Мікроорганізми виділені з різних природних жирів

АНОТАЦІЯ
ВИВЧЕННЯ СПРОМОЖНОСТІ МІКРООРГАНІЗМІВ деструктировать ЖИРОВІ речовин різної хімічної природи
Випускна кваліфікаційна робота (дипломна робота). ФСТД, 2005. 96 с., 14 рис., 13 табл., 84 джерел, 2 дод.
Об'єктом дослідження є мікроорганізми, виділені з різних природних жирів: нерпічьего, вовняного і мікроорганізми, виділені з стічних вод після проведення процесу знежирення.
Мета роботи - вивчення морфолого-культуральних та фізіологічних властивостей аборигенних мікроорганізмів, та дослідження їх деструктивної активності.
У результаті дослідження виділені колонії мікроорганізмів, визначено їх властивості, вивчена їх деструктивна здатність. Показана можливість застосування мікроорганізмів, що володіють липолитической активністю для біотехнологічного процесу знежирення хутряної овчини, шкурок єнота та білки.
Встановлено, що запропонований екобіотехнологіческій спосіб знежирення забезпечує оптимальне видалення жирових речовин з поверхні волосяного покриву і з кожевой тканини.
Розроблено маткові розчини для знежирення, що дозволяють проводити процес знежирення з меншою витратою синтетичних поверхнево-активних речовин, і виключенням з робочого складу формальдегіду і карбонату натрію.
Основні технологічні показники: виключення зі стічних вод формальдегіду, синтетичних поверхнево-активних речовин, скорочення витрати хімматеріалов.
Область застосування - для подальшого впровадження у виробництво.
Економічний ефект досягається за рахунок скорочення витрати хімматеріалов і зниження ступеня забруднення відпрацьованих розчинів.
Зміст
Введення
1 Літературний огляд. Жирові речовини і сучасні способи
їх видалення та утилізації
1.1 Структура жирових речовин
1.2 Сучасні методи знежирення
1.3 Очищення стічних вод від жирів
2 Об'єкти та методи дослідження
2.1 Об'єкти дослідження
2.2 Методи дослідження
2.2.1 Методика приготування живильних середовищ для культивування мікроорганізмів
2.2.2 Виділення чистої культури методом розведень
2.2.3 Посів на агаризованому середовища в чашки Петрі
2.2.4 Вивчення морфології бактерій
2.2.5 Методика вивчення культуральних властивостей
2.2.6 Метод роздавленої краплі
2.2.7 Визначення липолитической активності
2.2.8 Приготування бактеріальної суспензії
2.2.9 Визначення загальної кількості мікроорганізмів (КУО)
2.2.10 Визначення каламутності
2.2.11 Визначення кислотності
2.2.12 Визначення активної реакції середовища
2.2.13 Біуретова метод визначення білка по Ярош
2.2.14 Метод визначення протеолітичної активності (ПС) Вильштеттера і Вальдшмідт-Лейтц в модифікації
2.2.15 Визначення активності ліпази (ЛЗ) (модифікований
метод Ота, Ямада)
2.2.16 Визначення концентрації зважених речовин
2.2.17 Визначення вмісту органічних речовин
2.2.18 Відбір проб методом асиметричної бахроми
2.2.19 Визначення колористичних показників волосяного покриву
2.2.20 Визначення вмісту незв'язаних жирових речовин (ГОСТ 26129-84 Шкурки хутряні та овчина Шубна вироблені. Методи визначення незв'язаних жирових речовин)
3 Експериментальна частина. Вивчення здатності мікроорганізмів деструктировать жирові речовини різної хімічної природи
3.1 Відновлення та дослідження морфолого-культуральних властивостей мікроорганізмів, деструктуючих жирові речовини
3.2 Вивчення толерантності досліджуваних культур до факторів зовнішнього середовища
3.3 Проведення процесу знежирення хутряної овчини з застосуванням бактеріальної суспензії
4 Економічна частина. Розрахунок економічної ефективності екобіотехнологіческого процесу знежирення хутряної овчини
5 Безпека життєдіяльності
6 Охорона навколишнього середовища. Біологічне очищення стічних вод шкіряних та хутряних підприємств
Висновок
Список використаних джерел інформації
Додаток А Морфолого-культуральні властивості мікроорганізмів, деструктуючих жирові речовини
Додаток Б Акти про виробничих випробуваннях
Введення
Застосування мікробіологічних технологій у світі набуває все більшого поширення. Як свідчать аналітичні прогнози, одними з найбільш прогресуючих технологій нового тисячоліття, яке у більшості з нас асоціюється насамперед із комп'ютерами, надпотужними двигунами, автоматики і телемеханіки, будуть технології мікробіологічні. У них головними «машинами» служать живі істоти (бактерії, дріжджі, променисті і цвілеві гриби), мають такі маленькі розміри, що побачити їх неозброєним оком неможливо. Невидимі паралельні нашому світу організми всюди оточують нас. В даний час вимоги до продукції підприємств легкої промисловості зросли. Крім того підприємства повинні випускати конкурентоспроможну продукцію та забезпечити екологічну безпеку навколишнього середовища від можливих негативних наслідків, залишаючись кредитоспроможними і мати високі показники економічної ефективності виробництва. Все це веде до того, що керівники виробництва прагнуть впроваджувати ті технології вироблення, які дозволяють отримувати напівфабрикат з високими показниками якості, що відповідають ГОСТам, вироблений з мінімальними витратами праці, хімічних матеріалів і часу.
В даний час найбільш перспективним є використання біотехнологічних методів, заснованих на застосуванні мікроорганізмів, що дозволить зменшити рівень токсичного забруднення утворюються стічних вод. Можливість застосування препаратів на основі прокаріотів для технологічних процесів хутрового виробництва дозволить значно знизити кількість детергентів і ксенобіотиків у стічних водах, за рахунок первинного їх скорочення при виконанні технологічних процесів.
У зв'язку з цим метою роботи було вивчення мікробної деструкції жирових речовин, що містяться у волосяному покриві і кожевой тканини овчинно-шубного, хутряної сировини та розробки технологічної карти проведення біотехнологічного знежирення.
1 Літературний огляд. Жирові речовини і сучасні способи їх видалення та утилізації
Жири дуже поширені в природі. Вони являють собою суміш різних за складом тригліцеридів жирних кислот. З усіх відомих ліпідів жири є найбільшою групою [1].
У натуральних жирах міститься близько 95-97% гліцеридів жирних кислот, а після рафінації зміст їх підвищується до 98,5-99,5%. До складу суміші входить також деяку кількість супутніх речовин - фосфатидів, стеринів, восків, продуктів гідролізу гліцеридів та ін [2].
Таку складну суміш у природних жирах, що виконує важливу фізіологічну та біохімічну роль в живих організмах, називають ліпідами.
Ліпіди погано розчиняються у воді, але добре розчиняються в більшості гідрофобних органічних розчинників. Виняток становлять фосфоліпіди, які на відміну від гліцеридів погано розчиняються в ацетоні. Ліпіди взаємно розчиняються і при витягу з тканин рослин і тварин організмів вони разом складають продукт, званий сирим жиром [3].
Жири є одним з основних продуктів харчування. Вони служать також основною сировиною для жіроперерабативающей промисловості у виробництві мила, оліфи, гліцерину, використовуються як добавки до лікарських засобів, для будівельних розчинів, бетону, а так само широко використовуються в шкіряно-хутряної промисловості.
Жири входять до складу тваринних і рослинних організмів. У рослин жир міститься головним чином у насінні, причому у злакових - у зародку. Вміст жиру в насінні різних рослин коливається в широких межах [4].
Мікробна ліпаза здатна гідролізувати тваринні жири, рослинні олії, а також синтетичні моно-, ди-і тригліцериди. Синтетичні тригліцериди є кращими субстратами для багатьох мікробних ліпаз.
При мікробній деструкції жирові речовини розпадаються до гліцерину та вищих жирних кислот, включаючись в подальшому в цикл трикарбонових кислот і утворюючи кінцеві продукти розпаду: вуглекислий газ і воду [5].
Структура жирових речовин
Жири є речовинами нелетучими і при нагріванні до 250-300 ° С розкладаються з утворенням летких речовин, що виділяються у вигляді пари, газів і диму. Жири погані провідники тепла. У порівнянні з вуглеводами і білками вони мають вдвічі більшою теплотою згоряння. Так, 1 г жиру при повному згорянні виділяє 39,8 кДж тепла, тоді як така ж кількість вуглеводів - 17,2, білків - 23,0 кДж. Жири належать до речовин з низьким поверхневим натягом (для більшості жирів 30 '10 ^-3 -37' 10 ^-3 Н / м на кордоні з повітрям; для води - близько 73 '10 ^-3 Н / м). Завдяки невеликій поверхневому натягу жири можуть проникати в капілярні канали, чим пояснюється підйом їх по гноті свічки та освіта прозорого масляної плями на папері. Жири погані провідники електрики. Їх електропровідність збільшується при прогоркании і при зростанні вмісту жирних кислот [1].
Класифікацію жирів виробляють за різними ознаками. У першу чергу їх поділяють в залежності від природи їх походження на жири тварин і рослинні. Кожна з цих груп залежно від кількісного вмісту твердих гліцеридів, підрозділяється на жири рідкі при нормальній температурі (20 ° С) і жири тверді. Жири тваринного походження поділяють на:
а) жири наземних тварин;
б) жири молока;
в) жири птахів;
г) жири морських тварин і риб;
д) жири земноводних і плазунів. [6].
Ліпіди - велика група природних речовин, різноманітних за хімічною структурою та фізико-хімічними властивостями. Є кілька трактувань поняття ліпіди і різних схем їх класифікації, заснованих на властивостях цих речовин. Загальна властивість ліпідних сполук - здатність розчинятися в ефірі, хлороформі та інших органічних розчинниках (але не в воді) [7].
Ліпіди за будовою можна підрозділити на дві великі групи. 1. Прості ліпіди, або нейтральні жири, представлені у більшості організмів ацетілгліцерінамі, тобто гліцериновим ефірами жирних кислот (вільні жирні кислоти зустрічаються в клітинах лише як мінорний компонент). 2. Складні ліпіди, до яких відносяться ліпіди, що містять фосфорну кислоту в моно - або діефірной зв'язку, - це фосфоліпіди, до числа яких входять гліцерофосфоліпіди і сфінголіпіди. До складних ліпідів відносяться з'єднання, пов'язані глікозидної зв'язком з одним або двома залишками моносахаридів, або гліколіпіди, а також сполуки стероїдної і изопреноидной природи, у тому числі каротиноїди [8].
Перший доказ того, що ліпіди містять фізіологічно необхідні для вищих тварин з'єднання, отримано в 1926 р. голландськими дослідниками Іванс і Буром. ). Дещо пізніше було встановлено, що цими сполуками є полінасичені жирні кислоти (лінолева, ліноленова і арахідонова) - фізіологічно необхідні для більшості живих організмів (вітамін F).
У подальшому було встановлено, що і в клітинах мікроорганізмів ліпіди виконують самі різні біологічні функції. Вони входять до складу таких відповідальних структур, як клітинна мембрана, мітохондрії, хлоропласти та інші органели. Ліпопротеїнових комплекси відіграють важливу роль у процесах метаболізму. З ними значною мірою пов'язані активний перенесення різних речовин через прикордонні мембрани і розподіл цих речовин всередині клітини. Зі складом ліпідів пов'язані такі властивості організмів, як термотолерантность і термофильность, Психрофільні, кислотоустойчивость, вірулентність, стійкість до іонізуючої радіації та інші ознаки. Крім того, ліпіди можуть виконувати функцію запасних продуктів. До таких належать, полі-β-гідроксімаслянная кислота, утворена багатьма бактеріями, і ацетілгліцеріни, зокрема тріацетілгліцерін, що накопичуються у великих кількостях деякими дріжджами та іншими представниками грибів [9].
До складу природних ліпідів входять залишки довголанцюгових спиртів з парним числом атомів вуглецю. Крім того, вищі спирти, які беруть участь в утворенні молекул ліпідів, частіше за все мають неразветвленную вуглецевий ланцюг і можуть бути як насиченими, так і ненасиченими. -инозит) – шестиатомный циклический спирт, найден в составе липидов растительных и животных тканей. Найбільш поширені такі види спиртів: гліцерин - трьохатомний спирт, найбільш широко зустрічається поліоли в ліпідах, входить до складу нейтральних ліпідів і фосфоліпідів; діоли - двоатомні спирти, виявлені і виділені з різних природних джерел, входять до складу полярних ліпідів, поширені значно менше, ніж гліцерин; міоінозіт (мезоінозіт, i-інозит) - шестиатомний циклічний спирт, знайдений у складі ліпідів рослинних і тваринних тканин.
У складі ліпідів різного походження знайдені різноманітні вуглеводні молекули, що відносяться до різних класів моносахаридів: гексози, аміногексози, дезоксігексози та ін [10].
Розпад нейтральних ліпідів відбувається за рахунок гідролітичного дії ліпаз. Розпад призводить до утворення гліцерину і жирних кислот, іноді фосфатів і аміноспиртів.
Гліцерин, що утворюється в цій реакції, фосфорилюється до гліцерил-1-р, дегидрирующей до діоксіацетон-р і бере участь далі у процесах гліколізу.
Найбільш важливу роль під час розпаду органічних речовин відіграють ферменти - біокаталізатори, що утворюються в клітці і які становлять або прості білки, або складні, які містять не амінокислотні компоненти. Коферменти часто беруть участь у переносі електронів або функціональних груп. Як і вітаміни, вони входять в якості необхідного компонента в їжу і не можуть синтезуватися принаймні, в органах вищих організмів.
При розпаді жирних кислот в результаті β-окислення на першій стадії, жирні кислоти активуються реакцією з коферментом А (НS-CoA) у присутності молекули аденозинтрифосфату (АТФ). Утворений ацил-СоА поступово окислюється за допомогою дегідрогеназ і гідротаз до β-окси і β-кетокислот, з яких молекула ацетил-СоА («активна оцтова кислота») утворюється під дією іншої молекули коферменту СоА з вільною SH-групою. Таким чином, молекула жирної кислоти розпадається в кінці кінців до продуктів, що мають лише два вуглецевих атома, які перетворюються в циклі трикарбонових кислот.
Ацетил-СоА є ключовим проміжним з'єднанням у перетворенні всіх поживних речовин. Утворюється в аеробних умовах з цукрів, амінокислот, ліпідів (при β-окислюванні і при гидролитическом розпаді гліцерину).
Відновлені коферменти поступово окислюються в дихальному ланцюзі з поступовим освітою макроергічних фосфатів. З точки зору утворення АТФ, окислення жирних кислот становить основний енергетичний резерв організму. Якщо для еукаріотів β-окислення відбувається в мітохондріях, то для прокаріотичних організмів цей процес протікає в цитоплазматичної мембрани [11].
В організмі жири локалізовані в жирових клітинах і характеризуються високою швидкістю метаболізму. Наведемо реакцію β-окислення жирних кислот:
С H 3- CH = C ( CH 3)- COSCoA CH 3- CH ( OH )- C ( CH 3)- COSCoA CH 3- CO - C ( CH 3)- COSCoA ^- OOC - CH ( CH 3)- COSCoA ^- OOC - CH 2- CH - COSCoA Сукцинат Н3С-СН2-СН2 (СН3)-СВ SCoA З H 3 - CH = C (CH 3) - COSCoA CH 3 - CH (OH) - C (CH 3) - COSCoA CH 3 - CO - C (CH 3) - COSCoA ^- OOC - CH (CH 3) - COSCoA ^- OOC - CH 2 - CH - COSCoA Сукцинат
У кінцевому підсумку жирна кислота окислюється до сукцинату [12].
У цілому, окислення ліпідів можна представити наступною схемою, представленої на малюнку 1
Ліпіди

