Маслянокислі бактерії як продуценти кислот

До протеолітичних відносяться клостридії, що мають активні протеолітичні ферменти і тому здатні використовувати в якості субстратів білки і пептиди, гидролизуя їх до амінокислот і піддаючи потім останні сбраживанию. У цю групу входять C. putrificum, C. histoliticum, C. sporogenes та інші сапрофітні види. Близькі до цих видів і деякі патогенні форми: C. botulinum - продуцент ботуліна - екзотоксину, що є одним з найсильніших біологічних отрут; C. tetani - правцева паличка, яка утворює в організмі людини правцевий токсин. До протеолітичних клостридіями примикають види, які використовують як джерело вуглецю та енергії обмежене число вільних амінокислот. Наприклад, C. cochlearium росте тільки на середовищі з глутамінової кислотою, амінокіслот і гистидином; C. sticklandii може зброджувати лізин, аргінін, фенілаланін, серин, а C. propionicum - треонін, аланін, серин, цистеїн.
З життєдіяльністю клостридій пов'язані різні процеси, що протікають в природі: розкладання (гниття) азотовмісних сполук (білків, нуклеїнових кислот) в анаеробних умовах; анаеробне розкладання рослинних матеріалів, таких як клітковина, хітин. Деякі цукролітичні клостридії можуть використовувати в якості субстрату бродіння пектинові речовини, складові покриви рослинних клітин. Пектин - полімер метил-D-галактуроновой кислоти. Остання має складну будову і при впливі на неї пектиновими ферментами гідролізується на ряд цукрів, кислот і метиловий спирт. Клостридії, що належать до виду C felsineum, містять активну пектиназу і можуть, тому отримувати енергію, здійснюючи маслянокислое бродіння пектинових речовин. Цей вигляд відіграє важливу роль у процесі мацерації волокон при мочці льону.
Ще наприкінці минулого століття було виявлено, що деякі клостридії патогенні, тобто викликають захворювання людини і тварин. В основі патогенних клостридій лежить їх здатність синтезувати і виділяти з клітки високоефективні токсини.
До збудників маслянокислого бродіння відноситься в першу чергу вид Clostridium saccharobutyricum (Granulobacter saccharobutyricum). Клітини його циліндричної форми, довжиною від 4-5 до 7-12 мкм і завтовшки від 0,5 до 1-1,5 мкм, рухливі, спороутворюючі. Перед освітою спір у них накопичується гранулеза. Суперечки з'являється частіше в центрі клітини, остання біля суперечки розширюється (клостридій). Іноді спору розташовується на кінці клітини, форма якої набуває вигляду ракетки (плектрідій). Спори досить стійкі, вони можуть виносити нетривалий кип'ятіння протягом 1-2 хв.
Clostridium saccharobutyricum - облігатний анаероб, з оптимальною температурою розвитку 30-40 ^о С, зброжує багато вуглеводи і близькі до них сполуки з виділенням водню і вуглекислоти при одночасному накопиченні масляної кислоти. Остання цими бактеріями не споживається. С.Н. Виноградским описаний збудник маслянокислого бродіння Clostridium pasteurianum, здатний засвоювати атмосферний азот. За багатьма ознаками він схожий з попереднім видом, але відрізняється від нього біохімічними особливостям - він не зброжує крохмаль. До маслянокислим бактеріям відноситься також вид Clostridium butyricum і деякі інші представники. По відношенню до джерел азоту Маслянокислое бактерії досить невибагливі: вони засвоюють білковий, амінокислотний і амонійний азот, а деякі використовують азот повітря.
Маслянокислі бактерії є також збудниками ацетонобутилове бродіння, анаеробного бродіння клітковини і бродіння пектинових речовин.
Ацетонобутилове бродіння являє собою перетворення вуглеводів бактеріями з утворенням ацетону і бутилового спирту. При цьому бродінні, крім ацетону і бутилового спирту, виробляються також масляна і оцтова кислоти, водень і вуглекислий газ. Сумарно це бродіння можна виразити таким рівнянням:
12 З ₆ Н ₁₂ О ₆ → СН ₃ СН ₂ СН ₂ СН ₂ ВІН + 4СН ₃ СОСН ₃ + СН ₃ СН ₂ ОН + СН ₃ СН ₂ СН ₂ СООН + 18Н ₂ + 28СО ₂ + 2Н ₂ О + Х кДж
Механізм ацетонобутилове бродіння
Хімізм ацетонобутилове бродіння ще недостатньо з'ясований. Останнім часом для вивчення його використовують метод мічених атомів. У бродячу середу вводять проміжні продукти бродіння (оцтову, ацетоуксусную і масляну кислоти), що містять вуглець З ^13, а потім визначають наявність цього вуглецю в кінцевих продуктах. Цим способом встановлено, що при додаванні оцтової кислоти з З ₁₃ близько 50% всього міченого вуглецю міститься в бутиловом спирті, близько 15% - в ацетоні, до 18% - вуглекислому газі. При додаванні масляної кислоти, що містить З _13, близько 85% міченого вуглецю переходить в бутиловий спирт. Він знайдений також в етиловому спирті, в оцтової та масляної кислотах. Виходячи з цих даних, вважають, що освіта бутилового спирту йде головним чином через масляну кислоту. Крім того, вважають, що ацетон утворюється через масляну кислоту.
