ВСТУП
Для ідентифікації антибіотиків та їх віднесення до тієї чи іншої групи антибактеріальних препаратів служить ряд хроматографічних методів. До недавнього часу найбільш поширеним методом була паперова хроматографія (висхідна, спадна, кругова, центрифужна, одно-та двовимірна паперова хроматографія, хроматографія на папері, просоченої буферами, на іонообмінної папері і т. п.), проте згодом широке поширення набула також ТШХ ( переважно на силікагелі або на оксиді алюмінію), що відрізняється простотою апаратурного оформлення і високою швидкістю аналізу. Щоб надати сорбенту певні властивості, його можна заздалегідь обробити відповідним реагентом. Наприклад, для поділу тетрациклінів, здатних утворювати хелати, Нішімото та ін використовували пластинки з силікагелем, просоченим розчином динатрієвої солі ЕДТА. Відомі приклади хроматографическогоанализа антибіотиків на пластинках з целюлозою, сефадекса і активним вугіллям.
Для ідентифікації багатьох антибіотиків можна використовувати також електрофорез і противоточной розподіл. Що ж стосується розділення й ідентифікації антибіотиків за допомогою ГЖХ то в останні роки цей метод в значній мірі замінено на ВЕРХ, основні переваги якої полягають у тому, що вона забезпечує високу швидкість і ефективність розділення і детектування елюата не пов'язане з руйнуванням компонентів аналізованої суміші. Разом з тим ВЕРХ не позбавлена і деяких недоліків: по-перше, при переході від одного антибіотика до іншого часто буває необхідно міняти систему розчинників і режим детектування, і, по-друге, ВЕРХ на відміну від паперової та тонкошарової хроматографії не дозволяє одночасно аналізувати кілька сумішей.
Лише для невеликого числа з тисяч відомих антибіотиків розроблені системи класифікації та ідентифікації. У роботі на підставі даних ТШХ і біоавтографіі запропоновано класифікацію 151 антибіотика, володіє протипухлинною активністю; в роботах для класифікації 91 антибіотика використаний метод «миттєвої ТШХ», а в роботі розглянуті питання, пов'язані із застосуванням ТШХ-систем для класифікації та ідентифікації антибіотиків. Існують два довідника по хроматографії антибіотиків. У «Посібнику по хроматографії» наведені таблиці з даними по хроматографическим властивостями цих сполук. Опис ТШХ-методик можна знайти в докладному огляді Лотта та ін
Методи виявлення антибіотиків протягом ряду років практично не зазнали жодних змін. Зазвичай вони включають біоавтографію за допомогою чутливих до даного антибіотика мікроорганізмів, посіяних на агарі, або прояв хроматограм шляхом їх обприскування розчинами відповідних реагентів з наступним переглядом при УФ-освітленні. Для виявлення антибіотиків найбільш придатний метод біоавтографіі, суть якого полягає в наступному. Висушену паперову хроматограму, тонкошарову пластінпластінку або Електрофореграма притискують до поверхні агару, що містить культуру відповідного мікроорганізму, і витримують протягом певного часу. За час інкубації число бактерій збільшується лише в тих ділянках агару, які не стикалися з антибіотиком. За положенням зон, в яких пригнічується ріст бактерій, визначають значення Rf сполук, які проявляють властивості антибіотика. Мейерс і Чанг запропонували спосіб збільшення чутливості виявлення антибіотиків за допомогою Trichomonas, заснований на використанні монофосфату фенолфталеїну.
У цій роботі ми не будемо заглиблюватися в питання, що стосуються препаративної хроматографії, а обмежимося лише описом методології ідентифікації антибіотиків.
Метаболіти Актиномицет
Метод ТШХ застосовували для виділення, очистки та ідентифікації різних продуктів метаболізму актиноміцетів. Бек та ін призводять величини Rf для нонактіна і деяких його гомологів, отримані на силікагелі G з сумішшю хлороформ-етилацетат (1:2): нонактін 0,62, монактін 0,48, дінактін 0,32 і трінактін 0,15. Бікель та ін встановили значення Rf акуміціна і ряду стандартних антибіотиків у трьох різних розчинниках на силікагелі G (табл. 1.1).
Таблиця 1.1
Величини Rf X 100 акуміціна і стандартних антибіотиків групи макролідів, отримані на силікагелі G
Виявлення плям вони проводили обробкою сірчаної кислотою або методом біоавтографіі. З цією метою на поверхню зарядженого бактеріями шару агарового холодцю поміщали шари фільтрувального паперу, після чого до паперу притискали протягом приблизно 20 хв пластинку розміром 20X20 см із зусиллям близько 2 кг. Шар агару инкубировали від 16 до 18 год при 37 ° С.
Кассані та ін описали хроматографічний аналіз актиноміцину на силікагелі і оксиді алюмінію. Відокремити групу С від групи F можна на силікагелі з допомогою ряду різних розчинників, серед яких кращим виявилася суміш бутанол-оцтова кислота-вода (10: 1: 3); в цій суміші Rf для групи F дорівнює 0,5, а для групи С - 0,7 при довжині шляху поділу 15 см. Окремі з'єднання можна виділити на оксиді алюмінію, проводячи елюювання нижнім шаром суміші розчинників етилацетат-Сімм-тетрахлоретан-вода (3:1:3); при цьому (довжина шляху поділу 12,5 см ) отримані наступні величини Rf: d - 0,44; С2 - 0,51; С3 - 0,58; "Fi - 0,21 і F2 - 0,35; ці сполуки легко виявити по яскраво-помаранчевої забарвленні при спостереженні в УФ -свете.
Кондо та ін провели поділ водорозчинних основних антибіотиків, продукованих стрептоміцину на активному вугіллі, використовуючи чотири типи платівок з нейтрального і підкисленого активного вугілля з гіпсом в якості сполучного і без нього. Кращі результати отримані на підкисленою вугіллі. Для незакріплених верств суспензію готували, змішуючи 10 г активного вугілля, 30 мл 0,5 н. соляної кислоти і 30 мл метанолу. Для шарів, що містять гіпс в якості сполучного, додавали 0,5 г гіпсу і сірчану кислоту замінювали на соляну. Досліджували шість сумішей; кращі результати отримані для суміші метанол-0, 5 н. кислота (1:4) з добавкою соляної чи сірчаної кислот в залежності від того, яку з кислот використовували при приготуванні золю для тонкошарового покриття. Таким методом антибіотики були розділені на 4 групи: стрептоміцин, стрептотріцин, фрадіоміцін і канаміцин. Насбаумер і Шордере використовували тонкі шари силікагелю із сумішами н-бутанол-вода-метанол (40: 20: 10) + n-толуолсульфокіслота для ідентифікації стрептоміцину і Дигідрострептоміцин.
