Особливості гель-фільтрації

Реферат на тему

Особливості гель-фільтрації

2009

Загальний опис методу

Метод гель-фільтрації займає становище як би «приймального сина» у великій родині методів колонкової хроматографії. У ньому використовується весь набір хроматографічної апаратури, але принципова відмінність від всіх інших членів цього сімейства полягає в тому, що колективні при гель-фільтрації молекули не сорбуються всередині гранул і взагалі ні фізично, ні хімічно не взаємодіють з їх матеріалом. Весь процес фракціонування грунтується тільки на співвідношенні розмірів молекул фільтрованої суміші і пір в гранулах.

Термін «гранули» з'являється з самого початку і розшифровується, як малі частки сферичної форми, виготовлені з пористого матеріалу. Для розуміння процесу гель-фільтрації (і всіх наступних хроматографії-чеських процесів) таке визначення недостатньо. Що значить «пористий матеріал»? Яке походження і характер цих пір - поверхневий або глибинний? Який діапазон і розкид номінальних розмірів пор, та й самих гранул? Чи є їх матеріал хімічно інертним або він здатний вступати в реакції, що призводять до його модифікації? Яка ступінь його гідрофільності? Стійкий він до значних варіацій рН і температури середовища?

Для розуміння суті цього процесу (гель-фільтрації) нам досить буде уявити собі тільки фізичну структуру гранул і характер пористості, а також згадати їх гідрофільність. В кінці розділу ми докладніше познайомимося з різними матеріалами, використовуваними для виробництва цих гранул і торкнемося питання про можливість їх хімічної модифікації.

Отже, уявімо собі безліч довгих, тонких і міцних ниток, зібраних в одному місці, але йдуть у всіх можливих напрямках. У місцях їх випадкового перетинання і зближення вони міцно (хімічно) пов'язані короткими перемичками. Так, що в цілому являють собою якийсь жорсткий каркас, що має зовні сферичну форму, але без будь-якої замикає її поверхні. Це і буде фізична модель хроматографічної гранули. Весь її внутрішній обсяг являє собою сукупність безлічі переходять одна в іншу просторових осередків («пір»), розміри яких варіюють у певних межах близько якоїсь середньої величини, обумовленої густотою ниток і числом перемичок між ними. Ці середні величини пір у різних марок гранул покривають значний діапазон від 5 до 300 миллимикрон. Що ж стосується середніх зовнішніх діаметрів самих гранул, то, знову-таки для різних марок гранул, вони вкладаються в інтервал від 10 до 300 мікрон. Доступ до внутрішніх осередкам гранул повністю відкритий зовні.

Оскільки ми згадали про гідрофільності матеріалу ниток і відносної малості розмірів осередків (менше 1 мкн), то вода (або водні розчини) буде в них нерухома, незважаючи на те, що повз гранул, в проміжках між ними вона буде вільно протікати вздовж колонки.

Припустимо тепер, що у нас є колонка, заповнена подібними гранулами (гуртки на рис. А). І що в цю колонку, поверх гранул у шарі невеликої висоти ми вносимо препарат, що містить суміш 3-х типів молекул: великих, середньої величини і дрібних, позначені (там же) чорними точками, відповідно, різних розмірів.

Подамо подумки зверху на цю колонку ток елюента (хоча б води). Він буде вільно протікати між гранулами - вниз до виходу з колонки. Якщо великі молекули настільки великі, що абсолютно не проникають в межі гранул (пори для них занадто малі), то ці молекули разом з потоком елюента, без затримки будуть рухатися до виходу з колонки. Припустимо ще, що дрібні молекули настільки малі, що всі осередки всередині гранул будуть для них легкодоступні. Тоді (якщо швидкість елюції не дуже велика) ці малі молекули в результаті дифузії швидко займуть весь сукупний об'єм рідини у внутрішніх осередках гранул. Зрозуміло, дифузія буде йти і у зворотному напрямку так, що концентрація малих молекул в гранулах і у вільному рідини між ними спочатку виявиться однаковою. Однак незабаром малі молекули, які опиняться поза гранул, струмом елюента просунуться трохи вниз по колонці. Тут вони зустрінуть шар ще «порожніх» гранул і будуть дифундувати всередину них. У той же самий час в шарі, звідки ці молекули пішли, порушиться рівновага дифузії і малі молекули з гранул стануть переважно виходити назовні, в елюент.

