Нові методи иммунодиагностики та критерії їх оцінки [ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати. скачати Зміст: Зміст 1 стор Введення 2 стор Імуноферментний аналіз 5 стор Імммуносенсори 13 стор Методи генного зондування 16 стор Імуноелектрофорез і імуноблотинг 20 стор Критерії позитивних і негативних реакцій в лабораторній діагностиці інфекційних захворювань 23 стор Введення Ідеологія лабораторного аналізу в медицині заснована на розумінні будь-якого захворювання як реакції цілого організму. Патологічне зміна функції будь-якого органу, тканини, групи клітин викликає відхилення від нормальних показників у роботі інших органів, тканин, систем. Поряд з неспецифічним, тобто властивим для багатьох видів патології проявом таких зрушень, в більшості випадків спостерігаються особливі, характерні лише для даного захворювання зміни внутрішнього середовища організму. При інфекційних захворюваннях - це, перш за все, поява у внутрішньому середовищі організму збудника або його продуктів (токсини, антигени і т.д.) і імунна відповідь на збудник. У зв'язку з цим імунодіагностика інфекційних захворювань може бути розділена на дві частини. По-перше, це визначення зміни функціональної активності різних компонентів імунної системи, характерних для здорового організму: зміна кількості лімфоцитів різних популяцій, їх співвідношення, активності клітин системи мононуклеарних фагоцитів, концентрації імуноглобулінів і т.п. По-друге, це специфічне розпізнавання маркерів збудника і реагують з ним комплементарних структур (передусім антитіл) на основі їх взаємодії з мікробними антигенами. У більш широкому сенсі специфічне розпізнавання можливо не тільки за допомогою антитіл, але також і інших комплементарних структур, що реагують з мікробними продуктами - різними рецепторами клітинної поверхні, лектинами, ділянками молекул нуклеїнових кислот і т. п. В тій чи іншій мірі ці підходи знайшли технологічне здійснення в різних методах. Однак лише методи аналізу на основі реакції з ділянками нуклеїнових кислот знайшли досить широке застосування в клінічній практиці (генне зондування) і будуть описані більш детально. Оцінка стану імунної системи при інфекційному процесі може включати в себе такі методи: визначення кількості і співвідношень Т-і В-клітин, субпопуляцій лімфоцитів у периферичній крові, активності лімфоцитів в реакції бласттрансформації, визначення активності макрофагальної ланки (хемотаксис, рухливість, фагоцитоз), визначення концентрації імуноглобулінів М, G, А і Е, співвідношення концентрацій ізотипів IgG, визначення концентрації лімфокінів, монокинов, інтерферонів, стану місцевого імунітету (лізоцим, секреторний IgА) і загальних неспецифічних гуморальних факторів (система, комплементу, пропердин, трансферин, церулоплазмін), концентрації тимических гормонів і др.Находят застосування і методи комплексної оцінки реактогенності імунної системи по, так званим, реакцій негайного типу і реакції гіперчутливості уповільненого типу (шкірні проби при бактеріальних інфекціях і мікозах, туберкулінова проба). Вельми перепектівна оцінка субпопуляційного складу лімфоцитів за специфічними поверхневим маркерами, особливо при використанні імунофлуоресцентний методів автоматичного сортування клітин. Всі перераховані вище методи дозволяють оцінити динаміку змін станів імунної системи при інфекційному процесі, а при провокаційних тестах - виявити специфічну реактивність імунної відповіді. Застосування такого роду діагностичних процедур демонструє індивідуальну реакцію імунної системи пацієнта на перебіг інфекційного процесу, дозволяє оцінити ефективність застосовуваних методів лікування і прогнозувати результат захворювання. Проте лише в деяких випадках ці методи дозволяють визначити вид інфекційного агента. Зміна співвідношення популяцій і субпопуляцій лімфоцитів відбувається при різних видах інфекційних захворювань, особливо при хронічному перебігу інфекції. Так само часто змінюється концентрація неспецифічних гуморальних компонентів імунної системи. Відомо, що при деяких паразитарних захворюваннях різко підвищений рівень IgЕ в крові. При гострих запальних процесах, що викликаються бактеріями, зростає концентрація С-реактивного білка в крові, тоді як при подібних клінічних формах вірусної інфекції такі зміни не спостерігаються. Провокаційні методи можуть виявити сенсибілізацію до якого-небудь інфекційного агента, однак це може бути результатом зміни загальної реактивності організму. Імунодефіцитний стан, викликаний інфекцією, тобто синдром вторинного імунодефіциту, є широко поширеним явищем. З іншого боку, при інфекції, спричиненої ретровірусами ВІЛ-1, ВІЛ-2, НTLV-1, НТLV-2 спостерігаються різноманітні структурні зміни імунної системи, що супроводжуються множинними асоційованими інфекційними захворюваннями протозойні, бактеріальної та вірусної природи. Найбільш значущими для специфічної діагностики інфекційного процесу стали методи иммунохимического аналізу (immunoassay) для визначення антигенів і антитіл. Умовно методи иммунохимического аналізу можна розділити на чотири великі групи. До 1-ї групи належать прямі (безпосередні) методи визначення реакції антиген-антитіло. Утворений при цьому комплекс антиген-антитіло ідентифікується візуально, або за допомогою простих оптичних пристроїв. До таких методів належать преципитация в розчині (у тому числі - реакції турбодиметрія і нефелометрії), в гелі, на полімерній плівці, аглютинація бактеріальних клітин, найпростіших, пряма реакція аглютинації еритроцитів антитілами, вірусами. До 2-ї групи належать реакції пасивної аглютинації, тобто аглютинації часток, з поверхнею яких пов'язані антигени або антитіла. Такі препарати і отримали назву діагностикум. До цих методів відносяться реакції пасивної гемаглютинації (РНГА) та непрямий геммагглютінаціі (РНГА), латексагглютінаціі, коагглютинации, аглютинації часток бентоніту, желатинових капсул, частинок сефарози та ін До З-ї групи належать індикаторні методи, засновані на використанні різного роду міток для виявлення реакції антиген-антитіло. Найбільш поширені імуноферментний, імунофлюоресцентний, радіоімунологічних аналіз. У 4-у групу можна виділити одне з, бурхливо розвиваються напрямків лабораторного аналізу - иммуносенсор. Всі перераховані методи застосовуються не тільки при діагностиці інфекційних та неінфекційних захворювань людини, а й у ветеринарії, рослинництві, для контролю забруднення навколишнього середовища і т. п. ІМУНОФЕРМЕНТНИЙ АНАЛІЗ Основною відмінною рисою імуноферментного аналізу (ІФА) є те, що; в якості індикаторної молекули, яка дозволяє стежити за імунним комплексом, використовується молекула ферменту. У зв'язку з тим що фермент володіє унікальною властивістю модифіковані не одну, як у звичайних хімічних реакціях, а велика кількість молекул субстрату, тобто володіє свого роду підсилює властивістю, чутливість імуноферментних методик може бути дуже висока. У деяких випадках, як показують численні порівняльні дослідження, вона вища чутливості імунофлуоресцентний і радіоімунологічних методів. Історія створення імуноферментних методик починається з моменту, коли біохіміки почали ковалентно іммобілізовивать («пришивати») молекули ферментів до молекул білків і, зокрема, до молекул імуноглобулінів. Однак потрібно було п'ять років для створення методики імуноферментного аналізу саме в тому вигляді, в якому ми використовуємо його в даний час. Принципи цього методу такі: - Комплекс антиген - антитіло можна виявити, якщо ввести до складу одного з учасників імунної реакції (ковалентно «пришити») одну або декілька молекул ферменту. Причому ця процедура на проміжних (в процесі «пришивки») і фінальній стадії (кон'югат антигену чи антитіла з ферментом) не повинна змінювати імунні (властивості фермент-міченого учасника імунної реакції; зручно виявляти імунний комплекс, використовуючи здатність ферменту розщеплювати субстрат, який при ферментативної модифікації змінює свій колір. У цьому випадку для виявлення комплексу антиген - антитіло зазвичай використовують спектрофотометрію; - Ммунний комплекс можна виявляти за допомогою імуноферментного аналізу як у розчині, так і при адсорбції (або ковалентного іммобілізації) на твердому носії. Розрізняють два принципово різних типу ІФА - гомогенний і гетерогенний (твердофазний) імуноферментний аналіз. Гомогенний імуноферментний аналіз (гіфа) - найбільш простий в методичному відношенні вид ІФА. При його постановці один з учасників імунної реакції (звичайно це низькомолекулярний антиген) метится ферментом і за ходом формування комплексу антиген-антитіло стежать, реєструючи зміну активності ферменту. Таке порушення ферментативної активності може виникати або за рахунок просторового