Морфологія і метаболізм дріжджів

У більшості дріжджів колонії білі, часто купують при старінні кремовий або злегка коричневий відтінок. У деяких аскоспорових дріжджів, наприклад, з родів Nadsonia , старые колонии при обильном спорообразовании темнеют и становятся бурыми или шоколадными. або Lipomyces, старі колонії при рясному спорообразовании темніють і стають бурими або шоколадними. Багато дріжджі утворюють пігменти, що забарвлюють колонії в різні кольори. , Sporobolomyces , Cystofilobasidium Наявність каротиноїдних пігментів, що надають колоніям червону, рожеву, помаранчеву або жовте забарвлення, характерне для базідіоміцетових дріжджів пологів Rhodotorula, Sporobolomyces, Cystofilobasidium та ін Так само існують дріжджі виділяють у середу червоно-вишневий пігмент пульхеррімін. «Чорні дріжджі» формують темно-бурі або чорні колонії за рахунок накопичення меланіноподобних пігментів.

При зростанні у рідких середовищах дріжджі викликають помутніння, утворюють осад, кільце на стінках пробірки, різного характеру плівки. Як правило, ріст у вигляді плівки характеризує здатність дріжджів об'єднуватися в міцеліальні структури або свідчить про окислювальному типі енергетичного метаболізму (Бабьева, Чернов, 2004).

1.2 мікроморфології

Включає ознаки, що характеризують окремі клітини (форма, розміри), а також способи вегетативного і безстатевого розмноження і утворені при цьому структури.

Для більшості аскоміцетових дріжджів характерно багатостороннє брунькування, нирка виникає на будь-якому місці клітинної поверхні послідовно одна за одною, але у деяких видів може закладатися одночасно кілька нирок. У цьому випадку мова вже йде про множинне брунькування. При полярному брунькування закладка нирок відбувається тільки строго по полюсах клітини і кожна наступна нирка виникає на місці попередньої. ) или лимонную, апикулятную (у родов Saccharomycodes , Nadsonia и др.). При цьому шрами брунькування наростають один на інший і надають клітині характерну форму: грушовидну (у роду Schizoblastosporion) або лимонну, апікулятную (у пологів Saccharomycodes, Nadsonia та ін.)

1.3 Псевдоміцелій

У багатьох видів дріжджів в певних умовах зростання материнські і дочірні клітини після брунькування не роз'єднують, а продовжують розмножуватися брунькуванням. У результаті виникають структури, що імітують міцелій. Такий міцелій називають помилковим, або псевдоміцелія. На відміну від істинного (септірованного) міцелію, в нитках псевдоміцелія між клітинами звичайно добре помітні перетяжки, а апікальні (кінцеві) клітини завжди коротше попередніх. Псевдоміцелій, що стоїть тільки з клітин одного типу, схожих за формою та розмірами, називають примітивним (рудиментарним). Складний псевдоміцелій складається з клітин більш ніж одного типу, звичайно в ньому різко розрізняють довгі клітини, які складають псевдогіфи, і розташовані на них та зібрані гронами круглі, овальні або клиноподібні нирки, які в цьому випадку називаються бластоспорамі (малюнок № 1). , Pichia (http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm) Освіта псевдоміцелія характерно для багатьох аскоміцетових дріжджів, наприклад, з родів Candida, Pichia (http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm)

Малюнок 1. Примітивний - складається з клітин одного типу

Складний - складається з клітин декількох типів, зазвичай з подовженого стовбурових (псевдогіфи) і більш округлих дрібних (бластоспори).

1.4 диморфізм і плеоморфізм

Для дріжджів, як і для інших грибів, відомі явища диморфізму і плеоморфизмом. Міцеліальних-дріжджовий диморфізм проявляється в тому, що один вид може рости у двох формах - одноклітинної і міцеліальних. Це явище відоме в мікології і пов'язане з двома типами зростання - сферичним і апікальним. Є дріжджі, які утворюють лише одноклітинні популяції, хоча можуть рости у вигляді конгломератів з окремих клітин, вони можуть формувати структури, зовні імітують міцелій. Типовий дріжджовий зростання в процесі всього життєвого циклу характерний для багатьох видів аскоспорових дріжджів. Інша група дріжджоподібних грибів має або міцеліальних, або одноклітинних форму росту залежно від стадії життєвого циклу. Наприклад, у базадоміцетових дріжджів зазвичай гаплоидная фаза одноклітинна, а диплоїдна (дікаріотіческая) - міцеліальних.

Третя група дріжджів проявляє дріжджовий або міцеліальних зростання в залежності від умов середовища. Наприклад, перехід від однієї клітинної фазі росту може бути пов'язаний з умовами аерації.

Про явище плеоморфизмом кажуть, коли в життєвому циклі одного виду існують два або кілька видів безстатевого розмноження. Плеоморфізм у дріжджоподібних грибів виражається в тому, що поряд з основним типом вегетативного розмноження брунькуванням або розподілом деякі дріжджі утворюють особливі безстатеві структури, призначені спеціально для розповсюдження або збереження виду, наприклад, баллітоспори, ендоспори, хламідоспори.