Процеси ці будуть відбуватися протягом усього ходу елюції. За цей час кожна з дрібних молекул встигне (і не один раз) побувати в якихось гранулах і вийти з них. Для шару дрібних молекул в цілому це буде означати більшу втрату часу з точки зору просування цього шару вниз до виходу з колонки. (Нагадаю, що рідина всередині гранул не тече.) В результаті шар дрібних молекул сильно відстане від шару великих молекул.

Для молекул середнього розміру деякі осередки поблизу поверхні гранул виявляться доступними. Вони туди будуть «заходити». Але дифундувати глибоко всередину гранул їм, як правило, не вдасться, вони швидше будуть виходити назовні і рівновагу дифузії буде на користь вільної рідини між гранулами. Таким чином, ці молекули середнього розміру в цілому, як шар, будуть рухатися вниз по колонці швидше, ніж дрібні молекули, але все-таки значно повільніше, ніж великі, оскільки навіть тільки на захід в осередку гранул з поверхні буде витрачатися деякий час ...

Колоночной гель-фільтрація широко застосовується для вирішення двох основних завдань:

1. Швидкого звільнення великих молекул (білків, нуклеїнових кислот і їх комплексів) від знаходяться в тому ж розчині солей або низькомолекулярних попередників синтезу:

амінокислот або нуклеозідтріфосфатов (особливо радіоактивно мічених), а також у багатьох інших випадках очищення біополімерів від супутніх їм дрібних молекул. У цих випадках доцільно використовувати короткі (10-20 см) колонки щодо великого діаметра (2-3 см) і заповнювати їх великими гранулами з малими порами. Обсяг препарату, внесеного на колонку, може становити 20-25% від повного обсягу колонки. Очищення відбувається швидко (приблизно за 1 годину). Розведення очищеного препарату виявляється незначним (10-20%), так як він виходить з колонки не «піком», а протяжної «майданчиком», розширення якої йде тільки за рахунок дифузії на її передньому та задньому фронті. При роботі з мікрокількості можна як колонки використовувати циліндрик пластмасового шприца на 1 мл.

Поклавши на дно шматочок скляної вати, його щільно набивають гранулами, залишивши зверху вільні 0,1 мл для заповнення їх сумішшю ДНК та її попередників в розчині буфера.

Елюція - центрифугуванням. Під циліндрик підставляють пробірку від мікроцентрифузі і всі разом встановлюють в пробірку Бакет-ротора. Вихідна з циліндрика рідина в обсязі того ж 0,1 мл містить чисту ДНК - попередники залишаються в гранулах.

2. Фракціонування (поділ) суміші макромолекул не дуже значно різняться за своїми розмірами. Наприклад, різних білків. Тут слід використовувати довгі (1-1,5 м) колонки, діаметром не більше 1 см і завантажувати їх обсягом вихідного препарату, що становить не більше 1-2% від обсягу колонки. Якщо суміш містить 2-3 компонента, то їх нерідко вдається розділити повністю - вони виходять у вигляді досить широких, але не перекриваються один з одним піків.

Якщо ж суміш складається з кількох компонентів, то на хороше їх поділ методом гель-фільтрації розраховувати не доводиться. Адже всі ці компоненти, хоча і з різною швидкістю, рухаються по колонці одночасно. (Інша річ істинна хроматографія. Там на перший план виступає сорбція компонентів на модифікованому матеріалі гранул і кожен з них залишається сорбованих всередині гранул до тих пір, поки елюент «примусово» не витягне його звідти.)