Жирні кислоти, гліцерин

Ацетил-СоА

Оксалоацетата Цитрат

Малат Ізоцітрат
Фумарат α-кетоглутарату

Сукцинат
Малюнок 1 - Окислення ліпідів у циклі Кребса
Перша стадія в біосинтезі ліпідів, що містять жирні кислоти, - утворення ефірів жирних кислот і коферменту А. Весь гомологічний ряд жирних кислот з довгим ланцюгом, що містять парне число вуглецевих атомів, утворюється в результаті реакцій, званих Малоні-СоА. У цих реакціях до вихідної молекулі ацетил-СоА послідовно додається ланка С-2. Наведемо сумарну реакцію синтезу пальмети-СоА:
7СООН-СН _{2-СО-SКоА} + 14НАДФН ₂ СН ₃ (СН _{2) 14} СООН +
+ 7СО ₂ + 8КоАSН + 14НАДФ + 6Н ₂ О
При першій реакції утворюється Малоні-СоА (шляхів синтезу декілька). Один із шляхів - реакція, що каталізується біотінсодержащім ферментом ацетил-СоА-карбоксилазою:
Н-СН _{2-СО-SКоА} + СО ₂ + АТФ Ноосі-СН _{2-СО-SКоА} + АДФ + Ф _н
У дріжджів система синтезу жирних кислот представляє собою гомогенний многоферментний комплекс з молекулярною масою близько 2-3 млн. (так звана синтетаза жирних кислот).
Освіта жирних ненасичених кислот у аеробних мікроорганізмів відбувається за такою схемою:
СН ₃ (СН _{2) 14-СО-SСоА} пальмети-СоА
О ₂ НАДФН ₂
СН ₃ (СН _{2) 5} СН = СН (СН _{2) 7-СО-SСоА} пальмітолеіл-СоА
Додаткові подвійні зв'язки можуть бути введені в ефір СоА і мононенасичених кислоти у схожій реакції, яка може бути каталізувала тим же ферментом.
У багатьох бактерій звичайний шлях утворення жирних ненасичених кислот - анаеробний, при якому відбувається поступове подовження вже ненасичених попередників. Кислоти, що містять ціклопропановие кільця, синтезуються шляхом утворення метиленового містка за місцем подвійного зв'язку в ненасичених кислотах, при цьому добавлямий кисень запозичується з метильної групи метіоніну у формі S-аденозілметіонін. Це додавання має місце тільки при включенні в фосфолипид з одного подвійним зв'язком [13]. Реакція біосинтезу ліпідів протікає з виділенням вуглекислого газу та зміщенням рівноваги вправо, тобто є термодинамічно стійким процесом [14].
Одним з промислово важливих ферментів, які продукуються мікроорганізмами, є ліпази, які інтенсивно досліджуються в усьому світі. Ліпаза - трігліцерідгідролаза - фермент, що каталізує гідроліз жирів, широко поширена в природі. Вона присутня у тваринних і рослинних клітинах, а також в мікроорганізмах. Експериментальні дослідження свідчать про те, що мікробні ліпази є ферментами з широкою специфічністю і великою різноманітністю властивостей. Властивості ліпаз і характер липолитической активності навіть у одного роду можна різному варіювати. Вивчення мікробних ліпаз представляє великий теоретичний і практичний інтерес, оскільки вони можуть бути використані при гідролізі різноманітних жирових субстратів [15].
Ліпази каталізують гідроліз жирів і масел з утворенням діацілгліцерідов, моноацілгліцерідов, гліцерину і жирної кислоти. Катаболізм включає три основних фази перетворення органічних речовин органотрофамі. У першій фазі, за допомогою екзоферментів бактерії гідролізують ліпіди до жирних кислот і гліцерину, які можуть легко транспортуватися в цитоплазму. У другій фазі, що надійшли в цитоплазму органічні речовини розщеплюються до фрагментів, що містять два-три вуглецевих атома. У третій фазі ці сполуки окислюються до вуглекислого газу і води. Найбільша частина енергії вивільняється під другої і третьої фазах [11].
Ліпази можна розділити на дві групи: специфічні і неспецифічні. Ферменти з першої групи гідролізують складноефірні зв'язку в першому чи другому положенні. Багато мікробні ліпази зазвичай гідролізують первинні складноефірні зв'язку (a-ефірні зв'язку). У гідролізіатах за участю таких ферментів зазвичай виявляються жирні кислоти, 2,3 - і 1,2-дигліцериди, 2-моногліцериди. При більш тривалих гідролізу жирнокислотний залишок з 2-моногліцериди мігрує в перше положення з утворенням 1-моногліцериди, який легко гідролізується специфічною ліпазою з утворенням гліцерину і жирної кислоти. До цієї групи відносяться ліпази з Rhizopus arrhizus, Rhizopus delemar, Rhizopus microsporus, Mucor miechei, Aspergillus niger, Pseudomonas sp. і т.д. Ліпази другої групи не розрізняють ефірні зв'язку у всіх трьох положеннях трігліцерідной молекули і здатні піддавати субстрат тотального гідролізу. У гидролизатах тригліцеридів з участю цих видів ліпаз виявляються, як правило, залишки тригліцеридів (негідролізованная частина), гліцерин та жирні кислоти. Такі ліпази були виділені з Geotrichum candidum, Oospora lactis, Humicola lanuginosa і т. д. Активність ліпаз залежить від довжини ланцюжка і ступеня насиченості жирної кислоти. Дженсон описав, що ліпаза Geotrichum candidum виявляла високу специфічність до олеїнової і лінолевої кислот незалежно від їх положення в молекулах тригліцеридів. Такими ж властивостями володіють ліпази з Achromobacter lipolyticum, тоді як ліпаза з Aspergillus niger виявляла більшу специфічність до стеаринової кислоти і молекулам субстратів [16].
Важливе значення при дослідженні жирів придбали спектральний метод, метод радіоактивних ізотопних індикаторів, молекулярні перегонки та ін Всі вони представляють інтерес, тому що для їх здійснення потрібно дуже невелику кількість досліджуваного матеріалу, а точність результатів дуже висока.
нм, в ультрафиолетовой области с длиной волн 200—400 нм и в инфракрасной области с наибольшей длиной волн 2000—15000 нм. Спектральний аналіз при дослідженні жирів проводять у видимій області спектра з довжиною хвиль 400-750 нм, в ультрафіолетовій області з довжиною хвиль 200-400 нм і в інфрачервоній області з найбільшою довжиною хвиль 2000-15000 нм.
Спектральний аналіз застосовується для кількісного визначення в жирах ненасичених кислот, деяких продуктів окислення жиру, синтетичних інгібіторів окислення жирів і для багатьох інших цілей.
До складу більшості натуральних жирів і масел входять ненасичені кислоти з ізольованими подвійними зв'язками. Тому для визначення вмісту в них лінолевої і ліноленової кислот суміш кислот ізомеризуються.
Інфрачервона спектрометрія застосовується для встановлення деталей будови структурних елементів жирів, будови супутніх жирам речовин, для визначення вмісту в гідрованих і модифікованих жирах транс-ізомерів олеїнової кислоти, для визначення вмісту первинних і вторинних спиртів в суміші і для інших цілей.
метод разделения веществ, заключающийся в пропускании газовых смесей или растворов через слой пористых сорбирующих материалов. Хроматографія - метод розділення речовин, що полягає в пропущенні газових сумішей або розчинів через шар пористих сорбирующих матеріалів.
Хроматографічний аналіз набув велике застосування для розділення та кількісного визначення супутніх жирам речовин, жирних кислот, продуктів окислення жирів, високомолекулярних жирних спиртів і для багатьох інших цілей.
У галузі дослідження жирів найбільш широко поширені адсорбційна і розподільна хроматографія. Останнім часом широкого поширення в дослідженні ліпідів отримала газо-рідинна хроматографія.
Газо-рідинна хроматографія відрізняється від інших видів розподільної хроматографії в основному тим, що в якості рухомої фази використовується інертний газ (гелій, водень), а нерухомою фазою є рідина, нанесена на твердий носій. Поділ суміші на індивідуальні речовини виробляється у колонці, заповненій порошком, наприклад, кизельгур, цеолітом, рівномірно просоченим невеликою кількістю нелетучей рідини, яка є нерухомою фазою.
За допомогою газорідинної хроматографії можна з великою точністю аналізувати суміші метилових ефірів насичених і ненасичених жирних кислот, суміші жирних спиртів та інших речовин [6].
1.2 Сучасні методи знежирення
один из основных процессов производства меха. Знежирення - один з основних процесів виробництва хутра. Значення знежирення для хутряного виробництва велике: на поверхні волосяного покриву і в кожевой тканини шкурок деяких видів тварин (овець, нутрій, бабаків, тюленів, ондатр, морських котиків і т.д.) міститься значна кількість жироподібних речовин. Високий вміст жироподібних речовин у волосяному покриві є причиною дефектів фарбування (непрокрас, плямистість), погіршення блиску і розсипчастості волосяного покриву, а наявність великої кількості жиру в кожевой тканини в певних умовах призводить до його окислювання і зниження міцності кожевой тканини.
Встановлено, що після отмокі па волосяному покриві хутряних шкурок міститься значна кількість ліпідів. Забруднень білкової та вуглеводної природи [17].
Знежирення повинно вестися до вмісту жиру в волосі в межах 1,5-2% (вважаючи на вологість 0%). При більш низькому вмісті жиру погіршуються фізико-механічні властивості волосся, з'являються крихкість і ламкість, знижується стійкість його до стирання.
Відомо кілька методів знежирення:
Адсорбційний метод заснований на застосуванні високодисперсних твердих адсорбентів (спеціальних глин). Найдрібніші частинки глини обволікаються крапельками жиру і видаляють його. Цей метод малопроизводителен, тому майже не застосовується [18].
Знежирення розчинниками - екстракція напівфабрикату розчинниками жиру (дихлоретаном, бензином, уайт - спіритом, скипидаром). Перевагою цього методу є висока ступінь знежирення дерми, гарантія від теклості волосся. Однак відносно висока вартість розчинників, їх токсичність і складність апаратури обмежують застосування цього методу. Крім того, вовна дуже сильно адсорбує розчинник. Розробляються методи знежирення водними емульсіями жірорастворітелей.
Емульсійний метод знежирення має найбільш широке застосування як в хутряній, так і в шкіряній промисловості. Він заснований на використанні миючої здатності ПАР: ОП-10, сульфанолу НМ-3, сапоніни, мила, порошку і пасти «Новина» та ін [19].
Ферментативний метод знежирення волосяного покриву овчини здійснюється за допомогою таких ферментних препаратів, як ліпазін, ліпаваморін Г-3х і ліпопротеідліпаза [18].
В основному їх застосовують з метою додання кожевой тканини хутра м'якості і пластичності за рахунок видалення межволоконное речовин, зокрема білків, вуглеводів та їх комплексів. Основні проблеми та труднощі проведення знежирення з використанням ферментів полягають не тільки в ослабленні зв'язку волосяного покриву з дермою, але в тому, що в робочому розчині присутні синтетичні поверхнево-активні речовини (СПАР) та формальдегід, які викликають зниження активності застосовуваних ферментних препаратів.
У сучасних методах знежирення основна увага приділяється тільки технологічної осторонь процесу, а саме, ступеня видалення жирових речовин з поверхні волосяного покриву і кожевой тканини. При цьому не враховується рівень техногенного впливу, що чиниться на навколишнє середовище і, зокрема, на водні об'єкти. Висока токсичність стічних вод після процесу знежирення обумовлюється присутністю в них СПАР і формальдегіду.
., выделенная из сточной воды после эмульсионного метода обезжиривания меховой овчины. Для виконання роботи була використана культура роду Pseudomonas sp., Виділена зі стічної води після емульсійного методу знежирення хутряної овчини. Чисту культуру підтримували на синтетичних, елективних, агаризованих поживних середовищах, її введення здійснювали відповідно до загальноприйнятих мікробіологічними методами [20].
ч при температуре (40+0, 5) ^О С при переменном механическом воздействии. Біотехнологічне знежирення проводили протягом 1 год при температурі (40 +0, 5) ^Про С при змінному механічному впливі. Превоцелл W -О F -7 - 0.12 г/дм ³ ; бактериологический препарат - 2.5 г/дм ³ ; с активностями протеолитической - 212 ед./г и липолитической - 11,42 ед./г; биомассой микробных продуцентов 36х10 ⁴ клеток/см ³ . Для випробувань використовували склад, що містить неіоногенні СПАР - Превоцелл W-О F -7 - 0.12 г / дм ^3; бактеріологічний препарат - 2.5 г / дм ^3; з активностями протеолітичної - 212 од. / Г і липолитической - 11,42 од. / г; біомасою мікробних продуцентів 36х10 ⁴ клітин / см ^3. У досвідчений склад не вводили формальдегід і карбонат натрію. В якості контрольного варіанту було проведено знежирення за типовою методикою. Отриманий після досвідченого знежирення напівфабрикат характеризувався білим, чистим, розсипчастим волосяним покривом. и 2,0% соответственно. Зміст органічно вимиваючих речовин в кожевой тканини і волосяному покриві після досвідченого знежирення склало 13,87 і 2,0% відповідно.
Н. При цьому не виявляється помітного негативного впливу на зв'язок волоса з дермою, яка склала після біотехнологічного знежирення 6.66 Н.
было проведено исследование сточной воды после обезжиривания осуществленного по типовой и разработанной методикам. Для оцінки рівня токсичного забруднення (УТЗ) [21] було проведено дослідження стічної води після знежирення здійсненого за типовою та розробленою методиками. . В якості тест-об'єкта використовували рачки Daphnia magna Straus. Показником ступеня токсичності була кратність розведення. при якому усувається гостре токсичну дію.
Стічні води після процесу біотехнологічного знежирення менш токсичні і можуть бути віднесені до помірно забрудненим, в той час як стоки, які утворюються після типового знежирення і містять СПАР, формальдегід, відносяться до дуже брудним. [22]. Це підтверджується 100%-й загибеллю рачка Daphnia magna Straus [22].
Авторами Бреслер С.М., Пуримом Я.А., Савіної М.В запропоновано склад для знежирення хутряних овчин із застосуванням натрієвої солі моноефіри сірчаної кислоти та суміші цетилового і олеілового спиртів, формаліну, карбонату натрію і води. Додатково містить перекис водню і неіоногенна поверхнево-активна речовина при наступному співвідношенні компонентів, г / л:
Натрієва сіль моноефіри сірчаної кислоти та суміші цетилового і олеїнової спиртів - 0,2-2,5;
Формалін (у перерахунку на 100%-ную концентрацію) - 0,12-0,28;
Карбонат натрію - 0,2-0,7;
Перекис водню (у перерахунку на 100%-ную концентрацію) - 0,3-1,5;
Неіоногенна поверхнево-активна речовина - 0,2-0,5;
Вода - інше.
Завдяки введенню в знежирювальних складу активатора - перекису водню, досягається інтенсивність очищення волосяного покриву від жирових і механічних забруднень. Незабарвлений напівфабрикат овчини, оброблений запропонованим складом, відрізняється більш чистим і розсипчастим волосяним покривом, ніж напівфабрикат, оброблений складом по прототипу. Прототип - Єдина технологія обробки хутряних овчин. ЦНІІТЕІлегпром, 1978 [23].
З метою підвищення сортності, чистоти волосяного покриву, м'якості кожевой тканини, рівномірного фарбування Пуримом Я.А., Королькової Є.А. було запропоновано додаткове введення ферментного препарату - протосубтилин Г3х-1 0,8-1г / л.
Винахід випробувано в напіввиробничих умовах на цілих овчина і порівняльних половинках і дало позитивні результати. Окрім виключення використання неионогенного ПАР досягнуто покращення якості волосяного покриву. Досвідчені половинки мали більш чистий, розсипчастий, рівномірно забарвлений волосяний покрив і більш м'яку, пластичну кожевую тканина [24].
Л.А. Коміссарова в процесах миття і знежирення овчин використовувався ферментний препарат протеолитического дії протосубтилин ГЗх з метою впливу його на білкові складові забруднень, оболонки жирових клітин і межволоконное білки. ферментного препарата протосубтилина ГЗх, определенную по методу Лейлян – Фольгарда при стандартной температуре 37° С и при температуре 42°С, оптимальной для мойки и обезжиривания, которая соответствует температуре плавления шерстного воска. Було досліджено вплив компонентів миючих і знежирювальних розчинів, а також різних їх сполучень на протеолітичну активність; ферментного препарату протосубтилина ГЗх, визначену за методом Лейлян - Фольгарда при стандартній температурі 37 ° С і при температурі 42 ° С, оптимальною для миття та знежирювання, яка відповідає температурі плавлення вовнового воску.
Розроблений процес мийки - знежирення із застосуванням протосубтилина ГЗх для овчин у виробництві хутра мав меншу тривалість, і ферментний препарат використовувався при більш низьких концентраціях (з урахуванням активності), ніж при виробництві шкіри із застосуванням формальдегіду, тобто при дії протеолитического ферментного препарату створювалися більш «м'які» умови, щоб уникнути порушення зв'язку волосу з дермою і пошкодження волоса.
Ця технологія випробувана з позитивними результатами у виробничих умовах Каунаського виробничого хутряного об'єднання ім. К. Гедріса. Застосування протосубтилина ГЗх для миття та знежирювання овчин дозволяє інтенсифікувати технологічний процес, скоротити тривалість і трудомісткість обробки, знизити витрату води, пари, хімічних матеріалів, електроенергії, поліпшити якість напівфабрикату, зменшити об'єм стічних вод.
До недоліків даної технології слід віднести присутність в обробному розчині формальдегіду, який застосовується з метою зміцнення зв'язку волосу з кожевой тканиною, з огляду на те що ферментний препарат протосубтилин ГЗх діє в слабощелочной середовищі та в певних умовах має обезволашівающей здатністю.
Поєднане проведення процесів отмокі - мийки-знежирення сприяє інтенсифікації технологічного процесу, зменшенню витрати електроенергії, води, пари, хімічних матеріалів, обсягу стічних вод, поліпшення якості напівфабрикату [25].
липопротеидлипаза. Цікаво використання для знежирення хутряної сировини ферментного препарату бактеріального походження - ліпопротеідліпаза. Застосування її дозволяє підвищити продуктивність праці, скоротити тривалість виробничого циклу, зменшити витрату води, пари, знизити забрудненість стічних вод (за рахунок виключення ПАР). Однак цей ферментний препарат не знайшов застосування в хутряному виробництві у зв'язку з його високою вартістю, а також тому, що він був отриманий в малих кількостях в лабораторних умовах у вигляді сиропу і його активність різко знижувалася при зберіганні.
В інституті мікробіології ім. . Серпень Кірхенштейн АН Латвійської РСР розроблений ферментний препарат ліпаза, продуцентом якого є культура Sacharomycopsis lypolytica. ед./г, оптимальные условия действия при рН – 7-8, температуре 37-42 ⁰ С. Активність препарату 100000 од. / Г, оптимальні умови дії при рН - 7-8, температурі 37-42 ⁰ С. . У 1986р. На Алма-Атинській хутряному комбінаті ім. 50-річчя СРСР була впроваджена технологія обробки хутрової овчини з застосуванням у процесі знежирення ферментного препарату ліпази, що дозволило інтенсифікувати цей процес, скоротити витрату пасти «Новина», поліпшити якість готового напівфабрикату [17].
Цікава робота С.В. Чесунова і Л.Л. Щоголевої. Введение глутарового альдегида Сутність винаходу полягала в тому, що склад для знежирення хутряних овчин, що включає порошок «Новина», карбонат натрію, формальдегід і воду, додатково містив глутаровий альдегід (у перерахунку на 100%-ную концентрацію) 0,38-0,75 г / л. Введення глутарового альдегіду раствор для обезжиривания дало возможность получить полуфабрикат высокого качества с чистым рассыпчатым волосяным покровом, способствовало улучшению качества кожевой ткани, повышению ее мягкости, пластичности, способствовало лучшему использованию сырья [26]. в розчин для знежирення дало можливість отримати напівфабрикат високої якості з чистим розсипчастим волосяним покривом, сприяло поліпшенню якості кожевой тканини, підвищенню її м'якості, пластичності, сприяло кращому використанню сировини [26].
представлена работа по применению поверхностно-активных веществ на основе побочных продуктов производства в обезжиривающих и моющих составах производства овчины меховой. Казанським державним технологічним університетом була представлена робота щодо застосування поверхнево-активних речовин на основі побічних продуктів виробництва в знежирювальних і миючих складах виробництва овчини хутряної.
Відомо, що миючі і особливо знежирюючі склади є багатокомпонентними системами, до складу яких входять як аніоноактивні, так і неіоногенні ПАР, а також інші добавки.
Проблему сумісності аніонактивної ПАР і синтезованих карбоксілатамінов вдалося вирішити, завдяки двоїстий характер останніх, здатних виявляти як катіонактівние, так і неіоногенні властивості. Наявність катіонактівной форми олеінатаміна (ОЛТА) і флотатаміна (ФЛТА) підтвердилося даними ІЧ-спектроскопії
Знежирювальних та миюча здатність ПАР тісно пов'язана з адсорбцією його на поверхні волосся або кожевой тканини шкіри. Особливістю застосування ПАР в даному випадку є те, що адсорбція здійснюється на твердій поверхні. На відміну від рідких середовищ положення атомів на поверхні твердого тіла фіксоване. Адсорбція проходить не на всій поверхні, а лише в її активних центрах. Застосування в знежирювальних емульсіях сітезірованних карбоксілатамінов, що мають у своєму складі активні метилольними і складноефірні групи, здатні взаємодіяти з функціональними групами колагену і кератину, підвищує ефективність знежирення. Контроль знежирення здійснювався якісно по реакції Лібермана. Кількісно вміст жиру визначалося екстрагуванням дихлоретаном [7].
