Реферат на тему:
Осадження частинок
2009
Осадження частинок
2009
Швидкість осадження частинок
Під словом «частка» домовимося розуміти (якщо про це піде мова) і великі макромолекули білків або нуклеїнових кислот.
1. При однакових плотностях частки більшого розміру осідають набагато швидше, ніж дрібні.
2. Швидкість осідання («седиментації») збільшується зі збільшенням щільності частинок. Особливо сильно це виявляється в умовах, коли щільність середовища близька до щільності частинки. Можлива ситуація, коли дрібні, але більш щільні частинки будуть осідати швидше, ніж великі.
3. Швидкість осідання частинок пропорційна квадрату числа обертів ротора в хвилину.
4. Чим більше в'язкість середовища, тим повільніше осідання частинок.
5. Швидкість седиментації пропорційна відстані частинки від осі обертання ротора. Це відстань збільшується в міру просування частинки вздовж осі пробірки, тому при сталості інших умов швидкість седиментації повинна безперервно (хоча і повільно) зростати. Якщо це небажано, то слід підвищувати щільність або в'язкість середовища в радіальному напрямку так, щоб вони компенсували збільшення радіусу обертання.
Має сенс ввести поняття «плавучої щільності» часток. Справа в тому, що проявляє себе при ультрацентрифугирование щільність частинки обумовлена не тільки її хімічним складом і просторовою структурою. Наприклад, вона сильно залежить від ступеня «гідратації» частинки - кількості міцно пов'язаної з нею води. Ця вода рухається разом з часткою, значно зменшуючи її ефективну щільність. Кількість цієї води помітно зменшується в присутності високих концентрацій іонів чи інших гідрофільних молекул, теж пов'язують воду (вільної води не вистачає!). З іншого боку, деякі іони або молекули можуть самі міцно зв'язуватися з частинками, збільшуючи їх ефективну щільність.
Тому для даного типу частинок, які осідають у даному середовищі, вводять поняття «плавучої щільності». Її можна визначити експериментально, вимірявши щільність середовища в точці, де рух частинки припиняється через рівності нулю дужки у формулі 1 (див. нижче - «рівноважний ультрацентрифугирование»).
Нарешті, відхилення форми частинки від сферичної теж позначається (не дуже сильно) на швидкості їх осідання. У зв'язку з цим варто нагадати, що як макромолекули білків, так і молекули досить високополімерних нуклеїнових кислот у розчині згортаються в хаотичні клубки, форма яких близька до сферичної.
Роздільне осадження частинок
Припустимо, що з гомогенату клітин, вже звільненого низькошвидкісних центрифугуванням від ядра, мітохондрій і обривків зовнішньої оболонки, потрібно виділити рибосоми, внутрішні мембрани і ще більш дрібні частинки. Можна так підібрати помірну швидкість обертання кутового ротора (при значному обсязі пробірок), що в осад потраплять тільки найбільші частки, навіть ті з них, які спочатку перебували поблизу меніска. Менші частки при цьому майже повністю залишаться в надосадової рідини (супернатанті), за винятком тих, які з самого початку вже перебували у дна пробірки - вони увійдуть до складу осаду. Для доброї очистки великих часток супернатант обережно зливають, осад знову суспендують (в буфері) у повному обсязі пробірки і знову центрифугують в тих же умовах. Цю операцію можна повторити 2-3 рази, після чого осад виявиться практично однорідним. Тут є одне тонке місце, що відноситься до суспендированием опадів. Вкрай небажано утворення грудок, зважених у рідині. Вони можуть довгий час не розходитися, втримуючи усередині себе менш крупні частинки. Щоб цього уникнути, необхідно кожного разу з мінімальною кількістю буфера, або зовсім без нього, довгий час скляною паличкою розтирати осад по навколишніх стінках пробірки. Паличка повинна бути не надто тонкою, - всього в 3-4 рази менше по діаметру, ніж пробірка, - і закінчуватися рівною сферою без каплевидного потовщення. (Мистецтво експериментатора в чималому ступені полягає в передбачливості по відношенню до подібних «дрібниць».) Опади можуть бути і невидимі, але їх все одно треба розтирати. Для орієнтування можна попередньо позначити пробірки у верхнього краю фарбою і встановлювати в ротор цієї міткою назовні.