Тим не менше, і в цьому випадку гель-фільтрацію можна використовувати для очищення одного з компонентів складної суміші, якщо погодитися з його досить значними втратами. З цією метою суміш, наприклад білків, розганяють за обсягом елюента так, що зацікавив експериментатора білок виявляється десь в середині послідовності не повністю розділилися піків різних білків. (Для цього треба підібрати розмір пор використовуваних гранул.) Якщо потрібний білок піддається ідентифікації, наприклад по ферментативної активності, яка через м'якості способу фракціонування цілком може зберегтися, то можна відібрати вузьку область елюента, прилеглу до вершини піку цього білка. Таким чином, хоча й зі значними втратами, іноді вдається отримати практично чистий білок.

Основні матеріали гранул («матриць») для гель-фільтрації

Саме тут доречно познайомитися з основними матеріалами, з яких різні фірми виготовляють матриці для гель-фільтрації, оскільки ті ж матеріали після відповідної хімічної модифікації використовуються в інших видах хроматографії.

1. Гелі на основі декстрану-«сефадексе» »

Найчастіше для побудови хроматографічних гранул використовують довгі нитки полісахаридів. Зокрема, нитки декстрану - лінійного полімеру, що складається з безлічі однакових ланок одного з Сахаров, а саме - глюкози.

На рис. 55 ліворуч показано зв'язок між двома сусідніми молекулами глюкози. Як це вже було прийнято для Сахаров нуклеїнових кислот, в кутах шестикутника, позначених цифрами 1-5 слід розуміти атоми вуглецю, а на відкритих кінцях вертикальних рисок - атоми водню. Зв'язок здійснюється через атом кисню між вуглецями в позиціях 1 і 6.

На тому ж малюнку праворуч показано короткий «місток», що зв'язує дві пересічні один з одним нитки декстрану. (Зауважте, що пов'язані таким чином ланки глюкози розташовані симетрично.) Чим вище зміст містків по відношенню до кількості глюкози в нитках декстрану, тим менше буде розмір пор («осередків»), які вони утворюють.

Іноді в якості матеріалу гранул використовують уже знайомий нам по електрофорез поліакриламідний гель (ПААГ).

1а. "Сефакріли».

Це - матриці на основі того ж декстрану, але в якості зв'язуючих нитки «містків» використовується також знайома нам по ПААГ зв'язка - ИТ ^-метіленбісакріламід («Біс»).

2. Гелі на основі агарози - «сефаррзи».

Зауважимо, що максимальна концентрація агарози, яка називалася тим, становила 2%. А тверднуть гелі агарози при охолодженні з розплавленого стану вже при концентрації в 0,4%. Проте вони відносно м'які. Для цілей гель-фільтрації та інших видів хроматографії використовують жорстку, 4-х або 6-ти відсоткову агарозу, у вигляді сферичних гранул. Пори при цьому залишаються ще дуже великими. Іноді нитки агарози, все-таки зшивають додатково хімічними «містками». Виходять ще більш жорсткі гранули. Їх торгова назва «сефароза CL» (CL означає cross linked).

2а. "Ул'трагелі типу АСА» »

Всередині жорсткого крупнопористого каркаса агарози поліме-різуют ПААГ, що дозволяє варіювати менші розміри пір в широких межах, зберігаючи жорсткість гранул агарози.

Гелі на основі целюлози

Целюлоза - це теж лінійний полімер, складений з безлічі молекул все тієї ж глюкози, але пов'язаних між собою інакше, ніж в декстрану. Її часто використовують у вигляді, так званої, «волокнистої целюлози», тобто просто у вигляді хаотично поплутаних довгих ниток полімеру, без всяких додаткових зв'язок. У варіанті «мікрогранулірованная целюлози» між нитками для збільшення жорсткості вводять сполучні хімічні «містки». Один з типів такої целюлози має торгова назва «сефацел».