роз'єднання ферменту і субстрату, або за рахунок конформаційних змін в молекулі ферменту, супроводжуючих формування імунного комплексу. Гіфа має ряд істотних переваг перед іншими імунохімічних методів. По-перше, висока експресія (весь аналіз за допомогою гіфа, займає хвилини і навіть частки хвилин). Рис. Варіанти гомогенного імуноферментного аналізу (А-ефект роз'єднання ферменту (Ф) та субстрату (С) за рахунок стеричних перешкод при взаємодії антигену (Аг) і антитіла (Ат); Б-ефект зміни конформації ферменту при формуванні комплексу антиген-антитіло. По-друге, метод має одну стадію і не вимагає трудомістких і потребують часу етапів промивки. І нарешті, по-третє, метод вимагає мінімальних обсягів (8-50 мкл) і кількостей біологічного чи клінічного зразка. Однак у методу гіфа є один вкрай істотний недолік - на його основі можна створювати діагностичні тест-системи тільки для низькомолекулярних антигенів. Тільки, в цьому випадку антитіло, взаємодіючи з антигеном, може ефективно екранувати або модифіковані пов'язану з цим антигеном молекулу ферменту. Саме у зв'язку з цим, (незважаючи на уявну простоту і очевидні переваги перед іншими методами, на основі гіфа були створені діагностикуми для виявлення тільки гормонів, пептидів, лікарських і наркотичних речовин і деяких низькомолекулярних білків. Гетерогенний (твердофазний) імуноферментний аналіз (ТФІФА або ЕLISА) в останні роки особливо широко використовується в біології та медицині. Як і для інших твердофазних методів аналізу, характерною особливістю ТФІФА є те, що в процесі проведення аналізу один з учасників реакції антиген - антитіло мобілізують на твердому носії. Цю фіксацію антигену або антитіл можна здійснювати або шляхом їх ковалентного «пришивки» до полімерній або скляній матриці, або шляхом їх фізичної адсорбції на твердому носії за рахунок досить міцних сил електростатичного і ван-дер-ваальсових взаємодії. Ідея іммобілізації імунного комплексу важлива для аналізу багатокомпонентних сумішей макромолекул, коли в системі повинні залишатися тільки ті компоненти суміші, які володіють потрібними імунохімічних властивостями. Саме твердофазні методики дозволяють позбутися баластових, що не увійшли до імунний комплекс антигенів простий промиванням. Необхідно відзначити, що у своїй фізико-хімічної основі твердофазних ІФА дуже схожий з твердофазним РІА. Відмінність стосується лише індикаторних молекул - у ТФІФА це фермент, в твердофазном РІА це радіоактивні ізотопи. Решта ж принципи аналізу повністю збігаються - в обох методах використовується тверда матриця, на якій адсорбується імунний комплекс, та ідентичний спосіб видалення із системи не увійшли до комплексу компонентів діагностикуму. В даний час вже опубліковані огляди, докладно аналізують схеми проведення діагностичних досліджень з використанням методу твердофазного ІФА. Для виявлення в біологічних і клінічних зразках бактеріальних і вірусних антигенів особливо часто застосовується так званий сендвіч-метод або модифікований сендвіч-метод. При використанні цих методик на тверду підкладку (зазвичай полістирол) сорбуються послідовно первинні антитіла, що виявляються антиген і вторинні антитіла. У разі подвійного сендвіч-методу ферментна мітка вводиться до складу вторинних антитіл, у разі модифікованого подвійного сендвіч-методу вторинні антитіла (немічених) «проявляються» антивидові міченими ферментом імуноглобулінами. Особлива популярність останньої різновиди ТФІФА пояснюється тим, що для виконання методики немає необхідності синтезувати специфічні для кожного конкретного антигену кон'югати (мічені ферментом антитіла). В останні роки були розроблені методики ТФІФА, що використовують як «проявляють» кон'югатів молекулярні комплекси ферментів з білком А золотистого стафілокока. Як відомо, це білок взаємодіє з високою константою зв'язування з важкої ланцюгом (Fс-фрагментами) імуноглобулінів. Це дозволяє побудувати діагностичні системи, де - в якості «виявляє» агента використовуються не антивидові антитіла, а білок А. У цьому випадку, однак, виникають деякі труднощі, пов'язані з неспецифічністю білка А, який взаємодіє з Fс-фрагментами будь-яких антитіл. Якщо використовувати звичайну сендвіч-методику, замінивши лише антивидові кон'югат на кон'югат на основі білка А, останній буде взаємодіяти не тільки зі вторинними антитілами, але і з первинними імуноглобулінами, даючи позитивну реакцію, навіть якщо проба не містить шуканого антигену. У цьому випадку є кілька варіантів розв'язання проблеми. По-перше, в якості первинних антитіл в методиці можна використовувати імуноглобуліни, з якими білок А взаємодіє слабко (наприклад, з мишачим імуноглобулінами). По-друге, можлива пряма адсорбція антигену на полістирол, коли первинні антитіла просто не використовуються. І, нарешті, в якості первинних антитіл можна застосовувати не повні молекули імуноглобулінів, а молекули, позбавлені Fс-фрагментів, - так звані Раb 2-фрагменти. У цьому останньому випадку додатковим зручністю методики буде те, що для конструювання діагностичної системи можна буде використовувати не дві сироватки, отримані від різних тварин, а одну. Саме у зв'язку з цими обставинами в даний час розроблено і розробляється велика кількість діагностичних методик, що використовують кон'югати на основі білка А. Побудова діагностикумів для серодіагностики бактеріальних і вірусних захворювань, виявлення та ідентифікація з їх допомогою антитіл в біологічних і клінічних зразках проводиться аналогічним чином. Зазвичай готується так званий імуносорбент - антиген, іммобілізований на твердому носії (або за рахунок його прямої сорбції на тверду матрицю, або за рахунок ковалентного «пришивки» до цієї матриці, або за рахунок иммуносорбции на іммобілізовані первинні антитіла). Потім досліджувана сироватка, яка містить або не містить виявляються антитіла, контактує з імуносорбент. Ступінь адсорбції специфічних до іммобілізованим антигену імуноглобулінів зазвичай визначається за допомогою антивидових кон'югатів. Використання антивидових антитіл до різних класів імуноглобулінів дозволяє виявити в досліджуваному зразку не тільки специфічні до використаного антигену антитіла, але й провести їх ізотіповой аналіз. Конкретні методики діагностики та серодіагностики захворювань бактеріальної та вірусної природи, що використовують імуноферментні підходи, відрізняються багатьма параметрами, зокрема, типом і формою адсорбенту, на якому мобілізують імунний комплекс. Як твердофазного носія може використовуватися цілий ряд полімерів: поліметилметакрилат., І нейлон, тефлон, поліпропілен та ін Однак найчастіше в ролі адсорбенту в даний час застосовується полістирол і полівінілхлорид. Для зручності проведення аналізу ці адсорбенти виробляються у вигляді многолуночних плашок, кульок або паличок. Використання плашок, виготовлених з оптично прозорого полістиролу або полівінілхлориду дозволяє проводити всі операції ТФІФА, включаючи кінцеве фотометрирование хромофорной субстратної суміші. Не менш істотною перевагою полістиролових плашок перед іншими формами адсорбенту є можливість автоматизації практично всіх операцій аналізу, включаючи трудомісткі етапи промивання лунок та внесення до них однотипних реагентів. Слід зазначити, що використання полістиролових плашок для цілей ТФІФА має і деякі недоліки - високі вимоги до чистоти полімерного матеріалу і точності виготовлення плашок і нерентабельність їх використання для поодиноких аналізів. Велику увагу при постановці ТФІФА зазвичай приділяється правильному вибору фермент-субстратної системи. У сучасних діагностичних імуноферментних тест-системах використовується велика кількість різноманітних ферментів та субстратів. Вибір тієї чи іншої фермент-субстратної пари для використання в конкретній тест-системи на основі ТФІФА диктується декількома міркуваннями. По-перше, звертається увага на стабільність у процесі аналізу і зберігання як вкрай чутливого до структурних внутрішньомолекулярним перебудовам кон'югату, так і в багатьох випадках світлочутливого хромофорного або флуорохромного субстрату. По-друге, це відсутність використовуваного в диагностикуме ферменту або субстрату (вільного чи зв'язаного) в біологічних або клінічних зразках, які належить аналізувати. По-третє, наявність відповідної реєструючої апаратури (спектрофотометра або спектрофлуоріметри). І, нарешті, по-четверте, вибір тієї чи іншої фермент-субстратної пари диктується природним бажанням експериментатора чи клініциста мати на руках систему, що володіє максимальною специфічністю і чутливістю. Таблиця: Фермент-субстратні системи, найбільш часто використовувані в твердофазном ІФА Фермент Субстрат Спосіб Довжина хвилі спостереження (Н / м) Чутливість нг / зразок Лужна фосфатаза