Катаяма і Ікеда розробили методику двовимірного поділу стрептоміцином, що поєднує ТШХ на силікагелі і подальший електрофорез. Повного поділу всіх компонентів вдалося досягти методом ТШХ в чотири етапи, використовуючи 1) насичений водою бутанол, що містить по 2% п-толуол сульфокислоти і пиперидина (розчинник Si), з подальшим електрофорезом в 1%-ном тетраборату натрію, 2) ТШХ з 3 %-ним ацетатом натрію (розчинник S2) з подальшим електрофорезом в 1%-ном тетраборату натрію, 3) ТШХ з S2 з подальшим електрофорезом в буфері Міхаеліса-вероналу, рН 8,0, і 4) ТШХ з S2 з подальшим електрофорезом в 0 , 04 М буферному розчині Форміат амонію, рН 3. З'єднання виявляли реактивом Т-239.
Стрептоміцин, дигидродезоксистрептомищин. і дігідростреп-томіцін ділили на силікагелі, елюіруя 3% - або 4%-ним ацетатом натрію. Стрептоміцин та інші туберкулостатіче-ські антибіотики (канаміцин, виомицин, ціклозерін, рифами-цин SV і капреоміцину) поділяли спочатку сумішшю ацетон-2%-ний ацетат натрію (9:1), а потім сумішшю н-бутанол-піридин-метанол-оцтова кислота-вода (30: 20: 20: 1: 30) на силікагелі G.
Боровицкая ділила стрептоміцин, неоміцин, канаміцин, паромоміцін, гентаміцин, міцерін (форма неоміцину), Фраміцетину і лінкоміцин на шарах силікагель-кизельгур (1:2), застосовуючи суміш метанол-етилацетат-вода-25%-ний аміак-піридин-3, 85%-ний ацетат амонію (10:2:6:2: 1: 20).
Келлер-Шірлайн і Ронкарі досліджували гідроліз продуктів ланкаміціна.
ЕРИТРОМІЦИН
Андерсон поділяв ці антибіотики на тонких шарах силікагелю, елюіруя сумішшю метиленхлорид-метанол-бензол-формамід (80:20:20:2-5). Вологість атмосфери лабораторії визначає процентний вміст формамідом в розчині. рителя. Чим вище вологість, тим менше потрібно формамідом для поділу. Так, при 20%-ної ОВ (відносна вологість) потрібно 5 обсягів формамідом, а при 30-40%-ний - 3-2 обсягу. Плями виявляли обприскуванням 10%-ної фосфомолібденовой кислотою в етанолі або 50%-ним розчином сірчаної кислоти. В обох випадках після обприскування платівки нагрівали на гарячій плитці. Фосфомолібденовая кислота - більш чутливий реактив, але оброблені нею плями знебарвлюються через 1-2 год, тому, якщо хромато-граму потрібно зберегти, слід віддати перевагу обвуглювання сірчаної кислотою.
Мальчевська-Конецкая та ін поділяли еритроміцин А і С і ангідроерітроміцін на силікагелі, використовуючи верхній шар суміші етилацетат-ізопропанол-15%-ний ацетат амонію (9:7:8), рН якого доведений до 10,1. Виявлення прово проводили сумішшю 0,15%-ний розчин ксантідрола в суміші соляна кислота-оцтова кислота (12:1). Чутливість визначення складала 0,05 мкг. Річард і ін використовували суміші метанол - 0,02 н. ацетат натрію (4:1) на силікагелі G, приготованому з 0,02 н. ацетатом натрію, для відділення еритроміцину, естолата еритроміцину і етілсукцінат еритроміцину від деяких продуктів розкладання і фармацевтичних супутніх продуктів. Ці ж автори визначили Rf 23 інших антибіотиків. Радецький і ін [26] застосували прямий денситометрических метод для визначення еритроміцину і естолата еритроміцину в капсулах з тими ж розділяють середовищами. Виявлення здійснювали реактивом Т-139. Точність даних коливалася від 2,1 до 3,4% при чутливості визначення 5 мкг.
Майерс і Сміт описали методику біоавтографіческого аналізу на незакріплених шарах еритроміцину та інших антибіотиків. Після завершення поділу хроматограми сушать і покривають зволоженою фільтрувальним папером, покладеної на чисту скляну пластинку. Потім хроматографіче-ську платівку перевертають і краю фільтрувального паперу загинають тому, «а носій шару. Видаливши. Зовнішню скляну пластинку, притискають папір, що покриває шар, до зернистості шару агару (автори наводять детальну методику приготування такого шару агару з використанням Streptococcus lactis) і витримують 2 год при 37 ° С.
Істербрук і Херсі розробили метод тонкошарового аналізу еритроміцину і його ефірів з Sarcina lutea ATCC 9341 в якості організму для випробування. Площа зони гальмування вимірювали, проектуючи зображення на екран при 12-кратному збільшенні. Встановлено лінійна залежність між логарифмом концентрації речовини і коренем квадратним з площі плями. Чутливість визначення на шарах, нанесених на алюміній, коливається в межах від 0,03 мкг для основ та стеаратів і до 0,05 мкг для естолатов. Системами поділу служили системи Річарда і ін; пластинки попередньо промивалися.
Пеніцилін
Насбаумер розділив пеніциліни після кислотного гідролізу. Аналізуючи продукт розкладання пеніциліну, він досліджував вплив 40 різних компонентів на ідентифікацію пеніцілліяов методом ТШХ. Цей же автор вивчив можливість спектрофотометричного визначення пеніцилінів в різних фармацевтичних препаратах. Прямому аналізу цих антибіотиків заважають поліетиленгліколі і стеарати натрію, проте попереднє розділення методом ТШХ дозволяє відокремити пеніциліни від заважають аналізу сполук. Шари для хроматографічного розділення готують так: змішують 20% рисового крохмалю з силікагелем G у фосфатному буфері (рН 5,8). Елюювання проводять сумішшю бутилацетат-н-бутанол-оцтова кислота-фосфатний буфер (рН 5,8) - метанол (80: 15: 40: 24: 5).
Мак-Гільверей і Стрікленд розділили групу пеніцилінів на шарах целюлози MN 300 і на шарах силікагелю G. Для розділення ампіциліну і гетацілліна на шарах силікагелю цілком придатна також суміш ацетон-ускусная кислота. Ці системи не дозволяють відокремити діклоксаціллін від нафциллин або феніціллін від феноксиметилпенициллина. Нафциллин можна виявити за інтенсивною жовтому забарвленню, яку він дає з 50%-ної сірчаної кислотою. Крім нафциллин жовте забарвлення дає тільки метицилін, але у нього інша величина Rf. Біаджі та ін досліджували вплив рН на розділення методом ТШХ зі зверненням фаз пеніцилінів і сефалоспорінов. Екстрапольовані величини RM для пеніцилінів наведено в табл. 18.6. Аутергофф і Кінцлер ділили пеніциліни на силікагелі G, елюіруя пробу сумішшю бензол-етілформіат-мурашина кислота (80:15:6). Продукти розщеплення окса-циллином і феноксиметилпенициллина були проаналізовані хроматографічно Корчагіним і співробітниками. Вандамм і Фоетс використовували 4 наступні суміші розчинників при поділі продуктів спонтанного хімічного і ферментативного розкладання пеніцилінів і двох цефалоспоринів на силікагелі G: н-бутанол-вода-етанол-оцтова кислота (5:2:1,5:1,5), н- бутанол-вода-оцтова кислота (4:1:1), ацетон-оцтова кислота (19:1) і 85%-ний ацетон.