Перший злитий супернатант можна центрифугувати повторно на більшій швидкості і точно таким же чином очистити в ньому частки середніх розмірів. Конвергенції, якщо треба, зібрати і найдрібніші.
Зонально-швидкісний ультрацентрифугирование
Особливості цього типу центрифугування відображені в самому його назві: «швидкісне» - тому що частинки поділяються за швидкістю їх осідання, причому щільність їх значно більше, ніж щільність середовища; «зональне» - так як частинки різних розмірів осідають більш-менш тонкими шарами - « зонами ». Опадів не утворюється. Центрифугування ведуть в Бакет-роторах. Після того, як зони досягнуть оптимального розподілу по довжині пробірки, центрифугування припиняють, і зони частинок описаним нижче способом витягають одну за одною.
Тут, на відміну від предидщуего випадку, частки різних розмірів очищаються не роздільно, а одночасно - при одному центрифугуванні.
Вихідну суміш частинок різних розмірів (хоча б той же наполовину очищений гомогенат клітин) наносять тонким шаром на більш щільну (чим буфер гомогенату) середовище, що заповнює пробірку Бакет-ротора. У ході центрифугування найбільш важкі частинки швидко просуваються в напрямку дна пробірки, певною мірою зберігаючи обриси вихідного шару, де вони були розподілені. За ними, з отставаніяем, але теж у вигляді окремого шару рухаються менш великі частки, потім ще більш дрібні і т. д. Так утворюються дискретні зони частинок різних розмірів.
Для того, щоб зони залишалися вузькими, необхідно протидіяти конвекції рідини, в якій рухаються частинки. Ефективний спосіб придушення конвекції - збільшення щільності цієї рідини вздовж радіуса обертання в напрямку від меніска на дно пробірки. Наприклад, можна заповнювати пробірку Бакет-ротора водним розчином сахарози, концентрація якої наростає в напрямку до дна пробірки. А потім вже на цей «градієнт сахарози» (як його скорочено називають) нашаровувати препарат - суміш підлягають поділу частинок.
Крім того при зонально-швидкісному центрифугуванні бажано позбавитися від згаданого раніше збільшення швидкості руху часток по мірі їх просування уздовж пробірки. В іншому випадку може скластися ситуація, коли ниболее важкі частки досягнуть дна пробірки раніше, ніж дві зони легких частинок встигнуть відокремитися одна від одної. Як видно з формули 1, збільшення щільності середовища вже частково нейтралізує вплив видалення зони від меніска. Але не дуже ефективно, особливо якщо щільності частинок значно більше щільності середовища. Куди ефективніше може впливати збільшення в'язкості. Тому для створення «гальмуючого градієнта» доцільно використовувати градієнт концентрації речовини, яке мало б обома бажаними якостями (+ хімічна нейтральність). Мабуть, найкраще цій вимозі відповідають розчини сахарози, як це видно з нижченаведеної таблиці, де р виражено в г / см 3, а г - у сантіпуазах. Всі при температурі +5 ° С - звичайної при обробці біологічних препаратів.
На практиці, в залежності від завдання найчастіше використовують градієнти сахарози 5-20% і 15-30%. Пристрій для створення лінійного градієнта концентрації сахарози аналогічно тому для створення градієнта пористості ПААГ. Відмінність в тому, що з причини великої в'язкості розчинів сахарози замість магнітної мішалки використовують обертається в склянці змішувача гвинтоподібну смужку, виготовлену з підігрітого плексигласу, яка жене рідину нагору (мал.).
Рис.
Матеріал поліалмерних і полікарбонатних пробірок погано змочується водою. Тому подавати рідину в пробірку по стінці незручно - вона буде скочуватися краплями, порушуючи плавність градієнта. Краще, як це показано на малюнку, подавати розчин сахарози через довгу голку на дно пробірки. У змішувач в цьому випадку заливають розчин сахарози мінімальної концентрації, а в резервуар - максимальною. Більш щільний розчин сахарози буде плавно відтісняти догори менш щільні шари.