* Для фотометричних вимірів вказані лише найбільш часто використовувані довжини хвиль спостереження; для флюорометричних вимірювань - довжини хвиль флюоресценції і збудження (у дужках).

Специфічність діагностичної системи не залежить від вибору фермент-субстратної пари і визначається в основному чистотою і гомогенністю використовуваних при конструюванні діагностикуму препаратів антигенів і антитіл. Використання в ТФІФА НЕ гетерогенних антиген-утримуючих препаратів і навіть не очищених бактерій і вірусів, а індивідуальних бактеріальних і вірусних білків - ось єдиний, хоча і трудомісткий шлях підвищення специфічності діагностичних систем. Те ж можна сказати і про препарати, що використовуються в ТФІФА імуноглобулінів, - бажано використовувати не цілісні сироватки і навіть не сумарні гаммаглобуліновие фракції цих сироваток, а аффінноочіщенние або моноклональні антитіла.

Особливою популярністю в цей час у нас в країні користуються імуноферментні кон'югати на основі пероксидази хрону. Це, ймовірно, сіязано з доступністю сировини для виділення цього ферменту, щодо легкістю очищення, досить високою стабільністю, і великим числом хромофорних і флуорохромних субстратів .. Проте слід підкреслити, що два інших досить часто використовуються в ТФІФА ферменту - лужна фосфатаза і -галактозидаза - у деяких випадках мають цілий ряд переваг перед пероксидазою. Це, по-перше, висока стабільність, розчинність і нетоксичність субстратів, а, по-друге, можливість використання відносно недорогих флуорохромних субстратів, застосування яких різко підвищує чутливість аналізу.

Певне значення для реалізації максимальної чутливості ТФІФА має правильний вибір субстрату. Поряд з природним бажанням використовувати субстрати з високою питомою хромофорной активністю (високий коефіцієнт молярної екстинкції забарвленого кінцевого продукту) необхідно брати до уваги такі важливі фактори, як рвстворімость субстрату та продуктів його ферментативної модифікації в умовах проведення аналізу та стабільність цих субстратів при зберіганні і в процесі експерименту .

Чутливість діагностичних систем на основі ТФІФА лише частково залежить від типу обраної при конструюванні діагностикуму фермент-субстратної пари. В основному ця чутливість визначається іншими чинниками, які важко врахувати: способом синтезу кон'югату, гомогенністю і питомою активністю використовуються для такого синтезу антитіл і антигенів, а також численними па.раметрамі проведення аналізу (способом іммобілізації що виявляється антигену або антитіл, ступенем їх солюбілізаціі в біологічному чи клінічному зразку і т. д.). Саме у зв'язку з цим у літературі наводиться такий широкий діапазон меж чутливості для вже розроблених методик ТФІФА. На підставі аналізу цих даних важко рекомендувати при конструюванні новостворюваних твердофазних імуноферментних систем найкращий фермент і наулучшій субстрат. Слід лише зазначити, що з допомогою використаних раніше фермент-субстратні пар метод ТФІФА дозволяє виявити в досліджуваному зразку нанограммовие кількості антигену при використанні хромофорних субстратів і пікограммовие кількості антигену при застосуванні флюорохромних субстратів.

Якщо при конструюванні нової системи на основі ТФІФА неможливо або небажано використання комерційних універсальних кон'югатів (антивидових фермент-мічених антитіл), то постає питання про синтез кон'югату на основі вибраних ферменту і антитіл. Як вже зазначалося, найбільш специфічні і високоактивні кон'югати можуть бути отримані на основі тільки максимально очищених білкових інгредієнтів. Однак у зв'язку з відносною складністю і трудомісткістю робіт з ретельного очищення бактеріальних і вірусних антигенів в даний час при розробці імуноферментних систем часто використовуються або цільні сироватки, або сумарні фракції імуноглобулінів, що містять у своєму складі як специфічні, так і баластні антитіла. Антигени також часто не піддаються належної очищенню і використовуваний при конструюванні діагностикуму білок становить лише невеликий відсоток від сумарного білка. У зв'язку з цим різко підвищується ймовірність неспецифічних реакцій, особливо небезпечних за високої чутливості, якою володіють ІФ-методики.

