Методи дослідження клітин

настоящее время можно наблюдать с высоким разрешением даже внутренние детали трехмерных структур, таких, как вирусы. В даний час можна спостерігати з високою роздільною здатністю навіть внутрішні деталі тривимірних структур, таких, як віруси. Для цього використовують метод кріоелектронной мікроскопії, де дуже тонкий (приблизно 100 нм), швидко заморожений шар вологого зразка розміщують на мікроскопічну грати. За допомогою спеціального пристосування гідратований зразок утримують при - 160 ^с С у вакуумі мікроскопа. Таким способом можна спостерігати матеріал практично безпосередньо: без фіксації, фарбування і сушіння.

1.3 Рентгеноскопія

Рентгенівські промені, подібно до світла, є однією з форм електромагнітного випромінювання, але внаслідок того, що довжина хвилі рентгенівських променів значно коротше, їх застосування дозволяє вирішити значно більше дрібні деталі. На відміну від видимого світла або потоку електронів, рентгенівські промені не можна сфокусувати і після їх проходження через зразок отримати звичайне зображення. Однак структуру зразка можна виявити, використовуючи метод дифракції рентгенівських променів.

Розсіяне випромінювання можна розглядати як набір перекриваються хвиль, кожна з яких відображається різними ділянками об'єкта. Якщо хвилі перекриваються, вони піддаються інтерференції і виникає розподіл випромінювання, відоме як дифракційна картина. Дифракційна картина може бути зареєстрована на фотопластинці, вміщеній на деякій відстані від предмета, або представлена ​​за допомогою кількості розсіяного випромінювання, відбитого об'єктом у різних напрямках. Форма дифракційної картини визначається структурою об'єкту. З іншого боку, виходячи з повного опису дифракційної картини, можна теоретично розрахувати структуру даного об'єкта

Повна дифракційна картина кристалічної решітки буде складатися з безлічі яскравих плям різної інтенсивності. Відносна інтенсивність різних плям у дифракційної картини залежить від здатності різних об'єктів в решітці розсіювати випромінювання. Насправді інтенсивність даного плями пропорційна інтенсивності випромінювання, яке буде відображатися в даному напрямку від характерного одиночного об'єкту.

Таким чином, положення плям у дифракційної картини залежить від розташування об'єкта в системі, а їх інтенсивність дає інформацію про внутрішню структуру типового об'єкта. Більш того, така інформація є точною і достатньою, оскільки вона була отримана шляхом об'єднання вкладів безлічі рівноцінних джерел. Користуючись досить повним описом дифракційної картини, можна найчастіше обчислити структуру окремих об'єктів, що утворюють кристалічну решітку.

Довжина хвилі рентгенівських променів близько 0.1 нм (що відповідає діаметру атома водню), і тому даний тип випромінювання ідеально підходить для аналізу розташування індивідуальних атомів в молекулах. Таке завдання можна вирішити навіть на найсучасніших електронних мікроскопах. Істотною перевагою рентгенівських променів є висока (вище, ніж у електронів) проникаюча здатність. Це робить придатними для аналізу більш товсті зразки. І, нарешті, оскільки в цьому випадку використання вакууму не передбачено, можна вивчати товсті водовмісні зразки. Внаслідок цього виключаються артефакти, що виникають в процесі приготування зразка.

Для досягнення високого дозволу необхідно мати кристали з високим ступенем впорядкованості. У міру проходження через зразок рентгенівські промені розсіюються електронами атомів, складовими зразок. Тому великі атоми з великою кількістю електронів розсіюють рентгенівські промені більш ефективно, ніж невеликі атоми, так що атоми С, N, О, Р реєструються набагато надійніше, ніж атоми Н.

Розшифровка рентгенограм, утворених великими і неупорядкованими молекулами білків, до 1960 року була неможлива. В останні роки рентгеноструктурний аналіз все більш автоматизується. Розсіяні рентгенівські промені вимірюються електронними детекторами, а комп'ютери виконують необхідні обчислення. В даний час найбільш тривалим етапом у подібному дослідженні є етап отримання відповідних кристалів досліджуваних макромолекул; найчастіше на підбір оптимальних умов кристалізації йдуть роки. Маючи хороші кристали, можна розрахувати структуру білка з роздільною здатністю 0,3 нм і виявити не тільки основні закономірності розташування поліпептидного ланцюга, але і деякі більш дрібні деталі. Саме таким чином до цього часу були встановлені структури більше сотні білків і кількох малих молекул РНК і ДНК.

Розділ II Методи вивчення хімічного середовища живих клітин

Класичні методи мікроскопії дозволяють судити про клітинну архітектурі, але не дають докладної інформації про клітинну хімії. Підтримка життя можливо тільки при швидкій і точного регулювання концентрації таких найважливіших метаболітів, як АТФ, глюкоза й неорганічні іони; вміст цих речовин в різних ділянках клітин і тканин може істотно варіювати. Більше того, оскільки низькомолекулярні речовини, такі, як клітинний АТФ, кальцій і водень можуть виконувати функцію внутрішньоклітинних "месенджерів", дуже важливо вміти простежувати зміна їх концентрації у відповідь на внутрішньоклітинні сигнали. Обговоримо деякі методи, які дозволяють визначати хімічні умови в клітинах у процесі їхньої життєдіяльності.

2.1 Використання ядерного магнітного резонансу (ЯМР) для визначення хімічних умов у живих клітинах

Ядра багатьох атомів характеризуються магнітним моментом: отже, вони мають внутрішнім магнетизмом. Магнітні характеристики цих атомів схильні до впливу з боку оточуючих атомів. Метод ядерного магнітного резонансу (ЯМР), що є нешкідливим для живих клітин, дозволяє визначити хімічну природу речовини. Якщо ядра атомів, що володіють магнітним моментом, помістити в магнітне поле, вони приймають одну з можливих орієнтації. Кожна з орієнтації характеризується енергією, яка визначається силою поля і хімічним оточенням. При опроміненні радіохвилями набору атомів в ідентичному хімічному оточенні, енергія цих хвиль буде в значній мірі абсорбуватися, якщо хвилі володіють строго певною частотою, що відповідає різниці енергетичних станів двох можливих орієнтації ядер в магнітному полі. Це так звана резонансна частота. Зразок тканини містить атоми в різних молекулах, в різному оточенні, тому він буде поглинати енергію на різних резонансних частотах. Діаграма поглинання на резонансних частотах для даного зразка складе його спектр ЯМР. Такий спектр відображає структуру і відносний зміст кожного типу молекул, що містять магнітні ядра.