ФЛТА, рабочая концентрация которой 5г/дм ³ . Встановлено, що оптимальними знежирюючими властивостями володіє емульсія, яка містить у своєму складі 4% ФЛТА, робоча концентрація якої 5г/дм ^3. Залишковий вміст жиру після обробки зразків зазначеним складом не перевищує 1,9% [27].
Відомо застосування оролона - препарату підшлункової залози - при обробці хутряних овчин на фабриці «Паннонія» (Угорщина). Ферментативну обробку поєднували з знежиренням, тобто ферменти використовували в лужному середовищі при рН вище 7,5. Після ферментативної обробки проводили сірчанокисле пикелевание. Якість кожевой тканини вийшло приблизно таким же, як при хлібної вичинці [28].
Важливе значення при виробництві м'яких шкір має знежирення сировини, так як підвищений вміст природного жиру в свинячих шкурах негативно позначається на проведенні подальших процесів. При цьому рівномірного впливу лужних, ферментних, кислотних, дублячих та інших реагентів безпосередньо на структурні елементи дерми не забезпечується, що проявляється в підвищеній жорсткості готової шкіри. Найбільш ефективним є знежирення в відмочно-зольних і преддубільних процесах за допомогою механічного та хімічного знежирення сировини і напівфабрикату, в результаті чого вдається знизити вміст природного жиру в хромованому напівфабрикаті до 1% і нижче [29].
Мікаелян І.І., Меньшикова Л.М. запропоновано знежирення свинячого сировини з метою підвищення якості обробки. Зазначена мета досягалася тим, що склад для знежирення включає кальциновану соду, поверхнево-активна речовина і воду, містив як поверхнево-активної речовини алкилдиметилбензиламмонийхлорид, при наступному співвідношенні компонентів, г / л:
Кальцинована сода - 3-15
Алкилдиметилбензиламмонийхлорид - 0,3-1,0
Вода - Останнє
Крім того, з метою ослаблення зв'язку щетини з дермою, складу додатково містить сірчистий натрій при наступному співвідношенні компонентів, г / л:
Кальцинована сода - 10-15
Алкилдиметилбензиламмонийхлорид - 0,3-0,5
Сірчистий натрій - 0,3-0,5
Вода - Останнє
Введення до складу алкилдиметилбензиламмонийхлорида (катаміна АБ) активізувало знежирюючі властивості кальцинованої соди, що дозволило підвищити якість знежирення, полегшило проведення подальших рідинних процесів обробки свинячого сировини [30].
Оскільки процес знежирення свинячих шкір із застосуванням панкреатичних ферментів вивчений недостатньо, авторами В. А. Валейкене, Г. С. Сіманайтіте, А. А. Скродяніс (Каунаський політехнічний інститут імені Антанаса Снєчкусу) були проведені дослідження знежирення свинячих шкір таким препаратом - технічним панкреатином. Як відомо, панкреатин крім протеолитического має й іншу дію. Яка перебуває у його складі ліпаза викликає гідроліз жиру. Така ферментативна обробка дозволяє зменшити кількість жиру в свинячих шкурах на 35-45%. Причому після попередніх обробок структурні елементи дерми стають більш доступними для дії панкреатину.
Встановлено, що при обробці лужної бактеріальної протеазой катіонні і аніонні ПАР інгібують активність ферментів, у той час як неіоногенні ПАР не чинять негативного ефекту.
У процесі досліджень були отримані дані оптимального складу обезжирюючі ванни. Знежирення свинячих шкір доцільно проводити шляхом суміщеної обробки технічним панкреатином - 0,8% від маси парного сировини, неіоногенних ПАР - 5г / л протягом 5-6 год. Під час обробки видаляється близько 80% жиру, що залишився кількість жиру після обробки складає близько 2% [31].
Знежирення коллагенсодержащих сировини було представлено Чистяковим Б.Є., Полковниченко І.Т. Мета винаходу - здійснення одночасного відбілювання сировини і підвищення інтенсивності його знежирення. Це досягалося тим, що в якості поверхнево-активної речовини склад містить суміш солі алкілфосфатов на основі вищих жирних спиртів З _{10-З 20} і сінтанола при наступному співвідношенні компонентів, вагу.%:
Сода - 2-50
Сіль алкілфосфатов на основі вищих жирних спиртів З _{10-З 20}
Сінтанол - 20-60
Вода - Останнє
В якості поверхнево-активних речовин використовують тріетаноламіновие або калієві солі алкілфосфатних кислот на основі вищих аліфатичних первинних або вторинних спиртів.
Проведені випробування показали, що використання пропонованого складу дає в порівнянні з відомим складом більший знежирювальних ефект з одночасним відбілюванням кетгуту (хірургічного шовного матеріалу). Відомий склад відбілюючим дією практичес не володіє [32].
Авторами Фехретдіновим П.С., Угрюмова В.С. запропоновано засіб для знежирення коллагенсодержащих сировини, переважно кишкового. , N -диметил- N -алкил- N -[изононилфеноксидека(этиленокси)карбонилметил]аммоний хлорид фракции С ₁₀ -С ₁₆ . Для обробки сировини використовувалося як поверхнево-активної речовини препарат ф-761, що представляє собою N, N-диметил-N-алкіл-N - [ізононілфеноксідека (етіленоксі) карбонілметіл] амоній хлорид фракції С _{10-С 16.} Отримані результати, після випробування свідчили про значне підвищення інтенсивності знежирення коллагенсодержащих сировини запропонованим препаратом ф-761, а також про поліпшення технологічності його переробки у порівнянні з прототипом [33].
Робота Є.М. Харчуткіной, Є.П. Болдовський, О.В. Дормидонтова присвячена оптимізації ферментативної отмокі знежирення шкір вугра. Показана доцільність послідовного введення ліпази в обробну рідина.
Шкури вугра в порівнянні зі шкірами інших видів риб мають найбільш складне гістологічну будову, що визначає необхідність специфічної їх обробки з метою отримання шкір.
Для розробки методики отмокі-знежирення шкір вугра були обрані ферментні препарати ліпаза флюозім ГЗх, що забезпечує досягнення гарного знежирюючого і відмочують ефекту, і протеаза Прок, сприяє обводнення шкур.
Однак результати розвідувального експерименту показали, що при проведенні обробки з використанням однієї ліпази або однієї протеази відбувається руйнування епідермісу і пігментного шару, розташованого під епідермісом, яке призводить до отримання розмитого малюнка лицьової поверхні.
При дослідженні ефективного способу отмокі-знежирення шкір вугра, що дозволяє зберегти малюнок лицьової поверхні, було зроблено припущення про можливість спільного використання ліпази і протеази, проте при одночасному дозуванні ферментних препаратів активність системи менше сумарної активності окремо взятих препаратів.
Аналізуючи варіанти введення ферментних препаратів в розчин, можна зробити висновок про те, що спільне використання ліпази флюозім Г3х і протеази Прок можливе лише за умови їх почергового введення.
Таким чином, для отримання шкір з шкур вугра рекомендується технологія, що передбачає отмоку - знежирення у водному розчині ліпази флюозім Г3х і протеази Прок при їх послідовному введенні. Це дозволило отримати шкіряний напівфабрикат із збереженням специфічного малюнка лицьової поверхні, добрими характеристиками міцності та пружно-пластичними властивостями [34].
Очищення стічних вод від жирів
В даний час зросла проблема забруднення водного басейну виробничими стічними водами, що містять різні компоненти, в тому числі, жирові речовини. Органічні компоненти, вступаючи у водойму, створюють сприятливе середовище для життєдіяльності гнильних патогенних бактерій, грибків, найпростіших, піддаються складним біохімічним перетворенням, викликаючи тим самим вторинне забруднення водойм і роблять прямий негативний вплив на водні організми.
На практиці використовуються фізичні, електричні, біологічні, хімічні методи очищення стічних вод, у тому числі озонування, мембранний метод, зворотний осмос та ін
При розгляді деструкції органічної речовини у водоймах Романенко В.І. і Кузнєцов С.І. [35] відзначають, що при деструкції в оліготрофних водоймах (при надлишку кисню) відбувається аеробний розпад з виділенням вуглекислоти і води. В анаеробних умовах практично всі органічні речовини руйнуються з утворенням вуглекислоти, води, водню, жирних кислот та інших речовин. У другу фазу відбувається розпад жирних кислот до метану і вуглекислоти і, нарешті, освіта метану з водню і вуглекислоти.
Механізми анаеробного розпаду органічних речовин вивчалися на екосистемах анаеробних реакторів, донних відкладень і грунтів. Умови звалища добре імітуються в лабораторних циліндричних лізіметрах [36].
Розпад біополімерів (вуглеводів, білків і жирів) починається з гідролізу, який здійснюють мікроорганізми, що мають спеціальні ферменти - гідролази. Їх розмноженню і поширенню по поверхні твердого субстрату сприяє вода. Продукти цієї реакції споживаються гідролітікамі та іншими кіслотогеннимі мікроорганізмам, в результаті чого утворюються летючі жирні кислоти (оцтова, пропіонова, масляна), а також водень. Фаза, умовно об'єднує гідроліз і кіслотогенез, називається кіслотогенной. При накопиченні жирних кислот знижується pH середовища, а при pH <6.0 кінцева метаногенних фаза пригнічується [37].
Надмірний вміст алохтонні органічної речовини в нативних водних об'єктах призводить до погіршення гідрохімічних показників об'єкта.
У листкова Л.Л. [38] зазначено, що наявність у стічних водах жирових речовин у великих концентраціях створює труднощі в експлуатації каналізаційних систем та подальшої очистки стічних вод на спеціальних спорудах. Тому вкрай необхідно очищення стічних вод починати ще до їх випуску з локальних очисних споруд, так як подальша очищення проводиться міськими системами, які приймають стоки зі строго лімітованими показниками, які з кожним роком посилюються [39].
Жири в стічних водах можуть знаходитися в чотирьох агрегатних станах: грубодисперсної, тонкодисперсному, емульгованому (при цьому зберігається стійка кінетична оболонка) і розчиненому в залежності від рН потоку.
Слід зазначити, що забрудненість стічних вод розчиненими і емульгованими жирами є домінуючою і змінюється в залежності від характеру технологічного процесу і наявність у залпових скидах.
Не залежно від того, скидаються виробничі стічні води в міську каналізацію або обробляються на території самого підприємства, повинні бути передбачені наступні очисні споруди; решітка, пісковловлювач, жироловках і відстійник. При цьому грати і песколовку слід встановлювати перед жироловках в одному з нею приміщенні. Кількість задерживаемого осаду складе 0,04-0,05% від обсягу витрат стічних вод [40].
З досвіду експлуатації діючих заводських очисних споруд слід, що жироловки необхідно обладнати розосередженим випуском і забезпечити час перебування в ній стічної води 15 хв при максимальному припливі.
Встановлено, що фізико-хімічні методи, особливо флотація під тиском, є оптимальним рішенням, як у технічному, так і в економічному відношенні. Флотація під тиском, без застосування реактивів, дозволяє зменшити концентрацію нерозчинних речовин і жиру до меж, передбачених Комітетом з охорони навколишнього середовища. Швидке екстрагування забруднюючих речовин дає можливість отримати продукти, які можна використовувати на кормові цілі [41,42].
Американською фірмою [38] сконструйована багатокамерна флотаційна система з аерування, призначена для видалення вільних і емульгованих жирів і суспензій із стічних вод. Пропонована система видаляє 90% і більше жирів, масел і суспензій. Висока ефективність системи забезпечується чотириступінчастим процесом очищення шляхом флотації. Вона розрахована на очищення стічних вод, що містять до 500 мг / дм ³ жирів і масел.
У Швейцарії спроектована акваустановка для утилізації стічних вод, що містять органічні домішки, які в подальшому можна використовувати для виробництва біомаси, що вигідніше в порівнянні з типовими біоочістнимі установками [43].
На птахопереробних заводі фірми (ФРН) введена в лад найбільша флотаційна система з блоками перекидальних пластин призначена для очищення технологічної та промивної води, що містить кров, білок, жир і тверді домішки. У результаті роботи установки БПК знижується на 80%, вміст твердих домішок - на 95%, жиру - на 95%. Спеціальної конструкції скребки збирають і видаляють всю спливла масу, причому її частково зневоднюють та переробляють на корм худобі.
В даний час крім фізичних і фізико-хімічних методів очищення широко застосовується біологічний метод, заснований на життєдіяльності мікроорганізмів - деструкторів жирових речовин.
Існуючі системи очисних споруд, переробні скиди, не забезпечують повного вилучення жирових речовин, а тільки дозволяють знизити їх концентрацію. У цих умовах природне середовище, приймаючи такі не повністю очищені природні компоненти, виконує роль утилізатора та нейтралізатора шкідливих домішок. У багатьох випадках природне середовище не справляється зі все наростаючим потоком забруднення, і створюються умови для порушення екологічної рівноваги обміну речовин в біосфері [44].
У зв'язку з цим постало питання про створення технологічного виробництва, яке не викликало б екологічних збурень у природному середовищі.
Аналогом такого виробництва може служити біологічне природне виробництво, основу якого становить функціонування екологічних систем. Це біологічна очистка.
Біологічне очищення стічних вод заснована на здатності мікроорганізмів використовувати розчинені і колоїдні органічні забруднення в якості джерела живлення в процесах своєї життєдіяльності [45]. І вона має ряд важливих переваг перед іншими методами. Мікроорганізми здійснюють повну деструкцію забруднення до газоподібних продуктів і води, забезпечуючи тим самим кругообіг елементів у природі. Таким чином, при біологічному очищенню на відміну від інших способів не відбувається концентрації забруднення або переведення їх в іншу форму. У той же час біологічні методи найбільш економічні, так як за винятком основних капіталовкладень майже не вимагають витрат під час експлуатації споруд, а головний діючий компонент біологічної очистки - активний мул самовідтворюється [46].
. T ., Brown L . R . Мікроорганізми-деструктори пропонується використовувати не тільки для руйнування жирових домішок, але і для нейтралізації інших органічних речовин, так, англійськими дослідниками French W. T., Brown L. R. в процессе регенерации адсорбентов, применявшихся для выделения трихлорэтилена. [47] пропонується використовувати мікроорганізми виду Burkholderia cepacica в процесі регенерації адсорбентів, що застосовувалися для виділення трихлоретилену.
З урахуванням тієї обставини, що стічні води, що містять жирові речовини мають в основному підвищену температуру, селектованих кілька видів термофільних мікроорганізмів, здатних руйнувати жири при температурі понад 50 ^о С [48]. , Rhodococcus species . До таких культур належать Acinetobacter species, Rhodococcus species. Ефект очищення при такому способі досягає 100%.
Дослідниками з Великобританії пропонується використовувати спеціальний пристрій для видалення масел і жирів із стічних вод [49] особливістю такого способу очищення є те, що для деструкції жирів і масел використовуються спеціальні культури мікроорганізмів, які подаються в стічні води з ємності з містить їх рідиною дозатором. Для збільшення ефективності очищення використовується ефект флотації: повітря подається в диспергатор на дні.
У великих містах господарсько-фекальні стічні води зазвичай піддаються біологічному очищенню. Для цього служать спеціальні очисні споруди аеробного (аеротенки, біофільтри) або анаеробного (метантенки) типу. При наявності потужних міських споруд сюди ж надходять стоки промислових підприємств, які змішуються з побутовими і проходять спільну обробку. У аеротенках органічні забруднювачі стічних вод руйнуються мікроорганізмами активного мулу до найпростіших продуктів. Активний мул являє собою комплексний біоценоз, до складу якого входять мікроорганізми, найпростіші і деякі інші живі організми, що не грають ролі в очищенні. Одним з важливих властивостей активного мулу є здатність утворювати пластівці. Ці пластівці складаються з часток органічних забруднень, мікробів і інших живих істот. Завдяки здатності до хлопьеобразования активний мул відокремлюється від очищеної ним води, осідає і може бути видалений з споруди. Звільнена від мікрофлори і продезінфіковані вода прямує в природні водойми [50].
У Фінляндії з 1983 року досліджується анаеробна обробка стоків. Проведені дослідження показали, що при тривалості процесу від 1,7 до 55 діб ефект очищення за хімічним споживанням кисню (ХПК) становить 77-78%, зниження БПК - 73-79%, видалення зважених речовин - 94-98%. Таким чином, за допомогою анаеробного методу досягається високий рівень очищення [51].
Загальні стоки шкіряних та хутряних підприємств містять до 1800-2460 мг / дм ³ жирів або жироподібних речовин. У стоках від процесів отмокі і дублення їх кількість сягає більше 4 г / дм ^3. Відпрацьовані рідини після знежирення, промивання свинячого сировини і напівфабрикату, а також після зоління цієї сировини містять ще більше жиру. Після знежирення свинячих шкір карбонатом натрію (15-17 г / дм ³⁾ в розчині утворюється стійка жирова емульсія з вмістом жиру 8-10 г / дм ^3. Значна кількість його міститься також у стоках клееварочних цехів. Так на Могилівському шкіряному заводі в стоках зазначеного цеху вміст жиру досягає 8,3 г / дм ³ [52].
Для попереднього очищення загального стоку від зважених речовин, вовни, сульфідів, жирів, СПАР, іонів хрому може бути використана технологічна схема двоступеневої флотаційної очистки. Загальний стік піддається механічній очистці, усереднюється і надходить у камеру подщелачивания, де відбувається коригування рН стічних вод до 9,5-10, куди також подається до 25% реагентів. Далі загальний стік надходить у флотаційний шерстежіроуловітель, що працює за методом безнапірної флотації, камеру хлопьеобразования з коригуванням рН до 8,5 і подачею 75-100% реагенту, потім в напірний флотатор. Після цього загальний стік змішується з очищеним дубильним стоком і отримана суміш направляється на біологічне очищення. В якості реагентів можливе використання сульфату заліза (11), хлориду жедеза (111) або сульфату алюмінію [53].
У Богородському філії Центрального проектно-конструкторського бюро (ЦПКТЛлегпрома) в лабораторних умовах перевірялася можливість розкладання відпрацьованих розчинів від процесів знежирення. Н = 3-4. Повне і швидке руйнування цих емульсій наступало після їх підкислення до p Н = 3-4. При подальшому відстоюванні протягом 1,5 - 2 ч. весь жир у вигляді пухкої сирнистий маси випливав на поверхню і потім віддалявся. Дане забруднення слід утилізувати, воно може служити вихідною сировиною для отримання технічного жиру [40].
Наведені дані свідчать про те, що присутність жирових речовин у водоймах небажано і рішення цього питання може бути здійснено, перш за все шляхом вдосконалення очищення промислових викидів, які направляються в навколишнє середовище, а також розробка таких технологічних процесів і технічних пристроїв, які дозволили б раціонально використовувати вихідне сировину. І виключили б потрапляння шкідливих речовин у природне середовище - мова йде про створення безвідходної (маловідходної) технології.
Таким чином, на підставі літературного огляду можна зробити висновок, що жири відіграють важливу фізіологічну та біохімічну роль в живих організмах, є одним з основних джерел енергії. Служать основною сировиною для жіроперерабативающей промисловості у виробництві мила, оліфи, гліцерину, використовується в якості добавок до лікарських засобів, для будівельних розчинів, бетону, а так само широко використовується у хутряній промисловості.
Також видно необхідність в очищенні стічних вод від жирових компонентів. На цю тему проведено безліч досліджень, у тому числі з використанням різних мікроорганізмів. Так, ліполітичних активні організми використовують жири як джерела живлення, деструктіруя складові жирні кислоти аж до альдегідів.
Найбільш ефективним методом очищення стічних вод, що містять жирові речовини, є біологічний спосіб, який застосовується для видалення жирів за допомогою мікроорганізмів-деструкторів.
У зв'язку з цим є необхідність у вивченні ступеня залучення жирових речовин у конструктивний та енергетичний обмін прокариотическими організмами.
2 Об'єкти та методи дослідження
Метою дипломної роботи було вивчення здатності мікроорганізмів деструктировать жирові речовини різної хімічної природи.
Для виконання експерименту було складено графік, представлений на малюнку 2.