У хімізмі ацетонобутилове бродіння є багато спільного з маслянокислим, а зокрема, перші стадії до утворення ацетольдоля протікають подібно маслянокислому бродінню. Далі між двома молекулами ацетальдоля протікає окислювально - відновна: оксимасляная кислота і оксібутіловий спирт по наступному рівнянню: реакція, в результаті якої утворюються дві сполуки: β - оксимасляная кислота і β - оксібутіловий спирт по наступному рівнянню:
2СН ₃ стерпно ₂ СНТ + Н ₂ О → СН ₃ СНОНСН ₂ СООН + СН ₃ СНОНСН ₂ СН ₂ ВІН

β - оксимасляної кислота далі відщеплює водень і переходить в ацетоуксусную кислоту, яка потім розпадається на ацетон і вуглекислий газ:
СН ₃ СНОНСН ₂ СООН → СН ₃ СОСН ₂ СООН → СН ₃ СОСН ₃ + СО _в -
оксібутіловий спирт піддається відновленню до n - бутилового спирту відповідно до рівняння:
CН ₃ СНОНСН ₂ СН ₂ ВІН + Н ₂ → СН ₃ СН ₂ СН ₂ СН ₂ ВІН + Н ₂ О
Частина оцтового альдегіду, мабуть, також втягується в окислювально-відновну реакцію з утворенням оцтової кислоти та етилового спирту:
СН ₃ СНТ + СН ₃ СНТ + Н ₂ О → СН ₃ СООН + СН ₃ СН ₂ ОН
У ацетонобутилове бродінні спостерігаються дві фази: перша - кислотна, під час якої посилено розмножуються бактерії, а в середовищі накопичуються масляна і оцтова кислоти, і друга - ацетонобутилове в ній зменшується кислотність і відбувається посилене накопичення ацетону, бутилового та етилового спиртів. Залежно від умов бродіння, тобто придушуючи будь - яку фазу бродіння, можна отримати посилене накопичення тих чи інших продуктів. Отже, ацетонобутилове бродіння відрізняється від маслянокислого: при маслянокислом бродінні накопичуються кислоти поступово сповільнюють процес кислотоутворення і навіть зупиняють його, а при ацетонобутилове - утворилися кислоти споживаються бактеріями і перетворюються в інші речовини.
Перший збудник ацетонобутилове бродіння виділений в 1911 р . Бейеринком. Він отримав назву Granulobacter butyricum. Більш активним збудником цього бродіння з'явився вид Clostridium acetobutyricum. Клітини його за морфологічними ознаками подібні з маслянокислим бактеріями. Це рухливі, грампозитивні, палички зі спорами, які розвиваються в анаеробних умовах. Спороутворення - клостридиальной. У клітинах накопичується гранулеза. За біохімічними властивостями даний вид сильно відрізняється від маслянокислих бактерій. Починаючи з 1923 р . ацетонобутилове бактерії використовуються в промислових масштабах для отримання ацетону і бутилового спирту з крохмалистої сировини і меляси.
Серед збудників маслянокислого бродіння зустрічаються такі культури, які здатні викликати бродіння клітковини. Здатність анаеробних мікроорганізмів руйнувати клітковину вперше була встановлена ​​у 1875р. Л. Поповим, а сутність цього процесу розкрита в 1889 - 1902 рр.. В. Л. Омелянський, який виділив два різновиди целлюлозоразрушающіх бактерій. Одна з них викликає водневе бродіння клітковини Bac. cellulosae hydrogenicus, а друга - метанове Bac. cellulosae metanicus. У цих бактерій морфологічних відмінностей майже не спостерігається. Молоді форми - надзвичайно тонкі, прямі, іноді злегка зігнуті палички, товщиною від 0,3 до 0,5 мкм і довжиною від 4 до 8 мкм. У міру розвитку палички подовжуються і досягають 10-15 мкм, потім на їх кінці їх утворюються спори. При цьому клітини набувають форми барабанної палички. З часом суперечки у вигляді круглого тільця звільняється від клітини. Одним з суттєвих морфологічних відмінностей між водневими і метановими бактеріями є різна здатність до спір до проростання. Спори збудника метанового бродіння проростає набагато швидше суперечка водневого бродіння.
Хімізм цього бродіння складний, тому що целлюлозоразлагающіе бактерії спочатку переводять вуглеводи в розчинні цукри, які згодом частково зброджують головним чином до масляної та оцтової кислот. З інших продуктів ці бактерії продукують спирт, мурашину і молочну кислоти, а також виділяють гази - водень або метан (залежно від культури) і вуглекислий газ.
При водневому бродінні газоподібні речовини - водень і вуглекислота - становлять приблизно 1 / 3 маси розклалася клітковини. При метанове бродіння газоподібних речовин (метану, вуглекислоти) виходить більше, вони становлять приблизно половину маси розклалася клітковини.
Збудники водневого та метанового бродіння поряд з клітковиною здатні зброджувати солі масляної, молочної, мурашиної та інших кислот, що накопичуються при бродінні клітковини. У результаті такого процесу в анаеробних умовах досягається повна мінералізація клітковини - найбільш складного та сталого полісахариду. Останнім часом встановлено, що збудники маслянокислого бродіння клітковини є активними продуцентами вітаміну В _12. Це властивість їх використовується для промислового одержання кормового вітаміну В _12.
Пектинові речовини входять до складу тканин рослин. Будучи складовою частиною клітинної оболонки, вони як би склеюють клітини між собою, утворюючи міжклітинні платівки. Вони знаходяться в значній кількості в деяких органах рослин, наприклад, у листі, в м'якоті плодів, ягід, коренеплодів, в шкірці цитрусових і в багатьох інших.
Пектинові речовини в природі минерализуются мікроорганізмами, що володіють ферментами протопектіназой (пектазой) і полігалактуроновой (пектиназу). Фермент протопектіназа розщеплює в пектині зв'язку між метоксілірованной полігалактуроновой кислотою і пов'язаним з нею арабаном. Звільнена у цьому метоксілірованная полігалактуроновая кислота (розчинний пектин) під дією пектінестерази гідролізується з утворенням метилового спирту і полігалактуроновой кислоти.
Полігалактуроновая кислота піддається також дії іншого ферменту - полігалактуроназу мікроорганізмів (бактерій і цвілевих грибів). Цей фермент гідролізує глікозидні зв'язку між залишками галактуроновой кислоти, що не містять метоксільних груп. Галактуроновой кислоти поряд з іншими сполуками гідролізуються і використовуються мікроорганізмами як джерела вуглецю. У результаті гідролізу пектину утворюються продукти: галактуронова кислота, галактоза, арабіноза, ксилоза, оцтова кислота і метиловий спирт. Деякі з них - моносахариди - використовуються цими ж пектінразлагающімі мікроорганізмами, так арабіноза зброджується ними до масляної кислоти і вуглекислоти, а з галактози поряд з масляною і вугільної кислотами виділяється водень (Ємцев, Мішустін, 2006).