Манні і ін застосували метод вимірювання відбивної здатності in situ для визначення натрійпеніцілліна G у фармацевтичних препаратах. Після хроматографічного поділу на силікагелі з сумішшю ацетон-хлороформ-оцтова кислота (10:9: 1) автори вимірювали відбивну здатність плям в області 230 нм. Стандартне відхилення склало 5% для зон, що містили 1 мкг проби, і 1,5% для зон, що містили 10 мкг. Сінсхаймер та ін визначали флуоресцентним методом in situ сліди пеніциліну. Бензил-пеніцилін гідролізувати пеніциліназою, піддавали потім хроматографічного розділення на силікагелі G з сумішшю диметилформамід-хлороформ-28%-ний аміак (10:5:4) і вимірювали при 510 нм інтенсивність флуоресценції плями з Rf 0,50 (довжина хвилі збуджуючого випромінювання становила 410 нм). Інтенсивність флуоресценції плям феноксіметіл-пеніциліну, отриманого в результаті гідролізу (Rf 0,88), вимірювали в області 480 ом при довжині хвилі збуджуючого випромінювання 260 нм. Метициллин гідролізувати і вимірювали інтенсивність флуоресценції плями з Rf 0,73 при 480 нм при збуджуючу випромінюванні 350 нм. Межі чутливості в перерахованих вище визначеннях дорівнюють 3, 0,76 і 0,12 мкг відповідно. Пеніциланової кислоти визначали методом флуоресцентної денситометрії плями з Rf 0,45 при 440 нм з порушенням при 350 нм. У цьому випадку після поділу на силікагелі сумішшю хлороформ-етилацетат-мурашина кислота (60:40: 1) платівку витримували 3 хв у парах аміаку, щоб утворився флуоресціюючий продукт. Напівкількісне визначення пеніцилінів та продуктів їх перетворення проводили візуально, порівнюючи розміри плям і їх забарвлення.
Цефалоспорин В і деякі з його похідних аналізували хроматографічно на силікагелі G, використовуючи суміш н-бутанол-оцтова кислота (10:1), насичену водою, а також суміш н-бутанол-піридин-оцтова кислота-вода (17:12:4: 15). Для деяких специфічних сполук застосовували різні комбінації ацетону з бензолом (1:4; 2: 3) і толуолом (2:3; 1: 4; 3: 7; 1: 9), а також толуолу та етил-ацетату (1:1 ). Біаджі та ін розділили методом ТШХ зі зверненням фаз 13 цефалоспоринів. Поділ ці автори проводили на силікагелі, просякнутому силіконом, застосовуючи буферний розчин (рН 7,4) ацетат натрію-веронал, що містив від 0 до 24% ацетону. За отриманими даними були розраховані величини RM. Бурі хроматографіровал цефалоспорин В, цефалотин і цефалоридин на шарах силікагелю, забуференной фосфатним буфером (рН 5,8), елюіруя їх сумішшю ізопропанол - метанол - фосфатний буфер з рН 5,8 (2:7:1).
Рифамицин
Ці антибіотики поділяли за допомогою ряду спиртів та ацетону на шарах силікагелю G. Ацетон виявився кращим розчинником; проводячи елюювання ацетоном, вдається відділити рифаміцин В від рифаміцинів О, рифаміцин SV від ри-фаміціна S, а рифаміцин В від рифаміцинів SV. Ці сполуки інтенсивно забарвлені, і тому при досить високих концентраціях їх можна виявити на платівках, не застосовуючи реактив. Однак мікробіологічним методом їх можна виявити при набагато більш низьких концентраціях. Для 2 - 20 мкг рифаміцинів і дезацетілріфаміціна Колос і Ейдус призводять величини Rf (0,55 і 0,37 відповідно), отримані при хроматографування сумішшю хлороформ-етанол-0, 1 н. соляна кислота (84:15,9:0,1) на хроматографічних смугах № 6060 фірми Eastman. Медж та ін провели хроматографічний аналіз групи напівсинтетичних рифампіцинів на силікагелі з ацетоном.
Для ідентифікації антибіотиків та їх віднесення до тієї чи іншої групи антибактеріальних препаратів служить ряд хроматографічних методів. До недавнього часу найбільш поширеним методом була паперова хроматографія (висхідна, спадна, кругова, центрифужна, одно-та двовимірна паперова хроматографія, хроматографія на папері, просоченої буферами, на іонообмінної папері і т. п.), проте згодом широке поширення набула також ТШХ ( переважно на силікагелі або на оксиді алюмінію), що відрізняється простотою апаратурного оформлення і високою швидкістю аналізу. Щоб надати сорбенту певні властивості, його можна заздалегідь обробити відповідним реагентом. Наприклад, для поділу тетрациклінів, здатних утворювати хелати, Нішімото та ін використовували пластинки з силікагелем, просоченим розчином динатрієвої солі ЕДТА. Відомі приклади хроматографическогоанализа антибіотиків на пластинках з целюлозою, сефадекса і активним вугіллям.
Для ідентифікації багатьох антибіотиків можна використовувати також електрофорез і противоточной розподіл. Що ж стосується розділення й ідентифікації антибіотиків за допомогою ГЖХ то в останні роки цей метод в значній мірі замінено на ВЕРХ, основні переваги якої полягають у тому, що вона забезпечує високу швидкість і ефективність розділення і детектування елюата не пов'язане з руйнуванням компонентів аналізованої суміші. Разом з тим ВЕРХ не позбавлена і деяких недоліків: по-перше, при переході від одного антибіотика до іншого часто буває необхідно міняти систему розчинників і режим детектування, і, по-друге, ВЕРХ на відміну від паперової та тонкошарової хроматографії не дозволяє одночасно аналізувати кілька сумішей.
Лише для невеликого числа з тисяч відомих антибіотиків розроблені системи класифікації та ідентифікації. У роботі на підставі даних ТШХ і біоавтографіі запропоновано класифікацію 151 антибіотика, володіє протипухлинною активністю; в роботах для класифікації 91 антибіотика використаний метод «миттєвої ТШХ», а в роботі розглянуті питання, пов'язані із застосуванням ТШХ-систем для класифікації та ідентифікації антибіотиків. Існують два довідника по хроматографії антибіотиків. У «Посібнику по хроматографії» наведені таблиці з даними по хроматографическим властивостями цих сполук. Опис ТШХ-методик можна знайти в докладному огляді Лотта та ін
Методи виявлення антибіотиків протягом ряду років практично не зазнали жодних змін. Зазвичай вони включають біоавтографію за допомогою чутливих до даного антибіотика мікроорганізмів, посіяних на агарі, або прояв хроматограм шляхом їх обприскування розчинами відповідних реагентів з наступним переглядом при УФ-освітленні. Для виявлення антибіотиків найбільш придатний метод біоавтографіі, суть якого полягає в наступному. Висушену паперову хроматограму, тонкошарову пластінпластінку або Електрофореграма притискують до поверхні агару, що містить культуру відповідного мікроорганізму, і витримують протягом певного часу. За час інкубації число бактерій збільшується лише в тих ділянках агару, які не стикалися з антибіотиком. За положенням зон, в яких пригнічується ріст бактерій, визначають значення Rf сполук, які проявляють властивості антибіотика. Мейерс і Чанг запропонували спосіб збільшення чутливості виявлення антибіотиків за допомогою Trichomonas, заснований на використанні монофосфату фенолфталеїну.