Малюнок 2 - Мережевий графік дипломної роботи
2.1 Об'єкти дослідження
Об'єктом дослідження в дипломній роботі були мікроорганізми, виділені з різних природних жирів: нерпічьего (Н), нерпічьего, вирощеного на середовищі з вовняним жиром (Нв), вовняного (В) і мікроорганізми, виділені з стічних вод після проведення процесу знежирення (3, 8 ).
Для виконання роботи були використані наступні хімічні матеріали:
1 Нерпічій жир - рідина від світло-жовтого до темно-коричневого кольору. Отримують витоплювання, екстрагуванням, пресуванням і сепаруванням. У шкіряному виробництві використовують нерпічій жир з кислотним числом не менше 25.
2 Шерстний жир-виділяють вівці у вигляді жиропоту в кількості його досягає 5 - 10% від маси вовни. Сирий вовняний жир, виділений з промивних вод, - густа пастообразная маса бурого кольору. У ньому містяться крім воску вільні жирні кислоти, гліцериди, білки, слизу, фарбувальні речовини, мінеральні домішки та ін Виділені з вовняного жиру воски з домішкою деяких високомолекулярних сполук називають технічним ланоліном. У очищеному вигляді цей продукт називається ланоліном. Він являє собою світло-жовте мазеподібної речовина, що володіє високою гігроскопічністю.
3 Агар-агар - ГОСТ 16280-88 харчової. Являє собою порошок білого кольору без стороннього запаху, смаку. Наявність цвілі і видимих сторонніх включень не допускається. Фізико-хімічні показники повинні відповідати вимогам, зазначеним у таблиці 1
Таблиця 1 - Фізико-хімічні показники агар-агару
Найменування показників
Показники
Колір холодцю з масовою часткою сухого агару 0,85%,%, не менше
45 - 60
Міцність холодцю з масовою часткою сухого агару 0,85%, г, не менш
200 - 300
Температура плавлення холодцю з масовою часткою сухого агару 0,85%, ° С, не нижче
80
Масова частка вологи,%, не більше
18
Масова частка золи (в перерахунку на суху речовину),%, не більше
4,5
Наявність йоду і важких металів
Не допускається
Масова частка загального азоту (у перерахунку на суху речовину),%, не більше
0,2
4 Поживний бульйон для культивування мікроорганізмів сухий - порошок світло - жовтого кольору рН = 7,2 ± 0,2. Препарат гігроскопічний. Приготування: 15 г препарату розчиняється в 1 л дистильованої води. Склад (г / л): панкреатичного гідролізату кальцію - 10,05; хлориду натрію - 4,95.
5 Вода дистильована. Призначена для аналітичних цілей Н ₂ О (ГОСТ 6709-73). Молекулярна вага 18. Концентрація водневих іонів в межі 5,4-6,6. Сухий залишок не більше 5 мг / л, після прожарювання не більше 1мг / л.
6 Хлорид калію КСl, мовляв. маса 58,46 (ГОСТ 13380-68), добувають з надр відкритим або підземним способом, отримують з ропи озер або лиманів після природного випаровування води, з морських вод згущенням розчинів у спеціальних садочние басейнах і вирівнюванням природних розсолів на сольових заводах. Хлорид калію технічний отримують з відходів виробництва хлориду натрію. Ця сіль містить домішки хлориду магнію і сульфату кальцію. Застосовується для приготування синтетичної середовища.
7 Хлорид кальцію технічний (ГОСТ 450-77) отримують в обезвоженном вигляді - CaCl _2, плавленим вигляді - СаСl '2Н ₂ О, в рідкому вигляді. Застосовують для приготування синтетичної середовища.
8 Фосфат амонію (NH _{4) 3} рo _4, мовляв. маса 132,14 (ГОСТ 9097-74), - кристали білого або слабо-жовтого кольору. Фосфат амонію технічний (ТУ 6-03-395-75) отримують з розчину фосфату амонію, що є відходом виробництва рідкого ангідриду.
Крім того, використовувалися різні органічні і неорганічні кислоти та солі для визначення культуральних властивостей мікроорганізмів і приготування поживних середовищ.
2.2 Методи дослідження
2.2.1 Методика приготування живильних середовищ для культивування мікроорганізмів
Мясопептонний агар (МПА)
При культивуванні мікроорганізмів велике значення має забезпечення їх відповідним харчуванням. Білковою основою для всіх середовищ є поживний бульйон. Основою для приготування мясопептонного бульйону (МПБ) є м'ясна вода. Її готують наступним чином: 15 г сухого бульйону розчиняють в 1 дм ³ дистильованої води і кип'ятять 1-3 хв. Для приготування щільного живильного середовища МПА до 1 дм ³ МПБ додають 2-2,5% агар-агару від об'єму середовища і розплавляють в автоклаві.
Синтетична середу Рана
₄ Х 7 H ₂ O -1,0; FeCl ₃ Х 7 H ₂ O -следы. В 1 дм ³ дистильованої води розчиняють солі наступного складу (г / дм ^3): К ₂ HPO ₄ -5,0; (NH _{4) 3} рo ₄ -5,0; KCl-сліди; СаCl _лютого -1,0; MgSO ₄ Х 7 H ₂ O -1,0; FeCl ₃ Х 7 H ₂ O-сліди. Як джерело вуглецю використовують нерпічій жир в кількості 1 г / дм ^3. Для приготування щільної синтетичної середовища додають агар-агар в кількості 2-2,5% від обсягу рідкого середовища і розплавляють в автоклаві при тиску 1атм.
2.2.2 Виділення чистої культури методом розведень
Розведення роблять у стерильній водопровідній воді. Готують певний обсяг цього розчину і стерилізують при 1 атм. В ході одного досвіду користуються постійним коефіцієнтом розведення, тому що в цьому випадку зменшується вірогідність помилки. Найчастіше роблять десяткові розведення. Для цього беруть пробірку з 10 см ³ стерильного розчину і переносять стерильною піпеткою 1 см ³ досліджуваного матеріалу в дану пробірку. Суспензію цього розведення ретельно перемішують з допомогою нової стерильної піпетки, вбираючи в піпетку і випускаючи з неї отриману суміш кілька разів. Це забезпечує перемішування суспензії і зменшує адсорбцію клітин на стінках піпетки. Потім цією ж піпеткою беруть 1 см ³ отриманого розведення і переносять його в другу пробірку. Таким чином, готують і наступні розведення. Ступінь розведення визначається передбачуваним кількістю мікроорганізмів у зразку і відповідно число розведень тим більше, чим більше мікроорганізмів у вихідному субстраті.
Для приготування кожного розведення обов'язково використовують окрему піпетку. Нехтування цим правилом може привести до отримання помилкового результату. Помилка пов'язана з адсорбцією мікроорганізмів на стінках піпетки, в результаті чого не всі клітини видаляються з піпетки при приготуванні відповідного розведення. Частина клітин, що залишилася на стінках піпетки, може потім потрапити в одне з наступних розведень, що і стане причиною отримання завищеного результату.
2.2.3 Посів на агаризованому середовища в чашки Петрі
У стерильні чашки Петрі наливають розплавлену на киплячій водяній бані агаризованому середу, по 20-30 см ³ в кожну. Чашки залишають на горизонтальній поверхні, поки не охолоне агар. Для посіву відбирають чашки, середовище в яких залишилася стерильною. Коли використовують елективні середовища або виділяють і враховують мікроорганізми, які потребують підвищеної вологості, посів проводять відразу ж або незабаром після застигання агару.
Посів роблять з певних розведень в залежності від передбачуваної кількості мікроорганізмів у досліджуваному субстраті. Стерильною піпеткою наносять певний обсяг (зазвичай 0,05; 0,1 або 0,2 см ³⁾ відповідного розведення, попередньо ретельно перемішаного, на поверхню агарового платівки в чашки Петрі. Цей обсяг розподіляють по поверхні середовища стерильним шпателем. Потім цим же шпателем проводять по всій поверхні в другій чашці, куди посівної матеріалі вносили. При виявленні мікроорганізмів, кількість яких у субстраті відносно не велике, посівний матеріал розподіляють по поверхні середовища тільки в одній чашці.
З кожного досліджуваного розведення роблять таким чином 2 - 3 паралельних висіву. Для паралельних висівів з одного розведення можна користуватися однією піпеткою і одним шпателем. Для посівів з різних розведень використовують іншу стерильну піпетку та іншої шпатель. Чашки з засіяними середовищами поміщають у термостат, відрегульований на певну температуру, сприятливу для розвитку виявляються мікроорганізмів.
Підрахунок колоній, що виросли проводять через певний час після посіву, що залежить від швидкості росту виявляються мікроорганізмів на використовуваної в досвіді середовищі і даній температурі.
Підраховують кількість колоній, що виросли при висіві з певного розведення на двох (одній) чашки Петрі. Результати паралельних висівів підсумовують і визначають середнє число колоній, що виросли при висіві з цього розведення. Колонії вважають, як правило, не відкриваючи чашки. Для зручності відзначають прораховану колонію точкою на зовнішній стороні дна чашки, користуючись склографом або чорнилом по склу. При великій кількості колоній дно чашки ділять на сектори, підраховують кількість колоній в кожному секторі та результати підсумовують або використовують напівавтоматичні лічильники.
2.2.4 Вивчення морфології бактерій
Морфологічні властивості вивчають шляхом микроскопирования забарвлених мазків, приготованих з досліджуваної колонії. При цьому відзначаються форми мікробних клітин, характер їх розташування, наявність суперечка, капсул, джгутиків тинкторіальних здатність (фарбування за Грамом), визначають чистоту культури. Окрім перегляду забарвлених мазків, встановлюють наявність джгутиків шляхом дослідження культур на рухливість в препаратах "висяча» або «роздавлена» крапля, а також шляхом посіву культури на напіврідкий мясопептонний агар (рухливі бактерії викликають помутніння агару, а нерухомі ростуть по уколу).
З колоній готують мазки, потім фарбують по Граму, Трухільо, проводять забарвлення джгутиків по Леффлера.
Техніка фарбування за Грамом полягає в наступному:
- На знежиреному склі роблять мазки мікроорганізмів. Мазки висушують на повітрі і фіксують під полум'ям пальника;
- Мазки забарвлюють протягом 1 хв генціанвіолетом;
- Препарат промивають в слабкій струмені водопровідної води протягом 2 с.;
- Офарблюють препарат розчином Люголя протягом 1 хв.;
- Промивають препарат слабким струменем водопровідної води;
- Занурюють препарат на 30 секунд в 96%-ний спирт, збовтуючи останній, після чого препарат підсушують промокальним папером;
- Офарблюють мазки розчином фуксину Пфейффера протягом 30 с.;
- Промивають препарат в слабкій струмені водопровідної води до зникнення забарвлення в стоці, підсушують промокальним папером і мікроскопіруют.
Грампозитивні бактерії забарвлюються в синій або фіолетовий колір, а грамнегативні - у червоний.
Забарвлення за Трухільо полягає в наступному:
- Мазок фіксують запалом;
- Наносять водний розчин малахітової зелені (2%) і протягом 3 хв підігрівають на спиртівці до відходження вологи;
- Промивають водою;
- Опускають на 1 хв в 0,25% - ний водний розчин основного фуксину;
- Промивають водою;
- Висушують фільтрувальним папером і мікроскопіруют.
При такому методі забарвлення суперечки фарбуються в зелений колір.
Забарвлення джгутиків по Леффлера:
- Мазок заливають на 15-20 хвилин протравов Леффлера, необхідно стежити, щоб протрава не підсихала;
- Препарат промивають дистильованою водою;
- Офарблюють карболовим фуксином Циля протягом 3 хвилин;
- Висушують фільтрувальним папером і мікроскопіруют.
Клітини і джгутики забарвлюються в червоний колір.
2.2.5 Методика вивчення культуральних властивостей
Культуральні властивості визначають за характером росту мікробної культури на щільною і рідкої поживних середовищах. Характер зростання на щільному живильному середовищі вивчають з докладним описом форми, величини, кольору, поверхні, консистенції, країв і структури колоній, утворених на синтетичній живильному середовищі.
Мікроскопічне вивчення колоній проводять під мікроскопом. Розглядаючи колонії в світлі, що неозброєним поглядом, описують наступне: форму колоній; діаметр колоній; колір, який обумовлюється пігментом; рельєф колоній; поверхню; її блиск, прозорість, характер країв колоній; структуру колоній, її консистенцію.
Для визначення ставлення мікроорганізмів до кисню роблять посів уколом на мясопептонний агар (МПА). Посів уколом проводять бактеріологічної голкою шляхом проколювання стовпчика агару в середній частині, стежачи за тим, щоб голка ніде не підходила до стінок пробірки. Не доводячи на сантиметр до дна пробірки голку витягують і обпалюють над полум'ям спиртівки.
2.2.6 Метод роздавленої краплі
Застосовується при дослідженні морфології і рухливості мікроорганізмів.
Краплю мікробної суспензії поміщають на поверхню чистого знежиреного предметного скла. При роботі з культурою, яка постала на твердому середовищі, на предметне скло наносять краплю водопровідної води, потім стерильною піпеткою беруть невелику кількість культури і перемішують її краплі. Покривні скло поміщають ребром на предметне і обережно поміщають його на суспензію, стежачи за тим, щоб між стеклами не було бульбашок повітря. Надлишок рідини видаляють смужкою фільтрувального паперу.
2.2.7 Визначення липолитической активності
Ліполітичні властивості культури досліджують на середовищі певного складу (бульйон Штерна). Готують бульйон наступним чином: до 100 см ³ МПБ додають 1 см ³ гліцерину і доливають 2см ³ свіжоприготованого 10%-ного водного розчину сульфіту натрію, потім по краплях 10%-й спиртовий розчин основного фуксину (≈ 5 кап.).
Культури культивують у термостаті при 37 ⁰ С. Відзначають зміна кольору середовища, рН (лакмусовим папером), помутніння, наявність ударів.
2.2.8 Приготування бактеріальної суспензії
Стерильну рідку синтетичну середовище розливають в стерилізовані конічні колби по 100 см ^3.
Для отримання біомаси досліджуваної культури мікроорганізмів, роблять посів на скошений агар.
Підготовлені таким чином культури інкубують в термостаті 24 год при температурі (37 ± 5) ° С, після закінчення чого в пробірки з мікроорганізмами вводять 5 см ³ відповідної рідкої синтетичної середовища, здійснюючи процес механічного впливу. Приготовлену таким чином бактеріальну суспензію вносять у колби, що містять по 100 см ³ відповідної рідкої синтетичної середовища.
, с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 1 ч в сутки. Культивування мікроорганізмів проводять у термостаті при температурі 38 ± 5 ° С, зі змінним механічним впливом, що здійснюється на Shaker Type, з частотою коливань 200 об / хв, амплітудою 6 по 1 год на добу.
2.2.9 Визначення загальної кількості мікроорганізмів (КУО)
Суть методу полягає у визначенні в 1 см ³ води загального вмісту мезофільних аеробів і факультативних анаеробів при культивуванні на синтетичній живильному середовищі при температурі 40 ° С протягом 24 годин. Визначення починають з приготування розведень. Для цього у кілька пробірок наливають 10 см ³ стерильної води. У першу пробірку стерильною піпеткою додають 1 см ³ досліджуваної води. Нової стерильною піпеткою вносять пробу в пробірку зі стерильною водою, після чого цієї ж піпеткою набирають 1 см ³ з приготованого розведення і переносять в другу, з другої в третю і т. д. З кожної проби роблять посів не менше двох різних об'ємів, обраних з таким розрахунком, щоб на чашках зросла від 30 до 300 колоній. Через 24 годин при температурі 40 ° С підраховують число вирослих колоній. Якщо виросло велика кількість колоній, то дно чашки ділять на сектори і підрахунок ведуть в кожному окремому секторі. Результати підрахунку виражають у кількості бактерій на 1 см ³ аналізованої води з урахуванням посіяного обсягу.
2.2.10 Визначення каламутності
Мутність визначають фотометричним методом при довжині хвилі 540 нм і товщині поглинається шару 30 мм. Визначення каламутності проводять до процесу висолювання. При цьому вихідний розчин відфільтровують від жиру. Стандартним розчином є дистильована вода.
2.2.11 Визначення кислотності
10 см ³ досліджуваної рідини вносять у конічну колбу ємністю 100-250 см ³ і титрують 0,1 н розчином їдкого натру в присутності індикатора фенолфталеїну до слабо-рожевого забарвлення.
Реакція протікає за схемою:
СН ₃ СООН + NаОН = СН ₃ СООNа + Н ₂ О
Зміст органічної кислоти (К), г / дм ³ визначають за формулою (1):
а × до × 0,006 × 1000
К = = а × до × 0,6, (1)
10
де К - вміст кислоти, г / дм ^3;
а - кількість 0,1 н розчину лугу, витраченої на титрування, см ^3;
до - поправка до титру їдкого натру;
0,006 - кількість оцтової кислоти, відповідної 1 см ³ 0,1 н розчину гідроксиду натрію.
2.2.12 Визначення активної реакції середовища
Активна реакція середовища, тобто ступінь її кислотності або лужності, характеризується якісно концентрацією водневих іонів. Концентрацію іонів водню висловлюють величиною рН.
Величину рН визначають потенціометричним методом за допомогою потенціометра зі скляними електродами.
Перед початком вимірювань прилад вмикають до мережі за допомогою тумблера і дають нагріватися протягом 20 хвилин.
Електроди перед зануренням в розчин ретельно промивають дистильованою водою і просушують фільтрувальним папером.
Спочатку вимір проводять за шкалою від 0 до 14 (грубе визначення), а потім перемикають прилад на більш вузький інтервал.
Перед вимірюванням рН стічну воду добре перемішують і вимірюють температуру для введення необхідних поправок.
2.2.13 Біуретова метод визначення білка по Ярош
Метод використовується в розчинах білків з концентрацією від 0,04 до 1,6 мг / см ^3.