Велике значення для успішного використання ТФІФА в мікробіологічних і вірусологічних дослідженнях має правильна інтерпретація отриманих результатів. Це особливо важливо при використанні клінічного матеріалу, коли поняття «контроль» і «досвід» часто визначаються з великою часткою суб'єктивізму. Для тестування позитивних проб спочатку ставлять 6-8 тестів на зразках, узятих від явно здорових людей і визначають середню оптичну щільність контролю і стандартне відхилення при природному розкиді даних за рахунок різних методичних похибок. Проба зазвичай вважається позитивною, якщо відхилення її оптичної щільності від контролю в 3 рази перевищує стандартне.

Иммуносенсор

Вперше принцип імуносенсором був використаний М. Аizawа і співавт. (1977), коли вони сконструювали мембрану, здатну на імунологічний відповідь. В даний час опубліковано кілька повідомлень про використання аналогічного підходу для визначення різних мікробних антигенів або антитіл до них [Horbach Є. еt аl, 1989, Parry R. еt аl., 1990].

Принцип методів, заснованих на іммуносенсорной технології, полягає у зміні фізико-хімічних властивостей мембрани або іншого носія, пов'язаного з антитілами або антигенами. Зменшення мембранного потенціалу, зміна оптичних або хімічних властивостей середовища, що прилягає до носія, виявляються за допомогою спеціального електрода або оптичного пристрою і виражаються у вигляді електричного сигналу.

Існує два основних типи імуносенсором, що розрізняються за особливостями визначення реакції антиген - антитіло. 1 тип - так званий немічених иммуносенсор. Такий пристрій складається з металевого електроду для потенціометрії, покритого напівпроникною полімерною мембраною з іммобілізованими на ній молекулами антитіл (або антигену). У результаті реакції з шуканим комплементарним речовиною утворюються імунні комплекси на поверхні мембрани. Це призводить до зміни заряду мембрани і її поверхневого потенціалу. Зміна різниці потенціалів і визначається електродом.2 тип - мічений иммуносенсор. У цьому випадку на мембрані також мобілізують антитіла або антиген, але реакція визначається по зміні провідності (амперметр). Для цього використовують кисневий електрод, що реагує на зміну концентрації О ₂ після реакції антитіл з антигеном, міченим ферментом (наприклад, каталазою). Конкуренція шуканого антигену з відомою кількістю міченого кон'югату дає зміну провідності розчину в області мембрани, що реалізується у вигляді електричного сигналу на виході електрода. В іншій модифікації результат кольоровий ферментативної реакції може бути визначений і за допомогою оптичного пристрою.

Для оцінки результатів реакції у двох описаних типах імуносенсором значно рідше використовують п'єзоелектричний ефект, вимірювання температурних коливань і деякі інші способи, менш розроблені в порівнянні з електрохімічними і оптичними.

Особливістю імуносенсором, що відрізняє їх від інших систем імунохімічної діагностики, є те, що інформація про виникнення імунного комплексу безпосередньо реалізується у вигляді фізичного сигналу - зміни різниці потенціалів, оптичної щільності, сили струму і т. п.

Одним з перших застосувань імуносенсором було вимірювання кількості антитіл при сифілісі. Для цього на напівпроникною мембрані електрода пов'язували антигени трепонеми і инкубировали його в розчині сироватки крові. Зміни різниці потенціалів спостерігали аж до розведення позитивної контрольної сироватки 1:800, причому, збільшення сигналу відповідало підвищенню концентрації антитіл. Важливо те, що після відмивання иммуносенсор можна використовувати знову. Аналогічний підхід був застосований для визначення антитіл іншої специфічності (до групових антигенів крові) і альбуміну. Більш складну будову імуносенсора збільшує чутливість аналізу. Так при використанні міченого імуносенсора досягається чутливість до 0,1 нг білка / мл. Є дані про визначення таким методом HBs-антигену з допомогою I-електрода і антитіл до HBs-антигену, мічених пероксидазою [Аizawа М., 1987]. Пристрій, що включає скляну матрицю, активовану різними вірусними антигенами (біочіп) було використано для серологічної діагностики вірусних захворювань [Ноrbach Є. еt аl., 1989]. Зроблені спроби визначати за допомогою імуносенсором продукти синтезу деяких грибів (охратоксин А), клітини С. Albicans.

Хоча в даний час відсутні комерційні зразки імуносенсором для діагностики інфекційних захворювань, слід звернути увагу на основні етапи використання подібних пристроїв.

Досвід використання аналогічних систем для визначення глюкози в крові, гормонів, низькомолекулярних речовин дозволяє розділити процес аналізу на три етапи:

1 - підготовка зразка для аналізу

Деякі типи імуносенсором здатні взаємодіяти безпосередньо з біологічним матеріалом. Однак найчастіше використовується заздалегідь відокремлена центрифугуванням плазма або сироватка крові, розведення спеціальним розчином.

2 - проведення аналітичної процедури

Помістивши краплю розчину на мікроелектрод, або опускаючи електрод в досліджуваний зразок, створюється контакт реагентів. Час досягнення рівноваги від декількох секунд (для низькомолекулярних речовин) до декількох хвилин (для високомолекулярних агентів, антигенів, клітин). Результат визначається по різниці в показаннях з референс-електродом або щодо зміни сигналу після реакції. Результат може бути виражений в систематичних одиницях (мілівольт, міліампер), або за допомогою мікропроцесора трансформований в одиниці концентрації шуканого агента, у відповідності з попереднім калібруванням.

3 - регенерація імуносенсора

Для повторного або багаторазового використання імуносенсора необхідно звільнити його робочу поверхню від речовин, активно чи пасивно сорбованих в ході аналізу. Найбільш простий спосіб регенерації полягає в інтенсивному послідовному промиванні імуносенсора розчином з кислим значенням рН і буферним розчином з високою іонною силою. Для деяких типів імуносенсором до цих пір не знайдено оптимальних умов регенерації, не знижують їх чутливість. У цих випадках використовують змінні одноразові мембранні елементи.

Найближчим часом будуть створені надійні портативні иммуносенсор для діагностики найбільш поширених інфекційних захворювань, як це зроблено вже для аналізаторів глюкози.

МЕТОДИ генного ЗОНДУВАННЯ

Інтенсивний розвиток молекулярної біології і створення досконалої методичної бази генетичних досліджень стали основою генетичної інженерії. В області діагностики виникло і бурхливо розвивається напрям з визначення специфічних нуклеотидних послідовностей ДНК і РНК, так зване генне зондування. В основі подібних методик лежить здатність нуклеїнових кислот до гібридизації - освіті двохланцюжкової структур за рахунок взаємодії комплементарних нуклеотидів (А-Т, Г-Ц). Для визначення шуканої послідовності ДНК (або РНК) спеціально створюється, так званий, зонд полинуклеотид з певною послідовністю підстав. У його склад вводять спеціальну мітку, що дозволяє ідентифікувати освіта комплексу. Схема реакції представлена ​​на малюнку.