У деяких випадках, наприклад, коли бажано, щоб великі частки, наближаючись до дна пробірки, не тільки не збільшували б швидкість свого руху, а, навпаки, зменшували її, має сенс підібрати нелінійний, круто наростаючий на дно пробірки градієнт концентрації сахарози. Так, щоб спільне вплив зростання щільності і особливо в'язкості середовища центрифугування виявилися сильнішими, ніж ефект збільшення радіусу обертання. Цього можна досягти, якщо діаметр змішувача зробити більше діаметра резервуару. При заповненні пробірки сума обсягів рідини в обох склянках повинна бути використана повністю. Спочатку невеликі добавки щільною сахарози з резервуару, розбавляючи у великому об'ємі рідини в змішувачі, будуть лише незначно збільшувати початкову щільність розчину. Тим не менш, в кінці заповнення пробірки щільність розчину в ній все одно досягне максимального значення - градієнт виявиться повільно наростаючим у верхній частині пробірки і крутим у її дна.
Виймання та визначення розділилися зон після закінчення центрифугування (оскільки вони не вирізняються) доводиться робити «на дотик». Простіше за все, - так воно і робилося спочатку, - закріпивши відкриту пробірку в затиску вертикально, проколоти її дно голкою від шприца і збирати фракції по певному числу крапель в послідовний ряд пробірок, встановлених в штативі, який сам експериментатор і пересувати своєчасно. Спосіб добра не тільки тупий трудомісткістю, але і зміною обсягу крапель по мірі спорожнення пробірки. Краще до голки приєднати тонку поліетиленову трубочку, а її до перистальтичні насоси (буде описаний в наступній главі) із заданою швидкістю відкачування рідини. Від насоса подавати обрану кількість крапель в пробірки, встановлених у «колектор фракції». Останній являє собою механічний прилад, де близько 100-150 пробірок по черзі, автоматично, - через задані інтервали часу або після відліку заданого числа крапель, підводяться під крапельницю, якою закінчується трубочка, що йде від насоса.
Можна пробірку і не проколювати, а голку обережно опустити зверху до дна пробірки і таким чином пофракційно відсмоктувати її вміст. У будь-якому випадку виявлення розділених зон здійснюється послідовної перевіркою всіх пробірок на ультрафіолетове поглинання: на довжині хвилі 280 тц для білків і 260 тц - для нуклеїнових кислот. Фракції, що виявили шукане вміст, об'єднуються.
У якості цікавого для нас приклад використання центрифугування в градієнті щільності сахарози, я вибрав історичні досліди Окадзакі (1971 рік), що поклали основу сучасним уявленням про механізм редуплікації ДНК. У цих дослідах бактерії, що ростуть у рідкому поживному середовищі, отримували через це середовище імпульсну мітку радіоактивним тимідину тривалістю від 2 секунд до 2-х хвилин (у різних дослідах). Після закінчення імпульсу бактерії швидко охолоджували, виділяли сумарну ДНК і центрифугували її в лужному (для повної денатурації ДНК) градієнті 5-20% сахарози в Бакет-роторі на швидкості 25 тис. об / хв протягом 16 годин. Після розкопування градієнта зміст новосинтезованих ДНК в кожній фракції оцінювали за радіоактивністю (у рідкому сцинтилятор - див. розділ 15).
Далі відбувається перерозподіл мітки між «вільними» (відокремилися в ході виділення ДНК) фрагментами Окадзакі і великими фрагментами зрілої ДНК, які знаходяться у діапазоні 20-60 S. У ці останні преходить і частина радіоактивності, що знаходилася у фрагментах Окадзакі, після їхнього включення до складу комплементарної нитки ДНК. Так що для кривих 5 і 6 відносна частка включення мітки у фрагменти Окадзакі і зрілу ДНК суттєво змінюється.