Лише деякі атоми мають ізотопи, що створюють задовільний сигнал ЯМР. Для вивчення макромолекул, що містяться усередині живої клітки, що зазвичай використовують широко поширені ізотопи ¹ Н, ¹³ Na, ^3l P, ³⁹ K і рідкісні ізотопи ^l3 C і ^l5 N. Зважаючи на важливу роль сполук фосфору, яку вони відіграють у метаболізмі, ефективним виявляється визначення ЯМР ³¹ Р. Цей ізотоп в нормі присутня в фосфоровмісних речовинах клітин. Сигнали, створювані ним, можна використовувати для спостереження за зміною внутрішньоклітинної концентрації в процесі м'язового скорочення таких сполук, як АТР і неорганічний фосфат.

Рідкісні ізотопи ¹³ С і ^I5 N в нормі не містяться в клітинах в достатніх кількостях, однак їх можна вводити в специфічні макромолекули, що мають біологічне значення. За допомогою ЯМР вдається стежити згодом за їх хімічної трансформацією. Якщо, наприклад, вирощувати клітини на середовищі з глюкозою ¹³ С, то, вимірюючи протягом деякого часу спектр ЯМР зразка, можна визначати швидкість багатьох реакцій, в яких бере участь глюкоза.

Основним обмеженням методу ЯМР є його низька чутливість. Наприклад, для визначення змісту будь-якого з'єднання з використанням сучасних модифікацій методу ³¹ Р-ЯМР, в грамі живої тканини повинно міститися не менше 0,2 мМ досліджуваного з'єднання. Однак багато метаболіти присутні в живих тканинах у більш низьких концентраціях. Більше того, оскільки для зняття одного спектру ЯМР потрібно, як правило, кілька хвилин, можна не вловити швидкі зміни цитохімічних характеристик. З іншого боку, значна перевага ЯМР полягає в його нешкідливості для живих клітин, і ця обставина робить даний метод досить перспективним для клітинної біології.

2.2 Використання внутрішньоклітинних електродів

Для вивчення окремих клітин необхідно використовувати методи більш чутливі, ніж ЯМР. Один з них заснований на підході, розробленому електрофізіології для вивчення різниці потенціалів і струму на плазматичної мембрани. З цією метою готують внутрішньоклітинні мікроелектроди. Вони складаються з тонких скляних трубок, діаметр кінця яких вимірюється частками мікрона; такі трубочки заповнюють електропровідним розчином (зазвичай це розчин солі КС1 у воді). Кінчик мікроелектроди вводять в цитоплазму через плазматичну мембрану, яка замикається навколо капіляра, щільно прилягаючи до скла, так що клітина залишається відносно неушкодженою.

У дослідженні клітинного вмісту мікроелектроди використовують двояко: з їх допомогою можна вимірювати внутрішньоклітинну концентрацію звичайних іонів, таких, як іони Н ^+, Na ^+, K ^+, Cl ^-, Ca ^{2 +} і Mg ^{2 +.} Вони можуть бути використані і для ін'єкції молекул в клітини.

Мікроелектродна техніку використовують для вивчення транспорту іонів через спеціалізовані білкові канали (іменовані також іонними каналами), що містяться в невеликих ділянках плазматичної мембрани. У цьому випадку необхідний скляний мікроелектрод з дещо товщим кінчиком. Його не вводять в плазматичну мембрану, а щільно і м'яко притискують до неї. Це дозволяє реєструвати електричні характеристики невеликої ділянки мембрани, прилеглого до кінчика мікроелектроди, який торкається до клітки або знаходиться на невеликій відстані від неї. Даний метод відомий як "Петч-реєстрація" (реєстрація в даній ділянці). Його застосування зробило справжню революцію в дослідженні іонних каналів. Це едіственний метод клітинної біології, який дає можливість вивчати функцію одиночної білкової молекули в реальному часі.

2.3 Використання світловипромінюючих індикаторів

Електроди, чутливі до певних іонів, дозволяють вимірювати їх концентрацію тільки в одній точці на клітинній поверхні. Якщо ж іони представлені в клітинах в низькій концентрації, свідчення таких електродів найчастіше виявляються помилковими. Тому в таких випадках для реєстрації використовують внутрішньоклітинні індикатори, що випромінюють світло. Такими є люмінесцентні й флуоресцентні речовини, наприклад, білок Акварин або синтетичні. Цим способом вимірюють концентрацію іонів кальцію і водневих іонів.

Для введення в клітини молекул, не проникають через мембрану (це можуть бути світловипромінюючі індикатори, клітинні білки, пов'язані з флуоресцентною міткою) використовують мікроін'єкції молекул в клітини за допомогою скляної микропипетки. Використовуючи відповідний мікроскоп, дослідник отримує можливість стежити за поведінкою такого білка в процесі зростання і ділення клітин.

Мікроін'єкції - дуже ефективний і досить широко використовуваний метод, однак важливо пам'ятати, що в даному випадку процедурі мікроін'єкції піддається кожна клітина окремо, тому кількість клітин обмежена. Для підвищення проникності клітинних мембран використовують потужний електричний розряд або хімічний вплив, наприклад, розчином детергенту низької концентрації. Електричний розряд створює в плазматичної мембрани великі пори без пошкодження внутрішньоклітинних мембран. Ці пори залишаються відкритими протягом декількох хвилин і навіть годин в залежності від типу клітин та інтенсивності електричного впливу. Через ці пори макромолекули можуть швидко входити в цитозоль або залишати його. При обмеженому впливі мембрана багатьох клітин відновлюється і клітини виживають. Третій метод введення в клітини великих молекул полягає в злитті часток, оточених мембраною і містять необхідні молекули, з плазматичною мембраною клітини.