У цій роботі ми не будемо заглиблюватися в питання, що стосуються препаративної хроматографії, а обмежимося лише описом методології ідентифікації антибіотиків.
Метаболіти Актиномицет
Метод ТШХ застосовували для виділення, очистки та ідентифікації різних продуктів метаболізму актиноміцетів. Бек та ін призводять величини Rf для нонактіна і деяких його гомологів, отримані на силікагелі G з сумішшю хлороформ-етилацетат (1:2): нонактін 0,62, монактін 0,48, дінактін 0,32 і трінактін 0,15. Бікель та ін встановили значення Rf акуміціна і ряду стандартних антибіотиків у трьох різних розчинниках на силікагелі G (табл. 1.1).
Таблиця 1.1
Величини Rf X 100 акуміціна і стандартних антибіотиків групи макролідів, отримані на силікагелі G
| Антибіотики | Метанол | Хлороформ-метанол (95:5) | Хлороформ-метанол (1:1) |
| Акуміцін Анголаміцін Тилозин Карбоміцін Форомацідін А Форомацідін У Форомацідін З Еритроміцин Нарбоміцін Пікроміцін Ланкаміцін | 66 65 68 75 32 34 37 16 22 22 74 | 35 18 7 40 2 5 6 3 12 7 37 | 82 82 81 88 59 61 64 29 41 36 87 |
Кассані та ін описали хроматографічний аналіз актиноміцину на силікагелі і оксиді алюмінію. Відокремити групу С від групи F можна на силікагелі з допомогою ряду різних розчинників, серед яких кращим виявилася суміш бутанол-оцтова кислота-вода (10: 1: 3); в цій суміші Rf для групи F дорівнює 0,5, а для групи С - 0,7 при довжині шляху поділу 15 см. Окремі з'єднання можна виділити на оксиді алюмінію, проводячи елюювання нижнім шаром суміші розчинників етилацетат-Сімм-тетрахлоретан-вода (3:1:3); при цьому (довжина шляху поділу 12,5 см ) отримані наступні величини Rf: d - 0,44; С2 - 0,51; С3 - 0,58; "Fi - 0,21 і F2 - 0,35; ці сполуки легко виявити по яскраво-помаранчевої забарвленні при спостереженні в УФ -свете.
Кондо та ін провели поділ водорозчинних основних антибіотиків, продукованих стрептоміцину на активному вугіллі, використовуючи чотири типи платівок з нейтрального і підкисленого активного вугілля з гіпсом в якості сполучного і без нього. Кращі результати отримані на підкисленою вугіллі. Для незакріплених верств суспензію готували, змішуючи 10 г активного вугілля, 30 мл 0,5 н. соляної кислоти і 30 мл метанолу. Для шарів, що містять гіпс в якості сполучного, додавали 0,5 г гіпсу і сірчану кислоту замінювали на соляну. Досліджували шість сумішей; кращі результати отримані для суміші метанол-0, 5 н. кислота (1:4) з добавкою соляної чи сірчаної кислот в залежності від того, яку з кислот використовували при приготуванні золю для тонкошарового покриття. Таким методом антибіотики були розділені на 4 групи: стрептоміцин, стрептотріцин, фрадіоміцін і канаміцин. Насбаумер і Шордере використовували тонкі шари силікагелю із сумішами н-бутанол-вода-метанол (40: 20: 10) + n-толуолсульфокіслота для ідентифікації стрептоміцину і Дигідрострептоміцин.
Катаяма і Ікеда розробили методику двовимірного поділу стрептоміцином, що поєднує ТШХ на силікагелі і подальший електрофорез. Повного поділу всіх компонентів вдалося досягти методом ТШХ в чотири етапи, використовуючи 1) насичений водою бутанол, що містить по 2% п-толуол сульфокислоти і пиперидина (розчинник Si), з подальшим електрофорезом в 1%-ном тетраборату натрію, 2) ТШХ з 3 %-ним ацетатом натрію (розчинник S2) з подальшим електрофорезом в 1%-ном тетраборату натрію, 3) ТШХ з S2 з подальшим електрофорезом в буфері Міхаеліса-вероналу, рН 8,0, і 4) ТШХ з S2 з подальшим електрофорезом в 0 , 04 М буферному розчині Форміат амонію, рН 3. З'єднання виявляли реактивом Т-239.
Стрептоміцин, дигидродезоксистрептомищин. і дігідростреп-томіцін ділили на силікагелі, елюіруя 3% - або 4%-ним ацетатом натрію. Стрептоміцин та інші туберкулостатіче-ські антибіотики (канаміцин, виомицин, ціклозерін, рифами-цин SV і капреоміцину) поділяли спочатку сумішшю ацетон-2%-ний ацетат натрію (9:1), а потім сумішшю н-бутанол-піридин-метанол-оцтова кислота-вода (30: 20: 20: 1: 30) на силікагелі G.
Боровицкая ділила стрептоміцин, неоміцин, канаміцин, паромоміцін, гентаміцин, міцерін (форма неоміцину), Фраміцетину і лінкоміцин на шарах силікагель-кизельгур (1:2), застосовуючи суміш метанол-етилацетат-вода-25%-ний аміак-піридин-3, 85%-ний ацетат амонію (10:2:6:2: 1: 20).
Келлер-Шірлайн і Ронкарі досліджували гідроліз продуктів ланкаміціна.
ЕРИТРОМІЦИН
Андерсон поділяв ці антибіотики на тонких шарах силікагелю, елюіруя сумішшю метиленхлорид-метанол-бензол-формамід (80:20:20:2-5). Вологість атмосфери лабораторії визначає процентний вміст формамідом в розчині. рителя. Чим вище вологість, тим менше потрібно формамідом для поділу. Так, при 20%-ної ОВ (відносна вологість) потрібно 5 обсягів формамідом, а при 30-40%-ний - 3-2 обсягу. Плями виявляли обприскуванням 10%-ної фосфомолібденовой кислотою в етанолі або 50%-ним розчином сірчаної кислоти. В обох випадках після обприскування платівки нагрівали на гарячій плитці. Фосфомолібденовая кислота - більш чутливий реактив, але оброблені нею плями знебарвлюються через 1-2 год, тому, якщо хромато-граму потрібно зберегти, слід віддати перевагу обвуглювання сірчаної кислотою.
Мальчевська-Конецкая та ін поділяли еритроміцин А і С і ангідроерітроміцін на силікагелі, використовуючи верхній шар суміші етилацетат-ізопропанол-15%-ний ацетат амонію (9:7:8), рН якого доведений до 10,1. Виявлення прово проводили сумішшю 0,15%-ний розчин ксантідрола в суміші соляна кислота-оцтова кислота (12:1). Чутливість визначення складала 0,05 мкг. Річард і ін використовували суміші метанол - 0,02 н. ацетат натрію (4:1) на силікагелі G, приготованому з 0,02 н. ацетатом натрію, для відділення еритроміцину, естолата еритроміцину і етілсукцінат еритроміцину від деяких продуктів розкладання і фармацевтичних супутніх продуктів. Ці ж автори визначили Rf 23 інших антибіотиків. Радецький і ін [26] застосували прямий денситометрических метод для визначення еритроміцину і естолата еритроміцину в капсулах з тими ж розділяють середовищами. Виявлення здійснювали реактивом Т-139. Точність даних коливалася від 2,1 до 3,4% при чутливості визначення 5 мкг.