Необхідні реактиви. , добавляют 9г калия-натрия виннокислого, перемешивают до полного растворения, добавляют 3г сульфата меди (порошка) и 5г йодистого калия, объем доводят до метки 0,2н раствором NaOH ; раствор мочевины – к 300г мочевины (карбамида) прибавляют кусочек тимола величиной с горошину, приливают 700 см ³ дистиллированной воды и смесь нагревают, затем прибавляют 3г активного угля, перемешивают фильтруют в мерную колбу на 1 дм ³ , объем доводят до метки дистиллированной водой. Біуретова реактив - в мірну колбу на 1 дм ³ наливають 400 см ³ 0,2 н розчину NaOH, додають 9г калію-натрію виннокислого, перемішують до повного розчинення, додають 3г сульфату міді (порошку) і 5г йодистого калію, об'єм доводять до мітки 0, 2н розчином NaOH; розчин сечовини - до 300г сечовини (карбаміду) додають шматочок тимолу завбільшки з горошину, доливають 700 см ³ дистильованої води і суміш нагрівають, потім додають 3г активного вугілля, перемішують фільтрують у мірну колбу на 1 дм ^3, об'єм доводять до мітки дистильованою водою.
Техніка визначення. У пробірку наливають 2,4 см ³ розчину сечовини, 0,1 см ³ розчину білка і 2,5 см ³ біуретового реактиву. Суміш добре перемішують і пробірки поміщають у водяну баню при температурі 40 ^о С на 10 хвилин. Потім їх охолоджують до 20 ^о С. Через 30 хвилин після додавання біуретового реактиву розчин Колориметрують на ФЕК при довжині хвилі 540нм. Кількість білка знаходять по калібрувальної кривої, складеної по яєчному альбуміну.
Для побудови калібрувальної кривої готують вихідні водні розчини з вмістом 10, 20, 30, 40, 50, 60 мг білка в 10см ^3. З отриманих розчинів відбирають у пробірки по 0,1 см ^3, додають 2,4 см ³ розчину сечовини і 2,5 см ³ біуретового розчину і ведуть визначення описаним вище методом. Калібрувальний графік представлений на рисунку 3
Малюнок 3 - Калібрувальний графік залежності оптичної щільності від вмісту білка
2.2.14 Метод визначення протеолітичної активності (ПС) Вильштеттера і Вальдшмідт-Лейтц в модифікації
Метод заснований на визначенні вільних карбоксильних груп у спиртових розчинах амінокислот і поліпептидів.
Активність (ПС) виражають кількістю міліграмів амінного азоту, що утворюється при гідролізі певної кількості 5%-ного розчину желатину з рН 7,3-7,5 1г препарату або 1см ³ ферментного розчину за 1 годину при температурі 40 ^о С.
За одиницю протеолітичної активності приймають кількість ферменту, яке утворює 1мг амінного азоту за 1 годину в прийнятих умовах досвіду.
Необхідні реактиви. Фосфатний буферний розчин з рН 7,3-7,5; 5%-ний розчин желатину, приготовлений на основі буферного розчину, перед вживанням розчин желатину нагрівають на водяній бані до 40 ^о С; 1%-ний спиртовий розчин тимолфталеїну; 0,1 н розчин гідроксиду натрію; 96%-ний етиловий спирт.
Техніка визначення. До 10см ³ 5%-ного розчину желатину з рН 7,3-7,5 доливають 2см ³ випробуваного ферментного розчину і відразу ж відбирають 1см ³ реакційної суміші в конічну колбу на 50-100см ^3, куди попередньо налито 20см ^{березня 1996%-ного} етилового спирту і 0,2 см ³ 1%-ного розчину тимолфталеїну. Пробу тут же титрують 0,1 н розчином гідроксиду натрію. Після появи блакитного забарвлення в розчині додають ще 4 краплі лугу і на цьому титрування закінчують. Титрування проводять з микробюретки з ціною поділки 0,02 см ^3.
Частину, що залишилася суміш желатину з ферментним розчином поміщають в термостат з температурою ⁴⁰ ° С для гідролізу. Через 3 години 1см ³ реакційної суміші відбирають у другу конічну колбу на 50-100см ^3, куди попередньо налито 20см ^{березня 1996%-ного} етилового спирту і 0,2 см ³ 1%-ного розчину тимолфталеїну і титрують аналогічно контролю.
Розрахунок протеолітичної активності ПС ведуть за формулою (2):
ПС = , (2)
де ПС - протеолітічсекая активність, од / г;
А - кількість амінного азоту, накопичене за час досвіду в реакційній суміші, мг;
– время протеолиза, ч; t - час протеолізу, год;
Р - коефіцієнт, що враховує розведення та перерахунок на 1г препарату або 1см ³ рідкого ферментного розчину.
Величина А розраховується за формулою (3):
А = (а-а _к) × 1,4 × К, (3)
– количество аминного азота, мг; де A - кількість амінного азоту, мг;
, пошедшее на титрование 1см ³ опытной пробы, см ³ ; а - кількість 0,1 н розчину NaOH, який пішов на титрування 1см ³ дослідної проби, см ^3;
а _к - те ж, для контрольної проби;
1,4 - коефіцієнт перерахунку кількості 0,1 н розчину лугу в міліграми азоту амінокислот і поліпептидів;
К - поправка до титру лугу.
2.2.15 Визначення активності ліпази (ЛЗ) (модифікований метод Ота, Ямада)
За одиницю ферментативної активності ліпази беруть таку кількість ферменту, що звільняє 21мкмоль олеїнової кислоти з 40%-ної емульсії оливкової олії при рН 7,0 і температурі 37 ^о С протягом 1 годину.
Метод заснований на визначенні шляхом титрування лугом жирних кислот, що утворилися під дією ліпази при використанні в якості субстрату оливкової олії.
Необхідні реактиви. ); 0,05н раствор гидроксида натрия ( NaOH ); фосфатно-цитратный буфер с рН 7,0; 1%-ный раствор фенолфталеина; 90%-ный раствор спирта; 1%-ный раствор фермента. Розчин оливкової олії (субстрат), 2%-ний розчин полівінілового спирту; 1н розчин соляної кислоти (HCl); 0,05 н розчин гідроксиду натрію (NaOH); фосфатно-цитратний буфер з рН 7,0; 1%-ний розчин фенолфталеїну; 90%-ний розчин спирту, 1%-ний розчин ферменту.
Техніка визначення. 5см ³ емульсії субстрату і 4см ³ буферу з рН 7,0 поміщають в колбу Ерленмейера на 100см ^3, яку закривають пробкою. Суміш витримують на водяній бані при температурі 37 ^о С протягом 10 хвилин. Потім до суміші додають 1см ³ розчину ферменту і добре перемішують. Отриману суміш витримують при температурі 37 ^о С протягом 1 години, після чого негайно додають 30см ³ етанолу для припинення реакції. в присутствии 1%-ного раствора фенолфталеина до исчезновения окраски. Розчин титрують 0,05 н розчином NaOH в присутності 1%-ного розчину фенолфталеїну до зникнення забарвлення.
Контрольну пробу готуючи таким чином. До суміші субстрату і буферу з рН 7,0, витриманої при температурі 37 ^о С, додають 30см ³ етанолу, потім 1см ³ ферментного розчину і суміш негайно титрують.
, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента. Різниця між результатами титрування контрольної і дослідної проб відповідає кількості 0,05 н розчину NaOH, яке пішло на нейтралізацію жирних кислот, що утворилися з оливкової олії під дією ферменту.
Ліпазную активність ферменту ЛЗ (в од / г) визначають за формулою (4):
ЛВ = , (4)
де ЛЗ - липолитическая активність, од / г;
А - різниця між результатами титрування дослідної та контрольної проб, см ^3;
Т - титр лугу;
В - концентрація зразка ферментного розчину, г / см ^3.
2.2.16 Визначення концентрації зважених речовин
Попередньо готують фільтри наступним чином: промивають гарячою водою (дистильованої), потім висушують до постійної ваги в сушильній шафі при температурі 105 ^о С.
Для визначення вмісту завислих речовин їх відокремлюють, фільтруючи стічну воду, об'ємом 50-100 см ³ через паперовий фільтр середньої щільності, доведений до постійної ваги. Що залишився на стінках склянки осад змивають невеликою порцією фільтрату і переносять на фільтр. Осад змивають невеликою кількістю (10-15 см ³⁾ спіртоефірной суміші для видалення речовин, сорбованих на поверхні завислих речовин. Фільтр з осадом поміщають в той же бюкс, в якому його зважували до фільтрування, і висушують у сушильній шарфу при температурі 105 ^о С протягом 2 годин. Бюкс закривають кришкою і охолоджують у ексикаторі над прожареним хлоридом кальцію. Потім зважують з абсолютною похибкою не більше 0,0002 г.
Висушування, охолодження, зважування повторюють до досягнення постійної маси.
Вміст зважених речовин визначають за формулою (5):
Х = , (5)
де Х - вміст завислих речовин;
₁ – масса бюкса с высушенным фильтром и осадком, г; m ₁ - маса бюкса з висушеним фільтром і осадом, г;
₂ – масса бюкса с высушенным фильтром, г; m ₂ - маса бюкса з висушеним фільтром, г;
– объем воды, взятой для фильтрования, см ³ . V - об'єм води, взятої для фільтрування, см ^3.
2.2.17 Визначення вмісту органічних речовин
), 0,2-0,4 см ³ сульфата серебра и при перемешивании приливают концентрированную серную кислоту (7,5 см ³ на 1 см ³ пробы, 15 см ³ на 5 см ³ пробы). Для визначення хімічного споживання кисню (ХСК) беруть 1-5 см ³ профільтрованої води, додають 2,5 см ³ 0,25 н розчину дихромата калію, 0,4 г сульфату ртуті (II), 0,2-0,4 см ³ сульфату срібла і при перемішуванні підливають концентровану сірчану кислоту (7,5 см ³ на 1 см ³ проби, 15 см ³ на 5 см ³ проби). При цьому температура розчину піднімається до 100 ^о С. -фенилантраниновой кислоты или 3-4 капель ферроина. Через 2 хвилини розчин охолоджують до кімнатної температури, доливають 100 см ³ дистильованої води і титрують надлишок дихромата калію 0,25 н розчином солі Мора в присутності 10-15 крапель N-фенілантраніновой кислоти або 3-4 крапель ферроіна. Зміна забарвлення в першому випадку від червоної до смарагдово-зеленої, у другому - від блакитно-зеленої до червоно-блакитний.
Паралельно проводять контрольний дослід без стічної води.
ГПК виражають у міліграмах кисню на 1 дм ³ води (МГО / дм ^3).
Розрахунок роблять за формулою (6):
₁ - V ₂ )× k ×0.25×8×1000 (V ₁ - V ₂₎ × k × 0.25 × 8 × 1000
ГПК =, (6)
V
де ХСК - хімічне споживання кисню, мг О ₂ / дм ^3;
₁ , V ₂ – объемы 0,25н раствора соли Мора, израсходованные на титрование в контрольном опыте и пробы сточной воды, см ³ ; V _1, V ₂ - обсяги 0,25 н розчину солі Мора, витрачені на титрування в контрольному досліді і проби стічної води, см ^3;
– поправочный коэффициент для приведения концентрации раствора соли Мора к точно 0,25н; k - поправочний коефіцієнт для приведення концентрації розчину солі Мора до точно 0,25 н;
0,25 - концентрація розчину солі Мора;
8 - еквівалент кисню;
– объем сточной воды, взятой на определение, см ³ . V - обсяг стічної води, взятої на визначення, см ^3.
2.2.18 Відбір проб методом асиметричної бахроми
Для порівнянності результатів досліджень різних факторів або технологічних параметрів необхідно виключити вплив топографії шкури, напівфабрикату або шкіри. У цьому випадку для відбору середньої проби користуються методом асиметричної бахроми (МАБ), який полягає в наступному. Намічають необхідну кількість варіантів дослідження і задаються числом зразків (смужок), що входять до групи, призначених для кожного варіанта (зазвичай не менше 4). Чим більше число зразків, тим більш достовірним буде середнє значення, що характеризує варіант. Розмір зразка визначається набором фізико-механічних або фізичних випробувань, які передбачається провести, а всі зразки повинні вкластися в прямокутник, вписаний в чепрачних частина, показаний на малюнку 3
5
1
4
2
3
3
2
4
1
5
5
1
4
2
3
3
2
4
1
5
Рисунок 3 - Схема відбору проб методом асиметричної бахроми
2.2.19 Визначення колористичних показників волосяного покриву
Колористичні показники волосяного покриву визначаються на приладі «Пульсар». Зразки ретельно розчісується, накривають склом і фотографують. Далі працюють при встановленні кнопки «режим» - 3.
Попередньо прилад прогрівають протягом 30 хвилин, потім натисненням кнопки «скидання» очищають панелі виводу.
Спочатку виробляють калібрування приладу, для цього встановлюють «режим» - 0 (калібрування приладу); «висновок» - 0. Білу пластину поміщають на місце відображає зразка; чорну - на місце вимірюваного зразка, натискають «пуск», після загоряння «Б» витягають чорну пластину. » извлекают белую пластину. Знову натискають «пуск», загоряється «I» витягають білу пластину. Встановлюють на індикаторі «режим» - 1; «висновок» - 0 (вимір прозорих проб) на місце прозорого зразка - дистильовану воду, натискають пуск.
Для вимірювання робочого зразка встановлюють пробу. Натискають «пуск», знімають показання індикатора відповідно літературними даними.
2.2.20 Визначення вмісту незв'язаних жирових речовин (ГОСТ 26129-84 Шкурки хутряні та овчина Шубна вироблені. Методи визначення незв'язаних жирових речовин)
Наважку подрібненої кожевой тканини чи волосу масою 0,5-0,6 г зваженої з похибкою не більше 0,0002 г, поміщають у паперову гільзу і закривають тампоном. Гільзу закріплюють у попередньо доведеної до постійної маси колбі і з'єднують колбу зі зворотним холодильником. У колбу заливають 50 см ³ хлороформу або дихлоретану. Колбу з розчинником нагрівають на електричній плитці з азбестовим покриттям. Тривалість екстрагування при аналізі кожевой тканини - 45 хвилин, при аналізі волосини - 15-20 хвилин. Розчинник повинен постійно кипіти і, охолоджуючись і стікаючи з холодильника, потрапляти в центр гільзи. Надалі розчинник відганяють і колбу з жировими речовинами доводять до постійної маси у сушильній шафі при температурі 128-130 ˚ С. Тривалість першої сушіння 30 хвилин, наступних - по 15 хвилин.
Масову частку жирових речовин обчислюють за формулою (8):
Х ₁ = × 100, (8)
де Х ₁ - Масова частка жирових речовин;
– масса колбы с экстрагированными веществами, г; m - маса колби з екстрагованих речовинами, г;
₁ – масса пустой колбы, г; m ₁ - маса порожньої колби, г;
₂ – масса навески кожевой ткани или волоса, г. m ₂ - маса наважки кожевой тканини або волосся, м.
3 Експериментальна частина
В даний час проблема забруднення водного басейну антропогенними скидами у всьому світі стоїть на першому місці. Для регіону республіки Бурятія ця проблема є найбільш важливою, так як на нашій території знаходиться світову спадщину - озеро Байкал. Характер стоків, що надходять у водний басейн досить різноманітний, так як на території республіки знаходиться досить багато середніх і дрібних підприємств з переробки пушно-хутряної сировини, з виробництва м'ясної та молочної продукції, важливе значення має забруднення побутовими стоками. ) и ( VI ), красители, ПАВ, а также жировые вещества, которые образуются при проведении процессов отмоки и обезжиривания. До основних забруднювачів стоків пушно-хутряних підприємств відносяться солі хрому (III) та (VI), барвники, ПАР, а також жирові речовини, які утворюються при проведенні процесів отмокі і обезжирення. При очищенні стічних вод, що містять жирові речовини, на першому етапі застосовують фізичні та фізико-хімічні методи очищення, найбільш поширеним з яких є метод флотації, на подальших етапах очищення великого поширення набули біологічні методи, засновані на застосуванні мікроорганізмів-деструкторів жирових речовин. Відомо, що деструкція жиру на першому етапі відбувається до гліцерину і карбонових кислот (основних складових у структурі жирів), інтерес представляють наступні продукти деструкції. У зв'язку з цим, метою дипломної роботи було вивчення морфолого-культуральних властивостей мікроорганізмів, виділених з жирових матеріалів і із стічних вод після процесу знежирення, і дослідження деструкції жирових речовин прокариотическими мікроорганізмами.
3.1 Відновлення та дослідження морфолого-культуральних властивостей мікроорганізмів, деструктуючих жирові речовини
З метою відновлення властивостей мікроорганізмів в рідкі поживні середовища об'ємом 150 см ³ на основі мясопептонного бульйону (МПБ) і синтетичної середовища Рана, в якій в якості джерела вуглецю служив нерпічій жир (п.2.2.1), внесли досліджувані культури в кількості 10 ⁵ кл / см ³ (петлею). Культивування проводили в колбах Ерленмейера об'ємом 250 см ³ в термостаті марки «ТС-80М-2» при температурі (37 ± 0,5) ˚ С протягом 24 годин у стані спокою. Після закінчення заданого часу культивування перенесли 0,1 мл. бактеріальної суспензії і виробили посів на відповідні щільні середовища в чашки Петрі.
Для дослідження морфолого-культуральних властивостей прокаріотів була відновлена культура мікроорганізмів методом штриха і розведень (п.п.2.2.2-2.2.3) на мясопептонном агарі (МПА) і на синтетичному середовищі Рана. Культивування проводили в перевернутих чашках Петрі в термостаті при температурі (37 ± 0,5) ˚ С протягом 24 годин для МПА і 48 годин для середовища Рана.
Виділені культури були позначені таким чином: Нв - мікроорганізми, виділені з жиру нерпи, але адаптовані до зростання на шерстном жирі; Н - мікроорганізми, виділені з жиру нерпи; В - виділені з вовняного жиру; 3, 8 - культури мікроорганізмів, виділені з стічних вод після проведення процесу знежирення хутряної овчини.
При розгляді характеру росту культур на різних середовищах можна відзначити, що колонії мікроорганізмів, вирощених на мясопептонном агарі, характеризуються більш значними розмірами, в порівнянні з культурами, вирощеними на синтетичному середовищі Рана, що зумовлено підвищеною чутливістю культур до агресивного середовища, що містить в якості єдиного джерела вуглецю нерпічій жир, у кількості 1 г / дм ^3.
Дослідження морфолого-культуральних властивостей, виділених колоній мікроорганізмів проводили за такими параметрами: фарбування за методами Грама, Трухільо і Леффлера (п.2.2.4), визначення рухливості методом роздавленої краплі (п.2.2.6) та визначення культуральних властивостей (п. 2.2 .5).
Результати дослідження морфолого-культуральних властивостей бактерій представлені в таблиці 3 та на рисунках А1-А5.
Таблиця 3 - Порівняльна таблиця морфолого-культуральних ознак досліджуваних культур
Ознака
Тип культури