Серед пектінразлагающіх мікроорганізмів відомі бактерії виду Clostridium pectinovorum, які викликають маслянокислое бродіння пектинових речовин (описані Бейеринком в 1902 р .). Вони являють собою порівняно великі, рухливі, грампозитивні палички довжиною 10-15 мкм і шириною 0,8 мкм. У клітинах утворюються спори, які розташовуються на потовщених кінцях. Ставляться ці бактерії до облігатним анаеробів. При зброджуванні пектинових речовин вони накопичують масляну і оцтову кислоти, водень і вуглекислий газ. За відповідних умов бродіння можуть виробляти, крім основних продуктів бродіння, бутиловий спирт і ацетон.
Збудником пектинового бродіння є також Clostridium felsineum. Мікроорганізм виділено італійським дослідником Карбоне в 1916 р . зі стебел конопель. За формою клітин - спорова паличка одиночна або поєднана в короткі ланцюжки розмірами 3 / 5 * 0,3 мкм. Спори розташовуються на кінці (барабанна паличка), але іноді бувають і в центрі клітини. Культура має порівняно високим температурним оптимумом. Вона зброжує пектинові речовини з утворенням переважно оцтової кислоти і абсолютно не продукує масляної.
Крім описаних представників, відомі ще і деякі інші, які, розкладаючи пектинові речовини, зброджують продукти гідролізу (арабінозу, галактозу та ін) за типом маслянокислого або ацетонобутилове бродіння.
Бродіння пектинових речовин знайшло застосування в господарсько-технічної діяльності людини, зокрема, для отримання прядильних волокон з льону, коноплі та інших волокнистих рослин шляхом мочки їх у природних водоймах.
Для прискорення і поліпшення процесу звільнення волокон мочку сировини виробляють в басейнах. При цьому способі застосовують спеціально вирощені культури бактерій. Процес ведуть при температурі 26-28 ^о С протягом 5 діб замість 1,5-2 тижнів в природних водоймах.
Анаеробні бактерії роду Clostridium були відкриті Л. Пастером в 1861 р . Учений виявив, що деякі представники даного роду зброджують вуглеводи з утворенням масляної кислоти. Зараз серед представників Clostridium налічується більше 80 видів бактерій. Вони мають паличкоподібні клітини, зазвичай рухливі, пересуваються за допомогою перітріхальних джгутиків. У видів роду утворюються спори, що мають овальну або сферичну форму, вони терморезистентності. Як правило, спори роздмухують клітку. Грампозитивні. Облігатні анаероби (Богданов та ін, 1968).
Рід включає Психрофільні, мезофільні і термофільні види. Температурний оптимум для росту більшості мезофільних видів лежить в діапазоні 30-40 ^о С. Для термофільних видів температурний оптимум становить 60-75 ^о С. Оптимальна реакція середовища для клостридій - нейтральна або слаболужна. Хемоорганогетеротрофи. Клостридії зброджують цукри, багатоатомні спирти, амінокислоти, пурину і піримідинові, інші органічні сполуки. Ряд видів здатний до фіксації молекулярного азоту атмосфери. Місця проживання клостридій - грунт, водойми, а також травний тракт людини і тварин.
Всі види роду об'єднані в групи в залежності від здатності зброджувати ті чи інші органічні сполуки.
Перша група - цукролітичні види Clostridium, зброджують головним чином розчинні вуглеводи, крохмаль або пектин з утворенням бутирата, ацетату, СО ₂ і Н _2. Бродіння за участю деяких мікроорганізмів групи призводить до утворення з цукрів додаткових нейтральних сполук (бутанолу, пропанолу, ацетону, невеликих кількостей етанолу). До групи входять бактерії, що викликають маслянокислое і ацетонобутилове бродіння: C.butyricum, C. pasteurianum, C. tyrobutyricum, C. butylicum, C acetobutyricum та ін Можливо, до неї можна віднести і ряд видів - високоспеціалізованих агентів анаеробного руйнування целюлози, причому головні кінцеві продукти бродіння - етанол, ацетат і сукцинат, СО ₂ і Н _2.
Друга група - протеолітичні види, зброджують амінокислоти. Мають сильними протеолітичними властивостями і здатні до інтенсивного гідролізу білків з подальшим зброджуванням амінокислот. Зростання мікроорганізмів у середовищах з білком супроводжується утворенням аміаку, СО _2, Н _2, жирних кислот, і великої кількості летючих сполук з неприємним запахом. До групи належать види: C. sporogenes, C. perfringens, C. histoliticum, C. botulinum та ін Багато представників роду Clostridium, зброджують амінокислоти, здатні також до зброджування вуглеводів.
Третя група - види зброджують азотвмісні циклічні сполуки - пурини і піримідинові. Пуринові (гуанін, гіпоксантин, ксантин та ін) під впливом C. acidi-urici, C. cylindrosporum перетворюються на аміак, ацетат і СО _2. C. uracilicum, C. oroticum зброджують піримідин, при цьому урацил розпадається до в-аланіну, СО ₂ і N Н _3, а оротовая кислота-до оцтової кислоти, СО ₂ і N Н _3.
Четверта група включає лише один вид - C. kluyveri, зброджують суміш етанолу з ацетатом до бутирата і капронової кислоти, а також невеликої кількості водню.
Отримання вітаміну В ₁₂ з допомогою пропіоновокислих бактерій
В даний час для отримання вітаміну В ₁₂ використовують такі мікроорганізми Prop. freudenreichii ATCC 6207, Prop. shermanii ATCC 13673, Prop. shermanii BKM-103 та їх варіанти і мутанти. Найбільший інтерес представляють розкладання клітковини.