Рівноважний ультрацентрифугирование
Ідея методу полягає у створенні такого градієнта по довжині пробірки (в Бакет-роторі), щоб щільність середовища центрифугування у дна була більше, ніж у найбільш щільних частинок, а у меніска - менше, ніж у найменш щільних. При досить тривалому центрифугуванні частинки будуть переміщатися уздовж градієнта до тих пір, поки не досягнуть положення, в якому щільність середовища дорівнює їх плавучої щільності. Рух припиняється, частинки різної щільності розташовуються в різних ділянках градієнта. Таким чином, здійснюється фракціонування частинок за їх щільності.
Таке розділення має такі особливості:
1. Розміри частинок і їх маси не будуть позначатися на остаточному розподілі. Становище на градієнті буде визначатися тільки щільністю частинок.
2. Рух частинок до стану рівноваги буде відбуватися як з області більш низької щільності градієнта, ніж їх плавуча щільність, так і з області більш високої щільності. Таким чином поряд з седиментацією буде відбуватися і флотація. Це означає, що немає необхідності наносити тонкий шар початковий препарату на рідину, що заповнює пробірку. Можна навіть весь препарат змішати з повним обсягом градієнтної середовища.
3. Процес центрифугування повинен бути досить тривалим, тому що при підході до положення рівноваги частинки будуть рухатися дуже повільно.
4. В'язкість середовища у зв'язку з цим є небажаним чинником.
5. При рівноважному ультрацентрифугирование можлива помітно велике завантаження препаратом, ніж при зонально-швидкісному центрифугуванні.
6. В області рівноваги частинки розташуються у вигляді смуги, ширина якої визначитися співвідношенням двох процесів:
концентрування за рахунок седиментації - флотації та теплової дифузії частинок. Ця ширина буде тим менше, чим крутіше градієнт щільності середовища і чим більше маса частинок - збільшення маси зменшує схильність до дифузії. Розподіл концентрації речовини в смузі описується симетричною (гауссовской) кривої. За її ширині, знаючи координату центру смуги (Гд), кутову швидкість обертання і крутизну градієнта щільності середовища в центрі смуги (dp / dr) можна розрахувати масу (сольватіро-ванною) частинки.
Сахароза непридатна для створення градієнта при рівноважному центрифугуванні. Як видно з таблиці, наведеної у попередньому параграфі, щільність навіть 30%-ного розчину сахарози набагато менше, ніж в основних біологічних об'єктів, в той час, як в'язкість вже зростає «катастрофічно».
Можна очікувати, що підходящої середовищем для рівноважного центрифугування буде концентрований розчин солі якого-небудь важкого металу. Щільність такого розчину може виявитися досить значною, у той час як в'язкість сольового розчину слабо залежить від його концентрації. Як показав досвід, найбільш зручними середовищами для рівноважного ультрацентрифугирования виявилися концентровані розчини хлористого або сірчанокислого цезію (CsCI). У нижченаведеної таблиці наведені значення щільності розчинів CsCI різної вагової концентрації:
Розглядаючи цю таблицю, корисно згадати залежність плавучої щільності біологічних молекул від приєднання води та іонів. Там була вказана величина плавучої щільності ДНК в концентрованому розчині CsCI - 1,7 г / см 3. таким чином різні за щільністю молекули ДНК, очевидно, можна фракціонований рівноважним ультрацентрифугирование в градієнті CsCI. Чого не можна сказати про РНК, плавуча щільність якої в цих умовах досягає величини> 1,9 г / см 3. Білки ж, навпаки, успішно можуть розділятися в описуваних умовах. Для них плавуча щільність в концентрованих розчинах CsCI коливається в межах 1,3-1,33 г / см 3.
Під словом «частка» домовимося розуміти (якщо про це піде мова) і великі макромолекули білків або нуклеїнових кислот.
1. При однакових плотностях частки більшого розміру осідають набагато швидше, ніж дрібні.
2. Швидкість осідання («седиментації») збільшується зі збільшенням щільності частинок. Особливо сильно це виявляється в умовах, коли щільність середовища близька до щільності частинки. Можлива ситуація, коли дрібні, але більш щільні частинки будуть осідати швидше, ніж великі.