Рис. Схема реакції генного зондування для виявлення в зразках ДНК або РНК мікроба специфічним міченим зондом.

Хоча генне зондування не можна віднести до методів иммунохимического аналізу, основний його принцип (взаємодія комплементарних структур) методично реалізується тими ж способами, що і індикаторні методи иммунодиагностики. Крім того, методи генного зондування дозволяють заповнити інформацію про інфекційне агента у відсутності його фенотипической експресії (віруси, вбудовані в геном, «мовчазні» гени).

Перші повідомлення про використання зондів були пов'язані з суто дослідницькими завданнями молекулярної біології - контролем наявності тих чи інших послідовностей ДНК в загальному пулі клітинної ДНК. Розрізняють декілька різновидів генного зондування: гібридизація по Саузерн (аналіз ДНК), Nothern-блот (аналіз РНК), точкова гібридизація, гібридизація in situ. (На зрізі, в мазку)

Для проведення аналізу ДНК пробу піддають денатурації з метою отримання одноцепочную структур, з якими і реагують молекули ДНК-або РНК-зонда. Для приготування зондів використовують або різні ділянки ДНК (або РНК), виділені з природного джерела (наприклад, того чи іншого мікроорганізму), як правило представлені у вигляді генетичних послідовностей у складі векторних плазмід, або хімічно синтезовані олігонуклеотиди. У деяких випадках як зонд застосовують препарати геномної ДНК, гідролізований на фрагменти, іноді - препарати РНК, особливо часто - рибосомальная РНК [Stull T.1988].

У якості мітки використовують ті ж індикатори, що і при різних видах иммунохимического аналізу: радіоактивні ізотопи, флуоресцеїну, біотоп (з подальшим проявом комплексом авидин-фермент) і т. п.

Порядок проведення аналізу визначається властивостями наявного зонда. У дослідницьких лабораторіях використовують ДНК-зонди, приготовані самостійно і мічені, як правило, радіоактивним фосфором ⁽³² Р). В даний час все частіше застосовуються комерційні набори, що містять всі необхідні інгредієнти.

У більшості випадків процедуру проведення аналізу можна розділити на наступні стадії: підготовка зразків (у тому числі екстракція і денатурація ДНК), фіксація проби на носії (найчастіше - полімерний мембранний фільтр), предгібрідізація, власне гібридизація, відмивання незв'язаних продуктів, детекція. При відсутності стандартного препарату ДНК-або РНК-зонда попередньо проводиться її отримання і введення мітки.

Для підготовки проби може бути необхідно попереднє «подращивание» досліджуваного матеріалу для ідентифікації окремих колоній бактерій або збільшення концентрації вірусів в клітинній культурі. Проводиться і безпосередній аналіз зразків сироватки крові, сечі, уретральних зіскрібків, формених елементів крові або цільної крові на присутність інфекційного агента. Для звільнення нуклеїнових кислот зі складу клітинних структур проводять лізис клітин, а в деяких випадках очищають препарат ДНК за допомогою фенолу. Денатурація ДНК, тобто перехід її в одноцепочную форму, відбувається при обробці лугом. Потім зразок нуклеїнових кислот фіксують на носії - нітроцеллюлезной або нейлонової мембрані, звичайно шляхом інкубації від 10 хв до 4 год при 80 С ⁰ у вакуумі. Далі, в процесі предгібрідізаціі досягається інактивація вільних місць зв'язування для зменшення неспецифічного взаємодії зонда з мембраною. Процес гібридизації займає від 2 до 20 год, в залежності від концентрації ДНК в зразку, концентрації використовуваного зонду і його розміру.

Після закінчення гібридизації та відмивання незв'язаних продуктів проводиться детекція утворився комплексу. Якщо до складу зонда входить радіоактивна мітка, то для прояву реакції мембрану експонують з фотоплівкою (ауторадіографії). Для інших позначок використовують відповідні процедури. Наприклад, відомий метод визначення модифікованих ділянок ДНК за допомогою антитіл [Stollar В., Rashtchian А., 10987], введенням до складу зонда низкомолеку лярних компонентів (біотин, дигоксин і т. п.) з подальшим проявом кон'югатом авидин-фермент, антитіло - фермент [van Brunt J., Klausner A. 1987].

Перші повідомлення про комерційні зразках наборів для генного зондування з'явилися в 1986 р. - ними стали набори для визначення М.pneumoniae, L.pneumoniae. Потім з'явилися набори для ідентифікації інших патогенів, у тому числі - вірусу імунодефіциту людини.

В даний час ведуться інтенсивні розробки щодо спрощення процедури генного зондування до однієї - двох стадій процесу. Зроблені спроби відмовитися від сорбції матеріалу на мембрані [Edelstein Р., 1986].

Найбільш перспективним є отримання нерадіоактивних (так званих - холодних) зондів. На цій же основі розвивається методика гібридизації, що дозволяє встановлювати наявність патогена в препаратах зрізів, пунктатів тканини, що особливо важливо при патоморфологическом аналізі (гібридизація in situ).

Істотним етапом у розвитку методів генного зондування з'явилося використання полімеразної реакції ампліфікації (РCR). Цей підхід дозволяє збільшити концентрацію певної (заздалегідь відомою) послідовності ДНК в пробі за рахунок синтезу численних копій in vitro. Для проведення реакції до досліджуваного зразка ДНК додають препарат ферменту ДНК-полімерази, надлишок дезоксинуклеотидов для синтезу і, так звані, праймери - два типи олігонуклеотидів величиною 20-25 підстав, відповідних кінцевим ділянкам цікавить послідовності ДНК. Один з праймерів повинен бути копією початку ділянки зчитування кодує ланцюга ДНК при направленні зчитування 5-3, а другий - копією протилежного кінця некодирующей ланцюга. Тоді при кожному циклі полімеразної реакції відбувається подвоєння кількості ДНК-копій.

Для здійснення зв'язування праймерів необхідна денатурація ДНК (плавлення) при 94 ° С з наступним доведенням суміші до 40-55 ° С. У першому повідомленні, що описує метод, полімеразу додавали знову після кожного взаємодії праймерів з ДНК, так як фермент не витримував нагрівання до 94 ^0. В даний час найчастіше використовують ДНК-полімеразу термофільною бактерії Т.aquaticus, що витримує таку температуру і має максимум активності при 7 () ° С.

Для проведення реакції сконструйовані програмовані інкубатори мікропроб, що дозволяють легко чергувати зміни температури, оптимальної для кожного етапу реакції.

Реакція ампліфікації дозволяє істотно підвищити чутливість аналізу при генному зондуванні, що особливо важливо при низькій концентрації інфекційного агента. Особливе значення цей підхід набув при діагностиці СНІДу та деяких інших вірусних інфекцій. Причому в цих випадках вперше була показана можливість ампліфікації і для РНК-вмісних вірусів (безпосередньо, або через провірусну ДНК) [Реаkе I., 1989].

Одним з істотних переваг генного зондування з ампліфікацією є можливість дослідження субмикроскопической кількості патологічного матеріалу. Так вже показана можливість генетичного аналізу матеріалу єдиною волосяний сумки, взятої з людської шкіри, або декількох десятків буккальниє клітин, отриманих простим полосканням порожнини рота [Lench N. еt аl., 1988].

