трансмісійної (просвічує) ЕМ отримують площинне зображення внутрішньоклітинних структур, при скануючої - об'ємне. Дуже корисно поєднання ЕМ з іншими методами - авторадіографія, гістохімічними, імунологічними методами. Виникає можливість спостерігати перебіг біохімічних і імунологічних процесів в клітці в поєднанні із змінами внутрішньоклітинних структур. ЕМ вимагає спеціальної хімічної або фізичної фіксації тканин. Для дослідження беруть в основному біопсійний матеріал. Може бути використаний і секційний матеріал, але в максимально короткі терміни після смерті, зазвичай обчислюються хвилинами. Після фіксації тканини зневоднюють, заливають в епоксидні смоли, ріжуть скляними або алмазними ножами на ультратомах. При цьому отримують ультратонкі зрізи тканин товщиною 30-50 нм. Їх контрастують, переносять на спеціальні металеві сітки і потім вивчають у ЕМ.
При ультратомірованіі препарату можна отримати так звані напівтонких зрізи товщиною 1,5 мкм, які після забарвлення метиленовим синім досліджують у РМ. Це дозволяє одержати уявлення про стан тієї тканини, клітини якої будуть потім вивчені в ЕМ. Метод може мати і самостійне значення.
У скануючому (растровому) ЕМ досліджують поверхню біологічних і небіологічних об'єктів, напиляя у вакуумній камері на їх поверхню електроноплотние речовини і вивчаючи ці репліки, що повторюють контури об'єкта дослідження.
Методи фарбування
Мікроскопічні методи використовують у медицині в поєднанні з гістологічними методами дослідження клітин і тканин. Для цього, як правило, фіксовані тканинні зрізи повинні бути пофарбовані з метою виявлення різних клітинних структур. Останні сприймають барвники в залежності від їх фізико-хімічних властивостей. Тому барвники поділяють на основні, кислі і нейтральні.
Основні, або базофільні, барвники є фарбувальними підставами або їх солями (гематоксилін, метиленовий синій, толуїдиновим синій та ін.) У колірній гамі цих барвників переважають відтінки синього кольору. Інтенсивність забарвлення (базофілія) залежить від числа кислотних груп у структурах клітини, здатних взаємодіяти з основними барвниками. Кислі, або ацидофільні, барвники - фарбувальні кислоти або їх солі, що забарвлюють клітинні структури в різні відтінки червоного (еозин, еритрозин, Конго червоний, оранж та ін.) Нейтральні, барвники містять і базофільні, і ацидофільні речовини (наприклад, суміш Романовського-Гімзи). Такі барвники можуть мати здатність розчинятися в певних речовинах, фарбуючи їх (судан III, шарлах та ін.) Нерідко для контрастування структур клітин або тканин використовують методи, засновані на здатності цих тканин утримувати або відновлювати солі важких металів (срібла, золота, осмію, свинцю та ін.) Ці методи контрастування називаються імпрегнацією, вони використовуються як в СМ, так і в ЕМ.
За допомогою різних барвників в повсякденному житті та науковій практиці застосовують оглядові забарвлення для складання загального уявлення про стан досліджуваної тканини (гематоксилін і еозин, АЗУР-фукселін та ін), а також спеціальні забарвлення для виявлення особливостей процесів, що протікають в тканинах і клітинах. Так, використовують забарвлення Суданом III для виявлення жирової дистрофії клітин, Конго червоним - для визначення відкладень амілоїду, імпрегнацію сріблом - для дослідження нервової тканини і т.п. Живі і нефарбовані об'єкти досліджують за допомогою спеціальних мікроскопічних методів, описаних вище.