Баллітоспори - це екзогенні спори (конідії), які формуються на загострених кінчиках особливих виростів - стеригм, і при дозріванні з силою відстрілюються за рахунок крапельно-екскреторної механізму. Здатність до утворення баллітоспор, що розсіюються через повітряне середовище, властива дріжджів, що мешкають на надземних частинах рослин. , Sporobolomyces , Bullera и др. Прикладами є дріжджі пологів Sporidiobolus, Sporobolomyces, Bullera та ін

) из участков цитоплазмы, которые отделяются мембраной и затем образую клеточную стенку. Ендоспори представляють собою безстатеві ендогенні клітини, що формуються переважно у гіфах міцеліальних дріжджів (наприклад, Trichosporon) з ділянок цитоплазми, які відокремлюються мембраною і потім утворю клітинну стінку. Кількість ендоспори в одній клітці суворо не фіксоване. Після руйнування міцелію ендоспори звільняються і починають розмножуватися брунькуванням. Ендоспори ні за структурою, ні за стійкості не відрізняються від вегетативних клітин.

Хламідоспори - великі сферичні або овальні клітини, які утворюються як з поодиноких дріжджових вегетативних клітин, так і на міцелії: інтекалярно, латерально або термінально, по одній або ланцюжками. Хламідоспори на міцелії утворює, наприклад, Candida (рисунок №2). albicans (малюнок № 2). У хламідоспор значно знижена метаболічна активність, їх клітинні стінки володіють стійкістю до дії літичних факторів. Біологічна функція таких структур полягає в тривалому збереженні життєздатності в умовах голодування або низької вологості. (Http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm)

Малюнок 2. Phaffia rhorozyma Candida albicans

Істинний міцелій дріжджоподібних грибів має різну будову в залежності від таксономічного положення.

1.5 Особливості метаболізму

Хоча дріжджі і не такі різноманітні за своїм метаболізму, як бактерії, різні види дріжджів можуть катаболізіровать різні сполуки вуглецю і азоту і утворювати різні кінцеві продукти

Малюнок 3. (Http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm.)

1.5.1 Спиртове бродіння

Найбільш відоме властивість багатьох дріжджів - здатність до спиртного бродінню. Багато видів дріжджів можуть переключатися з бродильного метаболізму на дихальний і назад в залежності від умов: за наявності кисню бродіння інгібується і дріжджі починають дихати, у відсутності кисню включається механізм спиртового бродіння. Так як кисневе дихання - енергетично більш вигідний процес, ніж бродіння, то вихід біомаси дріжджів в розрахунку на одиницю використовуваного субстрату вище при вирощуванні їх в аеробних умовах, ніж в анаеробних. Це явище називається ефектом Пастера.

Спиртове бродіння може йти не тільки в анаеробних умовах. Якщо вирощувати дріжджі в присутності кисню, але при високому вмісті глюкози в середовищі, то в цьому випадку дріжджі також зброджують глюкозу. Таким чином, глюкоза пригнічує процеси анаеробного дихання. Це явище отримало назву ефекту Кребтрі, або катаболітной репресії.

Багато дріжджі взагалі не здатні бродити. За співвідношенням між цими двома процесами в метаболізмі можна виділити наступні групи дріжджів.

1. Дріжджі, що існують тільки за рахунок бродіння і не здатні рости в аеробних умовах. , обитающие в кишечном тракте грызунов. До них відносяться, наприклад, вид Arxiozyma telluris, що живуть у кишковому тракті гризунів.

2. Активні бродільщікі інтенсивно зброджують різні субстрати, але в анаеробних умовах перемикаються на дихальний обмін. Представники - Saccharomysec cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe.

3. Слабкі бродільщікі в основному живуть за рахунок аеробного дихання, але в аеробних умовах можуть бродити, проте значно менш інтенсивно, ніж види з попередньої групи. , Dedaryomycas , а также все способные к брожению базидиомицетовые дрожжи. Це аскоміцетовие дріжджі з родів Pichia, Dedaryomycas, а також всі здатні до бродіння базідіоміцетовие дріжджі.

4. Дріжджі існують тільки а рахунок дихання і не здатні рости в анаеробних умовах. , Rhodotorula , Sporobolomyces . До цієї групи відносяться аскоміцетовие дріжджі базідіоміцетового аффинитет - Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolomyces.

Основними продуктами спиртового бродіння є етанол і вуглекислота, проте, в микроколичествах утворюється також безліч побічних сполук.

Субстрати бродіння. Всі бродять дріжджі зброджують глюкозу і фруктозу, оскільки саме з цих цукрів починається гліколітичні розщеплення. Крім глюкози і фруктози можуть зброджувати інші сполуки, які легко перетворюються в інтермедіати гликолитического шляху. В основному до них належать галактоза, з дисахаридів - сахароза, мальтоза, трегалоза. Значно рідше зустрічаються дріжджі, зброджують лактозу і мелібіози.

Деякі дріжджі здатні зброджувати полісахариди. активно сбраживает крахмал. Наприклад, Sacchoromycopsis fibuliger активно зброжує крохмаль.

Довгий час не були відомі дріжджі, здатні інтенсивно зброджувати пентози. в. Такі види були описані тільки до початку 80-х рр.. XX ст. (несовершенная стадия – Candida shehatae ), Pachysolen tannophilus (Бабьева, Чернов, 2004). До них відносяться, наприклад, Pichia stipis (недосконала стадія - Candida shehatae), Pachysolen tannophilus (Бабьева, Чернов, 2004).

1.5.2 Дихання

При зростанні в аеробних умовах при низькому вмісті глюкози в середовищі дріжджі одержують АТФ за рахунок процесів дихання, як це робить більшість аеробних організмів. Повне окислення субстрату до вуглекислого газу і води може відбуватися у дріжджів за допомогою трьох різних механізмів: в циклі трикарбонових кислот, в гліоксілатном циклі і в пентозафосфатном циклі.

Спектр вуглецевих сполук, засвоюваних дріжджами за рахунок аеробного дихання, значно ширше, ніж у випадку бродіння.