Іншою особливістю методу, більш важливою для аналізу інфекційного матеріалу, є можливість виявлення прихованих (молчащих) генів. Наприклад, виявлення гена холерного токсину у штамах без його фенотипического прояви, дозволяє зробити важливі висновки при епідеміологічному аналізі [Гінцбург А. Л., 1988].

Методи, пов'язані з використанням генного зондування безумовно, будуть більш широко впроваджуватися в практику діагностики інфекційних захворювань у міру їх спрощення і здешевлення.

Імуноелектрофорез і иммуноблоттинга

Імуноелектрофорез допомагає ідентифікувати антигени по електрофоретичної рухливості, особливо в тому випадку, коли в зразку присутні й інші антигени. За допомогою даного методу в клінічній імунології напівкількісне визначають концентрацію імуноглобулінів і ідентифікують мієломні білки.

На основі поєднання електрофорезу з іммуноперціпітаціей розроблено кілька вдалих

методів, в кожному з яких переміщення антигену в електричному полі призводить до його контакту з антитілами. Зустрічний імуноелектрофорез може застосовуватися для визначення антигенів, що мігрують у агарі до позитивно зарядженого електроду. Даний метод займає менше часу і більш чутливий, ніж подвійна дифузія по Ухтерлоні. Його застосовують для ідентифікації антигенів вірусу гепатиту В і відповідних антитіл, антитіл до ДНК при системному червоному вовчаку, аутоантитіл до розчинним ядерних антигенів при колагенозах, а також антитіл (преціпітінов) до Aspergillus при алергічному бронхолегеневому аспергільозі. Ракетний електрофорез-це кількісний метод, який передбачає внесення антигену в гель, що містить антитіла. Лінія преципітації має форму ракети, довжина якої визначається концентрацією антигену. Як і зустрічний електрофорез, це-швидкий метод, але і тут антиген повинен переміщатися до позитивно зарядженого електроду. Таким чином, ракетний електрофорез підходить для білків, наприклад альбуміну, трансферину і церулоплазміну, в той час як концентрацію імуноглобулінів зазвичай визначають методом простої радіальної иммунодиффузии. Один з найбільш вдалих варіантів ракетного електрофорезу - двомірний або перехресний імуноелектрофорез Лорелла. При цьому на першому етапі суміш антигенів електрофоретичної поділяють в гелі агарози. Потім розділені білки знову змушують дифундувати в гелі під впливом електричного поля в іншому

Рис. Види імуноелектрофорез А-простий імуноелектрофорез; Б-зустрічний імуноелектрофорез; В - ракетний імуноелектрофорез; Г - двовимірний імуноелектрофорез. Стрілки - напрям рух АГ і АТ в електричному полі.

напрямі, перпендикулярному першому. Таким чином вдалося кількісно визначити кожен з антигенів суміші. Найбільш вражаючий приклад-це оцінка ступеня конверсії СЗ в інактивовану форму СЗс, що найчастіше відбувається при загостренні в сироватці хворих на системний червоний вовчак або синовіальної рідини уражених суглобів в гострій фазі ревматоїдного артриту, а також в інших випадках.

Імуноблотинг

Після поділу складної суміші білків методом електрофорезу в поліакриламідному або ага-розно гелі їх можна перенести з гелю на

Рис. Схема іммуноблотінга

мікропористу нітроцелюлозну мембрану. Далі неспецифічно пов'язані з мембраною антигени можуть бути ідентифіковані за допомогою мічених антитіл. Даний метод отримав широке поширення. Наприклад, він використовується для ідентифікації компонентів нейрофіламентів, які попередньо поділяють в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (ДСН).

Рис. Приклад іммуноблотінга

Зрозуміло, якщо антиген необоротно денатурируется ДСН, то така методика використовуватися не може. Якщо білки антісивороткк розділити ізоелектрофокусірованіем, а потім перенести (це і називається блотів) на мембрану, то за допомогою міченого антигену можна встановити і так званий спектротіп антисироватки, тобто визначити ізотип антитіл, що взаємодіють з даним антигеном.

Схема: Основні методи забарвлення в імуноблотінг (Western-blot).

Гель з досліджуваним зразком після електрофорезу

Перенесення розділених білків на мембрану

Визначення білків

Визначення антигену

Анніоние барвники

Біотіновие плашки для блотів

Барвники з колоїдного золота

Амідо чорний або Кумасі синій (R-250)

4 - хлоро - 1-нафтол (4CN)

Посилення забарвлення

Блок неспецифічних місць зв'язування

Інкубація зі специфічними антитілами

Інкубація з реагентом

Кон'югати пероксидази хрону

Кон'югати золота

Кон'югати лужної фосфатази

Кон'югати біотину, стрептовідін

4хлоро-1-нафтол, 3,3 '-діамін-бензидин (DAB)

Посилення

забарвлення

Хемілюмінесцентного визначення

5-бромо-4-хлоро-3-індол фосфат (BCIP),

нітросинім тетразолієм (NBT)

КРИТЕРІЇ ПОЗИТИВНИХ І НЕГАТИВНИХ РЕАКЦІЙ У лабораторної діагностики інфекційних захворювань

Проблема диференціації позитивного і негативного результату не є специфічною для медицини, а шляхи її вирішення лежать в області математичної статистики. Тим не менш, слід обговорити деякі практичні питання, з якими зустрічаються лікарі при використанні різних методів лабораторної діагностики, в тому числі - иммунохимического аналізу при інфекційних захворюваннях.

Основним протиріччям, що виникають при аналізі лабораторних даних і що призводить до вдосконалення відомих та розробці нових методів діагностики, є невідповідність між метою медичної діагностики як такої, тобто прагненням лікаря визначити, на що хворий пацієнт і метою того чи іншого методу (встановлення якого-небудь параметра внутрішнього середовища організму). Тому будь-який метод иммунохимического аналізу повинен розглядатися лише як частина загальної діагностичної процедури. Жоден з цих методів не може бути використаний поза клінічної інтерпретації. Хибнопозитивні або помилково негативні вия реакції при лабораторному аналізі мають значення не тільки для самого пацієнта. Така ситуація при СНІДі, наприклад, виявилася небезпечною і в соціальному і в епідеміологічному аспекті.

У лабораторному аналізі при характеристиці аналітичної процедури прийнято вказувати кількісні показники методу: чутливість, відтворюваність, точність та інших Проте за певних взаємодіях між організмом та інфекційним агентом може виникнути ситуація, коли високочутливий метод не дозволяє отримати достовірну інформацію про причину захворювання. Наприклад, визначення антитіл будь-якими досконалими методами не дає інформацію у разі вираженої імуносупресії гуморальної відповіді.

Для того, щоб висловити можливість використання симптому (результату иммунохимического аналізу) для діагностики певного захворювання можна визначити поняття чутливості і специфічності аналізу, у порівнянні з контрольною групою здорових людей, як частоту позитивних і негативних реакцій.