Розділ III Методи культивування клітин і визначення їх складу

Структуру органел і великі молекули можна вивчати під мікроскопом; для локалізації специфічних молекул в клітині розроблені ефективні методи фарбування. Однак, щоб розібратися в молекулярних основах клітинної організації, необхідний детальний біохімічний аналіз. На жаль, біохімічні методи передбачають використання значної кількості клітин і в процесі дослідження клітини руйнуються. Якщо в якості зразка для біохімічного аналізу використовувати шматочок тканини, то після руйнування буде отримана суміш фрагментів різних клітин. І якщо тканина утворена клітинами різного типу, що скоріше є правилом, ніж винятком, то розібратися в цій суміші буде просто неможливо. Для того, щоб витягнути максимум інформації про всіх клітинах, складових тканини, розроблені методи розділення тканин на клітини і методи виділення окремих типів клітин. Отриману щодо гомогенну популяцію клітин можна піддавати аналізу безпосередньо, або попередньо розмножив їх шляхом культивування.

3.1 Методи культивування клітин

Більшість видів клітин рослин і тварин у сприятливих умовах здатні вижити, розмножитися і навіть диференціюватися. Використовуючи методи культури тканини, можна вивчати клітини під мікроскопом або аналізувати їх біохімічно. Крім того, додаючи в культуральний посудину і видаляючи з нього специфічні молекули, такі, як гормони або фактори зростання, ми можемо судити про їх вплив на клітини. Застосування змішаних культур дозволяє вивчати взаємодію між різними типами клітин.

У наш час культури зазвичай готують з клітинної суспензії, отриманої шляхом дисоціації тканини. Більшість клітин, що утворюють тканини багатоклітинних організмів, на відміну від бактеріальних клітин не здатні рости в суспензії. Для зростання і ділення їм необхідна тверда поверхня. Спочатку, коли метод культивування тільки з'явився, як механічну опори використовували згусток плазми, але в даний час його зазвичай заміняють поверхнею пластикової культуральної чашки. Клітки дуже різняться за своїми потребам; деякі з них здатні рости або диференціюватися тільки в тому випадку, якщо культуральна чашка покрита компонентами позаклітинного матриксу, наприклад колагеном.

Розроблено спеціальні середовища певного хімічного складу, що використовуються для культивування клітин різних типів. Поряд з низькомолекулярними речовинами вони містять один або кілька різних білкових факторів зростання, необхідних клітинам для виживання і проліферація в культурі: наприклад, деяким нервовим клітинам, як у культурі, так і в організмі тварини необхідні слідові кількості фактора, що стимулює зростання нервів. Були відкриті і інші фактори подібного типу, що мають життєво важливе значення для розвитку клітин певних типів і підтримання їх нормального існування.

Більшість клітин ссавців в культурі гине після певного числа поділів; клітини шкіри людини, наприклад, перш ніж загинути, діляться 50-100 разів. Існує припущення, що обмежений термін життя клітин в культурі відображає обмежений термін життя організму, з якого були отримані ці клітини. Іноді в культурі з'являються мутантні клітини, які практично безсмертні. Вони можуть розмножуватися нескінченно і утворюють клітинну лінію. Ці клітини краще ростуть на твердій поверхні, і після утворення безперервного шару їх зростання, як правило, припиняється.

Зазвичай мутантні клітини, здатні до безперервного поділу, все-таки відрізняються від ракових клітин, здатних до безперервного поділу. На відміну від інших клітинних ліній ракові клітини можуть рости, не прикріплений до будь-якої твердої поверхні, і утворюють в культуральних чашках популяцію більш щільну, ніж популяції звичайних клітин. Аналогічне властивість можна викликати експериментально і в нормальних клітин шляхом трансформації їх опухолеродного вірусами або яким-небудь з'єднанням. Отримані таким чином неопластичних трансформовані клітинні лінії здатні викликати утворення пухлин після введення в організм тварин. І трансформовані, і нетрансформовані клітинні лінії служать джерелом великої кількості клітин одного типу і тому представляють велику цінність для дослідника. Такі клітинні лінії мають ще ту перевагу, що при - 70 ° С їх можна зберігати невизначено довго і при цьому вони зберігають здатність виробляти життєздатні клітини після розморожування.

Генетичну однорідність клітинних ліній можна збільшити ще більше шляхом клонування, т. е. виділивши окрему клітку і дозволивши їй пролиферировать до утворення великої колонії. Клон - це популяція клітин, що походять з однієї клітини-попередниці. Клонування клітин використовується в основному для отримання клітинних ліній, в яких мутація торкнулася певні гени. Дослідження таких мутантних клітин, дефектних за специфічним білку, дозволяє дізнатися багато нового про функції білка в нормальних клітинах.

Дві клітини, зливаючись, утворюють гетерокаріон - одну комбіновану клітку з двома ядрами. Зазвичай, щоб здійснити злиття клітин, клітинну суспензію обробляють інактивованими вірусами, або поліетиленгліколем. Обидва цих агента ушкоджують плазматичну мембрану клітини, що і приводить до злиття клітин. Освіта гетерокаріонов дає можливість змішувати компоненти двох окремих клітин з метою вивчення їх взаємодії. Саме в дослідах з гібридизації клітин миші і клітин людини вперше були отримані дані, що свідчать про те, що білки поверхні клітин людини і миші, що перебували спочатку на своїх половинках гетерокаріона, швидко дифундують і перемішуються по всій його поверхні.

Після закінчення певного часу гетерокаріон ділиться мітотично, утворюючи в результаті гібридну клітину. Ядерні оболонки втрачають хромосоми людини. У результаті утворюється безліч гібридних ліній "миша-людина", кожна з яких містить одну або кілька хромосом людини. Це явище виявилося корисним для картування і локалізації генів в геномі людини. Наприклад, інсулін людини синтезують тільки ті гібридні клітини, які містять хромосому 11 людини, отже, ген, що кодує інсулін, знаходиться саме на цій хромосомі.

3.2 Фракціонування клітинного вмісту

При обережному застосуванні методів руйнування деякі органели зберігаються в інтактному стані (ядра, мінтохондріі, апарат Гольджі, лізосоми і пероксисоми). Таким чином, суспензія клітин перетворюється в розчинний екстракт, що містить досить грубу суспензію пов'язаних з мембраною частинок, що володіють характерними розмірами, зарядом і щільністю.