1.3 Поширення маслянокислих бактерій
Найбільш поширеним вуглецевим з'єднанням в природі є целюлоза. Целюлоза становить від 15 до 60% маси рослин, в бавовні і льон її вміст досягає 80-95%.
Розкладання целюлози мікроорганізмами є найбільшим за масштабами природним деструкційних процесів, ланкою кругообігу вуглецю, який забезпечує повернення фіксованого в процесі фотосинтезу вуглецю в атмосферу у вигляді СО _2.
Глобальна роль мікроорганізмів у цьому процесі визначається тим, що ні тварини, ні рослини, як правило, не здатні розкладати целюлозу. Трансформація целлюлозоразрушающіх сполук у природі відбувається в різних умовах аерації, температури, рН середовища.
У природі розкладання целюлози - це складний, комплексний процес, що відбувається за участю співтовариства мікроорганізмів, до складу якого входять мікроорганізми, які розкладають целюлозу, і мікроорганізми-супутники, які використовують продукти розпаду.
В анаеробних умовах розкладання целюлози здійснюється анаеробними бактеріями роду Clostridium. При цьому утворюється багато органічних кислот (оцтова, янтарна, молочна, мурашина) етиловий спирт, вуглекислий газ і водень.
На відміну від анаеробного розкладання целюлози, який здійснюється тільки бактеріями, в аеробних умовах клітковину розкладають багато мікроорганізмів різних систематичних груп: бактерії, миксобактерии, актиноміцети, гриби.
У кислих лісових грунтах головна роль у перетворенні целюлози належить грибам (р. Trichoderma, р. Aspergillus, р. Penicillium і ін, базидіальних грибів).
У грунтах під трав'янистою рослинністю, у степових і лучних ландшафтах в розкладанні целюлози крім грибів беруть участь миксобактерии, актиноміцети, вібріони р.Cellvibrio.
Розкладання целюлози до глюкози мікробними ферментами протікає в декілька стадій і вимагає участь складного ферментного комплексу, що включає не менше чотирьох ферментів.
В анаеробних умовах глюкоза зброджується в основному за типом маслянокислого бродіння. В аеробних умовах глюкоза окислюється мікроорганізмами до оксикислот, а затії до кінцевих продуктів - вуглекислого газу і води.
Цей фермент гідролізує глікозидні зв'язку між залишками галактуроновой кислоти, що не містять метоксільних груп. Галактуроновой кислоти поряд з іншими сполуками гідролізуються і використовуються мікроорганізмами як джерела вуглецю. У результаті гідролізу пектину утворюються продукти: галактуронова кислота, галактоза, арабіноза, ксилоза, оцтова кислота і метиловий спирт. Деякі з них - моносахариди - використовуються цими ж пектінразлагающімі мікроорганізмами, так арабіноза зброджується ними до масляної кислоти і вуглекислоти, а з галактози поряд з масляною і вугільної кислотами виділяється водень (Ємцев, Мішустін, 2006).
Отримання вітаміну В ₁₂ з допомогою пропіоновокислих бактерій
В даний час для отримання вітаміну В ₁₂ використовують такі мікроорганізми Prop. freudenreichii ATCC 6207, Prop. shermanii ATCC 13673, Prop. shermanii BKM-103 та їх варіанти і мутанти. Найбільший інтерес представляють штами, здатні до самостійного синтезу 5,6 ДМБ. Оскільки синтез 5,6 ДМБ краще відбувається при доступі повітря, здійснюють двустадійность процес, в якому отримують найбільш високий вихід продукту. На 1-й стадії культуру вирощують в анаеробних умовах до повної утилізації цукру. На 2-й стадії включають аерацію, тим самим створюючи умови для синтезу 5,6 ДМБ і перетворення етіокобаламіна в дезоксікобаламін. Обидві стадії здійснюють у двох різних ферментерах або в одному. Анаеробно виросли клітини можна зібрати шляхом центрифугування і інкубувати густу суспензію на повітрі і, якщо потрібно, у присутності 5,6 ДМБ і ціаніду. Додавання ДМБ виробляють тільки в 2-й стадії ферментації (якщо бактерії не синтезують його самостійно), оскільки в його присутності утворюються повні форми вітаміну, інгібуючі його синтез. Середовище для ферментації зазвичай містить глюкозу або інвертовану мелясу (10-100 г / л), невеликі кількості солей Fe, Mn і Mg, а також Со (10-100 мг / л), джерела азоту [(Nl-UhSCU]. У середу додають кукурудзяний екстракт (30-70 г / л), що містить молочну та пантотенову кислоти, що підсилюють зростання бактерій. пантотенову кислоту, стимулюючу також синтез вітаміну, рекомендують вносити в середу додатково. Бактерії культивують при 30 ^о, підтримуючи рН на рівні 6,5 - 7,0 шляхом введення (NH ₄₎ OH. ферментацію проводять в ферментерах на 500 л , Що містять 340 л середовища, інокульованої 7 л посівного матеріалу. У перші 80 год культура росте під невеликим тиском N ₂ і слабким перемішуванням (без аерації), в наступні 88 год включають аерацію (2 м ³ / год) і перемішування. Можливі деякі варіації в культивуванні. Вітамін В ₁₂ зберігається в клітинах бактерій, тому проводять його екстракцію:
1) виділення вітаміну з клітин і перетворення його в ціанокобаламін;
2) виділення неочищеного продукту (80% чистоти), який можна використовувати в тваринництві;
3) подальше очищення до рівня 91-98% (для медичних цілей).
Для екстракції вітаміну з клітин останні нагрівають при 80 ^про -120 ^о С протягом 10-30 хв при рН 6,1-8,5. Перетворення в CN-кобаламін досягають, обробляючи гарячий розчин або клітинну суспензію ціанідом або тіоционату, часто в присутності NaNO ₂ або хлораміну В. Корріноіди сорбують на різних носіях: амберліте IRC-50, А1 ₂ О _3, активованому вугіллі та елюіруют водними спиртами або водно -фенольними сумішами. З водних розчинів корріноіди екстрагують фенолом або крезолу або сумішшю цих спиртів з бензином, бутанолом, вуглецевих тетрахлорид або хлороформом.