1.5.3 Вторинні продукти метаболізму

У процесі росту дріжджі на ряду з основними продуктами (етанол, СО ₂₎ утворюють безліч інших метаболітів, які при катаболізмі вуглеводів, обміні амінокислот та ін Хоча сполуки зазвичай накопичуються в культуральному середовищі в дуже незначних кількостях і важко ідентифікуються, вони можуть мати велике практичне значення, наприклад, для харчової промисловості, так як від їх складу залежить якість харчового продукту, що отримується за допомогою дріжджів. Такі з'єднання називають органолептичними.

Обов'язкові побічні продукти метаболізму дріжджів - вищі спирти (сивушні масла). Механізм синтезу вищих спиртів пов'язаний з утворенням аліфатичних амінокислот.

Найчастіше зустрічаються спирти: пропіловий, ізоаміловий, бутиловий, ізобутіловий. Летючі жирні кислоти, такі як уксуная, пропіонова, масляна, ізомасляная, ізовалеріанової - також звичайно мінорні продукти метаболізму дріжджів. Велике практичне значення мають виділяються дріжджами альдегіди і кетони (ацетоін і діацетил) (Бабьева, Чернов, 2004).

1.6 Джерела азоту

Універсальним джерелом азоту для дріжджів є солі амонію.

Багато дріжджі здатні засвоювати азот у окисленої формі - у вигляді солей нітратів і нітритів. Дріжджі, що використовують нітрати, мають дві ферментні системи: перша відновлює нітрат до нітриту, друга - нітрат до амонію. У деяких видів присутній тільки друга ферментна система - вони здатні засвоювати нітрити, але не нітрати. ₃ в качестве единственного источника азота – рутинный тест при идентификации дрожжей. Здатність до асиміляції нітратів вважається цінним таксономічним ознакою, тому визначення здатності до росту на середовищі з KNO ₃ як єдине джерело азоту - рутинний тест при ідентифікації дріжджів.

₃ . Практично всі дріжджі використовують як джерело азоту сечовину, розщеплюючи її до СО ₂ і NH _3.

1.7 лімітуючі фактори

За винятком декількох виключно холоднолюбівих видів, серед дріжджів немає яскраво виражених екстремофілів, тобто видів, що віддають перевагу вкрай високі або низькі значення температури, рН, осмотичного тиску, вологості, середовища, тощо У теж час існують дріжджі, які сильно виділяються серед більшості інших видів, які сильно виділяються серед більшості інших видів по своїй здатності переносити несприятливі фактори середовища (http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm.).

1.7.1 Температура

У більшості видів дріжджів мінімальна температура росту знаходиться в межах 0-5 ° С, а максимальна - 30-40 ° С. Майже всі дріжджі можуть рости при кімнатній температурі 20-25 ° С. Базідіоміцетовие дріжджі в цілому характеризуються більш низькими максимальними температурами зростання, ніж аскоміцетовие. Проте з цього правила є низка виключень.

У цілому дріжджі - це досить холоднолюбівая група мікроорганізмів. Часто це дає можливість створити селективні умови при виділенні дріжджів методом посіву на твердих поживних середовищах сильно заважають міцеліальні гриби, присутні в досліджуваному субстраті. Колонії грибів маскують більш дрібні дріжджові колонії і ускладнюють їхню ізоляцію. Підібрати будь-яку селективну тільки на одноклітинні гриби живильне середовище, тобто обмежити зростання міцеліальних грибів хімічно неможливо: всі інгібітори росту міцеліальних грибів діють і на дріжджі. Однак при вирощуванні посівів при низькій (близько 5 ° С) температурі дріжджоподібні колонії в середньому розвиваються швидше. Це дає можливість частково позбутися від колоній міцеліальних грибів.

1.7.2 Кислотність середовища

Оптимальні значення рН для росту більшості дріжджоподібних грибів перебуває в області середньої кислотності (рН4-6). Однак окремі види здатні розвиватися в більш кислому середовищі. хорошо растут при рН 2,5-3. Наприклад, деякі штами Saccharomyces cerevisiae добре ростуть при рН 2,5-3.

Практично всі види дріжджів можуть рости в діапазоні рН 4-4,5. У той же час, в такій слабокислою середовищі не росте більшість банальних бактерій, які найбільш звичайними в самих різних природних середовищ існування. или молочной кислотой до рН 4-4,5. На цьому заснований найпростіший метод селективного виділення дріжджів: живильне середовище (наприклад, сусло агар) подкисляется Н CL або молочною кислотою до рН 4-4,5. У більшості випадків на такому середовищі виростають тільки дріжджі і швидкоростучі міцеліальні гриби.

1.7.3 Інгібітори росту

Зростання дріжджів пригнічується багатьма антибіотиками актиномицетного і грибного походження з різним механізмом дії.

1.8 Промислове використання дріжджів

Дріжджі були першими мікроорганізмами, які людина стала використовувати для задоволення своїх потреб. Основна властивість дріжджів, яке завжди було привабливим для людини - це здатність до утворення досить великих кількостей спирту з цукру. Перша згадка про отримання спиртних напоїв у Єгипті, так званої «бузи», що представляє собою різновид пива, відноситься до 6000 р. до н. е.. Цей напій отримували в результаті зброджування пасти, отриманої при роздавлюванні і розтиранні пророслого ячменю. Приготування бузи можна вважати народженням сучасного пивоваріння. З Єгипту технологія пивоваріння була завезена до Греції, а звідти в Древній Рим. У цих же країнах активно розвивалося виноробство. Міцні спиртні напої, отримані перегонкою бражки, мабуть, були вперше отримані в Китаї близько 1000 р. до н. е.. Зараз промислове виробництво спиртних напоїв існує в більшості країн світу і являє собою велику галузь промисловості.