3. Швидкість осідання частинок пропорційна квадрату числа обертів ротора в хвилину.
4. Чим більше в'язкість середовища, тим повільніше осідання частинок.
5. Швидкість седиментації пропорційна відстані частинки від осі обертання ротора. Це відстань збільшується в міру просування частинки вздовж осі пробірки, тому при сталості інших умов швидкість седиментації повинна безперервно (хоча і повільно) зростати. Якщо це небажано, то слід підвищувати щільність або в'язкість середовища в радіальному напрямку так, щоб вони компенсували збільшення радіусу обертання.
Має сенс ввести поняття «плавучої щільності» часток. Справа в тому, що проявляє себе при ультрацентрифугирование щільність частинки обумовлена не тільки її хімічним складом і просторовою структурою. Наприклад, вона сильно залежить від ступеня «гідратації» частинки - кількості міцно пов'язаної з нею води. Ця вода рухається разом з часткою, значно зменшуючи її ефективну щільність. Кількість цієї води помітно зменшується в присутності високих концентрацій іонів чи інших гідрофільних молекул, теж пов'язують воду (вільної води не вистачає!). З іншого боку, деякі іони або молекули можуть самі міцно зв'язуватися з частинками, збільшуючи їх ефективну щільність.
Тому для даного типу частинок, які осідають у даному середовищі, вводять поняття «плавучої щільності». Її можна визначити експериментально, вимірявши щільність середовища в точці, де рух частинки припиняється через рівності нулю дужки у формулі 1 (див. нижче - «рівноважний ультрацентрифугирование»).
Нарешті, відхилення форми частинки від сферичної теж позначається (не дуже сильно) на швидкості їх осідання. У зв'язку з цим варто нагадати, що як макромолекули білків, так і молекули досить високополімерних нуклеїнових кислот у розчині згортаються в хаотичні клубки, форма яких близька до сферичної.
Роздільне осадження частинок
Припустимо, що з гомогенату клітин, вже звільненого низькошвидкісних центрифугуванням від ядра, мітохондрій і обривків зовнішньої оболонки, потрібно виділити рибосоми, внутрішні мембрани і ще більш дрібні частинки. Можна так підібрати помірну швидкість обертання кутового ротора (при значному обсязі пробірок), що в осад потраплять тільки найбільші частки, навіть ті з них, які спочатку перебували поблизу меніска. Менші частки при цьому майже повністю залишаться в надосадової рідини (супернатанті), за винятком тих, які з самого початку вже перебували у дна пробірки - вони увійдуть до складу осаду. Для доброї очистки великих часток супернатант обережно зливають, осад знову суспендують (в буфері) у повному обсязі пробірки і знову центрифугують в тих же умовах. Цю операцію можна повторити 2-3 рази, після чого осад виявиться практично однорідним. Тут є одне тонке місце, що відноситься до суспендированием опадів. Вкрай небажано утворення грудок, зважених у рідині. Вони можуть довгий час не розходитися, втримуючи усередині себе менш крупні частинки. Щоб цього уникнути, необхідно кожного разу з мінімальною кількістю буфера, або зовсім без нього, довгий час скляною паличкою розтирати осад по навколишніх стінках пробірки. Паличка повинна бути не надто тонкою, - всього в 3-4 рази менше по діаметру, ніж пробірка, - і закінчуватися рівною сферою без каплевидного потовщення. (Мистецтво експериментатора в чималому ступені полягає в передбачливості по відношенню до подібних «дрібниць».) Опади можуть бути і невидимі, але їх все одно треба розтирати. Для орієнтування можна попередньо позначити пробірки у верхнього краю фарбою і встановлювати в ротор цієї міткою назовні.
Перший злитий супернатант можна центрифугувати повторно на більшій швидкості і точно таким же чином очистити в ньому частки середніх розмірів. Конвергенції, якщо треба, зібрати і найдрібніші.