При упарюванні різних розчинників отримують осад або кристали вітаміну, які розчиняють у відповідному розчиннику до потрібної концентрації. Вихід вітаміну B ₁₂ при використанні пропіоновокислих бактерій - 25-40 мг / л. Але є патентне повідомлення (Франція) про досягнення неймовірно високого виходу - 216 (Ємцев, Мішустін, 2006).

Глава 2
2.1 Об'єкти і методи досліджень
Об'єктом даного дослідження є грунт, відібрана в парковій зоні в районі АГТУ. Грунт розсипчаста, коричневого кольору, сильно гумусированню, котра не піддається антропогенному впливу.
Для взяття проб грунту використовували стерильний посуд і лопату. Грунт відбирали з поверхневого шару, глибиною не більше 2 см . і поміщали в поліетиленові пакети. Відбір проб проводився у березні 2007 р .
Методи стерилізації. При будь мікробіологічної роботі: при посівах, виділення, пересіву, збереженні чистих культур - використовуються стерильні середовища, стерильна посуд, стерильні інструменти, щоб запобігти можливості попадання сторонньої мікрофлори.
Стерилізація - один з важливих і необхідних прийомів у мікробіологічній техніці. Слово «стерилізація» в перекладі з латинської (sterilis) означає знепліднювання. У мікробіології під стерилізацією розуміють загибель всіх живих мікроорганізмів. У мікробіологічної практиці стерилізують живильні середовища, посуд, інструменти та інші необхідні матеріали, щоб не допустити розвитку сторонньої мікрофлори.
Посуд перед стерилізацією ретельно миють, сушать і загортають в папір для збереження стерильності після прогрівання.
Кожну піпетку загортають окремо в довгі смужки паперу, шириною 4 - 5 см . У кінці піпеток, які попередньо вставляють ватні тампони. Обмотку починають з протилежного кінця поступовим рухом папери по спіралі і закінчують біля кінця з тампоном. Загорнуті піпетки для запобігання папери від забруднення і розривів загортають по кілька штук разом або поміщають у спеціальні металеві або картонні пенали. Шпателі обгортають окремо аналогічно піпетка, використовуючи для обмотки смужки паперу більшої ширини. Чашки Петрі загортають разом по 2-4 штуки. Колби, пробірки та інші посудини закривають ватними пробками, а зверху паперовими серветками.
Стерилізація посуду. Для отримання стерильного посуду використовується стерилізація сухим жаром. Вона виробляється нагріванням протягом 2:00 при температурі 170 ^о С в печі Пастера або в електросушільних шафах (з нагріванням до 200 ^о С).
При відсутності сушильних шаф, стерилізація посуду може бути проведена на автоклаві або в духовій шафі плити (побуріння папери показує достатність нагрівання).
Весь посуд перед стерилізацією повинна бути ретельно вимита, висушена і загорнута в папір. Балони, склянки, трубки, піпетки загортають в папір поодинці, і в цьому папері вони зберігаються до моменту використання. Чашки Петрі можуть бути загорнуті по 2-3 разом. Піпетки перед стерилізацією затикають з широкого кінця ватою і загортають (закочують) у вузькі, довгі стрічки паперу, починаючи з відтягнутого кінчика.
Пробірки повинні бути закриті ватяними пробками. Для загортання посуду при стерилізації та сушильній шафі краще користуватися тонким папером (лимонної або цигаркового), при стерилізації в автоклаві - газетного (яка не розмокає). Не можна стерилізувати посуд, закриту притертими пробками.
Для отримання стерильних голок, петель при виробництві посівів, взяття матеріалу з культур для приготування мазків користуються стерилізацією прокаливанием на полум'я. При цьому па полум'я (спиртівки, газового пальника) піддають короткочасному обпеченю шийки пробірок, колб, пробки і т. д.
Стерилізація автоклавуванням застосовується, головним чином, для стерилізації поживних середовищ. Цей спосіб заснований на прогріванні насиченою парою при тиску вище атмосферного, тобто, при температурі вище 100оС і здійснюється у спеціальних апаратах-автоклавах.
Спільна дія високих температур і пари забезпечує надійність стерилізації - загибель вегетативних клітин і спор мікроорганізмів. Автоклавування проводять при різних режимах, при додатковому тиску 50,100,200 кПа (Градова та ін, 2001).
Приготування поживних середовищ. При складанні поживних середовищ необхідно враховувати потребу мікроорганізмів в елементах живлення. По складу середовища поділяють на дві групи: природні і синтетичні.
С.Н. Виноградским в практику мікробіології введені елективні (виборчі середовища для певних груп мікроорганізмів, що забезпечують переважний розвиток одного виду або групи споріднених мікроорганізмів і менш придатні або зовсім не придатні для розвитку інших.
Знаючи фізіологічні особливості відповідної групи мікробів, можна підібрати такі умови культивування, за яких будуть розвиватися лише представники цієї групи. Застосовують поживні середовища різної консистенції: щільні, рідкі, напіврідкі (Теппер та ін, 1987).
Для виділення маслянокислих бактерій використовується середу Виноградського (г / л): KH ₂ PO ₄ - 1,0 г .; MgSO ₄ * 7H ₂ O -0,5 р.; NaCl - 0,5 г .; MnSO ₄ - 0,01 г .; Fe ₂ (SO4) ₃ * 9H ₂ O- 0,01 г .; CaCO ₃ - 20г.; KNO ₃ - 4г.; Дистильована вода - 1л.
При посіві досліджуваної грунту 1 г . розтертої стерильним товкачем в ступці грунт поміщали в пробірку з 10 г . стерильної води. Потім виробляли ряд послідовних розведень; 10 ^-1 - 10 ^-7 розведення розливали по 1 мл у великі стерильні пробірки методом глибинного посіву. В отриману культуральну рідину заливали рідке середовище Виноградського до ¾ об'єму. Пробірки із середовищами поміщають у водяну баню при 80 ^о С на 10-15 хв., тому що при кип'ятінні в культуральній рідині створюються анаеробні умови. Посіви поміщають у термостат при температурі 30-35 ^про с. Інкубація проводиться протягом 2-3 днів.