Інша група процесів, в яких здавна використовуються дріжджі, також пов'язана з їх здатністю до спиртного бродінню: утворення вуглекислого газу під дією дріжджів - найважливіший етап в приготуванні хліба, що приводить до заквашування тесту. Цей процес також дуже давній. Вже до 1200 р. до н. е.. в Єгипті була добре відома різниця між хлібом з кислого і прісного тіста, а також користь від застосування вчорашнього тесту для заквашування свіжого.

1.8.1 Традиційні процеси

Виноробство, пивоваріння та хлібопечення існують вже кілька тисячоліть. Природно, що за цей час були отселекціоніровани сотні видів заквасок, які використовуються для приготування різних сортів вина і пива. Проте лише на початку XIX ст. були висловлені припущення, що за спиртове бродіння, що викликається цими заквасками, відповідальні присутні в них дріжджі, побачені вперше в 1680 р. Антоні ван Левенгуком. Ці дріжджі були описані в 1837 р. Мейеном, який дав їм назву Saccharomyces. До кінця ХІХ ст. стало відомо, що сахароміцети, виділені з різних заквасок і різних сортів вина та пива, розрізняються за фізіологічними властивостями, наприклад, по здатності до зброджування різних цукрів. У подальшому на підставі таких фізіологічних відмінностей в роді Saccharomyces було описано декілька десятків видів. Однак в останні роки методами молекулярної та генетичної таксономії було показано, що більшість цих «видів» насправді являють собою різні фізіологічні раси декількох близьких біологічних видів, головним чином Saccharomyces cerevisiae. Це такі «види», як, наприклад, Saccharomyces vini, Saccharomyces ellipsoides, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces cheresiensis, Saccharomyces chevalieri і десятки інших, які зараз переведені в розряд синонімів Saccharomyces cerevisiae. Більшість цих «видів» - це отселекціонірованние століттями раси - такий же продукт людської діяльності, як сорти культурних рослин. У природі їх знайти іноді просто неможливо. Однак, нещодавно Г. І. Наумов виявив, що дикі популяції Saccharomyces cerevisiae поширені на Далекому Сході в сокотеченіях дуба. Він припустив, що Далекий Схід - центр видоутворення цих дріжджів.

Окрім вина і пива, що стали найбільш популярними, у світі виробляється безліч різноманітних традиційних алкогольних напоїв: саке на Сході, текіла в Південній Америці, помбе в Африці і т.д. Вони розрізняються за типом вихідної сировини, способами оцукрювання полісахаридів, видами добавок. У деяких випадках для зброджування використовуються види дріжджів, відмінні від Saccharomyces cerevisiae. При виробництві рому, наприклад, застосовуються дріжджі з роду Schizosaccharomyces.

Дріжджі використовуються також при виготовленні безлічі інших традиційних харчових продуктів. Наприклад, спеціальні раси дріжджів входять до складу заквасок, які використовуються для приготування кефіру. Дріжджі застосовуються в сироварінні при отриманні деяких сортів сиру. У Східній Азії широко поширені численні закваски для отримання різноманітних традиційних соусів, до складу яких входять специфічні види дріжджів, що не зустрічаються в інших місцях проживання. У побуті велику популярність отримав «чайний гриб» - специфічна бактеріально-дріжджова асоціація, за допомогою якої отримують легкий, освіжаючий напій.

Новий етап у розвитку бродильних процесів почався після робіт Пастера, Коха та інших корифеїв мікробіології, які ввели в практику метод чистих культур. Тим не менше, до кінця ХІХ ст. дріжджі застосовувалися лише у виноробстві, пивоварінні та хлібопеченні. Двадцяте століття з його нестримним розвитком промисловості різко розширив і області застосування дріжджів. Вони стали вирощуватися у великих масштабах в якості джерела білка і вітамінів для сільськогосподарських тварин. Дріжджі - основне джерело технічного етанолу. За допомогою дріжджів зараз отримують великий спектр сполук, що використовуються в різних областях людської діяльності. До них належать вітаміни, різні полісахариди, ліпіди, які можуть служити замінниками рослинних масел, різноманітні ферменти, які використовуються в харчовій промисловості. Розвиток генетичної інженерії дозволило використовувати легко культивовані дріжджі для одержання багатьох корисних речовин тваринної і рослинної природи, наприклад інсуліну.

1.8.2 Дріжджі в сучасної біотехнології

Дріжджі як джерело білка

Використання мікробної біомаси для збагачення кормів білком і незамінними амінокислотами в умовах інтенсивного тваринництва - одна з важливих проблем майбутнього, тому що людство розвивається таким чином, що воно навряд чи зможе забезпечити себе їжею традиційними методами. Вирощування мікроорганізмів не залежить від кліматичних та погодних умов, не вимагає посівних площ, піддається автоматизації. Дріжджі - одна з найбільш перспективних груп мікроорганізмів для отримання білкових кормових добавок. Вміст білка в клітинах деяких штамів дріжджів становить від половини до 2 / 3 сухої маси, на частку незамінних амінокислот припадає до 10% (у білках сої, багатих на лізин, його міститься не набагато більше 6%).

Виробництво етанолу

Етанол широко застосовується в хімічній промисловості як вихідна сполука для синтезу багатьох речовин, як розчинник, екстрагент, антифриз і т.п. Ймовірно, у етанолу велике майбутнє і як палива в двигунах внутрішнього згоряння: етанол - набагато більш екологічно чисте паливо, ніж бензин.

У принципі етанол можна отримувати з будь-якого джерела вуглеводів, які зброджуються дріжджами. Різноманітність потенційних продуцентів теж велике: більше 200 видів дріжджів здатні зброджувати глюкозу.