Гістохімічні методи
Гістохімічні та гістоферментохімічне методи дозволяють простежити і оцінити обмін речовин у тканинах і клітинах в нормі і висловах патології; вибірково оцінити метаболізм білків, ліпідів, вуглеводів та інших метаболітів, локалізацію та активність ферментів і гормонів, проаналізувати особливості окисно-відновних процесів, що протікають у клітинах і тканинах в умовах патології, при пристосуванні і компенсації. Діапазон застосування гістохімічних методів в патології надзвичайно широкий. Для гістохімічних досліджень використовують зрізи свіжозаморожених тканин, приготовані в криостате, що дозволяє зберегти прижиттєву локалізацію тієї чи іншої хімічної сполуки. Гістохімічні методи часто поєднують з іншими методами СМ і ЕМ. Для кількісної оцінки результатів гістохімічних реакцій застосовують гістофотометрію, цитофотометрії, мікрофлюорометрію та ін
Цитологічне дослідження мазків, зіскрібків і відбитків
Традиційними методами, використовуваними патологоанатомами для діагностики різних захворювань, є цитологічне дослідження мазків, зіскрібків і відбитків тканини з різних органів і морфологічне вивчення заморожених чи укладених в парафін біоптатів органів і тканин. Цитологічні дослідження дозволяють дати попередній діагноз протягом 20-30 хв, вони широко застосовуються в поліклінічної і хірургічній практиці. Однак при цитологічному дослідженні порушуються взаємини між різними клітинами і позаклітинним матриксом. Крім того, в цитологічному зразку можуть бути відсутні окремі типи клітин. Тому цитологічні дані часто носять попередній характер, а остаточний діагноз ставлять після морфологічного дослідження біоптату через 4-5 днів. Використання зрізів, отриманих із замороженої тканини (кріостатних зрізів), дозволяє прискорити обробку матеріалу до 1-2 год, але за рахунок погіршення морфологічної картини. У зв'язку з цим дослідження біопсійного матеріалу, укладеного в парафін, залишається основним підходом у патологоанатомічної діагностики. Дуже інформативна імуноцитохімії. Використовуючи специфічні AT і ефективні системи їх візуалізації, можна отримати дані, що визначають вибір терапії захворювання та його прогноз. Особливо ефективно використання цих методик при діагностиці пухлин, імунних, аутоімунних та запальних процесів.
Авторадіографія
Близька до гастохіміческім методам дослідження авторадіографія, заснована на виявленні в клітинах і в субклітинних структурах в РМ чи ЕМ локалізації радіоактивних ізотопів. Метод дозволяє візуально оцінити інтенсивність метаболізму в клітинах і у внутрішньоклітинних структурах, а також в структурах різних мікробних і вірусних збудників хвороб. Авторадіографія дозволяє спостерігати динаміку процесів метаболізму, так як α-і β-частки використовуваних ізотопів, локалізуючи і переміщаючись у певних структурах, залишають слід на фотоемульсії, якою покривають гістологічний або ультратонкий зріз тканини.
МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНІ МЕТОДИ
Бурхливий розвиток і прогрес в області імунології, генетики, біотехнології, клітинної та молекулярної біології призвели до подальшого удосконалення методичного арсеналу патолога. В області цитології з'явилися цитологічні центрифуги (цітоспіни), що дозволяють сконцентрувати клітини з різних біологічних рідин і отримати якісний клітинний моношар, придатний для цитологічного і іммуноцітологіческого досліджень в мінімальні терміни.