Після того як на початку 40-х років почали використовувати препаративні центрифугу, розділення різних компонентів гомогенату стало цілком реальним. Така обробка ділить клітинні компоненти за їх розміром: більші частки при центрифугуванні рухаються швидше. Великі компоненти екстракту, в тому числі ядра або незруйнована клітини, швидко осідають при відносно низьких швидкостях і утворюють осад на дні центріфужний пробірки.

Ультрацентрифугу поділяє клітинні компоненти не тільки по масі, але і по плавучої щільності. У цьому випадку зразок седіментірует в круговому градієнті, утвореному висококонцентрованим розчином сахарози або хлористого цезію. Компоненти клітин опускаються за градієнтом до тих пір, поки не досягнуть ділянки, щільність розчину в якому дорівнює власної щільності компонентів. Подальшої седиментації компонентів не відбувається і вони "застряють" на цьому рівні. Таким чином, в центріфужний пробірці виникає набір різних смуг, причому смуги прилеглі до дна пробірки, містять компоненти максимальної плавучої щільності. Даний метод настільки чутливий, що з його допомогою можна відокремлювати немічених макромолекули від макромолекул, що містять важкі ізотопи ⁽¹³ С або ¹⁵ N).

Фракціоновані клітинні екстракти, звані також безклітинним системами, широко використовуються для вивчення внутрішньоклітинних процесів. Тільки працюючи з безклітинним екстрактами можна встановити молекулярний механізм біологічних процесів, оскільки лише в цьому випадку досліджуваних механізм може бути вивчений у чистому вигляді без перешкод, створюваних відбуваються в клітині побічними реакціями. Використання безклітинних систем принесло перші тріумфальний успіх при вивченні механізмів біосинтезу білка. Відправною точкою у даному випадку послужив неочищений клітинний екстракт, здатний транслювати молекули РНК в білок. Після багаторазового фракціонування цього екстракту були отримані рибосоми, РНК і різні ферменти, що складають у сукупності апарат біосинтезу білка. Після отримання окремих компонентів у чистому вигляді їх можна було додавати в систему і виключати з неї і таким чином уточнювати роль кожного компонента в процесі біосинтезу білка. Ця ж "система трансляції in vitro" виявилася корисною для розшифровки генетичного коду-з використанням в якості матричної РНК (мРНК) штучних полінуклеотидів відомого складу.

В даний час різні системи трансляції in vitro застосовують і для визначення механізмів розподілу білків з різних внутрішньоклітинним компартментах, а також для ідентифікації білків, що кодуються очищеними препаратами мРНК (очищення мРНК є важливим етапом у процедурі клонування генів).

Багато чого з того, що ми знаємо про молекулярної біології клітини, відкрито при вивченні безклітинних систем. Саме так вдалося з'ясувати механізми реплікації ДНК, транскрипції ДНК, сплайсингу РНК, м'язового скорочення і транспорту частинок за мікротрубочки. Аналіз в безклітинних системах увазі повне розділення всіх складових її індивідуальних макромолекулярних компонентів і, зокрема, всіх білків, що входять в систему. Методи розділення білків розглядаються в наступних розділах.

В даний час хроматографія є одним з методів, найбільш широко використовуваних для фракціонування білків. Найбільшого поширення отримала розподільна хроматографія.

Білки найчастіше розділяють методом хроматографії на колонках (колонкової хроматографії). У цьому випадку суміш молекул в розчині пропускають через колонку, що містить твердий пористий матрикс. У результаті взаємодії з матриксом різні білки проходять через колонку з різною швидкістю. Після того як різні білки досягнутий в певній послідовності дна колонки, їх збирають окремими фракціями. В даний час розроблено і застосовується безліч матриксом різних типів, використовуючи, які можна ділити білки згідно їх заряду (іонообмінна хроматографія), гідрофобності (гідрофобна хроматографія), розміру (хроматографія гель-фільтрацією) або здатності зв'язуватися різними хімічними групами (афінна хроматографія).

На кожному, етапі колонкової хроматографії вміст білка в суміші збільшується не більше ніж у 20 разів, і тому виділити зі складної суміші білків окремий білок за один цикл практично неможливо. На частку кожного білка, як правило, припадає менше 1 / 1000 всього білка клітини, і для його очищення потрібно послідовне використання декількох різних типів колонок.

Набагато більш ефективний метод афінної хроматографії (хроматографія по спорідненості). В основі цього методу лежать біологічно важливі взаємодії, що відбуваються на поверхні білкових молекул. Так, при ковалентном зв'язуванні субстрату ферменту з матриксом, наприклад, з полісахаридними кульками, фермент специфічно утримується матриксом і може бути елюірован (змито) практично в чистому вигляді. Аффінниє колонки мають високий ступінь специфічності; за один цикл хроматографії можна домогтися дуже високого ступеня очищення (1000-10000 разів). Застосування колонок високоефективної рідинної хроматографії забезпечує високий рівень дозволу і значну швидкість процесу. Ось чому саме цей метод надзвичайно популярний зараз для поділу і білків, і малих молекул.

Білки зазвичай несуть сумарний позитивний або негативний заряд, обумовлений наявністю на їх поверхні позитивно чи негативно заряджених груп амінокислот. Якщо білкові молекули помістити в електричне поле, вони починають переміщатися зі швидкістю, яка визначається їх сумарним зарядом, а також формою і розмірами. Цей феномен лежить в основі електрофорезу - методу розділення сумішей білків у вільних водних розчинах і в твердому пористому матриксі.

У середині 60-х років був розроблений модифікований метод електрофорезу - електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (ДСН-ПААГ). При використанні даного методу білки мігрують в інертному матриксі - поліакриламідному гелі з високим вмістом поперечних зшивок. При цьому білки перебувають у розчині, що містить потужний, негативно заряджений детергент - додецилсульфат натрію або ДСН (SDS).

Зв'язуючись з гідрофобними ділянками білкової молекули, цей детергент викликає розгортання білкових молекул в довгі витягнуті ланцюга. Розгортаючись, окремі білкові молекули звільняються з комплексів з білками або молекулами ліпідів і солюбілізіруются в розчині детергенту.