Зонально-швидкісний ультрацентрифугирование
Особливості цього типу центрифугування відображені в самому його назві: «швидкісне» - тому що частинки поділяються за швидкістю їх осідання, причому щільність їх значно більше, ніж щільність середовища; «зональне» - так як частинки різних розмірів осідають більш-менш тонкими шарами - « зонами ». Опадів не утворюється. Центрифугування ведуть в Бакет-роторах. Після того, як зони досягнуть оптимального розподілу по довжині пробірки, центрифугування припиняють, і зони частинок описаним нижче способом витягають одну за одною.
Тут, на відміну від предидщуего випадку, частки різних розмірів очищаються не роздільно, а одночасно - при одному центрифугуванні.
Вихідну суміш частинок різних розмірів (хоча б той же наполовину очищений гомогенат клітин) наносять тонким шаром на більш щільну (чим буфер гомогенату) середовище, що заповнює пробірку Бакет-ротора. У ході центрифугування найбільш важкі частинки швидко просуваються в напрямку дна пробірки, певною мірою зберігаючи обриси вихідного шару, де вони були розподілені. За ними, з отставаніяем, але теж у вигляді окремого шару рухаються менш великі частки, потім ще більш дрібні і т. д. Так утворюються дискретні зони частинок різних розмірів.
Для того, щоб зони залишалися вузькими, необхідно протидіяти конвекції рідини, в якій рухаються частинки. Ефективний спосіб придушення конвекції - збільшення щільності цієї рідини вздовж радіуса обертання в напрямку від меніска на дно пробірки. Наприклад, можна заповнювати пробірку Бакет-ротора водним розчином сахарози, концентрація якої наростає в напрямку до дна пробірки. А потім вже на цей «градієнт сахарози» (як його скорочено називають) нашаровувати препарат - суміш підлягають поділу частинок.
Крім того при зонально-швидкісному центрифугуванні бажано позбавитися від згаданого раніше збільшення швидкості руху часток по мірі їх просування уздовж пробірки. В іншому випадку може скластися ситуація, коли ниболее важкі частки досягнуть дна пробірки раніше, ніж дві зони легких частинок встигнуть відокремитися одна від одної. Як видно з формули 1, збільшення щільності середовища вже частково нейтралізує вплив видалення зони від меніска. Але не дуже ефективно, особливо якщо щільності частинок значно більше щільності середовища. Куди ефективніше може впливати збільшення в'язкості. Тому для створення «гальмуючого градієнта» доцільно використовувати градієнт концентрації речовини, яке мало б обома бажаними якостями (+ хімічна нейтральність). Мабуть, найкраще цій вимозі відповідають розчини сахарози, як це видно з нижченаведеної таблиці, де р виражено в г / см 3, а г - у сантіпуазах. Всі при температурі +5 ° С - звичайної при обробці біологічних препаратів.
На практиці, в залежності від завдання найчастіше використовують градієнти сахарози 5-20% і 15-30%. Пристрій для створення лінійного градієнта концентрації сахарози аналогічно тому для створення градієнта пористості ПААГ. Відмінність в тому, що з причини великої в'язкості розчинів сахарози замість магнітної мішалки використовують обертається в склянці змішувача гвинтоподібну смужку, виготовлену з підігрітого плексигласу, яка жене рідину нагору (мал.).
| Параметр | Концентрація розчину сахарози у воді (вес.%) | |||||
| 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | |
| Р | 1,020 | 1,041 | 1,062 | 1,084 | 1,107 | 1,131 |
| Л | 1,753 | 2,073 | 2,513 | 3,135 | 4,042 | 5,422 |
Рис.
Матеріал поліалмерних і полікарбонатних пробірок погано змочується водою. Тому подавати рідину в пробірку по стінці незручно - вона буде скочуватися краплями, порушуючи плавність градієнта. Краще, як це показано на малюнку, подавати розчин сахарози через довгу голку на дно пробірки. У змішувач в цьому випадку заливають розчин сахарози мінімальної концентрації, а в резервуар - максимальною. Більш щільний розчин сахарози буде плавно відтісняти догори менш щільні шари.