Майерс і Сміт описали методику біоавтографіческого аналізу на незакріплених шарах еритроміцину та інших антибіотиків. Після завершення поділу хроматограми сушать і покривають зволоженою фільтрувальним папером, покладеної на чисту скляну пластинку. Потім хроматографіче-ську платівку перевертають і краю фільтрувального паперу загинають тому, «а носій шару. Видаливши. Зовнішню скляну пластинку, притискають папір, що покриває шар, до зернистості шару агару (автори наводять детальну методику приготування такого шару агару з використанням Streptococcus lactis) і витримують 2 год при 37 ° С.
Істербрук і Херсі розробили метод тонкошарового аналізу еритроміцину і його ефірів з Sarcina lutea ATCC 9341 в якості організму для випробування. Площа зони гальмування вимірювали, проектуючи зображення на екран при 12-кратному збільшенні. Встановлено лінійна залежність між логарифмом концентрації речовини і коренем квадратним з площі плями. Чутливість визначення на шарах, нанесених на алюміній, коливається в межах від 0,03 мкг для основ та стеаратів і до 0,05 мкг для естолатов. Системами поділу служили системи Річарда і ін; пластинки попередньо промивалися.
Пеніцилін
Насбаумер розділив пеніциліни після кислотного гідролізу. Аналізуючи продукт розкладання пеніциліну, він досліджував вплив 40 різних компонентів на ідентифікацію пеніцілліяов методом ТШХ. Цей же автор вивчив можливість спектрофотометричного визначення пеніцилінів в різних фармацевтичних препаратах. Прямому аналізу цих антибіотиків заважають поліетиленгліколі і стеарати натрію, проте попереднє розділення методом ТШХ дозволяє відокремити пеніциліни від заважають аналізу сполук. Шари для хроматографічного розділення готують так: змішують 20% рисового крохмалю з силікагелем G у фосфатному буфері (рН 5,8). Елюювання проводять сумішшю бутилацетат-н-бутанол-оцтова кислота-фосфатний буфер (рН 5,8) - метанол (80: 15: 40: 24: 5).
Мак-Гільверей і Стрікленд розділили групу пеніцилінів на шарах целюлози MN 300 і на шарах силікагелю G. Для розділення ампіциліну і гетацілліна на шарах силікагелю цілком придатна також суміш ацетон-ускусная кислота. Ці системи не дозволяють відокремити діклоксаціллін від нафциллин або феніціллін від феноксиметилпенициллина. Нафциллин можна виявити за інтенсивною жовтому забарвленню, яку він дає з 50%-ної сірчаної кислотою. Крім нафциллин жовте забарвлення дає тільки метицилін, але у нього інша величина Rf. Біаджі та ін досліджували вплив рН на розділення методом ТШХ зі зверненням фаз пеніцилінів і сефалоспорінов. Екстрапольовані величини RM для пеніцилінів наведено в табл. 18.6. Аутергофф і Кінцлер ділили пеніциліни на силікагелі G, елюіруя пробу сумішшю бензол-етілформіат-мурашина кислота (80:15:6). Продукти розщеплення окса-циллином і феноксиметилпенициллина були проаналізовані хроматографічно Корчагіним і співробітниками. Вандамм і Фоетс використовували 4 наступні суміші розчинників при поділі продуктів спонтанного хімічного і ферментативного розкладання пеніцилінів і двох цефалоспоринів на силікагелі G: н-бутанол-вода-етанол-оцтова кислота (5:2:1,5:1,5), н- бутанол-вода-оцтова кислота (4:1:1), ацетон-оцтова кислота (19:1) і 85%-ний ацетон.
Манні і ін застосували метод вимірювання відбивної здатності in situ для визначення натрійпеніцілліна G у фармацевтичних препаратах. Після хроматографічного поділу на силікагелі з сумішшю ацетон-хлороформ-оцтова кислота (10:9: 1) автори вимірювали відбивну здатність плям в області 230 нм. Стандартне відхилення склало 5% для зон, що містили 1 мкг проби, і 1,5% для зон, що містили 10 мкг. Сінсхаймер та ін визначали флуоресцентним методом in situ сліди пеніциліну. Бензил-пеніцилін гідролізувати пеніциліназою, піддавали потім хроматографічного розділення на силікагелі G з сумішшю диметилформамід-хлороформ-28%-ний аміак (10:5:4) і вимірювали при 510 нм інтенсивність флуоресценції плями з Rf 0,50 (довжина хвилі збуджуючого випромінювання становила 410 нм). Інтенсивність флуоресценції плям феноксіметіл-пеніциліну, отриманого в результаті гідролізу (Rf 0,88), вимірювали в області 480 ом при довжині хвилі збуджуючого випромінювання 260 нм. Метициллин гідролізувати і вимірювали інтенсивність флуоресценції плями з Rf 0,73 при 480 нм при збуджуючу випромінюванні 350 нм. Межі чутливості в перерахованих вище визначеннях дорівнюють 3, 0,76 і 0,12 мкг відповідно. Пеніциланової кислоти визначали методом флуоресцентної денситометрії плями з Rf 0,45 при 440 нм з порушенням при 350 нм. У цьому випадку після поділу на силікагелі сумішшю хлороформ-етилацетат-мурашина кислота (60:40: 1) платівку витримували 3 хв у парах аміаку, щоб утворився флуоресціюючий продукт. Напівкількісне визначення пеніцилінів та продуктів їх перетворення проводили візуально, порівнюючи розміри плям і їх забарвлення.
Цефалоспорин В і деякі з його похідних аналізували хроматографічно на силікагелі G, використовуючи суміш н-бутанол-оцтова кислота (10:1), насичену водою, а також суміш н-бутанол-піридин-оцтова кислота-вода (17:12:4: 15). Для деяких специфічних сполук застосовували різні комбінації ацетону з бензолом (1:4; 2: 3) і толуолом (2:3; 1: 4; 3: 7; 1: 9), а також толуолу та етил-ацетату (1:1 ). Біаджі та ін розділили методом ТШХ зі зверненням фаз 13 цефалоспоринів. Поділ ці автори проводили на силікагелі, просякнутому силіконом, застосовуючи буферний розчин (рН 7,4) ацетат натрію-веронал, що містив від 0 до 24% ацетону. За отриманими даними були розраховані величини RM. Бурі хроматографіровал цефалоспорин В, цефалотин і цефалоридин на шарах силікагелю, забуференной фосфатним буфером (рН 5,8), елюіруя їх сумішшю ізопропанол - метанол - фосфатний буфер з рН 5,8 (2:7:1).