При дослідженні культуральних ознак звертають увагу на наступні ознаки:
1. Зміна кольору середовища (спочатку середу прозора). Колір змінюється від жовтого до коричневого.
2. Утворення осаду
3. Поява каламуті.
4. Освіта плівки.
Культуру відбирають з середини стовпчика рідини і цю краплю поміщають на середину предметного скла, накривають покривним склом і до краю предметного скла підносять піпетку з розчином Люголя. До іншого краю - фільтрувальний папір, яка засмоктує розчин під покривне скло.
При мікроскопірованіі препарату добре видно клітини клостридій з потемнілим змістом, так як перед спорообразование в клітинах накопичується багато гранульози, яка при взаємодії з Люголя дає темне забарвлення (Теппер та ін, 1987).
Мікроскопування маслянокислих бактерій. Поживне середовище з колби Вюрца або пробірки беруть піпеткою, закривши вказівним пальцем верхній кінець і зануривши її в середній шар сброженной рідини. Злегка підвівши палець, набирають у піпетку рідина, знову затискають пальцем верхній кінець піпетки і, вийнявши її з колби, наносять краплю на предметне скло. До накопичувальній культурі додають краплю розчину Люголя і накривають покривним склом, на якому розміщують краплю кедрової олії. При мікроскопірованіі препарату виявляються клітини, в яких можна помітити овальні тільця, сільнопреломляющіе світло (спори). У тих місцях клітини, де міститься гранулеза, виникає синьо-фіолетове забарвлення. Замальовують тільки пофарбовані клітини, явно відносяться до групи маслянокислих бактерій.
При постановці накопичувальної культури целлюлозоразлагающіх аеробних бактерій використовують середу Гетченсона. Шар середовища Гетченсона- 1 см . Вносять 0,5 -1 Р . грунту і на кінчику шпателя - крейда. Колбу закривають ватним корком, поміщають у термостат на 10-14 діб. Папір стає ослизнення і розпадається, конус осідає на дно.
Для отримання целлюлозоразрушающіх аеробних бактерій використовують середовище (г / л): КН ₂ РО ₄ -0,1; NaCl -0,1; CaCl ₂ -0,1; TeCL _{березня} -0,1; MgSO ₄ * 7Н ₂ О-0 , 3; NaNO ₃ -2,5; агар-агар -2%.
Середовище розливають в чашки Петрі і на поверхню накладають фільтрувальний папір, нарізану за розміром чашки Петрі і попередньо теж простерилізованих.
Скляною паличкою з витягнутим кінцем на поверхню фільтру розкладають паралельними рядами грудочки грунту на відстані 1см. (За трафаретом). Засіяні чашки Петрі поміщають у ексикатор над водою і ставлять у термостат при 25-30 ^о С.
Через 10-14 доби навколо грудочок грунту розвиваються грудочки целлюлозоразлагающіх мікроорганізмів у вигляді жовтих, зелених, помаранчевих і коричневих плям. У місцях утворення колоній фільтрувальний папір розкладається, ослизнюється, стає прозорою. За морфологією можна диференціювати колонії цвілевих грибів, актиноміцетів і бактерій. Приймаючи загальне число висіяних грудочок грунту за 100%, можна підрахувати у відсотках число грудочок грунту, що дали колонії целлюлозоразлагающіх мікроорганізмів. Із зон руйнування клітковини готують препарат «роздавлена ​​крапля» і описують виділені різні целлюлозоразрушающіе мікроорганізми.
Мікроскопування целлюлозоразлагающіх бактерій. Видаляють пінцетом з дна колби шматочок розкладається папери і розмазують на предметному склі без додавання води. Мазок сушать звичайним способом, фіксують на полум'ї пальника і забарвлюють фуксином.
Для накопичувальної культури анаеробних целлюлозоразрушающіх бактерій використовують середу, запропоновану Імшенецьким: мясопептонний бульйон - 500 мл, СаСО ₃ - 2 г , Фільтрувальний папір- 15 г , Водопровідна вода- 0,5 л .
Середовище розливають високим шаром у високу пробірку. На дно опускають нарізану смужками фільтрувальний папір. Пробірки закривають ватними пробками, потім пробірки стерилізують і засівають грудочкою грунту або гною. Інкубують протягом доби в термостаті при 30-35 ^о С для виявлення мезофільних бактерій і при 60 ^о С - для пошуку термофільних бактерій.
Через 3-4 доби при 60 ^о С у пробірках починається процес руйнування клітковини, рідина піниться, виділяється газ. Смужки фільтрувального паперу жовтіють, ослизнюються, поступово перетворюючись на аморфну ​​масу і осідають на дно. При 30-35 ^о С руйнування клітковини відбувається повільніше. Зруйновані маси клітковини піддаються мікроскопічному аналізу. Готують фіксований препарат - фарбування фуксином (Батьківщина, 1968).
Маслянокислое бродіння крохмалю досліджують на середовищі з картоплею. Сирий неочищений картоплю нарізують дрібними кубиками, заповнюють ними 1 / 3 високої пробірки, додають трохи крейди, заливають водопровідною водою на 2 / 3 і поміщають у водяну баню при 80 ^о на 19 хв для пастеризації. У середу не вносять ні грунту, ні маслянокислих бактерій, так як на шкірці картоплі завжди є їхні суперечки. Елективні умови створюють: крохмалем-джерелом вуглецю, використовуваним тільки мікроорганізмами, що містять фермент амілазу; пастеризацією; анаеробіозом (високий стовпчик рідини в пробірці і виділення в процесі бродіння СО ₂ і Н _2, які витісняють повітря). Через 2-3 дні картопля спливає внаслідок бурхливо йде газоутворення. Після закінчення бродіння культуральну рідину використовують для дослідження морфології маслянокислих бактерій і якісного визначення продуктів бродіння.