У деяких випадках, наприклад, коли бажано, щоб великі частки, наближаючись до дна пробірки, не тільки не збільшували б швидкість свого руху, а, навпаки, зменшували її, має сенс підібрати нелінійний, круто наростаючий на дно пробірки градієнт концентрації сахарози. Так, щоб спільне вплив зростання щільності і особливо в'язкості середовища центрифугування виявилися сильнішими, ніж ефект збільшення радіусу обертання. Цього можна досягти, якщо діаметр змішувача зробити більше діаметра резервуару. При заповненні пробірки сума обсягів рідини в обох склянках повинна бути використана повністю. Спочатку невеликі добавки щільною сахарози з резервуару, розбавляючи у великому об'ємі рідини в змішувачі, будуть лише незначно збільшувати початкову щільність розчину. Тим не менш, в кінці заповнення пробірки щільність розчину в ній все одно досягне максимального значення - градієнт виявиться повільно наростаючим у верхній частині пробірки і крутим у її дна.
Виймання та визначення розділилися зон після закінчення центрифугування (оскільки вони не вирізняються) доводиться робити «на дотик». Простіше за все, - так воно і робилося спочатку, - закріпивши відкриту пробірку в затиску вертикально, проколоти її дно голкою від шприца і збирати фракції по певному числу крапель в послідовний ряд пробірок, встановлених в штативі, який сам експериментатор і пересувати своєчасно. Спосіб добра не тільки тупий трудомісткістю, але і зміною обсягу крапель по мірі спорожнення пробірки. Краще до голки приєднати тонку поліетиленову трубочку, а її до перистальтичні насоси (буде описаний в наступній главі) із заданою швидкістю відкачування рідини. Від насоса подавати обрану кількість крапель в пробірки, встановлених у «колектор фракції». Останній являє собою механічний прилад, де близько 100-150 пробірок по черзі, автоматично, - через задані інтервали часу або після відліку заданого числа крапель, підводяться під крапельницю, якою закінчується трубочка, що йде від насоса.
Можна пробірку і не проколювати, а голку обережно опустити зверху до дна пробірки і таким чином пофракційно відсмоктувати її вміст. У будь-якому випадку виявлення розділених зон здійснюється послідовної перевіркою всіх пробірок на ультрафіолетове поглинання: на довжині хвилі 280 тц для білків і 260 тц - для нуклеїнових кислот. Фракції, що виявили шукане вміст, об'єднуються.
У якості цікавого для нас приклад використання центрифугування в градієнті щільності сахарози, я вибрав історичні досліди Окадзакі (1971 рік), що поклали основу сучасним уявленням про механізм редуплікації ДНК. У цих дослідах бактерії, що ростуть у рідкому поживному середовищі, отримували через це середовище імпульсну мітку радіоактивним тимідину тривалістю від 2 секунд до 2-х хвилин (у різних дослідах). Після закінчення імпульсу бактерії швидко охолоджували, виділяли сумарну ДНК і центрифугували її в лужному (для повної денатурації ДНК) градієнті 5-20% сахарози в Бакет-роторі на швидкості 25 тис. об / хв протягом 16 годин. Після розкопування градієнта зміст новосинтезованих ДНК в кожній фракції оцінювали за радіоактивністю (у рідкому сцинтилятор - див. розділ 15).
Далі відбувається перерозподіл мітки між «вільними» (відокремилися в ході виділення ДНК) фрагментами Окадзакі і великими фрагментами зрілої ДНК, які знаходяться у діапазоні 20-60 S. У ці останні преходить і частина радіоактивності, що знаходилася у фрагментах Окадзакі, після їхнього включення до складу комплементарної нитки ДНК. Так що для кривих 5 і 6 відносна частка включення мітки у фрагменти Окадзакі і зрілу ДНК суттєво змінюється.