Н
Нв
У
3
8
Місце виділення
Природні жири: шерстний, нерпічій.
Стічні води після проведення процесу знежирення
Морфологія
Коккобактеріямі
Палички, зчеплені попарно і більше
Рельєф колоній
Плоскі
Прозорість
Непрозора
Краї колонії
Рівні
Структура колонії
Гомогенна
Консистенція
Мазеподібної
Забарвлення за Грамом
+
+
+
+
+
Забарвлення за Трухільо
-
-
-
-

Забарвлення за Леффлера
+
+
+
+
+
Рухливість
+
+
+
+
+
Розташування джгутиків
Перетріхі
рН (опт)
5,6-7,5
Температура (опт), ^о С
25-40
Форма колоній
Точкова
Фарбування мазків показало, що всі культури є грампозитивними дрібними паличками, аспорогенних з перетріхіальним розташуванням джгутиків. ». Більш докладно форму бактерій можна розглянути на малюнках 2-6, отриманих в результаті фотографування забарвлених мазків на мікроскопі Ломо МИКМЕД-1 за допомогою цифрового фотоапарата «Samsung». За формою бактерій культури типу Н, Нв і В слід віднести до коккобактеріямі - дрібним паличкам, близьким до овальної форми, в той час як культури типу 8, 3 представляють собою бактерії, діплобактеріі і стрептобактеріі. Розмір досліджуваних мікроорганізмів варіюється в межах 0,1-0,5 нм.
При розгляді роздавленої краплі бактеріальної суспензії було відзначено броунівський рух бактерій, що супроводжується обертальним рухом, обумовленим перетріхіальним розташуванням джгутиків.
Результати вивчення культуральних властивостей представлені на малюнках А6-А10. При вивченні культуральних властивостей встановлено, що всі культури мають точкові колонії матового кольору, непрозорі, з рівними краями.
Для визначення липолитической активності був проведений посів в бульйон Штерна, що містить у ролі субстрату гліцерин. Посів проводили наступним чином: для отримання біомаси досліджуваної культури мікроорганізмів виробляли посів на скошену синтетичну середовище і культивували протягом 24 годин при температурі (37 ± 0,5) ˚ С, потім зробили змив отриманої біомаси 10 см ³ бульйону Штерна в пробірки, і термостатіровалі при температурі (37 ± 0,5) ˚ С протягом 120 годин в термостаті марки «ТС-80М-2».
При розгляді поведінки культур в даному середовищі виявлено, що вже до 24-48 годин культивування мало місце перехід забарвлення бульйону з рожевого в яскраво - червоний (малюнок А11), освіта пластівчасті осаду і газоутворення. До 72 години культивування спостерігалося поява біоплівки і пристінкового кільця, а до 96 години посветленіе середовищ до світло-рожевого кольору. При розгляді забарвлення по стовпу рідини була відзначена її діфференсація: фарбування була більш інтенсивною в верхній частині рідини, що можливо обумовлено більш високим вмістом кисню в цьому шарі. Отже, для зростання даних мікроорганізмів необхідний кисень.
Також було відзначено зміна активної реакції середовища (рН = 7 контрольної проби). Через 24 години культивування після зараження бульйону Штерна при температурі (37 ± 0,5) ˚ С сталося зниження рН з 5 до 3 для всіх досліджуваних середовищ за винятком середовищ, що містять культуру 8, активна реакція якої зберігалася протягом 72 годин і становила рН = 4, а до 120 годин культивування підвищилася до рН = 5. Для решти культур було характерно плавне підвищення активної реакції середовища до рН = 5 до закінчення культивування (120 годин).
На основі проведених досліджень слід зазначити, що досліджувані культури мікроорганізмів мають липолитической активністю, тобто залучають речовини жирової природи (як джерело вуглецю) в конструктивний і енергетичний обмін, що помітно за такими показниками середовища як: поява пластівчасті осаду, зміна кольору від відновлення індикатора при зміні рН. Однак виявлення культури з чітко вираженою максимальною величиною активності по ліпазі не було - спостерігається однаково рівнозначні характеристики росту на спеціалізованій середовищі протягом усього періоду культивування.
3.2 Вивчення толерантності досліджуваних культур до факторів зовнішнього середовища
Для дослідження впливу зовнішніх факторів на динаміку росту і розвитку мікроорганізмів, а також для культур, які продукують сумарний продукт життєдіяльності мікроорганізмів з максимальною липолитической і мінімальної протеолітичної активністю провели скринінгове дослідження.
Для цього культивування проводили в колбах Ерленмейера об'ємом 250 см ^3, що містить 200 мл бактеріальної суспензії на основі рідкої синтетичної середовища Рана (п.2.2.8). Кількість введеної біомаси ¹⁰ Травень кл / см ³ на 200 см ³ робочої рідини. -357», с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 2 ч в сутки в течение 48 часов. Культивування мікроорганізмів проводили в термостаті при температурі (37 ± 5) ° С, здійснюючи змінне механічний вплив на встряхиватель «Shaker Type -357», з частотою коливань 200 об / хв, амплітудою 6 по 2 год на добу протягом 48 годин. Для вивчення динаміки активності мікроорганізмів через кожні 24 години знімали такі свідчення, як підрахунок величини КУО (п.2.2.9), мутність (п.2.2.10), кислотність (п.2.2.11), активна реакція середовища (п.2.2 .16) після 48 годин культивування було визначено сумарний продукт життєдіяльності мікроорганізмів (п.2.2.12). Крім того, визначали показники для контрольної середовища - не зараженої культурами мікроорганізмів.
Для визначення липолитической і протеолітичної активностей ендофермента бактеріальну суспензію після 48 годин культивування піддавали центрифугированию при 5000 об. / хв. протягом 15 хвилин. Осад, що утворюється в результаті центрифугування заморожували, після чого розтирали у фарфоровій ступці з склом, додавши 100 см ³ дистильованої води. Отриману суспензію центрифугували при 5000 об. / хв. 10 хвилин для видалення скла. ₄ ) ₂ SO ₄ для высаливания белка и центрифугировали при 5000 об./мин. Після того як, скло видалили в отриману рідину вводили 30% від обсягу (NH _{4) 2} SO ₄ для висолювання білка і центрифугували при 5000 об. / хв. протягом 15 хвилин, після чого на стінках центріфужний пробірки утворювався жовтий наліт, який збирали в колбу Ерленмейера об'ємом 100 см ³ та доливали 30 см ³ дистильованої води, ретельно перемішували і і відбирали проби для визначення ліполітичних, протеолітичних властивостей (п.2.2.13 , 2.2.14) і сумарного продукту життєдіяльності мікроорганізмів.
₄ ) ₂ SO ₄ для высаливания белка, и проводили все операции аналогично как при определении активностей эндофермента. Для визначення ліполітичних і протеолітичних властивостей екзоферментів в над осадову рідина отриману після першого центрифугування при визначенні властивостей ендофермента вводили 30% від обсягу (NH _{4) 2} SO ₄ для висолювання білка, і проводили всі операції аналогічно як при визначенні активностей ендофермента.
Протеолітичну активність визначали за методом Вильштеттера і Вальдшмідта-Лейтц (п.2.2.13) і розраховували за формулами (2) і (3).
Приклад розрахунку протеолітичної активності для культури Н:
а = 1,4 мл.; а _до = 1,29 мл.
А = (1,4-1,29) × 1,4 × 1 = 0,154 мг.
0,154 × 12 × 100
ПС = = 3,08 од. на 1 м. культури.
3 × 1 × 2 × 10
Липолитическую активність визначали за модифікованим методом Ота, Ямада (п.2.2.14) і розраховували за формулою (4).
Приклад розрахунку липолитической активності для культури Н:
В = 46,3 г / см ^3; А = 0,25 см ^3.
0,25 × 2 × 50
ЛВ = = 0,54 од. / М.
46,3
Подальші розрахунки проводили аналогічним чином. Результати, отримані після проведення скринінгове досліджень, представлені в таблиці 4.
Таблиця 4 - Результати проведення скринінгове досліджень
Показання
Тип культури