У нашому ознайомчому курсі не має сенсу наводити докладні списки матриць для гель-фільтрації з каталогів різних форм. Досить згадати, що списки ці бувають досить довгими, пропонуючи користувачеві широкий вибір гранул різного розміру і різної пористості, особливості яких часто бувають зашифровані індексом, що стоять після основної назви. Так, наприклад, шведська фірма Pharmacia пропонує список з 18 типів сефадексе з індексами від G -10 до G -200, відповідно до поступово збільшуються розмірами пор. Японська фірма Toyopearl випускає 10 типів гранул для гель-фільтрації з індексами від HW 40 C до HW 75 F.

Мені залишається звернути увагу читача на те, що всі матриці для гель-фільтрації на основі декстрану, агарози і целюлози у своїх «цукрових» ланках містять безліч ОН-груп, за якими можливі приєднання різних хімічно активних молекул, що здійснюють бажану модифікацію початково нейтральних гранул. З цими модифікаціями ми познайомимося в наступних розділах, де йтиметься про справжню хроматографії.

Детектори речовини

Їх призначення - вести безперервну реєстрацію складу рідини, яка витікає з колонки, на предмет виявлення в ній шуканих фракцій речовини. Оскільки одночасно з реєстрацією проводиться автоматично відлік пробірок в колекторі фракцій, експериментатор звільняється від тривалої перевірки вмісту кожної пробірки. Розподіл за ним фракцій досліджуваної речовини з'ясовується вже в ході хроматографії.

Реєстрацію білків і нуклеїнових кислот виробляють з поглинання світла в ультрафіолетовій області спектра. Білки та пептиди поглинають в області 206-215 тц за рахунок пептидного зв'язку, а також в широкій області поблизу 280 тц за рахунок присутності в них ароматичних амінокислот. (Неароматичних амінокислоти при їх хроматографическом поділі доводиться спеціально фарбувати.) Нуклеїнові кислоти, так само як і самі нуклеїнові підстави, добре поглинають ультрафіолетове світло у районі 260 тц.

У деяких випадках (згадаємо про секвенатор ДНК) реєструвати вихід речовини з хроматографічної колонки можна і по флюоресценції. Однак при цьому потрібна додаткова операція попереднього фарбування цікавить нас речовини флюоресцентним барвником.

У переважній більшості випадків реєстрацію виходять з хроматографічної колонки білків, нуклеїнових кислот або їх фрагментів ведуть з поглинання світла в ультрафіолетовій області, поблизу 280 і 260 тц відповідно.

Для цієї мети служать так звані УФ-денситометри.

Головним елементом цього приладу є джерело випромінювання - найчастіше ртутна лампа низького тиску. Більше 90% що випускається нею світу припадає на частку яскравою спектральної смуги з довжиною хвилі 254 тц. Випромінювання з довжиною хвилі поблизу 280 тц можна отримати за допомогою тієї ж лампи, якщо її світлом опромінювати флуоресцентний на цій довжині хвилі "вторинний" джерело світла. У нові моделі УФ-денситометрів встановлюють ще й безелектродні газорозрядну лампу, що дає сильну смугу випускання з довжиною хвилі 206 тц, що в десятки разів підвищує чутливість цих приладів по відношенню до білків.

Важливим елементом УФ-детектора є кварцова кювету, через яку безупинно протікає виходить з колонки рідина. Використовуються кювети як циліндричної форми, так і прямокутні, обсягом у кілька десятків мікролітрів і довжиною оптичного шляху від 2-х до 10 мм.

Багато фірм будують свої УФ-детектори по двухлучевой схемою: прилад оснащується додаткової кюветою порівняння, через яку постійно протікає чистий елюент. Промінь світла від лампи розщеплюється за допомогою напівпрозорого дзеркала і проходить паралельно через робочу кювету і кювету порівняння. Двопроменева схема дозволяє виключити при реєстрації власне поглинання світла елюентом, яке може змінюватися, наприклад, в ході градієнтної елюції.

Вона також компенсує зміни яскравості світіння лампи, сильно спрощуючи проблеми її стабілізації.