Великомасштабне отримання етанолу в якості палива здійснюється в основному в Бразилії та інших країнах Південної Америки. Як джерело вуглеводів використовується цукровий очерет і маніока, в якості продуцента етанолу - Saccharomyces cerevisiae.

Перспективним сировиною для отримання спирту є відходи целюлозно-паперової та деревообробної промисловості. Однак, гідролізати деревини містять велику кількість пентоз. До середини 70-х років XX ст. взагалі не були відомі дріжджі, активно зброджують пентози. Зараз такі види знайдені: Pachysolen tannophilus і Pichia stipitis (анаморфа - Candida shehatae). Їм пророкують велике майбутнє у виробництві спирту з гідролізатів деревних відходів, соломи, торфу і т.п.

У невеликих масштабах етанол можна отримувати і з інших субстратів, наприклад з молочної сироватки, використовуючи зброджують лактозу дріжджі з роду Kluyveromyces.

Різні продукти, одержувані з дріжджів

В останні десятиліття різноманітність біотехнологічних процесів, в яких використовуються дріжджі, різко збільшилася. Ще більш різноманітні перспективи використання дріжджів: в різних розробках, патентах тощо згадується понад 200 видів. Зараз дріжджі використовуються для отримання різних ферментних препаратів, органічних кислот, полісахаридів, багатоатомних спиртів, вітамінів і вітамінних добавок, а також у безлічі інших дрібномасштабних процесах.

Промислово важливі органічні кислоти, які продукують мікроорганізмами, є або кінцевими продуктами (молочна, масляна, пропіонова кислоти у анаеробних бактерій), або інтермедіатами метаболізму. Останні можна отримувати за допомогою дріжджів. У найбільших масштабах виробляється лимонна кислота, в основному за допомогою Aspergillus niger, з використанням у якості субстрату меляси. Проте, її можна отримувати і з допомогою дріжджів на більш дешевих субстратах, таких як парафіни нафти або етанол. Зараз розроблено технології отримання та багатьох інших кислот, наприклад, ізолімонной з Candida catenulata, фумарової з Candida hydrocarbofumarica, яблучної з Pichia membranaefaciens та ін

З дріжджових полісахаридів найбільш відомий пуллулан, який отримують з дрожжеподобного гриба Aureobasidium pullulans. Він являє собою β-глюкан, в якому мальтотріозние залишки з'єднані між собою β (1 → 6) глікозидними зв'язками. Пуллулан використовується в основному в харчовій промисловості як плівкового покриття. Можливе отримання різноманітних за будовою і властивостями полісахаридів і з інших видів дріжджів. Особливо багато позаклітинних полісахаридів утворюють дріжджі Cryptococcus, Rhodotorula, Lipomyces.

Багатоатомні спирти (гліцерин, ксиліт, Еритреї, араби) - широко застосовуються в хімічній і харчовій промисловості. Перспективним вважається спосіб отримання сахароспирти, таких як гліцерин, Еритреї і ксиліт, з використанням ксеротолерантних дріжджів роду Zygosaccharomyces. Ці дріжджі здатні рости в середовищах з високим осмотичним тиском, синтезуючи при цьому велику кількість внутрішньоклітинних поліолів, які служать осмопротекторамі. Інший спосіб стосується отримання ксиліту - важливого полиола для харчової промисловості. Ксиліт накопичується як побічний продукт при зброджуванні ксилози дріжджами Pachysolen tannophilus.

Багато дріжджі служать джерелами для отримання ферментних препаратів, які використовуються в сучасній харчовій і хімічній промисловості. З дріжджового осаду, що утворюється як відхід пивоваріння, отримують фермент β-фруктофуранозидази (інвертазу), який розщеплює сахарозу на глюкозу і фруктозу. Препарати інвертази широко застосовуються в кондитерській промисловості для запобігання кристалізації сахарози, для приготування інвертних сиропів. За допомогою культур Kluyveromyces marxianus отримують β-галактозидазу, яка застосовується в молочній промисловості. Дріжджі Yarrowia lipolytica використовуються для отримання ліполітичних ферментів, що представляють великий інтерес для багатьох галузей господарства. Ліпази використовуються в сироварінні, в косметичній промисловості, при виробництві хутра і шкір, в миючих засобах. В останні роки розроблено безліч способів отримання самих різних ферментів з дріжджів: пектіназ з Saccharomycopsis fibuliger, амілаз з Schwanniomyces occidentalis, ксиланазу з Cryptococcus laurentii, гідролаз L-α-аміно-ε-капролактаму з кріптококков, алкогольоксидази з Pichia burtonii, оксидази D-амінокислот з Trigonopsis variabilis, фенілаланінамміакліази з Rhodotorula glutinis. Це лише деякі приклади отримання дріжджових ферментних, спектр яких в останні роки постійно розширюється.

Застосування дріжджів як джерел вітамінів почалося в 1930-і роки. Одним з перших промислових процесів одержання вітамінів було виділення ергостерину з Saccharomyces cerevisiae з наступним опроміненням ультрафіолетом для перекладу на вітамін D. Потім у дріжджів була відкрита здатність до сверхсинтезу деяких вітамінів групи В, зокрема рибофлавіну. Деякі червоні дріжджі використовуються для отримання каротиноїдів, зокрема β-каротину, службовця попередником вітаміну A, астаксантину, використовуваного в якості кормової добавки в рибництві. Крім виробництва індивідуальних вітамінів вже багато років у світі практикується отримання автолізат і гідролізатів дріжджів, питних дріжджів, які використовуються як джерело вітамінів і як смакові добавки.