число позитивних реакцій у хворих з підтвердженим діагнозом

Чутливість =------------------------------------------------ ---------------------

число обстежених хворих з підтвердженим діагнозом

число негативних реакцій у контрольній групі

Специфічність = ------------------------------------------------ -------------------------

число обстежених пацієнтів у контрольній групі

Ці параметри можуть бути використані при порівнянні ефективності будь-яких методів. Проте для застосування їх на практиці необхідно уточнити принципи формування дослідної та контрольної груп, а також оцінити, яке значення мають обчислені параметри для оцінки випадково вибраних невідомих зразків. Правильне рішення зазначених питань і дозволяє перейти до розробки критеріїв позитивної та негативної реакції.

Для формування дослідної групи хворих з інфекційною патологією, як правило, використовують хворих, у яких виявлено шуканий інфекційний агент іншими методами - бактеріологічними, вірусологічними і т. п. У разі інфекції, спричиненої умовнопатогенними мікроорганізмами використовують кількісні або функціональні критерії. Залежно від цілей аналізу, група може бути більш-менш однорідної за іншими ознаками даного захворювання - особливостям перебігу та тяжкості інфекційного процесу, віком хворих, супутнього лікування (перш за все - введення антибіотиків).

Формування контрольної групи зі здорових осіб є найбільш частим, але не єдиним способом. Якщо аналізований метод буде застосований для диференціального аналізу _ подібних захворювань, що викликаються різними мікроорганізмами, більш важливим є підбір групи з захворюванням, яке слід виключити при встановленні діагнозу. Наприклад, при гострій пневмонії, викликаної різними збудниками (Str. Pneumoniae, H. influenzae) для оцінки чутливості та специфічності, наприклад, методу визначення антигенів пневмокока, слід сформувати контрольну групу з хворих із захворюванням, викликаним гемофільної палички. Вищевказане важливо враховувати при розробці методів діагностики. Однак і при використанні цих методів слід мати уявлення про причини виникнення і можливої ​​інтерпретації хибнопозитивних і псевдонегативних реакцій. При аналізі зразків від пацієнтів з невідомим діагнозом слід враховувати додаткові параметри, похідні від чутливості і специфічності аналізу.

Очікувана цінність Число позитивних результатів у дослідній групі

позитивного =------------------------------------------------ -------------------

результату Число позитивних результатів в обох групах

Очікувана цінність Число негативних результатів в дослідній групі

негативного =------------------------------------------------ -------------------

результату Число негативних результатів в обох групах

У цілому, чим вище чутливість та специфічність аналізу, тим вище цінність позитивного і негативного результатів. Однак для випадково взятих зразків значення очікуваної цінності результатів буде залежати від частоти даного захворювання в популяції (преваленс). Наприклад, при чутливості і специфічності методу рівних 99% і частоті захворювання 0,1% кількість хворих на 100 000 пацієнтів складе 100, з них позитивна реакція буде в 99. Однак у пацієнтів без даного захворювання (всього їх 99 900) буде в 100 випадках також виявлена ​​позитивна реакція. Таким чином, цінність позитивного результату складе 99 / (100 +99) 50%, а негативного - 99 80ОД99 800 +1) 100%. У разі ж, якщо в даній популяції частота захворювання вища, то і цінність позитивного результату вище. Наприклад, при частоті в 10%, відповідні значення цінності позитивного результату - 91,70 / 0, а негативного - 99,9%.

Чи впливає вибір критерію оцінки позитивного і негативного результату на чутливість і специфічність аналізу?

При оцінці того чи іншого методу діагностики лікар, як правило, користується критеріями, спеціально виробленими для даного методу, рідше - власним досвідом. В якості критерію встановлення позитивного або негативного результату може виступати параметр у вигляді концентрації речовини (у порівнянні з концентрацією в нормі). Можуть бути використані безрозмірні величини, що виражають ставлення визначається показника до нормальної величини. Іноді критерієм служать одиниці активності матеріалу і характеристики активності спеціально запроваджених мічених молекул (флуохроми, ізотопи і т. п.).

Найбільш часто визначення критерію позитивної реакції пов'язане з аналізом зразків з дослідної та контрольної груп, описаних вище. Визначення значень чутливості і специфічності при різних способах оцінки дозволяє виявити критерій, який відповідає максимальному значенню обчислених величин.

Принципове значення для визначення цих критеріїв має аналітична варіабельність методу, тобто величина розбіжності між значеннями, отриманими при багаторазових вимірах однієї і тієї ж проби. Допускається, що цей параметр повинен скласти не більше 10% середнього значення вимірюваної величини, але не більше 25% ширини інтервалу величин, отриманих у контрольній групі [Власов В. В., 1988].

Велика розмаїтість методів і реакцій, що застосовуються в імунохімічної аналізі відображає відмінності в течениии інфекційних процесів, різноманіття збудників і умов взаємодії між мікро-і макроорганізмом. Але також, як не може існувати єдиного засобу лікування всіх хвороб, немає панацеї і в діагностичному сенсі.

Отже, проведення аналітичних процедур при підозрі на інфекційне захворювання, повинне бути спрямоване на виявлення патогенного агента (вірусу, бактерії, найпростішого і т. п.), а також імунологічної відповіді макроорганізму на цей агент. Класична тріада Коха в переважній більшості випадків є недосяжним умовою діагностики вірусних та бактеріальних захворювань, у меншій мірі - паразитарних. Численні дослідження безсимптомного носійства вірусів і бактерій переконують у тому, що виявлення мікроба є лише однією з ознак, які повинні враховуватися лікарем при постановці діагнозу. Ситуацію ускладнюють часті змішані інфекції (асоціації типу вірус - вірус, бактерія - бактерія і вірус - бактерія). Крім того, імунна відповідь на інфекційний агент не у всіх випадках носить регулярний характер (первинні та вторинні імунодефіцити). З іншого боку, сучасна людина иммунизируется досить великою кількістю вакцин, що може маскувати розвиток супутньої інфекції. У зв'язку з цим, процес встановлення діагнозу, в тому числі за допомогою імунохімічних методів, слід розглядати як імовірнісний. Залучення додаткової інформації (розширення симптоматики) можна вважати способом збільшення ймовірності встановлення правильного діагнозу. Для інфекційних захворювань, не дивлячись на конкретний тип або вид збудника, можна назвати три основні процеси, які визначають ймовірність ідентифікації етіологічного агента:

- Наявність у макроорганізмі або на обмежують його покривах генетичного матеріалу мікроорганізму, продукти якого прямо або опосередковано ушкоджують функціональні структури макроорганізму;

- Визначення у макроорганізмі або на обмежують його покривах цих біологічно активних продуктів мікроорганізму, що призводять до прояву симптомів, характерних для даного захворювання;

- Зміна стану імунної системи макроорганізму під впливом мікробних продуктів, спрямоване на їх нейтралізацію.

Очевидно, що жоден з цих ознак не виявляється в 100% випадках у будь-якій стадії і різновиду інфекції певного типу. Так, на стадії одужання самі мікроби і багато їхніх продукти можуть не визначатися. Іноді розгорнута клінічна картина є наслідком впливу на макроорганізм мікроба, який швидко елімінується з організму. При цьому, в одних випадках неможливо достовірно визначити генетичний матеріал мікроба, а в інших - вже нейтралізований антигенний матеріал. Імунна відповідь, як вже зазначалося вище, може розвиватися лише за кілька діб після початку хвороби. Отже, у початковій стадії хвороби визначення, наприклад, наявності антитіл важко. Але тим не менш наявність протягом певного періоду часу одного, двох або всіх трьох розглянутих ознак пропорційно веде до збільшення ймовірності того, що даний мікроб є збудником. І навпаки, якщо жоден з цих ознак не спостерігається, то ця імовірність прагне до нуля.