Як приймачів енергії в денситометрах використовують високочутливі фотоелементи. Напруга з навантаження фотоелемента посилюється спеціальним, «логарифмічним» підсилювачем, на виході якого з'являється «сигнал» напруги, пропорційний оптичної щільності Детектируемая розчину, з амплітудою близько 10 мВ.

Цей сигнал управляє становищем пера потенціометричного реєстратора («самописця»). За допомогою перемикача діапазонів посилення можна встановити чутливість запису так, щоб відхилення пера від нульової лінії на всю ширину стрічки реєстратора відповідало б максимальне значення оптичної щільності розчину.

При кожній зміні нумерованих пробірок на реєстратор від колектора фракцій надходить сигнал. Таким чином легко встановити в яких пробірках і в якій кількості виходить з колонки цікавить нас речовина.

Колектори фракцій

До сказаного раніше варто додати згадка про численність варіантів механічних пристроїв, що змінюють пробірки під крапельницею, куди надходить рідина відразу після денситометра. В одних випадках штативи, що містять по 10-12 пробірок перебудовуються, подібно взводу солдат, «шеренгами на прямокутному плацу». В інших конструкціях пробірки встановлюються в кілька рядів по колах (або по спіралі) в гнізда повертається поштовхами барабана, а крапельниця здійснює необхідне переміщення від периферії до центру. Є колектори, де всі пробірки залишаються нерухомими в своїх штативах, а крапельниця, встановлена ​​на рухомий каретки. Переміщаючись в двох взаємно-перпендикулярних напрямках, вона обходить всі штативи один за іншим. Зміна пробірки найчастіше задається автоматично самим колектором фракцій (за вибором експериментатора) - чи то по часу, чи то за кількістю крапель, яке відраховує просте реле з фотоелементом. Іноді зміною пробірок за допомогою електричного імпульсу управляє перистальтичний насос, прив'язуючи тим самим зміну пробірок до істинного потоку рідини через колонку, незалежно від можливих змін швидкості подачі елюента (в силу зміни опору колонки) або від розміру крапель, який залежить від в'язкості і температури рідини.

Для роботи з радіоактивними речовинами колектори оснащують додатковим пристроєм, який замикає вихід рідини з колонки під час зміни пробірок.

Апаратура для рідинної хроматографії високого тиску (ЖХВД)

З подальшого буде ясно, що хроматографічні процеси протікають тим швидше (якою б природи вони не були), чим менше розмір гранул. Швидше встановлюється певна рівновага між змістом фракціоніруемих молекул або іонів всередині гранул і в протікає між ними рідини - елюента. При відповідних змінах складу елюента швидше здійснюється «насичення» внутрішнього об'єму гранул пов'язаними молекулами речовини або, навпаки, відбувається повний вихід цих молекул з гранул в ток елюента.

У звичайній рідинної хроматографії низького тиску використовують сферичні гранули в широкому діапазоні розмірів (діаметром 20-300 мікрон). Для забезпечення необхідної швидкості протікання рідини навіть через довгі колонки з найбільш дрібними гранулами з цього діапазону досить створити перепад тиску на колонці в 3-4 атмосфери. Процес хроматографічного фракціонування при цьому займає кілька годин.

З середини 70-х років, коли відкрилися перспективи хроматографічного контролю за технологічними процесами в харчовій і фармакологічної промисловості, в інтересах прискорення такого контролю багато фірм стали пробувати переходити на розміри гранул в 10,5 і навіть 3 мкн. Однак виявилося, що для забезпечення швидкого перебігу елюента через колонки, наповнені настільки дрібними гранулами, потрібно створювати перепад тиску в 200-300 атмосфер на колонку. Фізично це можна пояснити двома причинами. По-перше, шари вільної рідини між добре упакованими гідрофільними гранулами стають такі тонкі, що починає сильно позначатися рідинне тертя в елюента. По-друге, настільки малі гранули важко зробити сферичними і притому уникнути як значного розкиду їх діаметрів, так і засмічення проміжків між гранулами зовсім дрібними уламками. («Отмучіваніем» у цих умовах малоефективне.)