Проточна цитофлюориметрії
Важливим досягненням в області цитології з'явилося використання проточної цитофлюориметрії. Проточний цитофлюориметр - прилад, що дозволяє виробляти якісний і кількісний аналізи фізичних та біологічних параметрів клітин, фенотипування лейкоцитів, ДНК-аналіз. Прилад автоматично вимірює кількість світла з флюорохромом, пов'язаного зі специфічними AT (CD3, CD4, CD8, CD19 і т.д.) або певними речовинами (наприклад, етідіумом броміду - 4 ',6-діамідинів-2-феніліндолом [DAPI]), фарбуючими ДНК або РНК. Використовуючи різні флюорохромом, можна отримати многопараметровие дані з одного зразка. Сигнал з кожної клітини збирається протягом декількох мікросекунд при проходженні клітини через лазерний пучок, обробляється комп'ютером та подається на дисплеї у вигляді кількісних даних. Зразки, що містять суспензію або дрібні агрегати клітин, готуються протягом 2-3 ч. Найбільш широко проточна цитофлюориметрії стала використовуватися в цитологічної практиці після розвитку ультразвукової діагностики та застосування техніки тонкоголкової аспіраційної біопсії. На відміну від звичайної біопсії, тонкоголкової аспіраційної біопсії менш травматична, не вимагає спеціальної підготовки хворого і стерильних умов. З одержуваного аспіраційного матеріалу готують мазок для цитологічного дослідження і клітинну суспензію для проточної цитофлюориметрії. Недоліком тонкоголкової аспіраційної біопсії є її менша інформативність і неможливість отримання суспензії клітин із солідних тканин для проточної цитофлюориметрії.
Метод подвійний або потрійний мітки
Удосконалення систем візуалізації флюоресцентних і ферментних міток дозволило використовувати кілька помічених різними мітками різних AT на одному препараті при імуногістохімічному дослідженні. Це метод подвійний або потрійний мітки.
Цей методичний підхід особливо важливий при дослідженні гетерогенної за складом тканини і дозволяє виявити розподіл різних популяцій клітин при інфільтративному рості пухлин, розвитку локального імунної відповіді і т.д. За певних умов одна і та ж клітина може експресувати кілька Аг (коекспресій), що виявляються зазвичай на різноманітних клітинах. У таких випадках використовують флюоресцентний мікроскоп, зображення з якого передається в комп'ютер.
Ще більш ефективно дослідження таких препаратів за допомогою конфокальної скануючої лазерної мікроскопії. Монохромний джерело освітлення (лазер) не дає оптичних спотворень і дозволяє сканувати клітини в зрізі або мазку в одній площині на різній глибині. Спеціальна комп'ютерна програма дозволяє поєднувати зображення одних і тих же ділянок, що містять клітини з різними флюорохромами, і аналізувати розподіл різних міток на клітинах. При збігу міток і накладення їх один на одного з'являється псевдоцветное світіння жовтого кольору.
Гібридизація in situ
В останнє десятиліття в патології активно використовують гібридізаційного іммуногістохімію, або гібридизацію in situ. Ця техніка, на відміну від описаних вище, здатна продемонструвати розподіл специфічних послідовностей ДНК або РНК в індивідуальних клітках на зрізах тканини, в мазку, в культурі клітин, хромосомних препаратах.
Гібридизація in situ здатна визначати 20-50 копій певних послідовностей ДНК або РНК в одній клітці. Таким чином, цей метод дозволяє судити про биосинтетической активності окремих клітин при їх прямої візуалізації і широко використовується в діагностиці інфекційних захворювань та неопластичних процесів, включаючи онкогени, гени-супресори, ростові фактори і чинники, що регулюють клітинний цикл. Наприклад, ця техніка використовується для ідентифікації експресії РНК в пухлинах ендокринної системи, негативних при імуногістохімічної забарвленні. Гібридизація in situ є також важливим інструментом у моніторингу генної терапії, оскільки дозволяє виявляти локалізацію та розподіл терапевтичних генів, трансфецірованних вірусними або плазмідними векторами в клітини або органи. Недоліком гібридизації in situ є її відносно низька чутливість. Цей недолік з успіхом компенсується використанням полімеразної ланцюгової реакції.