Кожна молекула білка пов'язує значна кількість негативно заряджених молекул детергенту, загальний заряд яких перевершує загальний заряд білка. З цієї причини білок після того, як буде докладено напруга, почне рухатися в напрямку позитивного електрода. Білки одного розміру ведуть себе подібним чином, оскільки, по-перше, їх природна структура повністю порушена ДСН так, що їх форма ідентична, по-друге, вони пов'язують однакову кількість ДСН і набувають однаковий, негативний заряд. Великі білки, що володіють великим зарядом, піддаються дії значних електричних сил, а також більш істотного гальмування. У звичайних розчинах ці ефекти взаємно погашаються, але в порах поліакриламідного гелю, що діє як молекулярне сито, великі білки гальмуються значно сильніше, ніж малі білки. Внаслідок цього складна суміш білків ділиться на ряд смуг, розташованих у відповідності з їх молекулярною масою. Використовуючи барвники, можна виявити основні фракції поліпептидів.

Метод ДСН-електрофорезу білків в поліакриламідному гелі значно потужніше будь-якого іншого методу фракціонування білків, відомих раніше, хоча б тому, що може бути використаний для виявлення будь-якого білка незалежно від його розчинності у воді. При використанні цього методу поліпептиди поділяються строго за розміром, тому з його допомогою можна отримати інформацію про суб'едінічная складі будь-якого комплексу і про молекулярній масі білків, які складають цей комплекс.

Метод двовимірного гель-електрофорезу, в якому об'єднані дві різні процедури поділу, дозволяє ідентифікувати більше 1000 білків. Результати при цьому отримують у вигляді "двовимірної" білкової карти.

При роботі даним методом на першому етапі білки поділяють за їх заряду. Для цього зразок поміщають в невеликий об'єм розчину, що містить неіонний (незаряджений) детергент - меркаптоетанол, і в якості денатуруючого агента - сечовину. Дисоційованому поліпептидні ланцюги поділяють методом ізоелектричного фокусування, заснованому на зміні заряду білкової молекули при зміні рН навколишнього середовища. При ізоелектричного фокусування білки піддаються електрофорез у вузькій трубочці, заповненої поліакриламідному гелем, в якому за допомогою спеціальних буферів створюється градієнт рН. Під дією електричного поля кожен білок переміщається в ту зону градієнта, яка відповідає його ізоелектричної точці і залишається в ній. Так відбувається поділ білків в одному напрямку двовимірного гель-електрофорезу.

На другому етапі трубочка гелю, що містить розділені білки, знову піддається електрофорез, на цей раз в напрямку перпендикулярному того, що на першому етапі. У цьому випадку електрофорез ведуть у присутності ДСН та білки поділяють за їх молекулярній масі, як в одновимірному ДСН-ПААГ. Нерозділеними в результаті залишаються тільки ті білки, які неможливо розрізнити як по ізоелектричної точці, так і за молекулярною масою; таке поєднання зустрічається дуже рідко. Дозвіл цього методу настільки велика, що дозволяє розділити два практично ідентичних білка, що відрізняються однієї зарядженої амінокислотою.

В основі точної ідентифікації білкової молекули лежить визначення амінокислотної послідовності. Вже на першому етапі цього процесу, що включає розщеплення білка на дрібні фрагменти, можна отримати значну інформацію про даному білку. Так, фермент трипсин відщеплює залишки лізину і аргініну з боку карбоксильних груп; хімічний реактив бромистий ціан розщеплює пептидні зв'язки, розташовані після залишків метіоніну. Оскільки такі специфічні ферменти і реактиви розщеплюють в білковій молекулі обмежена кількість зв'язків, за її вплив утворюється суміш великих пептидів. Розділивши цю суміш методом електрофорезу або хроматографії, можна отримати пептидную карту, що характеризує досліджуваний білок. Такі пептидні карти називають іноді "Фінгерпринт" (відбитками пальців) білка.

Після поділу пептидів визначають послідовність амінокислот у кожному з виділених пептидних фрагментів. Спершу пептид обробляють яких-небудь реактивом, взаємодіючим тільки з вільною аміногрупою на його N-кінці, специфічно розщеплюють пептидний зв'язок. Вивільняються амінокислоту ідентифікують методом хроматографії. Що залишився пептид вкорочується на одну амінокислоту. Його також піддають реакцій, що проводяться в тій же послідовності. Циклічний характер цих реакцій дав можливість автоматизувати весь процес у приладах секвенатори. На останньому етапі аналізу послідовності амінокислот, отримані для пептидних фрагментів, розташовують у тому ж порядку, як вони були розташовані в інтактній ланцюга. Для цього порівнюють послідовності наборів перекриваються фрагментів, отриманих при розщепленні одного і того ж білка різними протеолітичними ферментами.

В даний час досить визначити в білку 20 амінокислот, щоб сконструювати ДНК-зонд, який використовується для клонування відповідного гена. Після виділення гена залишилася нез'ясованою частина амінокислотної послідовності білка може бути реконструйована за нуклеотидної послідовності згідно генетичним кодом.

Розглянемо два методи визначення молекул усередині клітин: одна з них включає використання радіоактивних ізотопів, а інший - використання антитіл. Обидва методи дуже ефективні для виявлення певних молекул у складних сумішах. Потенційно ці методи дуже чутливі і при оптимальних умовах дають можливість виявляти в зразку молекули, загальна кількість яких менше 1000.

Радіоактивні молекули можна використовувати для дослідження практично всіх внутрішньоклітинних процесів. Для цього зазвичай в ході експерименту в культуральне середовище додають попередник в радіоактивній формі: при цьому радіоактивні молекули змішуються з присутніми в клітинах нерадіоактивними. Клітина використовує обидва типи молекул, оскільки вони відрізняються тільки масою атомного ядра. Зміна локалізації радіоактивних молекул в клітині або їх хімічні перетворення можна простежити в часі. Саме цей метод дає можливість дискримінувати хімічно ідентичні молекули, історія яких різна - наприклад, ті молекули, які відрізняються часом синтезу. За допомогою радіоактивних методів вдалося визначити, що майже всі молекули живої клітини постійно руйнуються і заміщуються іншими молекулами.