Глава 2. Об'єкти і методи досліджень

2.1 Об'єкти досліджень

Об'єктом досліджень є грунт, відібрана з різних еконіш. Проба № 1 - грунт поля не посівного (Ахтубинский р-он), проба № 2 - грунт лісова (Ахтубінський р-он), проба № 3 - грунт садова (парк АГТУ), проба № 4 - грунт лугова (луг заливний, Ахтубінський р-он), проба № 5 - грунт з грибниці печериці (Ікряненскій р-он).

2.2 Відбір проб

Середню грунтову пробу отримують змішуванням окремих зразків. Проби № 1, № 2, № 3, та № 4 були відібрані по одному і тому ж методу, з площі 100 м ² взяли пробу з трьох точок. Верхній шар грунту товщиною 2 см знімається і тільки після цього відбирається проба грунту. Так проробляємо три рази. Проба № 5 відбирається з однієї точки, з грибниці печериці.

2.3 Прилади для взяття проб

Грунтовий зразок беруть буром, лопатою і ножем. У полі перед взяттям зразка їх ретельно очищають, потім обробляють спиртом і обпалюють. Можна обмежитися очищенням цих предметів, якщо потім кілька разів увіткнути їх у грунт досліджуваного горизонту. Укладають зразок у заздалегідь приготовлену скляну шірокогорлую стерильну банку, що закривається корковою пробкою, оберненої стерильною папером, або в стерильні пергаментні пакети або пакети з щільного паперу, взятої подвійним шаром. На пакети, банки наклеюють етикетки із зазначенням місця взяття проби, горизонту та інших відомостей.

Грунтові зразки аналізують у першу добу. При необхідності допускається зберігання їх у холодному приміщенні (у холодильнику) протягом двох днів. Для додання середньому зразком більшої однорідності, дотримуючи всі умови асептики, ретельно перемішують грунт, виймають коріння рослин, різні включення (Теппер, 1994).

2.4 Методи стерилізації

Стерилізація, або знепліднювання (від лат. Sterilis - безплідний), - це повне знищення клітин мікроорганізмів у поживних середовищах, посуді тощо

Відомо кілька методів стерилізації. Найчастіше застосовують стерилізацію нагріванням.

Фламбірованіе, або прожарювання

Прожарювати можна безпосередньо перед вживанням платинові петлі, голки, шпателі, дрібні металеві предмети (ножиці, ланцети, пінцети), а також скляні палички, предметні, покривні скла і т. д.

Стерилізація сухим жаром

Її застосовують для обробки посуду і сухих матеріалів, наприклад крохмалю, крейди. При цьому стерилізується об'єкт витримують при 170 º С протягом 2 год (починаючи з того моменту, як встановлена ​​необхідна температура) в печі Пастера або в електросушільних шафах. Піднімати температуру вище 170 º С не рекомендується: ватні пробки і папір починають руйнуватися (буріють, стають ламкими).

Перед стерилізацією скляний посуд закривають ватними пробками і обгортають папером. Чашки, пробірки, піпетки, вату, марлю загортають у папір або поміщають в особливі футляри та пенали, в яких стерильна посуд може зберігатися після стерилізації.

Після закінчення стерилізації шафа відкривають тільки після того, як температура знизиться до кімнатної, інакше скло може лопнути.

Стерилізація текучим паром

Текучою парою (100 ° С) обробляють предмети, що псуються від сухого жару, і деякі живильні середовища, які не витримують більш високої температури (середовища з вуглеводами, МПЖ, молоко). Проводять стерилізацію в кип'ятильнику Коха по 30 хв протягом 3 діб щодня. Така стерилізація називається дробовою.

Стерилізація насиченою парою під тиском

Це найбільш швидкий і надійний спосіб стерилізації, при якому гинуть самі стійкі спори. З його допомогою стерилізують більшість поживних середовищ, посуд.

Обробку насиченою парою проводять в герметично закривається товстостінному котлі - автоклаві. На масивній кришці або збоку котла знаходяться кран для виходу пари, манометр і запобіжний клапан. Манометр показує, на скільки тиск пари всередині котла вище нормального. Для запобігання вибуху при перевищенні граничного тиску спрацьовує запобіжний клапан, даючи вихід пару.

Автоклав використовують і для дробової стерилізації текучим паром. У цьому випадку кришку не загвинчують, щоб забезпечити вільний вихід пару (Теппер, 1994).

2.5 Матеріали та обладнання

Культури мікроорганізмів, пробірки, колби, чашки Петрі, бактеріологічні голки, шпателі, штативи, предметні і покривні скла, барвники, спиртовий пальник.

При будь-мікробіологічної роботі: при посівах, при посівах, виділення, пересіву, збереженні чистих культур використовуються стерильні середовища, стерильна посуд, стерильні інструменти, щоб запобігти можливості попадання сторонньої мікрофлори.

Для стерильного посуду використовується стерилізація сухим жаром. Вона виробляється нагріванням протягом 2 годин, при температурі 1700 ° С (починаючи з того моменту, як температура встановилася) в печі Пастера або в електросушільних шафах (з нагріванням до 2000).

Весь посуд перед стерилізацією повинна бути вимита, висушена і загорнута в папір.

Для загортання посуду при стерилізації в автоклаві, використовують газетний папір (яка не розмокає).

Більшість поживних середовищ стерилізують насиченою парою під тиском в автоклавах. Підвищення тиску в автоклаві підвищує температуру пари, утвореного всередині автоклава і отже, температуру стерилізації.