Якісна реакція на масляну кислоту. Одержання маслянокислого заліза (реакція з FeCl _3). Нейтральні розчини маслянокислих солей при нагріванні з FeCl ₃ набувають коричневе забарвлення внаслідок утворення маслянокислого заліза. У пробірку наливають 3-5 мл сброженной рідини, додають 1-2 мл 5% - ного хлориду заліза і нагрівають на полум'ї. Реакція йде за рівнянням:
3Ca (CH ₃ CH ₂ CH ₂ COO) ₂ + 2Fe ₂ Cl ₃ → 2Fe (CH ₃ CH ₂ CH ₂ COO) ₃ + 3CaCl ₂
Розчин маслянокислого заліза у відбитому світлі набуває буро-коричневе забарвлення, а в світлі, - криваво-червоне.
Техніка посіву культур мікроорганізмів. У лабораторних умовах мікроорганізми вирощують на твердих і рідких середовищах в пробірках, колбах або в чашках Петрі.
Посівом в мікробіології називається внесення клітин мікроорганізмів (посівного матеріалу - інокуляту) у стерильні середовища.
Пересівши-це перенесення вирощеної культури мікроорганізмів на живильному середовищі на іншу свіжу живильне середовище.
Посів (і пересівання) мікроорганізмів проводять при дотриманні певних правил стерильності, які необхідно виконувати, щоб оберегти досліджувану культуру від забруднення сторонніми мікроорганізмами і не забруднювати навколишнє середовище досліджуваними культурами мікроорганізмів.
Посів (або пересівання) завжди проводять поблизу пальника. Пробірки при взятті мазка необхідно утримувати в похилому положенні, щоб гарантувати стерильність культури. Якщо їх тримати вертикально, то можливе попадання сторонніх клітин мікроорганізмів.
У полум'ї пальника ретельно обпалюють бактеріологічну петлю, тримаючи її в правій руці в стрімкому положенні. Мізинцем правої руки виймають з другої пробірки ватяну пробку і затискають її між мізинцем і долонею, пробку першої пробірки затискають між безіменним і середнім пальцями правої руки. Знову злегка обпалюють голку і вводять її в пробірку з культурою. Платинова голка остигає дуже швидко. Легким дотиком її до колонії мікроорганізмів беруть невелику кількість мікробної маси і переносять у другу пробірку.
Забарвлення клітин мікроорганізмів за Грамом. Метод диференціації мікробних клітин, заснований на відмінності в хімічному складі клітинних оболонок. Сутність його в тому, що в клітинах одних видів мікроорганізмів утворюється нерозчинний у спирті з'єднання йоду з основним барвником, у інших видів це з'єднання тимчасово з'являється тимчасово і після обробки спиртом розчиняється. Мікроби першої групи називаються грампозитивними, другий - грамнегативними.
Техніка фарбування за Грамом. На добре знежирене скло наносять три тонких мазка різних культур мікроорганізмів (два з них-контрольні із завідомо відомим ставленням до фарбування за Грамом). Мазки висушують на повітрі, фіксують над полум'ям пальника і забарвлюють протягом 1хв фенольних розчином генціана фіолетового (або кристалічного фіолетового), тримаючи скло в кілька нахиленому положенні. Препарат, не промиваючи водою, обробляють, безперервно похитуючи, 96%-ним спиртом протягом 15-20 с. Час знебарвлення дуже істотно, при перевищенні зазначеного терміну знебарвлюються і грампозитивні клітини, при недостатньому терміні обробки препарат виявиться перефарбованих.
Промивши препарат водою, його фарбують фуксином Пфейфера протягом 1хв. Після цієї обробки грампозитивні мікроорганізми забарвлюються в темно - фіолетовий колір, грамнегативні мають тільки колір додаткової забарвлення (фуксину) (Теппер та ін, 1987).

2.2 Модельні мікроекосистемою
Невеликі автономні «світи» або мікрокосм, у бутлях або інших посудинах можуть імітувати в мініатюрі природу різних екосистем. Ці невеликі «світи» можна розглядати як мікроекосистемою. Створення невеликих, повністю закритих систем, які потребують лише однієї світлової енергії (своєрідні мініатюрні біосфери), - дуже складне завдання. Експериментальні мікрокосм зазвичай варіюють від частково закритих систем, в яких відбувається газообмін з атмосферою, але не відбувається обміну біогенними елементами і організмами, до повністю закритих систем, що включають співтовариства організмів, що містяться в різних хемостатах і турбідостатах з регульованим припливом і відтоком біогенних елементів і організмів. У добре змодельованих мікрокосму можна спостерігати багато або навіть майже всі основні функції і трофічні структури природної екосистеми, проте в силу необхідності різноманітність і розміри компонентів таких мікрокосмів вкрай невеликі. Переваги мікроекосістем для дослідника полягають в тому, що вони мають чіткі межі, легко відтворювані і зручні для експериментів. Не слід, однак, думати, що мікрокосм представляють собою копії тієї чи іншої конкурентної екосистеми, це всього лише живі працюють моделі (спрощення) природи.
Можна виділити два типи біологічних мікрокосмів: 1) мікроекосистемою, взяті безпосередньо з природи шляхом множинного засіву культурального середовища пробами з різних природних середовищ існування, і 2) системи, створені шляхом поєднання видів, вирощених у «чистих» або аксеніческіх, культурах (вільних від інших організмів ), поки не вийде бажана комбінація. Системи першого типу - це, по суті, «демонтована» або «спрощена» природа, зведена до тих мікроорганізмів, які можуть тривалий час підтримуватися і функціонувати в умовах обраного експериментатором судини, культурального середовища, освітленості і температури. Такі системи, отже, зазвичай імітують які - то певні природні ситуації. Одна з проблем, яка виникає при роботі з такими похідними екосистемами, полягає в тому, що важко визначити їх точний видовий склад, особливо склад бактерій (den et al, 1969). Початок використання в екології похідних або «множинних» систем поклали роботи Г. Одума і його учнів (H. Odum, Hoskins, 1957; Beyers, 1963).