Одна з найбільш важливих областей застосування радіоактивних ізотопів у біології клітини - це визначення локалізації радіоактивних сполук у зрізах клітин або живих тканин методом радіоавтографіі. При використанні цього методу живі клітини піддаються короткочасного мічення з подальшою інкубацією протягом різних проміжків часу в нерадіоактивних середовищі. Потім клітини фіксують і обробляють для проведення світловий або електронної мікроскопії. Кожен приготований препарат покривають тонким шаром фотоемульсії і залишають на кілька днів у темряві - час, протягом, якого відбувається розпад радіоактивного ізотопу. Потім фотоемульсію виявляють. Місце розташування радіоактивних молекул в кожній клітині можна визначити по розташуванню темних зерен срібла.

Антитілами називають білки, які продукують хребетними тваринами для захисту від інфекції. Кожна форма антитіл володіє певними ділянками зв'язування, які призначені для специфічного впізнавання молекул, що стимулювали синтез антитіл. Ці молекули називають антигенами. Висока специфічність антитіл щодо антигену перетворює їх на потужний інструмент для дослідження біології клітини. Після фарбування антитіл флуоресціюючими барвниками їх можна використовувати для визначення внутрішньоклітинної локалізації специфічних макромолекул за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Мічення електроноплотнимі мікрочастинками, наприклад мікросферами колоїдного золота, дозволяє використовувати антитіла для локалізації клітинних антигенів за допомогою електронної мікроскопії. Антитіла можуть виступати в ролі біохімічних ланок для виявлення та визначення кількості молекул в клітинних екстрактах та ідентифікації специфічних білків після їх поділу за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі. При зв'язуванні антитіл з інертним матриксом отримують аффінниє колонки, придатні для виділення і очищення специфічних молекул з грубих клітинних екстрактів.

Зазвичай антитіла витягають із сироватки, збагаченої антитілами, яку отримують шляхом багаторазового введення антигену твариною (наприклад, кролику або козі). Ця Антисироватка містить гетерогенну суміш антитіл, кожен тип яких був утворений певними клітинами, синтезують антитіла (В-лімфоцитами).

Проблему гетерогенності антисироватки вдалося подолати в 1976 р. після розробки нового методу, що зробив революцію в дослідженні внутрішньоклітинних процесів з допомогою антитіл. Цей метод включає клонування В-лімфоцитів, які секретують тільки один певний тип антитіл. Час життя В-лімфоцитів у культурі звичайно досить обмежена. Тому від імунізованих мишей отримують В-лімфоцити, секретирующие окремі види антитіл, і здійснюють їх злиття з "безсмертними" клітинами з пухлини В-лімфоцитарного походження. У результаті утворюється гетерогенна суміш гібридних клітин, з яких відбирають гібриди, здатні розмножуватися в культурі і синтезувати антитіла певного виду. Ці так звані гібридоми клонують окремо і отримують клони, кожен з яких є постійним джерелом моноклональних антитіл одного типу.

Основна перевага методу гібридом визначається можливістю отримання моноклональних антитіл проти неочищених молекул містяться в складній суміші у якості мінорного компонента. Таким чином, в принципі можна отримати моноклональні антитіла проти будь-якого білка, що міститься в клітині. Кожен тип антитіл можна потім використовувати в якості специфічного зонда як для локалізації білків за допомогою цитологічних методів, так і для очищення білків.

Оскільки плазматична мембрана клітин непроникна для великих молекул, білки, розташовані усередині живих клітин, не можуть взаємодіяти з антитілами, що додаються ззовні. Якщо такі білки необхідно пов'язати, в цитоплазму клітин еукаріотів можна ввести антитіла і інші молекули, ін'еціруя їх тонкою скляною піпеткою через плазматичну мембрану. Проколюється плазматична мембрана має здатність "самозапаіваться" через деякий час після ін'єкції.

Розділ IV. Технологія рекомбінантних ДНК

Цей останній розділ присвячений методам вивчення структури і функції клітинних ДНК. Класичний підхід має на увазі використання генетичних методів, що дозволяють судити про функції генів, аналізуючи фенотипи мутантних організмів та їхнього потомства. Цей підхід, як і раніше ефективний, але останнім часом він доповнений набором методів, які в сумі відомі як "технологія рекомбінантних ДНК". Ці методи суттєво розширили можливості генетичних досліджень, оскільки з їх допомогою вдається проводити як прямий контроль, так і детальний хімічний аналіз генетичного матеріалу. Використовуючи методологію рекомбінантних ДНК, вдається навіть мінорні клітинні білки отримувати у великих кількостях і, отже, проводити тонкі біохімічні дослідження структури і функції білка.

Ще не так давно, лише на початку 70-х років біохіміки вважали, що ДНК є найбільш складним для дослідження компонентом клітини. Надзвичайно довгу, хімічно монотонну послідовність нуклеотидів в спадковому матеріалі тоді можна було дослідити лише за допомогою непрямих методів - або визначаючи структуру білка або РНК, або з допомогою генетичного аналізу. В даний час можна вирізати окремі ділянки ДНК, отримувати їх практично в необмеженій кількості і визначати послідовність нуклеотидів по кілька сот нуклеотидів в день.

За допомогою цих же методів можна за бажанням експериментатора змінити виділений ген і ввести його знову в геном культивованих клітин або ембріон тварини (що трохи більш складно), де цей змінений ген починає функціонувати.

Технологія рекомбінантних ДНК зробила істотний вплив на всю клітинну біологію, дозволяючи дослідникам вирішувати задачі, які раніше здавалися нерозв'язними, наприклад, визначати функції багатьох знову відкритих білків та їх індивідуальних доменів, розшифровувати складні механізми регуляції експресії генів у еукаріот. За допомогою методів генної інженерії вдалося у великій кількості отримати багато білків, що беруть участь у регуляції клітинної проліферації та розвитку. Застосування цих методів має принести успіх у великомасштабному промисловому виробництві білкових гормонів та штучних вакцин, на отримання яких раніше витрачали дуже багато сил і коштів.