Н
Нв
У
3
8
Контр

0ч
48ч
0ч
48ч
0ч
48ч
0ч
48ч
0ч
48ч

рН
7,25
7,40
7,28
7,44
7,30
7,40
7,33
7,40
7,37
7,10
7,31
Кислотність, г / дм ³
1,26
1,56
1,20
1,26
1,20
1,38
1,50
1,20
1,50
1,44
1,20
₅₄₀ ² Оптична щільність D ₅₄₀ ²
7,00
8,10
6,20
5,60
5,80
5,60
6,60
4,60
4,00
5,80
5,60
КУО, кл / см ³
3,3 × 10 ⁵
5,1 × 10 ⁵
1,2 × 10 ⁶
6,1 × 10 ⁶
5,8 × 10 ⁵
4,1 × 10 ⁶
7,3 × 10 ⁵
5,3 × 10 ⁶
2,4 × 10 ⁶
6,8 × 10 ⁶
-
Сум-ий продукт жизн-ти, гр. / дм ³
0,08
0,05
0,17
0,04
0,03
-
Протеолітична активність екзоферментів, од. / гр.
3,08 ± 0,12
5,32 ± 0,25
8,26 ± 0,23
3,36 ± 0,27
5,60 ± 0,32
-
Протеолітична активність ендофермента, од. / гр.
1,82 ± 0,23
3,64 ± 0,19
2,66 ± 0,31
5,60 ± 0,24
11,2 ± 0,30
-
Ліполітична активність екзоферментів, од. / гр.
0,54 ± 0,26
1,16 ± 0,23
0,26 ± 0,14
1,79 ± 0,12
1,79 ± 0,23
-
Ліполітична активність ендофермента, од. / гр.
0,83 ± 0,21
2,15 ± 0,17
0,76 ± 0,28
2,87 ± 0,26
3,59 ± 0,11
-
Отримані результати показують, що для всіх культур, за винятком культур 3 і 8, характерне зростання кислотності до 48 годин культивування, що пов'язано із залученням жирового матеріалу в конструктивний і енергетичний обмін мікроорганізмами. У результаті метаболічних процесів спостерігається деструкція жирового матеріалу до гліцерину і карбонових кислот, в результаті утворення яких підвищується кислотність середовища. Наприклад, кислотність середовища, що містить культуру Н зростає з 1,26 г / дм ³ до 1,56 г / дм ^3, що відповідає найбільш максимальному зростанням кислотності в порівнянні з іншими середовищами. Найменша інтенсивність зростання даного показника відзначена для середовищ, що містять культуру Нв - збільшення з 1,2 г / дм ³ до 1,26 г / дм ^3.
Оптична щільність визначали на фотоколориметр ФЕК-4 при довжині хвилі 540 нм, чутливості 2 і товщині поглинаючого шару 3,025 мм. При вивченні динаміки зміни значень каламутності можна відзначити, що для бактеріальних суспензій культур Н і 8 характерне зростання даного показника протягом 48 годин культивування, пов'язаний з настанням для культур мікроорганізмів сприятливою для їх бурхливого розвитку лог-фази. Найбільше збільшення значення каламутності характерно для середовища, що містить культуру 8. До 48 годин культивування спостерігалося зростання каламутності з 4,0 до 5,8, що пов'язано з інтенсивним залученням природних жирових речовин в клітинний метаболізм. Зменшення значення каламутності спостерігалося у бактеріальних суспензій культур Нв, В і 3. Дана динаміка може пояснюватися процесами автолізу, зокрема зростанням лімітування по субстрату і утворенням альдегідів
Зміна рН робочої рідини проводили на цифровому іономір Аніон 7000. З даних таблиці видно, що зменшення рН спостерігалося тільки для середовища, що містить культуру 8, що ймовірно пов'язано з деструкцією жиру і утворенням гліцерину і карбонових кислот, які обумовлюють кислу реакцію середовища.
Про O
/ / / /
₁ – C СН ₂ - О - С R ₁ - C
\ \
₁ CH ₂ – OH OH R ₁ CH ₂ - OH OH
О ç O ê Про ç O
– OH + // / / CH - OH + / /
₂ – C СН - О - С ® ç R ₂ - C
₂ – OH \ \ CH ₂ - OH \
R ₂ OH
ê O O
/ / / /
CH ₂ - O - C R ₃ - C
\ \
₃ OH R ₃ OH
Протягом 48 годин ймовірно відбувається розщеплення карбонових кислот мікроорганізмами до відповідних альдегідів, які окислюються до кислот або полімеризуються. У результаті чого значення рН через 48 годин збільшилася для середовищ, що містять культури Н, Нв, В і 3.
O O
/ / / /
– C ® R – C R - C ® R - C
\ \
OH H
Також спостерігалося стійке зростання величини КУО протягом усього періоду культивування з 10 ⁵ по 10 ⁶ кл / см ^3, що вказує на достатню кількість субстрату в синтетичному середовищі і його утилізації.
На підставі проведення скринінгове досліджень можна відзначити, що всі досліджувані культури здійснюють деструкцію жирового матеріалу. Деструкція жирового матеріалу на першому етапі можливо походить до гліцерину і карбонових кислот, це підтверджується збільшенням значень кислотності в перші години культивування. У результаті проведення попереднього скринінгу та вивчення морфолого-культуральних ознак досліджуваних прокаріотів були відібрані найбільш активні культури для проведення подальших досліджень. Інтерес представляла культура 8, що характеризується максимальним зростанням оптичної щільності середовища до 48 годин культивування та культура Нв з найбільшим значенням липолитической активності. Для обраних культур провели скринінгове дослідження через 24 год і 48часов за яким зробили підбір оптимального часу культивування. Результати представлені в таблиці 5 і на малюнках 4-6.
Таблиця 5 - Підбір оптимального часу культивування
Показання
Тип культури