При другому підході шляхом підбору спочатку ізольованих і ретельно вивчених компонентів створюється система з відомим складом. Отримані при цьому культури часто називають гнотобіотіческімі (цей термін обговорюється в роботі Догерті (Dougherty, 1959)), оскільки тут точно відомий склад і навіть те, присутні чи відсутні бактерії. Гнотобіотіческіе культури раніше використовували головним чином для вивчення харчування, біохімії та інших аспектів життя окремих видів і штамів або для вивчення взаємодії двох видів. Проте останнім часом екологи почали експериментувати з більш складними поліаксеніческімі культурами в пошуках шляхів побудови автономних екосистем (Nixon, 1969; Taub, 1969, 1974).
Ці два протилежні підходи до створення лабораторних мікроекосістем паралельні двом давно існуючим підходам (холістичному і мерологіческому) екологів до вивчення озер та інших великих систем, що існують в природі.
Існує широко поширена помилка щодо «рівноваги» в акваріумі з рибами. Цілком можливо досягти деякого приблизного рівноваги газового і харчового режиму за умови, що в ньому мало риб, а води і рослин багато. Ще в 1851 р . Дж. Уорінгтон «встановив це дивовижне і чудове рівновагу між тваринним і рослинним царствами» в акваріумі об'ємом 12 галонів ( 54,6 л ), Поселивши в ньому кілька золотих рибок, равликів і велика кількість валліснеріі (водна рослина), а з ними і безліч різноманітних мікроорганізмів. Уорінгтон правильно оцінив не тільки взаємодія риб і рослин, а й наголосив на значенні детрітоядних равликів «в розкладанні решток рослин і водорослевой слизу», в результаті чого «те, що інакше могло б діяти як отруйна початок, перетворюється на родючу середовище для росту рослин». Більшість спроб любителів домагатися рівноваги в акваріумі зазнає невдачі через те, що для наявної кількості ресурсів в акваріум поміщають занадто багато риб (діагноз: елементарний випадок перенаселення). Для повного самозабезпечення однієї рибі середнього розміру потрібно багато кубічних метрів води та організмів, службовців їжею. Оскільки акваріум зазвичай тримають вдома, на роботі або в школі заради «спостереження за рибами», поміщаючи велике число риб в малому просторі, необхідно додаткове харчування, аерація і періодичне очищення акваріума (Одум, 1986).
У даній роботі була проведена постановка двох модельних мікроекосістем. В одній системі досліджувався вплив мікрофлори річки Крива Болда на мікробіологічний склад садової грунту. У другій мікроекосистемою спостерігалося вплив мікрофлори озера Баскунчак на мікробіологічний склад садової грунту.
Для постановки модельних мікроекосістем на дно двох високих циліндрів V = 500 см ³ поміщалося 100 г . досліджуваної грунту і заливалося 1000мл. води в першому випадку взятої з річки Крива Болда, а в другому - з озера Баскунчак. У тому вигляді екосистеми залишали на відкритому повітрі на 3 тижні. По закінченні цього часу з дна циліндра забирають невелику кількість грунту, просушують її на повітрі, потім зважують у кількості 1г, яку поміщали в пробірку з 10 г . стерильної води. Виробляли ряд послідовних розведень: 10 ^-1 -10 ^-7. З кожного розведення брали по 1 мл і поміщали у високі стерильні пробірки методом глибинного посіву. В отриману культуральну рідину заливають рідке середовище Виноградського до 3 / 4 об'єму.
Дані екосистеми досліджувалися також на середовищі Імшенецького, при цьому середовище у високій пробірці, попередньо простерилизованная засівається грудочкою грунту і міститься в термостат.
Необхідність вивчення маслянокислих бактерій у водоймах була очевидною. Обстеження різнотипних водойм з широким спектром гідролого-гідрохімічних і продукційних характеристик дозволило вперше виявити екологічні особливості розподілу окремих видів маслянокислих бактерій. Головними чинниками, що зумовлюють переважний розвиток тих чи інших бактерій у відкладеннях, є концентрація, склад і доступність З _орг - з'єднань, що відображають трофічний статус водоемов.C pasteurianum, зброджують прості цукри, домінує вилах евтрофними озер донних відкладень полісапробних зон з максимальним вмістом легкогідролізуемих сполук. C. butyricum і C. felsineum, ферментують різні полісахариди, переважають в мезотрофні озерах і водосховищах
, Грунти яких формуються під впливом алохтонні стоку та прибережної рослинності. C. acetobutyricum, що володіє здатністю засвоювати не тільки вуглеводи та амінокислоти, але також лігніну - гумусові сполуки, досягає максимуму донних відкладеннях ацидності хтоніоевтрофних озер. Таким чином, отримані на великому матеріалі нові для водної мікробіології відомості незаперечно свідчать про геохімічної значущості маслянокислих бактерій, які є найважливішою ланкою бактеріальних спільнот донних відкладень внутрішніх водойм різного типу (Дзюбан, 2005).

Глава 3. Результати досліджень
При постановці накопичувальної культури, виділення і мікроскопірованіі маслянокислих бактерій отримали наступні дані.
Таблиця 1
Культуральні ознаки маслянокислих бактерій на середовищі Виноградського
При аналізі даної таблиці можна спостерігати, що тут досить інтенсивно відбувалися процеси бродіння: відбувалося помутніння середовища, утворювався газ, відчувався сильний запах масляної кислоти, виділився осад, була присутня плівка. При культивуванні в середовищі створилися анаеробні бактерії, тому виявлені тут бактерії відносяться до анаеробів і утворюють спори.
Таблиця 2
Культуральні ознаки бактерій на середовищі Імшенецького
При аналізі даної проби спостерігалося присутність на середовищі анаеробних спороутворюючих паличок. Помітний інтенсивний процес руйнування клітковини. Папір ослизнюється в результаті утворення оксикислот.