2.6 Методи і способи обробки матеріалу

Приготування грунтової суспензії і посів на середовища

На стерильну папір відважують 10 г грунту. Наважку грунту переносять в колбу на 250 мл з 100 мл стерильної водопровідної води, збовтують 10 хв (краще на механічній гойдалці) і дають відстоятися грубим часткам грунту.

Перед приготуванням суспензії для кожного зразка готують 2 стерильні колби на 250 мл, одна містить 100 мл стерильної водопровідної води, інша - порожня. Водою з першої колби розтерту грунтову масу змивають у порожню стерильну колбу. Колбу з отриманою суспензією струшують 5 хв, залишають на 30 с і готують розведення, що містять різні концентрації грунту. 1 мл суспензії в першій колбі відповідає розведення 10 ^-1. Наступні розведення (10 ^-2; 10 ^-3; 10 ^-4; 10 ^-5; 10 ^-6 і т. д.) краще теж робити в колбах на 250 мл з 90 мл стерильної водопровідної води, але ми використовували пробірки зі стерильною водою з 9 мл.

З кожного попереднього розведення окремої стерильною піпеткою беруть 1 мл суспензії і переносять у наступну пробірку з 9 мл води. Кожного разу піпетку обполіскують і відставляють. Наступні пробірки струшують по 1 хв.

З отриманих розведень роблять посів на щільні середовища. Набір середовищ залежить від завдань бактеріологічного аналізу грунту. На щільні живильні середовища посів проводять переважно поверхово, але ми використовували переважно глибинний посів.

При визначенні кількості бактерій у грунті використовувалися наступні середовища: Глюкозо-петонная, Глюкозо-амонійна, Сабуро, Ешбі з сахарозою, і МПА.

Для глибинного посіву беруть 1 мл грунтової суспензії з розведення на порядок меншого, ніж для поверхневого посіву.

Суспензію вносять у стерильну чашку Петрі, заливають агаром, розплавленим і охолодженим до 45 ° С, і змішують з ним. При глибинному посіві показники виходять більш низькі, ніж при поверхневому (Теппер, 1994).

2.7 Методи приготування препаратів мікроорганізмів

Техніка взяття культури для приготування препарату

Пробірку з культурою тримають в лівій руці майже в горизонтальному положенні поблизу пальника. Перед взяттям культури правою рукою виймають ватяну пробку з пробірки, затискаючи її між мізинцем і долонею, а краї пробірки обпалюють на полум'ї пальника. Голку тримають у правій руці великим, вказівним та середнім пальцями. Обпаленої в полум'ї бактеріологічної голкою з пробірки беруть невелику кількість мікробної маси.

Якщо культуру беруть з рідкого середовища, не слід сильно нахиляти пробірку, щоб не змочити її краю і пробку. Для взяття культури краще користуватися петлею. Після взяття культури краю пробірки і пробку обпалюють у полум'ї і закривають пробірку.

Фіксовані препарати мікроорганізмів

Вступні пояснення. У мікробіології часто готують фіксовані препарати. Їх розглядають під мікроскопом у забарвленому вигляді. Під фіксацією мається на увазі така обробка живого об'єкта, яка дає можливість швидко перервати перебіг життєвих процесів в об'єкті, зберігши його тонку структуру. У результаті фіксації клітини міцно прикріплюються до скла і краще фарбуються. Фіксація необхідна у випадку роботи з патогенними мікроорганізмами (в цілях безпеки).

Приготування мазка. На чисте знежирене предметне скло наносять краплю водопровідної води. Для знежирення стекол використовують суміш етилового спирту та сірчаного ефіру в співвідношенні 1:1. Ці операції проводять далеко від пальників. Прокаленной бактеріологічної голкою з пробірки з культурою беруть невелику кількість мікробної маси і вносять в краплю води. Краплю ретельно розмазують петлею по склу на площі близько 4 см ^2.

У випадку, якщо суспензія густа, її спочатку розводять водою. Для цього прокаленной петлею беруть трохи суспензії і переносять в краплю води на інше предметне скло. Суспензію нормальної густоти розмазують тонким шаром по склу, потім мазок сушать на повітрі при кімнатній температурі або при слабкому нагріванні, тримаючи препарат високо над полум'ям пальника. Сильне нагрівання препарату при сушці не рекомендується для уникнення коагуляції білків, спотворює структуру і форму клітин. Висушений препарат фіксують (Теппер, 1994).

Фіксація мазка. Її проводять над полум'ям пальника. Для цього препарат три-чотири рази повільно проводять нижньою стороною над полум'ям пальника.

Фарбування препарату. При фарбуванні мазка препарат поміщають на препаратодержатель. На мазок наносять кілька крапель барвника. Залежно від виду барвника і мети дослідження тривалість фарбування варіює від 1 до 5 хв, в окремих випадках займаючи до 30 хв і більше. Після закінчення фарбування препарат промивають водою, фільтрувальним папером видаляють воду, підсушують на повітрі і мікроскопіруют.

Існують прості і диференційовані методи забарвлення.

При простій забарвленні використовують який-небудь один барвник, наприклад метиленовий синій, фуксин, генціан фіолетовий у лужних або карболової розчинах. При цьому фарбується вся клітка.

При диференційованої забарвленні окремі структури клітини фарбуються різними барвниками. Такі методи фарбування по Граму, забарвлення суперечка.

Фарбування препарату за способом Грама

1. Метил-Віолет 30 сек.

2. Фарбу злити самопливом.

3. Висушити мазок фільтрувальним папером.

4. Налити на 30сек. розчин люголя.

5. Злити самопливом розчин люголя.

6. Знебарвлювати спиртом 15 сек.

7. Промити препарат водою.

8. Додаткова забарвлення - розлучений фуксин 1 хв.