Рифамицин
Ці антибіотики поділяли за допомогою ряду спиртів та ацетону на шарах силікагелю G. Ацетон виявився кращим розчинником; проводячи елюювання ацетоном, вдається відділити рифаміцин В від рифаміцинів О, рифаміцин SV від ри-фаміціна S, а рифаміцин В від рифаміцинів SV. Ці сполуки інтенсивно забарвлені, і тому при досить високих концентраціях їх можна виявити на платівках, не застосовуючи реактив. Однак мікробіологічним методом їх можна виявити при набагато більш низьких концентраціях. Для 2 - 20 мкг рифаміцинів і дезацетілріфаміціна Колос і Ейдус призводять величини Rf (0,55 і 0,37 відповідно), отримані при хроматографування сумішшю хлороформ-етанол-0, 1 н. соляна кислота (84:15,9:0,1) на хроматографічних смугах № 6060 фірми Eastman. Медж та ін провели хроматографічний аналіз групи напівсинтетичних рифампіцинів на силікагелі з ацетоном.
Тетрациклін
Ніколаус та ін досліджували також поділ тетрациклінів на тонких шарах силікагелю G. Вони вивчили велику кількість розчинників; чотири кращі розчинника вказані в табл. 1.2, там же дано відповідні величини Rf. На додаток до наведених у таблиці результатів слід вказати, що окситетрациклін і діметілтетраціклін можна відокремити від тетрацикліну, хлортетрациклин і дезоксітетрацікліна, елюіруя суміш 10%-ним розчином лимонної кислоти, насиченим бутанолом. Виявляють тетрацикліни, обприскуючи платівки 1 н. соляною кислотою і потім нагріваючи їх при 50 ° С. Тетрацикліни виявляють у вигляді жовтих плям. Для виявлення дезоксітетрацікліна використовують реакцію сполучення із сіллю діазонію. При проведенні мікробіологічної проби агар заражають Bacterium subtilis.
Таблиця 2.1
Величини Rf X 100 деяких тетрациклінів, отримані з різними хроматографічними системами
Автори роботи поділяли тетрациклін, хлортетрациклин, діметілхлортетраціклін та їх ангідр-і епіпроізводние на промитому кислотою кизельгур G, просякнутому 20%-ним розчином поліетіленоксідгліколя 400 в суміші гліцерин - 0,1 М ЕДТА при рН 7 (1: 19). Розділяє розчинником був органічний шар суміші етилацетат - 0,1 М ЕДТА, рН 7 (6:1). При розгляді платівок в довгохвильовому УФ-світлі можна виявити 0,05 мкг антибіотика. У роботі описана методика поділу тетрациклінів та продуктів їх перетворення на кизельгур, просякнутому ЕДТА; величини Rf та застосовуються розчинники вказані в табл. 1.2.
Кількісне визначення ангідротетраціклінов в розклалися таблетках тетрацикліну проводили, екстрагуючись зони ТШХ і вимірюючи коефіцієнт поглинання при 428 нм. При визначенні епітетрацікліна і хлортетрациклин зону перший зішкрібали, елюіровалі 0,1 н. соляною кислотою і вимірювали поглинання елюента при 356 нм. Хлортетрациклин після елюювання 0,2 н. гідроксидом натрію вимірювали за інтенсивністю флуоресценції в області 414 нм (довжина збудливого випромінювання 356 нм). Радека і Вільсон проводили визначення тетрацикліну в фармацевтичних препаратах in situ. Хоча цей метод менш точний, ніж спектрофотометричний метод Альварца Фернандеца та ін, він більш чутливий, вимагає менше часу і більш точний, ніж офіційні мікробіологічні методи. Ван Хоек та ін розробили для цієї групи сполук флуорометріческій метод визначення in situ.
Пептидні АНТИБІОТИКИ
Поліміксіновие антибіотики представляють собою пептиди дуже близького будови. Крім амінокислот в їх молекулу входять жирні кислоти. Голкою і др.разделялі полі-міксин В, D і М на силікагелі G, використовуючи суміш ацетон-вода-оцтова кислота-2 н. гідроксид амонію (15:5:1:2). Поліміксин Е (колістін) не вдається відділити від Полімік-сина В. Хоулетт і Зельцер розробили метод диференціації цих двох з'єднань: пробу гідролізують 5 н. соляною кислотою в запаяній трубці 6 год при 120 ° С і визначають амінокислотний склад хроматографічно в камері з насиченою атмосферою на шарі силікагелю MNG, використовуючи розчин 68 мг иодида калію в 84 мл 90%-ного фенолу і 16 мл води. Нінгід-ріновая проба дозволяє виявити L-2 ,4-діаміномасляную кислоту, L-треонін, фенілаланін і лейцин в пробі поліміксину В, у той же час при хроматографування колістіна пляма фенілаланіну виявлено не було. Хамерс і Моерлуз воліють проводити 22-годинної гідроліз при ВО "С, щоб уникнути появи помилкових плям.
Хіноміціновие антибіотики - це пептидні лактони з хі-ноксаліновим кільцем, що відрізняються один від одного тільки своєю N-метіламінокіслотной часткою. Шой піддавав хро-матографіческому поділу сполуки А, В, Во, С, D і Е методом кругової хроматографії на оксиді алюмінію, застосовуючи нижню фракцію суміші етилацетат-1 ,1,2,2-тетрахлор-етан-вода (3:1:3 ). Таким способом вдалося розділити всі компоненти, крім В і Во. Хроматографування проводили на флуоресцентному шарі і розглядали пластинки в УФ-світлі.
Штудер та ін при визначенні будови енніатіна У синтезували ряд циклічних пептидів з активністю антибіотиків. У суміші бензол-ефір-метанол (17:2: 1) на силікагелі енніатіни А і В характеризуються Rf 0,39.
Поліенових Макролідні АНТИБІОТИКИ
Ікекава та ін розділили шість полієнів на сілікасілікагеле G, використовуючи суміш н-бутанол-оцтова кислота-вода (3:1:1), і отримали при цьому такі величини Rf. ністатин 0,18; пімаріцін 0,34; унаміцін А 0,36; амфотерицин А 0,33; пентаміцін 0,67 і тріхоміцін 0,17. Берже і Еблі розділили на силікагелі HF, забуференной сумішшю 0,2 М ді-гідрофосфат калію-0, 2 М гідрофосфат натрію (1:1), елюі-ю чи пробу сумішшю метиленхлорид-мета «ол (17:3). Виділені компоненти характеризуються такими величинами Rf. I 0,8; II 0,7; III 0,6; IV 0,5. Охаб розділив на силікагелі тріхоміцін, фумагіллін, натаміцин, ністатин, амфотерицин А і амфотерицин В. Кращі результати дають суміші етанол-аміак-вода-діоксан (8:1:1:1) і н-бутанол-піридин-вода (3:2 : 1). Мартін і Мак-Даніел розділили комплекс кандігексіна на силікагелі G на п'ять компонентів з наступними величинами Rf. А 0,26; У 0,29; D 0,36; Е 0,39 і F про ', 43. Комплекс кандідіна вдалося розділити на дві фракції з Rf 0,27 (А) і 0,32 (В). Третій компонент з Rf 0,36, про наявність якого в сирих препаратах кандідіна повідомили Боровський та ін, в очищених препаратах виявити не вдалося. Елюювання проводилося нижньої фракцією суміші хлороформ-метанол-20%-ний гідроксид амонію (2:2:1). Кількісне поділ досягається денсітометрірованіем in situ кандігексіна при 340 нм і кандідіна при 360 нм.