Технологія рекомбінантних ДНК включає в себе набір методів - як нових, так і запозичених з інших дисциплін, наприклад з генетики мікроорганізмів. Найбільш важливі серед них це: 1) специфічне розщеплення ДНК рестрщірующімі нуклеазами, що істотно прискорює виділення і маніпуляції з різними генами, 2) швидке секвенування всіх нуклеотидів в очищеному фрагменті ДНК, що дозволяє визначити точні межі гена і амінокислотну послідовність, кодованих їм; 3) гібридизація нуклеїнових кислот, що дозволяє виявляти специфічні послідовності РНК або ДНК з великою точністю і чутливістю на підставі їх здатності зв'язувати комплементарні послідовності нуклеїнових кислот; 4) клонування ДНК: оберіть дослідника ДНК-фрагмент вводять в самореплицирующихся генетичний елемент (плазміди або вірус), який використовують для трансформації бактерій. Бактеріальна клітина після трансформації відтворює цей фрагмент в багатьох мільйонах ідентичних копій; 5) генетична інженерія, за допомогою якої послідовності ДНК змінюють з метою створення модифікованих версій генів, які потім знов впроваджують в клітини або організми.

4.1 Виділення та фракціонування ДНК

Основна проблема виділення нуклеїнових кислот полягає в отриманні клітин та відділенні нуклеїнових кислот від пов'язаних з ними білків та інших клітинних компонентів. Крім очищення нуклеїнових кислот від небажаних компонентів, слід звернути увагу на те, що самі нуклеїнові кислоти вимагають виключно обережного поводження, так як вони надзвичайно чутливі до дії нуклеаз і гідродинамічних сил. Клітини гомогенізують різними методами, а з гомогенату відокремлюють нуклеїнові кислоти. З гомогенату нуклеїнові кислоти можна виділити двома методами, які полягають в "висолювання" ДНК різними сумішами органічних розчинників. Нуклеїнові кислоти залишаються у водній фазі, в той час як інші денатуровані макромолекули збираються на кордоні між фазами. Ці методи не дозволяють виділити непошкодженими великі молекули ДНК. Утворену гетерогенну суміш нуклеїнових кислот піддають поділу на фракції методами ультрацентрифугування, гель-фільтрації на сефадекса, хроматографування. Отримані фракції ДНК піддають секвенированию, для чого їх піддають дії ендонуклеаз рестрикції.

4.2 Розщеплення ДНК рестріцірующімі нуклеазами

Для захисту від молекул чужорідних ДНК, здатних проникнути в клітину і викликати її трансформацію, багато бактерії виробляють ферменти рестріцірующіе нуклеази, здатні зруйнувати чужорідну ДНК. Кожен такий фермент пізнає в ДНК специфічну послідовність з 4-6 нуклеотидів. Відповідні послідовності в геномі самих бактерій замасковані метилюванням залишків А і Ц, але будь-яка чужорідна молекула ДНК, потрапивши в клітину, негайно розпізнається нуклеаз, і обидві ланцюга її ДНК розрізаються. В даний час відомо більше 100 таких ферментів, більшість з яких пізнає різні послідовності нуклеотидів.

Порівняння розмірів фрагментів ДНК, отриманих після обробки певного ділянки геному набором рестріцірующіх нуклеаз, дозволяє побудувати рестрикційну карту, на якій вказано положення кожного сайту рестрикції щодо інших рестрикційних ділянок. Короткі фрагменти, розділені електрофорезом або хроматографією, секвеніруют, тобто визначається послідовність нуклеотидів.

4.3 Секвенування ДНК

Для визначення нуклеотидної послідовності в ДНК були розроблені два методи:

1. Метод з використанням "мінус-і плюс"-систем ("мінус-плюс"-метод, метод Сенгера).

2. Метод з використанням діметілсульфата і гідразину (метод Максама-Гілберта).

Метод Сенгера полягає в отриманні коротких ділянок ланцюга ДНК на матриці батьківської ДНК, при цьому використовуються різні унікальні за властивостями ферменти. Зіставлення отриманих фрагментів дозволяє встановити вихідну послідовність.

Метод Максама-Гілберта побудований на розщепленні фрагментів ДНК за визначеними підставами хімічними агентами. Чергування цих розщеплень на однорідному матеріалі (спочатку, припустимо, по А, потім по Т, Г, С) дозволяє отримати набори коротеньких фрагментів. Зіставленням встановлюють загальну послідовність.

Незважаючи на коротеньке виклад суті методів, самі методи є дуже складною технічною процедурою. Але, все-таки, дані методи вдалося автоматизувати, що дозволяє досить швидко встановлювати послідовності нуклеотидів у генах, а також призвело до розшифровки генетичних карт багатьох організмів, у тому числі і людини.

4.4 Клонування ДНК

Багато рестріцірующіе нуклеази вносять розриви в два ланцюги ДНК зі зміщенням на кілька нуклеотидів, так що на кінцях утворюються короткі одноланцюгові ділянки. Ці одноланцюгові кінцеві ділянки мають здатність утворювати комплементарні пари основ з будь-яким іншим одноланцюговим ділянкою, отриманим за допомогою того ж ферменту, і тому їх називають липкими кінцями. Липкі кінці, утворені рестрикційних ферментів, дозволяють легко з'єднати два будь-яких фрагмента ДНК воєдино за умови, що ці фрагменти утворилися після дії однієї і тієї ж рестріцірующей нуклеази (рестриктаз). Таким чином, фрагмент ДНК будь-якого походження можна вбудувати в очищену ДНК авторепліцірующегося генетичного елемента, яким, як правило, є плазміда або бактеріальний вірус. Вихідний фрагмент може відбуватися прямо з геномної ДНК, або з кДНК (комплементарної ДНК), тобто з ДНК, отриманої копіюванням матричної РНК.