9. Промити препарат водою, висушити фільтрувальним папером, мікроскопіювати з 90 * об'єктивом.

2.8 Виділення чистої культури і перевірка на чистоту

Чисті культури виділялися на середовище Сабуро (див. Додаток № 1), тому що вона містить всі необхідні живильні речовини для росту дріжджів.

Отриману культуру перевіряємо на чистоту методом посівів на селективні щільні живильні середовища.

2.9 Отримання культуральної рідини

За допомогою шпателя відбиралася біомаса культури дріжджів, потім її поміщали в рідку живильне середовище (Сабуро). Культура інкубувати протягом 1 тижня в аеробних умовах, в даному випадку ми використовували «гойдалку». Після інкубації отримана рідина центрифугували і стерилізувалася при 1 атмосфері.

В отриманій культуральної рідини можуть бути присутніми різні кислоти (молочна, масляна, пропіонова, яблучна), багатоатомні спирти (гліцерин, ксиліт, Еритреї, араби), деякі вітаміни групи В, зокрема рибофлавіну.

Глава 3. Експериментальна частина

Виділення грунтових дріжджів вироблялося чашкові методом, шляхом висіву на різні поживні середовища. Рецепт середовища див. у додатку.

Проба № 1 - грунт з польова (не посівна).

Проба № 2 - грунт лісова.

Проба № 3 - грунт садова (парк АГТУ).

Проба № 4 - грунт з лугова (заливна).

Проба № 5 - грунт з грибниці печериці.

При дослідженні проб виявлена ​​наступна закономірність: У пробах під номерами 1, 3 та 4 не було виявлено дріжджів.

Ймовірно це можна пояснити тим, що ці грунти бідні легко доступними елементами живлення. На цих грунтах дуже маленька рослинність, а як нам вже відомо в основному вони потрапляють в грунтів з рослинним опадом. Грунт не є для них справжнім місцем проживання, а лише «пасткою», місцем збереження або поступового відмирання.

У пробі № 2 на середовищі Сабуро була виявлена ​​колонія дріжджів з наступними культуральними ознаками: кругла, слизова, з валиків по краю, помаранчевого кольору, профіль випуклий, пігмент в агар не виділяє. Мікроскопія: великі, округлі діляться клітини, що знаходяться в скупченні, одноклітинного міцелію не утворюють. . За допомогою ключа для визначення родів дріжджів передбачається, що дана колонія відноситься до роду Schizosaccharomyces.

На глюкозо-пептонов середовищі цієї ж проби була виділена колонія іншого роду дріжджів. Культуральні ознаки: кругла, бархатиста колонія, що вростають в агар, зеленувато-блакитного кольору з білим кантом. Мікроскопія: великі клітини утворюють міцелій, брунькуються клітини відсутні. . За допомогою ключа для визначення родів дріжджів імовірно встановлено, що вони належать до роду Galactomyces.

Результати досліджень свідчать, що розкладаються рослинні залишки: опад, лісові підстилки, відмерлі частини мохів, торф - представляють собою типові місця проживання багатьох видів дріжджів. Свіжий рослинний опад, який складається з листя рослин, що зберігають анатомічна будова, практично завжди містить дріжджі в кількості не меншій, ніж на надземних частинах рослин. У деяких випадках чисельність дріжджів в опаде навіть вище, ніж на живих частинах рослин. Щільність заселення дріжджами рослинного опаду в значній мірі визначається кількістю дріжджових клітин спочатку присутніх на листі рослин (Максимова, Чернов, 2004.)

З підвищенням ступеня розкладання рослинних залишків середня чисельність дріжджів убуває. У зразках нижніх шарів лісової підстилки, перегнійних горизонтах грунтів дріжджі виявляються далеко не завжди, і чисельність їх може знижуватися.

Проба № 5

Таблиця 1.

Характеристика виділених культур на середовищі Сабуро

При дослідженні проби під № 5 було з'ясовано, що в ній знаходиться максимальна кількість дріжджів. , Schizosaccharomyces, Candida. Основна маса, яких представлена ​​наступними пологами Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida.

Результат досліджень показує, що надземні частини рослин майже заселені епіфітним мікроорганізмами, серед яких значну частину складають дріжджі. Ці дріжджі - не паразити рослин, а симбіонти. Єдине джерело живлення таких дріжджів - прижиттєві виділення рослин, до складу яких входять глюкоза, фруктоза, сахароза і різні органічні кислоти. Відомо, що земля грибниці печериці має слабо-кислу реакцію середовища (рН = 5.8-6), вологість становить близько 75%. Також грибниця багата легко доступними елементами живлення (http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm). У відповідь дріжджі виділяють різні ростові речовини, в числі яких вітаміни, амінокислоти, органічні кислоти, ферменти.

Швидкість зростання маткових культур досліджувалася на основі картопляного агару з додаванням культуральних рідин з досліджуваних зразків:

Зразок № 1 - Candida

Зразок № 2 - Saccharomysec

Зразок № 3 - Galactomyces

Зразок № 4 - Saccharomysec

Зразок № 5 - Schizosaccharomyces

и Saccharomysec (2,4). Інтенсивне зростання відзначений на середовищі з додаванням культуральної рідини родів Candida і Saccharomysec (2,4).

Шампіньйон 2

Результати показали, що гриб росте швидше з культуральної рідиною дріжджів ніж без неї, найбільший показник зростання був встановлений з екстрактами зразків № 1,4,5.

Огнівка

Результати показали, що гриб росте швидше з культуральної рідиною дріжджів ніж без неї, найбільший показник зростання був встановлений з екстрактами зразків № 1,2,4.