Ніколаус та ін досліджували також поділ тетрациклінів на тонких шарах силікагелю G. Вони вивчили велику кількість розчинників; чотири кращі розчинника вказані в табл. 1.2, там же дано відповідні величини Rf. На додаток до наведених у таблиці результатів слід вказати, що окситетрациклін і діметілтетраціклін можна відокремити від тетрацикліну, хлортетрациклин і дезоксітетрацікліна, елюіруя суміш 10%-ним розчином лимонної кислоти, насиченим бутанолом. Виявляють тетрацикліни, обприскуючи платівки 1 н. соляною кислотою і потім нагріваючи їх при 50 ° С. Тетрацикліни виявляють у вигляді жовтих плям. Для виявлення дезоксітетрацікліна використовують реакцію сполучення із сіллю діазонію. При проведенні мікробіологічної проби агар заражають Bacterium subtilis.
Таблиця 2.1
Величини Rf X 100 деяких тетрациклінів, отримані з різними хроматографічними системами
| З'єднання | Силікагель | Кизельгур | |||||
| А | Б | У | Г | Д | Е | Ж | |
| Тетрациклін Хлортетрациклин Ангідротетраціклін Окситетрациклін Ангідрохлортетраціклін Діметілхлортетраціклін Метациклин Доксициклін 4-Епітетраціклін Епіангідротетраціклін 4-Епіхлортетраціклін | 36 30 0-20 58 0-20 | 38 43 45 41 46 | 61 72 68 70 75 | 50 60 50 55 52 | 53 76 93 60 83 73 44 53 20 47 33 | 36 60 83 20 57 44 29 27 12 50 21 | Ро Ро Ро Ж Ро Ро Ро-Ко Ро-Ко Ж Ж-Ро Ж-Ро |
Кількісне визначення ангідротетраціклінов в розклалися таблетках тетрацикліну проводили, екстрагуючись зони ТШХ і вимірюючи коефіцієнт поглинання при 428 нм. При визначенні епітетрацікліна і хлортетрациклин зону перший зішкрібали, елюіровалі 0,1 н. соляною кислотою і вимірювали поглинання елюента при 356 нм. Хлортетрациклин після елюювання 0,2 н. гідроксидом натрію вимірювали за інтенсивністю флуоресценції в області 414 нм (довжина збудливого випромінювання 356 нм). Радека і Вільсон проводили визначення тетрацикліну в фармацевтичних препаратах in situ. Хоча цей метод менш точний, ніж спектрофотометричний метод Альварца Фернандеца та ін, він більш чутливий, вимагає менше часу і більш точний, ніж офіційні мікробіологічні методи. Ван Хоек та ін розробили для цієї групи сполук флуорометріческій метод визначення in situ.
Пептидні АНТИБІОТИКИ
Поліміксіновие антибіотики представляють собою пептиди дуже близького будови. Крім амінокислот в їх молекулу входять жирні кислоти. Голкою і др.разделялі полі-міксин В, D і М на силікагелі G, використовуючи суміш ацетон-вода-оцтова кислота-2 н. гідроксид амонію (15:5:1:2). Поліміксин Е (колістін) не вдається відділити від Полімік-сина В. Хоулетт і Зельцер розробили метод диференціації цих двох з'єднань: пробу гідролізують 5 н. соляною кислотою в запаяній трубці 6 год при 120 ° С і визначають амінокислотний склад хроматографічно в камері з насиченою атмосферою на шарі силікагелю MNG, використовуючи розчин 68 мг иодида калію в 84 мл 90%-ного фенолу і 16 мл води. Нінгід-ріновая проба дозволяє виявити L-2 ,4-діаміномасляную кислоту, L-треонін, фенілаланін і лейцин в пробі поліміксину В, у той же час при хроматографування колістіна пляма фенілаланіну виявлено не було. Хамерс і Моерлуз воліють проводити 22-годинної гідроліз при ВО "С, щоб уникнути появи помилкових плям.
Хіноміціновие антибіотики - це пептидні лактони з хі-ноксаліновим кільцем, що відрізняються один від одного тільки своєю N-метіламінокіслотной часткою. Шой піддавав хро-матографіческому поділу сполуки А, В, Во, С, D і Е методом кругової хроматографії на оксиді алюмінію, застосовуючи нижню фракцію суміші етилацетат-1 ,1,2,2-тетрахлор-етан-вода (3:1:3 ). Таким способом вдалося розділити всі компоненти, крім В і Во. Хроматографування проводили на флуоресцентному шарі і розглядали пластинки в УФ-світлі.
Штудер та ін при визначенні будови енніатіна У синтезували ряд циклічних пептидів з активністю антибіотиків. У суміші бензол-ефір-метанол (17:2: 1) на силікагелі енніатіни А і В характеризуються Rf 0,39.
Поліенових Макролідні АНТИБІОТИКИ
Ікекава та ін розділили шість полієнів на сілікасілікагеле G, використовуючи суміш н-бутанол-оцтова кислота-вода (3:1:1), і отримали при цьому такі величини Rf. ністатин 0,18; пімаріцін 0,34; унаміцін А 0,36; амфотерицин А 0,33; пентаміцін 0,67 і тріхоміцін 0,17. Берже і Еблі розділили на силікагелі HF, забуференной сумішшю 0,2 М ді-гідрофосфат калію-0, 2 М гідрофосфат натрію (1:1), елюі-ю чи пробу сумішшю метиленхлорид-мета «ол (17:3). Виділені компоненти характеризуються такими величинами Rf. I 0,8; II 0,7; III 0,6; IV 0,5. Охаб розділив на силікагелі тріхоміцін, фумагіллін, натаміцин, ністатин, амфотерицин А і амфотерицин В. Кращі результати дають суміші етанол-аміак-вода-діоксан (8:1:1:1) і н-бутанол-піридин-вода (3:2 : 1). Мартін і Мак-Даніел розділили комплекс кандігексіна на силікагелі G на п'ять компонентів з наступними величинами Rf. А 0,26; У 0,29; D 0,36; Е 0,39 і F про ', 43. Комплекс кандідіна вдалося розділити на дві фракції з Rf 0,27 (А) і 0,32 (В). Третій компонент з Rf 0,36, про наявність якого в сирих препаратах кандідіна повідомили Боровський та ін, в очищених препаратах виявити не вдалося. Елюювання проводилося нижньої фракцією суміші хлороформ-метанол-20%-ний гідроксид амонію (2:2:1). Кількісне поділ досягається денсітометрірованіем in situ кандігексіна при 340 нм і кандідіна при 360 нм.
РІЗНІ ПРИКЛАДИ ЗАСТОСУВАННЯ
Берд і Стевенс використовували ТШХ для виявлення домішок в нітрофуразоне - синтетичному антибактеріальному з'єднанні. При хроматографування на силікагелі G сумішшю бензол-ацетон Rf нітрофуразона становить 0,23. Одна з домішок, 5-нітро-2-фуральдазін, переміщається з фронтом розчинника, Rj інший домішки дорівнює 0,65.