4.5 Гібридизація нуклеїнових кислот

Якщо водний розчин ДНК нагріти до 100 ° С і сильно защелочіть (рН 13), то комплементарні пари основ, які утримують два ланцюги подвійної спіралі разом, зруйнуються і ДНК швидко дисоціює на дві

ланцюга. Цей процес, званий денатурацією ДНК, раніше вважався необоротним. Однак у 1961 році було виявлено, що якщо комплементарні ланцюга ДНК витримати при температурі 65 ° С, вони легко спаровуються, відновлюючи структуру подвійної спіралі (процес, який отримав назву ренатурації або гібридизації) Подібні процеси гібридизації можуть відбуватися між двома будь-якими одинарними ланцюгами нуклеїнових кислот (ДНК -ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК) за умови, що вони містять комплементарні послідовності нуклеотидів.

Цей метод дуже ефективний для пошуку неідентичних, але споріднених генів; наприклад, після клонування цікавлять дослідника генів миші або курки, їх послідовності можуть бути використані для пошуку відповідних генів в геномі людини.

ДНК-зонди застосовують і в реакціях гібридизації з РНК для виявлення експресії даного гена в клітинах. У цьому випадку ДНК-зонд, що містить частину послідовності гена, намагаються гібрідізовать з РНК, виділеної з аналізованої клітини. Якщо гібридизація відбувається, проводять кількісне визначення експресії. Більш удосконалені методики припускають обробку ДНК-зонда специфічними нуклеазами для виявлення ділянок, гибрідизуючою з клітинної РНК. Таким чином можна визначити початкові і кінцеві ділянки транскриптів РНК; цей же метод може бути корисний для з'ясування точних меж ділянок, вирізані з транскриптів РНК в процесі сплайсингу РНК.

4.6 Методи рекомбінантних ДНК

Розробка методів рекомбінантних ДНК зробила доступними будь-які клітинні білки (включаючи мінорні білки) у великих кількостях. Для цього клонують ген потрібного білка і потім вбудовують його в спеціальну плазміду, іменовану клонуючим вектором. Цей вектор сконструйований таким чином, що будучи введеним в бактерії, дріжджі або клітини ссавців відповідного типу, він забезпечує великомасштабний синтез цього білка. Таким чином, якщо раніше для детальних структурних або функціональних досліджень були доступні лише деякі білки, в даний час практично всі білки клітини можуть бути предметом таких досліджень.

Отримати мутантів, у яких порушена реплікація ДНК або, наприклад, розвиток очі, в принципі досить просто. Однак, щоб зв'язати цей дефект зі зміною конкретного білка, можуть знадобитися роки. Технологія рекомбінантних ДНК дала в руки дослідників зовсім інший підхід: аналіз починається з білка і завершується створенням мутантної клітини або цілого організму. Оскільки такий підхід в порівнянні з традиційним напрямком генетичного аналізу від гена до білка представляється зворотним, його зазвичай називають зворотним генетикою.

Зворотній генетика починається з виділення з клітини потрібного білка. Ген цього білка клонують і визначають його нуклеотидну послідовність; потім цю послідовність міняють біохімічними методами, створюючи мутантний ген, що кодує змінену форму білка. Потім такий ген вводять в клітку, де він може вбудуватися в хромосому в процесі гомологічної рекомбінації і перетворитися таким чином в постійний елемент геному. Якщо вбудований ген експресується, то несуча його клітка і всі її нащадки будуть синтезувати змінений білок. У тому випадку, коли змінений in vitro ген вводять в запліднену яйцеклітину, виходить багатоклітинний мутантний організм. Деякі з таких трансгенних організмів передадуть цей ген своїм нащадкам в якості постійного елемента клітин зародкової лінії. Така генетична трансформація в даний час стає звичайною процедурою для плодових мушок або ссавців. В принципі на сьогоднішній день абсолютно реальна і трансформація людини, але такі експерименти не виконують зі страху перед можливими генетичними порушеннями, які не можна виключити у осіб, які стали об'єктом таких досліджень.

Технологія рекомбінантних ДНК зробила істотний вплив на всю клітинну біологію, дозволяючи дослідникам вирішувати задачі, які раніше здавалися нерозв'язними, наприклад, визначати функції багатьох знову відкритих білків та їх індивідуальних доменів, розшифровувати складні механізми регуляції експресії генів у еукаріот. За допомогою методів генної інженерії вдалося у великій кількості отримати багато білків, що беруть участь у регуляції клітинної проліферації та розвитку.

Висновок

У ході виконання даної курсової роботи були розглянуті різноманітні методи, які використовуються для вивчення клітин на сучасному етапі наукового розвитку. Наведені у форматі даної роботи методи можна систематизувати на основі їх підходу до дослідження. Можна виділити методи статичного дослідження, такі як:

а) методи оптичної мікроскопії;

б) методи електронної мікроскопії;

в) методи фракціонування клітинного вмісту;

г) рентгеноструктурний аналіз і метод ЯМР.

Також виділимо методи дослідження функціонування клітини (тобто безпосередньо впливають на її функціонування):

а) методика мічених ізотопів і антитіл;

б) методи внутрішньоклітинних ін'єкцій;

в) методи клітинних культур і тканин;

г) методи гібридизації та клонування ДНК.

Набір функціональних методів дуже багатий і не повністю висвітлений в даній роботі, оскільки не можливо описати всі їхні разнооразіе в такому форматі, наприклад, не враховано багато різноманітних генетичних методів, які допомагають встановити функції багатьох молекул, а також механізми спадкування.

З викладеного матеріалу випливає, що сучасна клітинна біологія оперує безліччю методів, що дозволяють досліджувати клітку не тільки в її статичному вияві, але і розібратися в її функціонуванні на молекулярному рівні. А деякому роді вінцем сучасних досягнень в клітинній біології є методи генної інженерії.

Список використаної літератури

1. Айала Ф. Кайгер Дж. Сучасна генетика. У 3-х т. Пер з англ.: - М.: Світ, 1987.

2. Албертс Б. та інших Молекулярна біологія клітини. У 5-ти томах. М.: Світ, 1986 - 1987.

3. Зенгбуш П. Молекулярна та клітинна біологія. У 3-х т. М.: Світ, 1982.

4. Ленінджер А. Основи біохімії. У 3-х т. М.: Світ, 1985.

5. Льюин Б. Гени. М.: Світ, 1987.

6. Страйер Л. Біохімія. У 3-х т. М.: Світ, 1985.

7. Третяк А. П. Молекулярна біологія. Чернігів. 1999.