8
Нв

0ч
24г
48ч
0ч
24г
48ч
рН
7,64
7,61
7,67
7,65
7,63
7,66
Кислотність, г / дм ³
1,30
1,40
1,70
1,40
1,60
1,50
₅₄₀ ² Оптична щільність D ₅₄₀ ²
4,50
5,20
3,60
4,80
4,90
4,70
КУО
2,70 × 10 ⁶
5,10 × 10 ⁶
8,40 × 10 ⁶
9,20 × 10 ⁵
2,50 × 10 ⁶
4,70 × 10 ⁶
Сум-ий продукт жизн-ти, м / дм ³
-
0,05
0,03
-
0,03
0,01
Протеолітична активність, од. / гр.
-
2,80 ± 0,25
2,24 ± 0,16
-
4,48 ± 0,22
1,68 ± 0,15
Ліполітична активність, од. / гр.
-
4, 53 ± 0,21
1, 23 ± 0,24
-
3, 47 ± 0,18
1, 19 ± 0,27
При аналізі таблиці можна зробити висновок, що при досягненні необхідного обсягу бактеріальної суспензії значних змін в показаннях не відбувалося. Ймовірно, це говорить про те, що система стабілізована.
Рисунок 4 - Динаміка зміни активної реакції середовища для середовищ, що містять культури 8 і Нв

Рисунок 5 - Динаміка зміни кислотності для середовищ, що містять культури 8 і Нв
Для показника кислотності бактеріальних суспензій характерно збільшення до 24 години культивування для середовищ, що містять культури Нв і 8, з подальшим зменшенням значення кислотності для середовища, що містить культуру Нв, обумовлене, можливо повним розщепленням субстрату, в якості якого виступав нерпічій жир і розщеплення утворилися карбонових кислот до альдегідів, або одноатомних спиртів. Для середовища, що містить культуру 8 спостерігалося збільшення кислотності до 48 годин культивування, що пов'язано з її меншою активністю.

Малюнок 6 - Динаміка зміни оптичної щільності для культур 8 і Нв
При розгляді динаміки зміни оптичної щільності можна відзначити збільшення даного показника для обох культур, що пов'язано з інтенсивним залученням природних жирових речовин в клітинний метаболізм. А надалі, у зв'язку з автолітіческімі процесами, найбільш важливим з яких є лімітування по субстрату, настає так звана фаза відмирання мікроорганізмів, що тягне за собою зменшення показань каламутності до 48 годин культивування.
Малюнок 7 - Діаграма залежності протеолітичної і липолитической активностей сумарного продукту життєдіяльності мікроорганізмів від тривалості культивування
При аналізі протеолітичної і липолитической активностей можна зробити висновок, що мінімальною протеолітичної активністю має сумарний продукт життєдіяльності культури Нв, а максимальною липолитической активністю має сумарний продукт життєдіяльності культури 8 через 24 години культивування. Отже, в підготовчих процесах вироблення, а саме в знежирення буде використана культура 8.
3.3 Проведення процесу знежирення хутряної овчини з застосуванням бактеріальної суспензії
Метою даного етапу експерименту було вивчення можливості застосування мікроорганізмів для проведення процесу знежирення хутряної овчини. Грунтуючись на результати скринінгове дослідження, були обрані оптимальний час культивування (24 години) і культура 8 в якості продуцента сумарного продукту життєдіяльності мікроорганізмів.
Для проведення процесу знежирення за типовою методикою необхідна наявність в робочій ванні таких компонентів, як формальдегід - 0,5 см ³ / дм ^3, карбонат натрію - 1 г / дм ³ та ПАР - 6 г / дм ^3. Проведення процесу із застосуванням мікроорганізмів дозволяє повністю виключити формальдегід, і карбонат натрію і ПАР.
На першому етапі був проведений посів культури 8 на скошену синтетичну середу Рана, що містить нерпічій жир як джерело вуглецю в кількості 10 кл / см ³ на 500 см ^3. Культивування проводили в колбах Ерленмейера об'ємом 250 см ³ в термостаті марки «ТС-80М-2» при температурі (37 ± 0,5) ˚ С протягом 24 годин. Після закінчення заданого часу справили змив виросли культур зі скошеною синтетичної середовища приготовленої рідким середовищем Рана об'ємом 300 мл. -357», с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 2 ч в сутки в течение 24 часов. і термостатіровалі, здійснюючи змінне механічний вплив на встряхиватель «Shaker Type -357», з частотою коливань 200 об / хв, амплітудою 6 по 2 год на добу протягом 24 годин. Через кожні 24 години доливали по 300 мл. стерильною рідкої синтетичної середовища Рана і визначали перед внесенням середовища такі свідчення як оптична щільність, рН, КУО, сумарний продукт життєдіяльності мікроорганізмів. Результати представлені в таблиці 6.
Таблиця 6 - Вплив тривалості культивування на властивості бактеріальної суспензії
Показання
Тривалість культивування, год

0
24
48
72
96
120
144
168
рН
7,92
7,84
7,78
7,62
7,60
7,60
7,57
7,60
Кислотність, г / дм ³
1,40
1,40
1,50
1,70
1,70
1,60
1,60
1,50
₅₄₀ ² Оптична щільність D ₅₄₀ ²
7,50
7,80
8,50
8,50
8,10
7,80
7,30
6,60
КУО
2,30 × 10 ⁶
5,80 × 10 ⁶
4,30 × 10 ⁶
1,20 × 10 ⁶
7,50 × 10 ⁶
6,40 × 10 ⁶
8,20 × 10 ⁶
7,6 × 10 ⁶
Показання
Тривалість культивування, год

0
24
48
72
96
120
144
168
Сум-ий продукт жизн-ти, м / дм ³
-
0,03
0,03
0,01
0,04
0,05
0,05
0,05
Обсяг бактеріальної суспензії, дм ³
0,50
0,80
1,10
1,40
1,70
2,00
2,30
2,60
Для проведення процесу знежирення в присутності мікроорганізмів матковий розчин був приготований в чотирьох варіантах: у першому випадку концентрований розчин (100%), в інших - з розведенням: у другому випадку - 75%, в третьому випадку - 50% і в четвертому випадку 25% від обсягу робочої ванни. Також були відібрані зразки хутряної овчини, розміром 10 × 10 см за методом асиметричної бахроми (п.2.2.18). Процес знежирення хутряної овчини проводили протягом 45 хвилин при температурі 40 ˚ С з змінним механічним впливом на основі бактеріальної суспензії без введення СПАР і формаліну.
Для дослідження процесу знежирення було приготовлено 5 робочих складів, характеристика яких представлена в таблиці 7. В якості контрольного варіанту процес знежирення проводили за типовою методикою.
Таблиця 7 - Характеристика робочих ванн
Склад ванни
Витрата бактеріальної суспензії від обсягу робочої ванни,%
Состав1
100
Состав2
75
Состав3
50
Складу 4
25
Склад 5
Типова методика
До і після процесу знежирення були зняті такі свідчення, як ліполітична, протеолітична активності, вміст жирових речовин в кожевой тканини і волосяному покриві і колористичні показники волосяного покриву.
Розрахунок липолитической і протеолітичної активностей складу ванни 1 (100% витрати бактеріальної суспензії від обсягу робочої ванни) проводився аналогічно розрахунками при вивченні толерантності досліджуваних культур до факторів зовнішнього середовища. Результати розрахунку представлені в таблиці 8.
Таблиця 8 - Показники липолитической і протеолітичної активностей до і після проведення процесу знежирення
Показання
До знежирення
Після знежирення
Ліполітична активність, од. / гр.
4,316
2,284
Протеолітична активність, од. / гр.
2,27
1,86
Оцінку вмісту жиру в волосі і кожевой тканини проводили на апараті Зайченко (п.2.2.20) і розраховували за формулою (8).
Приклад розрахунку вмісту жирових речовин в кожевой тканини до процесу знежирення за типовою методикою:
= 112,6616 г.; m ₁ = 112,5058 г.; m ₂ = 0,5684 г. m = 112,6616 р.; m ₁ = 112,5058 р.; m ₂ = 0,5684 р.
(112,6616-112,5058) × 100%
₁ = = 27,41% X ₁ = = 27,41%
0,5684
Подальші розрахунки були проведені аналогічним чином.
Результати визначення вмісту незв'язаних жирових речовин представлені в таблиці 9.
Таблиця 9 - Вміст незв'язаних жирових речовин в кожевой тканини і у волосяному покриві до і після проведення процесу знежирення
Склад ванни
Топографічний
ділянка шкіри
Зміст жирових речовин в кожевой тканини,%
Зміст жирових речовин у волосяному покриві,%

До знежирення
Після знежирення
До знежирення
Після знежирення
Состав1
Вороток
-
19,35
-
9,25

Підлоги
-
4,46
-
2,64

Хребет
-
17,96
-
8,21
Состав2
Вороток
-
21,63
-
10,18

Підлоги
-
4,53
-
2,83

Хребет
-
19,32
-
8,76
Состав3
Вороток
-
22,71
-
11,56

Підлоги
-
4,67
-
3,17

Хребет
-
20,27
-
10,50
Складу 4
Вороток
-
23,52
-
12,32

Підлоги
-
4,72
-
3,44

Хребет
-
22,64
-
12,04
Склад 5
Вороток
27,41
13,83
15,14
6,14

Підлоги
5,10
4,43
3,10
1,98

Хребет
26,41
13,79
13,17
5,79
Результати, наведені в таблиці 9 показують, що всі склади мають знежирюючим дією. При порівнянні проведення процесу знежирення за запропонованою і типовий методикою видно, що склади ванн 1-4 мають менший знежирюючим дією, ніж склад робочої ванни, проведеної за типовою методикою. Ймовірно, це пов'язано з тим, що до складу ванн 1-4 не входив СПАР, присутність якого необхідно для знежирення й емульгування природного жиру, що міститься в волосі і кожевой тканини.
Діаграми залежності вмісту жирових речовин в кожевой тканини і волосяному покриві по топографічних ділянках від складу ванни представлені на малюнках 8, 9.
Малюнок 8 - Діаграма залежності вмісту жирових речовин в кожевой тканини по топографічним ділянках від складу робочої ванни
Рисунок 9 - Діаграма залежності вмісту жирових речовин у волосяному покриві по топографічних ділянках від складу робочої ванни
При порівнянні знежирюючого дії між концентрованим і розведеним робочим розчинами можна відзначити, що проведення процесу в концентрованих бактеріальних суспензіях тягне за собою зниження вмісту жирових речовин, як у волосині, так і в кожевой тканини. Однак, різниця вмісту жиру в волосі і кожевой тканини після проведення процесу в концентрованих і розведених розчинах бактеріальних суспензій не на багато відрізняється. Таким чином, найбільш доцільним варіантом проведення знежирення хутряної овчини у присутності мікроорганізмів є склад ванни 1 (100% витрати бактеріальної суспензії від обсягу робочої ванни).
Типова і запропонована методики показали зниження вмісту жирових речовин в межах ГОСТ (10-20% для кожевой тканини і 2% для волосяного покриву). За типовою методикою після проведення процесу знежирення вміст жирових речовин в кожевой тканини зменшилася в середньому на 46%, у волосяному покриві на 56%, а при використанні складу ванни 1 у відсутності СПАР в кожевой тканини зменшилася кількість жирових речовин на 29% і у волосяному покриві на 36%.
Також можна відзначити, що підлоги є таким топографічним ділянкою, в якому міститься найменша кількість жирових речовин (5,1% у кожевой тканини і 3,1% у волосяному покриві), а комірець містить найбільшу кількість жирових речовин (27,41% у кожевой тканини і 15,14% у волосяному покриві).
Колористичні показники волосяного покриву визначали на приладі «Пульсар» (п.2.2.18). Результати дослідження представлені в таблиці 10.
Таблиця 10 - Колористичні показники волосяного покриву до і після процесу знежирення
Склад ванни
Топографічний
ділянка шкіри
Білизна, бали
Жовтизна, бали

До знежирення
Після знежирення
До знежирення
Після знежирення
Состав1
Вороток
70,40
77,96
22,71
17,56

Підлоги
72,59

Склад ванни	Вміст зважених речовин, мг / дм ³	рН	ГПК МГО ₂ / дм ³	Кислотність, г / дм ³	₅₄₀ ² Оптична щільність D ₅₄₀ ²	Сум-ий продукт жизн-ти, м / дм ³
Состав1	480	7,61	8200	1,20	1,20	0,04
Состав2	440	7,55	6560	0,84	1,20	0,03
Состав3	380	7,55	5740	0,60	2,20	0,04
Складу 4	350	7,57	4100	0,30	5,70	0,04
Склад 5	616	7,55	13120	0,60	40,00	-