Розглядаючи приклади використання різних методів для специфічної діагностики інфекційних захворювань можна відзначити, що комерційні препарати, які використовуються в світі для цих цілей, відносяться в основному до методів аглютинації, преципітації, нейтралізації вірусів, інгібування гемаглютинації, пасивної гемаглютинації, коагглютинации, латексагглютінаціі, реакції зв'язування комплементу, імунофлуоресценції, ІФА. Значно рідше для цих цілей використовують радіоімунологічних аналіз, метод генного зондування, а комерційні иммуносенсор і ліпосомальні методи ще тільки розробляються. Хоча в науковій літературі є повідомлення про різні види иммунохимического аналізу, описаних або не згадуються у цій главі, деякі методи стали загальноприйнятими.

Для бактеріальних інфекцій в деяких випадках зберігається використання методів прямої аглютинації бактерій для ідентифікації їх чистої культури (при респіраторних, кишкових інфекціях) або ухвала

Таблиця: Можливості використання комерційних препаратів для різних методів лабораторної діагностики при інфекціях у людини.

антитіл (кишкові інфекції), хоча значення цих реакцій у порівнянні з іншими більш чутливими, поступово знижується. Така ж закономірність спостерігається і при використанні методів прямої аглютинації при паразитарних захворюваннях.

Для вірусних інфекцій аналогом є метод прямої гемаглютинації. Однак, через його відносно невисокою специфічності, практично більш важливим є метод інгібування (гальмування) реакції гемаглютинації з метою визначення антитіл до вірусу. Для цих же цілей використовують метод нейтралізації вірусів, проте він більш трудомісткий через необхідність підтримки культури вірусу.

На зміну цим реакцій при бактеріальних, вірусних і паразитарних інфекціях приходять методи коагглютинации (визначення антигенів) і латексагглютінаціі (визначення антигенів, або антитіл). Ці методи знаходять все більш практичного застосування, особливо при діагностиці менінгітів, респіраторних і деяких кишкових інфекцій. Реакція пасивної аглютинації як і раніше популярна при діагностиці паразитарних захворювань, рідше при визначенні антитіл до вірусів (краснуха, мононуклеоз).

Реакція зв'язування комплементу використовується для визначення антитіл при більшості видів інфекцій, а особливо широко - при вірусних захворюваннях і хворобах, що викликаються рикетсіями, мікоплазмами і т. п. Однак в останнє десятиліття цей метод витісняється ІФА.

Імунофлюоресцентний метод для визначення антигенів і антитіл в силу своєї універсальності також поширений при різних видах інфекційної патології. У звичайних варіантах він заснований на мікроскопії і візуальному спостереженні. Це одночасно і недолік (суб'єктивна оцінка) і гідність (наочність), що значною мірою керує при його виборі лікарем, в залежності від цілей аналізу. Модифікації останніх років, засновані на інструментальному обліку, разом з ІФА тіснять інші імунохімічні методи.

Радиоиммунологический аналіз для діагностики інфекцій застосовується для підтвердження деяких форм гепатиту В, а також СНІДу. Розширення сфери його використання в практиці діагностики інфекційної патології мало ймовірно.

Імуноферментний аналіз для визначення антигенів і антитіл до мікроорганізмів знаходить все більш широке застосування в практиці. В даний час за частотою застосування він не поступається, а в багатьох випадках (гепатити, СНІД) перевершує інші методи иммунохимического аналізу. При бактеріальних, вірусних, паразитарних захворюваннях з його допомогою визначають різні антигени мікробів і антитіла до них, що відносяться до різних класів імуноглобулінів.

Практично важливим при виявленні антигена будь-яким методом иммунохимического аналізу є уявлення про природу шуканого антигену. У деяких випадках система аналізу орієнтована лише на певний тип антигену, характерний для певного типу інфекції. Наприклад, при діагностиці кашлюку можна визначати різні компоненти бактерії - ЛПС, різні білки і т. д. Однак найбільш істотно виявлення коклюшного токсину. Віруси, що викликають у людини СНІД (ВІЛ-1 і ВІЛ-2) мають спільні антигени з вірусами лейкозу великої рогатої худоби, але діагностично значуще визначати специфічні глікоп-ротеіни gp 24, gp 120 і т. д. Те ж відноситься і до визначення антитіл . При бактеріальному ендокардиті, що викликається S.aureus діагностично більш значущі антитіла до тейхоєвих кислот, а при респіраторній стафілококової інфекції - антитіла до поверхневих антигенів. При використанні того чи іншого набору для проведення імунологічного аналізу слід визначати для якого типу захворювання визначається ознака є інформативним, тобто збільшує ймовірність точного діагнозу.

Отже, в результаті розгляду всього розмаїття методів імунохімічної діагностики, можна зробити висновок, що необхідним є використання різних методів, оптимальний набір яких залежить від конкретної патології. Так для гострої респіраторної інфекції крім класичних бактеріологічного і вірусологічного аналізу можна рекомендувати метод латексагглютінаціі для визначення антигенів, імунофлуоресцентний метод для підтвердження, імуноферментний для визначення антитіл. При СНІД проводиться визначення вірусу і антитіл до нього імуноферментним методом (іноді скринінг - методом латексаг-глютінаціі) з підтвердженням імуноферментним (вестерн-блат), або радіоімунологічним методом.

Цілі безпосереднього аналізу диктують найбільш прийнятні варіанти обстеження і рівень складності методів. Для масового скринінгу необхідні прості, але надійні і чутливі методи (латексагглютінація, гомогенний ІФА, іноді РПГА), що дозволяють проводити десятки і сотні аналізів на добу. Для встановлення первинного діагнозу в поліклінічному лікувальному закладі, для аналізу зразків у лабораторії СЕС необхідні відносно прості методи, але з більш високими показниками чутливості (ІФА, РІА). При обстеженні пацієнта в спеціалізованій клініці комплекс таких методів повинен бути як можна більш широким, включаючи і тривалі спостереження динаміки розвитку процесу, іммуногістологіческій аналіз (у тому числі - імунофлуоресцентний), генне зондування і т. д.

Послідовне застосування викладених принципів, на наш погляд, дозволить найбільш ефективно використовувати переваги високочутливих та інформативних методів иммунохимического аналізу для діагностики інфекційних захворювань людини.

Список літератури:

1. Ройт А. "Основи імунології" Світ 1990

2. Керівництво "Імунологія інфекційного процесу" Москва 1994

3. В.Г. Галактінов "Графічні моделі в імунології" Медицина 1986

4. Р.В. Петров "Імунологія" Медицина 1987

5. А.М. Єгоров "Теорія і практика імуноферментного аналізу" Вища школа 1991

6. У.П. Коллінз "Нові методи імуноаналізу" Світ 1991

7. Каталог фірми Biorad 1996

8. Матеріали занять і лекції з мікробіології 1995 - 1996 рік.