Маєр і Шафнер досліджували антибіотики методом ТШХ на силікагелі з сумішшю хлороформ-метанол-28%-ний гідроксид амонію-вода (1:4:2:1), доповнивши ТШХ при визначенні деяких ацетілпроізводних хроматографування на папері. У результаті ці автори показали, що в даний комплекс входить 16 антибіотиків. Вагман і ін виділили з цього комплексу чотири домішкових компонента. Вільсон і ін здійснили хроматографічне розділення в цій же системі деяких домішкових компонентів.
Патуліну, фурапіраноновий антибіотик, виділений з ряду грибів, був підданий хроматографічного аналізу з застосуванням великої кількості розчинників. Скотт і Кеннеді розробили кількісний метод виявлення цього антибіотика в яблучному соку, заснований на встановленні мінімально визначної флуоресценції, коли шар силікагелю обприскують 0,5%-ним розчином 3-метил-2-бензотіазолінгідразона і нагрівають 15 хв при 130 ° С.
Фішер і Рігельман] розробили флуоресцентний метод визначення in situ гризеофульвіну і його 4'-спиртових похідних у плазмі. Поділ проводили на силікагелі, який містив 6,7% колоїдного оксиду алюмінію (беміт) (Du Pont); елюентом служила суміш безводних ефіру та ацетону (3: 2). Антибіотики екстрагували з плазми ефіром. Каднер та ін використовували суміш силікагель G-нейтральний оксид алюмінію з активністю I (30:2); після поділу з'єднання елюіровалі і вимірювали інтенсивність флуоресценції при 385 нм при довжині збудливого випромінювання 365 нм.
Берже і Еблі [92] розділили комплекси Філіппіни на чотири фракції: Філіпін II, Філіпін III, Філіпін IV і комплекс Філіппіни I; остання фракія представляє собою суміш принаймні п'яти компонентів. Поділ проводили на силікагелі HF, забуференной сумішшю 0,2 М розчинів одно-і двузамещенного фосфату натрію, з застосуванням суміші метиленхлорид-метанол (17:3). Зазначеним фракціям відповідають такі величини Rf: 0,7; 0,6; 0,5 і 0,8.
Ніфіміцін вдалося розділити на чотири компоненти Ai і А2, Bi і В2 методом подвійного елюювання сумішшю етилацетат-етанол-вода (150:45:28) на шарах силікагелю GF. Варіаміцін аналізували на шарах кременевої кислоти, застосовуючи суміш метанол-хлороформ (9:1). Кількісне визначення проводять, вимірюючи коефіцієнт поглинання елюата при 280 нм. Кліндаміцин і його метаболіти сульфоксиду-кліндаміцин, N-деметілкліндаміцін і сульфоксиду-N-деметіл-кліндаміцин хроматографіровалі на аркушах з шаром силікагелю 6061 (фірма Eastman) сумішшю ацетон-метилетилкетон-вода (20,1:72,1:7,8). Плями виявляли і детектированного методом біоавтографіі. Азалос та ін наводять перелік мікроорганізмів для детектування 84 антибіотиків.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Кашкін П.М., Безбородов А.М. Антібіотікі.Ленінградское відділення: «Медицина». 1970.-375с.
2. Кірхнер Ю. Тонкошарова хроматографія т.1.М.: «МИР» 1981.-616с.
Берд і Стевенс використовували ТШХ для виявлення домішок в нітрофуразоне - синтетичному антибактеріальному з'єднанні. При хроматографування на силікагелі G сумішшю бензол-ацетон Rf нітрофуразона становить 0,23. Одна з домішок, 5-нітро-2-фуральдазін, переміщається з фронтом розчинника, Rj інший домішки дорівнює 0,65.
Маєр і Шафнер досліджували антибіотики методом ТШХ на силікагелі з сумішшю хлороформ-метанол-28%-ний гідроксид амонію-вода (1:4:2:1), доповнивши ТШХ при визначенні деяких ацетілпроізводних хроматографування на папері. У результаті ці автори показали, що в даний комплекс входить 16 антибіотиків. Вагман і ін виділили з цього комплексу чотири домішкових компонента. Вільсон і ін здійснили хроматографічне розділення в цій же системі деяких домішкових компонентів.
Патуліну, фурапіраноновий антибіотик, виділений з ряду грибів, був підданий хроматографічного аналізу з застосуванням великої кількості розчинників. Скотт і Кеннеді розробили кількісний метод виявлення цього антибіотика в яблучному соку, заснований на встановленні мінімально визначної флуоресценції, коли шар силікагелю обприскують 0,5%-ним розчином 3-метил-2-бензотіазолінгідразона і нагрівають 15 хв при 130 ° С.
Фішер і Рігельман] розробили флуоресцентний метод визначення in situ гризеофульвіну і його 4'-спиртових похідних у плазмі. Поділ проводили на силікагелі, який містив 6,7% колоїдного оксиду алюмінію (беміт) (Du Pont); елюентом служила суміш безводних ефіру та ацетону (3: 2). Антибіотики екстрагували з плазми ефіром. Каднер та ін використовували суміш силікагель G-нейтральний оксид алюмінію з активністю I (30:2); після поділу з'єднання елюіровалі і вимірювали інтенсивність флуоресценції при 385 нм при довжині збудливого випромінювання 365 нм.
Берже і Еблі [92] розділили комплекси Філіппіни на чотири фракції: Філіпін II, Філіпін III, Філіпін IV і комплекс Філіппіни I; остання фракія представляє собою суміш принаймні п'яти компонентів. Поділ проводили на силікагелі HF, забуференной сумішшю 0,2 М розчинів одно-і двузамещенного фосфату натрію, з застосуванням суміші метиленхлорид-метанол (17:3). Зазначеним фракціям відповідають такі величини Rf: 0,7; 0,6; 0,5 і 0,8.
Ніфіміцін вдалося розділити на чотири компоненти Ai і А2, Bi і В2 методом подвійного елюювання сумішшю етилацетат-етанол-вода (150:45:28) на шарах силікагелю GF. Варіаміцін аналізували на шарах кременевої кислоти, застосовуючи суміш метанол-хлороформ (9:1). Кількісне визначення проводять, вимірюючи коефіцієнт поглинання елюата при 280 нм. Кліндаміцин і його метаболіти сульфоксиду-кліндаміцин, N-деметілкліндаміцін і сульфоксиду-N-деметіл-кліндаміцин хроматографіровалі на аркушах з шаром силікагелю 6061 (фірма Eastman) сумішшю ацетон-метилетилкетон-вода (20,1:72,1:7,8). Плями виявляли і детектированного методом біоавтографіі. Азалос та ін наводять перелік мікроорганізмів для детектування 84 антибіотиків.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Кашкін П.М., Безбородов А.М. Антібіотікі.Ленінградское відділення: «Медицина». 1970.-375с.
2. Кірхнер Ю. Тонкошарова хроматографія т.1.М.: «МИР» 1981.-616с.