Рівноважний ультрацентрифугирование
Ідея методу полягає у створенні такого градієнта по довжині пробірки (в Бакет-роторі), щоб щільність середовища центрифугування у дна була більше, ніж у найбільш щільних частинок, а у меніска - менше, ніж у найменш щільних. При досить тривалому центрифугуванні частинки будуть переміщатися уздовж градієнта до тих пір, поки не досягнуть положення, в якому щільність середовища дорівнює їх плавучої щільності. Рух припиняється, частинки різної щільності розташовуються в різних ділянках градієнта. Таким чином, здійснюється фракціонування частинок за їх щільності.
Таке розділення має такі особливості:
1. Розміри частинок і їх маси не будуть позначатися на остаточному розподілі. Становище на градієнті буде визначатися тільки щільністю частинок.
2. Рух частинок до стану рівноваги буде відбуватися як з області більш низької щільності градієнта, ніж їх плавуча щільність, так і з області більш високої щільності. Таким чином поряд з седиментацією буде відбуватися і флотація. Це означає, що немає необхідності наносити тонкий шар початковий препарату на рідину, що заповнює пробірку. Можна навіть весь препарат змішати з повним обсягом градієнтної середовища.
3. Процес центрифугування повинен бути досить тривалим, тому що при підході до положення рівноваги частинки будуть рухатися дуже повільно.
4. В'язкість середовища у зв'язку з цим є небажаним чинником.
5. При рівноважному ультрацентрифугирование можлива помітно велике завантаження препаратом, ніж при зонально-швидкісному центрифугуванні.
6. В області рівноваги частинки розташуються у вигляді смуги, ширина якої визначитися співвідношенням двох процесів:
концентрування за рахунок седиментації - флотації та теплової дифузії частинок. Ця ширина буде тим менше, чим крутіше градієнт щільності середовища і чим більше маса частинок - збільшення маси зменшує схильність до дифузії. Розподіл концентрації речовини в смузі описується симетричною (гауссовской) кривої. За її ширині, знаючи координату центру смуги (Гд), кутову швидкість обертання і крутизну градієнта щільності середовища в центрі смуги (dp / dr) можна розрахувати масу (сольватіро-ванною) частинки.
Сахароза непридатна для створення градієнта при рівноважному центрифугуванні. Як видно з таблиці, наведеної у попередньому параграфі, щільність навіть 30%-ного розчину сахарози набагато менше, ніж в основних біологічних об'єктів, в той час, як в'язкість вже зростає «катастрофічно».
Можна очікувати, що підходящої середовищем для рівноважного центрифугування буде концентрований розчин солі якого-небудь важкого металу. Щільність такого розчину може виявитися досить значною, у той час як в'язкість сольового розчину слабо залежить від його концентрації. Як показав досвід, найбільш зручними середовищами для рівноважного ультрацентрифугирования виявилися концентровані розчини хлористого або сірчанокислого цезію (CsCI). У нижченаведеної таблиці наведені значення щільності розчинів CsCI різної вагової концентрації:
| Конц.СsС1 (%) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 65 (насищ.) |
| р г / см 3 | 1,079 | 1,174 | 1,286 | 1,420 | 1,582 | 1,785 | 1,910 |
Література
1 Давиденкова Є.Ф., Ліберман І.С., Шафран М.Г. Генетичні і патогенетичні механізми атеросклерозу. / / Клинич. медіціна.-1990 .- N 10.-С.-23.
2 Денисенко А.Д., Поліський В.А., Лозівський В.Т. Ліпопротеїди високої щільності і атеросклероз. / / Матеріали I-го сов. - Америк. симпозіуму. - М.: Медицина,-1983.-С.113-122.
3 Дея К., Деккер М. Ліпопротеїди високої щільності. - М.: Медицина, -1981.
1 Давиденкова Є.Ф., Ліберман І.С., Шафран М.Г. Генетичні і патогенетичні механізми атеросклерозу. / / Клинич. медіціна.-1990 .- N 10.-С.-23.
2 Денисенко А.Д., Поліський В.А., Лозівський В.Т. Ліпопротеїди високої щільності і атеросклероз. / / Матеріали I-го сов. - Америк. симпозіуму. - М.: Медицина,-1983.-С.113-122.
3 Дея К., Деккер М. Ліпопротеїди високої щільності. - М.: Медицина, -1981.