Полімеразна ланцюгова реакція
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - метод, в основі якого лежить ферментне накопичення специфічних ДНК-послідовностей. У ПЛР використовуються олігонуклеотидно праймери (короткі ДНК-послідовності), які розташовуються збоку від ланцюга ДНК і тим самим визначають цікавить область у досліджуваній ДНК. Процедура включає повторні серії циклів, кожен з яких складається з шаблонної денатурації, відпалу праймера і подовження прайм-міра термостабільної ДНК-полімеразою до створення експоненціального накопичення специфічного фрагмента ДНК, кінець якого визначається 5'-кінцем праймера. Після 20 циклів кількість копій зростає в 10 6 -10 8 разів. Для ПЛР, крім ДНК, може бути в якості стартового матеріалу використана РНК. Ця процедура відома як ПЛР із зворотною транскрипцією. За допомогою зворотної транскрипції відбувається побудова комплементарної ДНК, яка і визначається ПЛР. ПЛР є надзвичайно чутливим методом, здатним збільшувати 1-2 копії генів до рівня, легко визначається гель-електрофорезом або блот-гібридизацією за Е. Саузерн (англ. назва методу - southern blotting). Ця підвищена чутливість ПЛР часто здатна давати хибно позитивні результати при контамінації зразків. Сучасна лабораторна техніка максимально запобігає подібне забруднення. Найбільш важливим правилом ПЛР є роздільне проведення пре-і пост-ПЛР етапів. Крім того, кожна ПЛР включає негативний ПЛР-контроль
В даний час ПЛР отримала подальший розвиток у вигляді ПЛР в реальному часі, здатної давати кількісну оцінку досліджуваних нуклеїнових кислот. При проведенні ПЛР потрібно руйнування клітин і тканин для ізоляції нуклеїнових кислот і переведення їх в рідку фазу. Отже, результати ПЛР неможливо пов'язати з конкретним гістологічним типом клітини, визначити відсоток клітин, що містять досліджувану послідовність.
Молекулярна техніка, що об'єднала високу чутливість ПЛР і клітинну локалізацію послідовностей, що виявляються гібридизацією in situ, отримала назву ПЛР in situ. Часто ця техніка використовується для визначення вірусних або провірусних послідовностей нуклеїнових кислот. Крім цього, ПЛР in situ застосовують для вивчення ендогенних послідовностей ДНК, включаючи перестроювання клітинних генів, хромосомні транслокації та картування геномних послідовностей з невеликим числом копій в метафазних хромосомах. Проте ця техніка не знаходить широкого застосування із-за легкості отримання псевдопозитивні результати та необхідності проведення великої кількості контролів, складності інтерпретації отриманих результатів та їх низькою відтворюваності.
Мікродіссекція
У зв'язку з вищевикладеним, був запропонований метод мікродіссекціі, що дозволяє вирізувати окремі ідентифіковані клітини або групи клітин з наступним їх аналізом за допомогою звичайної ПЛР. Перші кроки в цьому напрямку були зроблені шляхом вирізання бритвою або зіскрібків цікавлять ділянок тканини на зрізі під мікроскопом. Надалі стали використовувати мікроманіпулятори, що дозволяють точно виділити окремі скупчення клітин. В обох методах процес мікродіссекціі дуже довгий і багато в чому залежить від майстерності оператора. В даний час для точної і відтворної мікродіссекціі все частіше використовують лазери. У ряді приладів застосований принцип лазерної мікропучковой мікродіссекціі, коли точно сфокусованим пучком ультрафіолетового лазера вирізують клітини або область, захищену фотопігментом, що запобігає руйнування ДНК в УФ-світлі. В інших приладах використовують принцип лазерного захоплення. Цей принцип заснований на селективному прилипанні вибраних клітин чи фрагментів тканини до термопластичній мембрані, активованої пульсами низькоенергетичного інфрачервоного лазера. Термопластична мембрана, що використовується для перенесення вибраних клітин, має діаметр близько
Таким чином, сучасний патолог володіє можливістю використати значний арсенал методів, починаючи з рутинних і закінчуючи молекулярно-біологічними, для діагностики цитологічного та біопсійного матеріалів.
Вибір тих чи інших методів обумовлюється видом матеріалу (мазок, кріостатних або парафіновий зріз), особливостями його фіксації, гістоархітектурнимі особливостями тканини і кінцевими цілями дослідження.