Математично можна довести, що при заповненні якогось фіксованого обсягу (колонки) відносно малими сферичними частинками строго однакового розміру частка вільного об'єму залишається однаковою незалежно від діаметра частинок. Але якщо вільний простір між ними забиває «пил», то опір протіканню рідини через таку упаковку зростає багаторазово.

Все це не зупинило конструкторів апаратури для хроматографії. Були створені розбірні колонії з легованої сталі, розраховані на такі тиску і відповідні ущільнювальні пристрої на їх вході і виході, а також для вприскування досліджуваних препаратів. З'явилися потужні плунжерні насоси з кулачковим приводом (як у клапанів автомобільного двигуна). Зрозуміло, всі прилади, які стоять після колонки, на стороні атмосферного тиску (денситометри, колектори фракцій) залишилися тими ж, що для звичайної хроматографії.

Високий тиск спричинило за собою підвищені вимоги до жорсткості самих гранул. Їх стали виготовляти на основі оксиду кремнію («силікагелю»).

Виграш у швидкості проведення хроматографії при високому тиску очевидний. Але в лабораторних умовах, як правило, не відіграє суттєвої ролі триває хроматографічний процес кілька годин або кілька хвилин. Якщо тільки в цей процес не втручається дифузія розділених препаратів уже в елюент, в ході їх елюції з колонки. Для низькомолекулярних речовин фактор дифузії може відігравати серйозну негативну роль, чого не можна сказати про молекулах білків і інших біополімерів.

Мабуть, виходячи з міркувань дифузії, перші реклами фірм, що виготовляють апаратуру для загальноприйнятого найменування процесу «HPLC - chromatography» розшифровували це найменування не просто як High Pressure Liquid Chromatography, a як High Performance Liquid Chromatography. Здавалося, що новий підхід скоро витіснить хроматографію при низькому тиску. Однак цього не сталося. Час усе розставив по своїх місцях: в каталогах 2001 апаратура, колонки, гранули для звичайної хроматографії займають таке ж місце, як апаратура високого тиску. В описах методик лабораторних експериментів використання звичайної хроматографії зустрічається частіше, ніж ЖХВД. Неабиякою мірою це, звичайно, визначається і набагато більш високою вартістю апаратури високого тиску.

На початку 80-х років шведська фірма «Pharmacia» випустила на ринок порівняно недорогий «проміжний» варіант комплекту хроматографічної апаратури під назвою «FPLC» (Fast Protein Liquid Chr.) Зі зрозумілих після зазначеного вище причин, фірма приділила особливу увагу однорідності гранул. Замість зазвичай розкиду діаметрів в = ь40% від номіналу, фірма зуміла налагодити випуск сферичних гранул різного призначення діаметром 10 ± 0,1 мікрон (тобто з розкидом в 1%). Це дозволяє, незважаючи на малий розмір гранул обмежитися тиском в 30-50 атмосфер. Поділ білків при цьому займає 5-20 хвилин. Колонки - сталеві, насоси плунжерного типу, але скляні.

Судячи за наявними відомостями, ця система завоювала популярність у сучасних дослідників.

Оскільки по суті хроматографічних процесів всі три підходи абсолютно однакові, я обмежуся зробленими короткими зауваженнями щодо систем HPLC і FPLC і буду далі описувати принципи роботи і приводити деякі приклади для варіанту звичайної хроматографії при низькому тиску.

Література

1. Насиров Х.М., Кондратенко Р.М. До прооксідазному дії медіаторів запалення. / / Пат. фізіологія. 1992. N 3.-С.-12-14.

2. Неговський В.А. Загальні проблеми постреанимационной патології мозку. / / Міжн. симпозіум "постреанімаційної патологія мозку": Матеріали. Тези доповідей. - М. 1978. -С.82-85.

3. Нікітін Ю.П., Курилович С.А., Давідін Г.С. Печінка і ліпідний обмін. - Новосибірськ. Наука, -1985.