Мас спектрометричних оцінка рівня включення дейтерію і вуглець

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

БІОТЕХНОЛОГІЯ
Мас-спектрометричний ОЦІНКА РІВНЯ ВКЛЮЧЕННЯ дейтерію та вуглецю-13 У МОЛЕКУЛИ АМІНОКИСЛОТ БАКТЕРІАЛЬНИХ ОБ'ЄКТІВ
@ О. В. Мосіна
Московська державна академія тонкої хімічної технології ім. М.В. Ломоносова, 117571, м. Москва, просп. Вернадського, д.86
Методом високочутливої ​​мас-спектрометрії електронного удару досліджені рівні включення стабільних ізотопів дейтерію 2 H і вуглецю-13 13 С в молекули секретується амінокислот L-фенілаланінпродуцірующего штаму Brevibacterium methylicum і L-лейцінпродуцірующего штаму Methylobacillus flagellatum і амінокислотні залишки сумарних білків біомаси при вирощуванні бактерій на середовищах, містять як джерел стабільних ізотопів (2 Н) метанол, (13 С) метанол і 2 Н 2 О. Також здійснено включення L - [2,3,4,5,6 - 2 Н] фенілаланіну, L - [3,5 - 2 Н] тирозину і L - [2,4,5,6,7 - 2 Н] триптофану в бактеріородопсин, синтезується Halobacterium halobium ЕТ 1001. Для мас-спектрометричного аналізу мультикомпонентного суміші амінокислот у складі культуральних рідин і білкових гідролізатів (гідроліз в 6 М 2 НСl (3% фенол) і 2 М Ва (ОН) 2), перетворювали в N- бензілоксікарбоніл-похідні амінокислот і метилові ефіри N-діметіламінонафталін-5-сульфоніл-похідних амінокислот, які препаративно разделелялі методом обернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії. Отримані [2 H] - і [13 C] амінокислоти представляли собою суміші, що розрізняються кількістю включених в молекулу ізотопів. Рівні включення 2 Н і 13 С в молекули секретується амінокислот і амінокислотні залишки сумарних білків біомаси змінюються в залежності від вмісту мічених субстратів в ростових середовищах і розрізняються для різних амінокислот (до 10% для L -лейціна/ізолейціна і до 97.5% для L-аланіну ).
Ключові слова: стабільні ізотопи; метилотрофних бактерій; галофільні бактерії; вирощування на 2 Н 2 О; ізотопномечение амінокислоти, бактеріородопсин

ВСТУП

Збагачення молекул стабільними ізотопами (2 Н, 13 С, 15 N та інші) в даний час є важливим методом у різнопрофільних біохімічних та метаболічних дослідженнях з використанням амінокислот та інших біологічно активних сполук (БАС) [1-3]. Тенденції до кращого застосування стабільних ізотопів порівняно з їх радіоактивними аналогами обумовлені відсутністю радіаційної небезпеки і можливістю визначення локалізації мітки в молекулі методами високого дозволу, включаючи ЯМР [4], ІК-[5] і лазерну спектроскопію [6] і мас-спектрометрію [7 ]. Розвиток цих методів детекції стабільних ізотопів за останні роки дозволило підвищити ефективність біологічних досліджень, а також вивчати структуру і механізм дії клітинних БАС на молекулярному рівні [8, 9]. Зокрема, амінокислоти, мічені 2 Н, 13 С, 15 N з різними рівнями ізотопного включення, застосовуються для вивчення просторової структури і конформаційних змін білків [10], взаємодії білкових молекул [11], а також в хімічних синтезах широкого кола ізотопномечених сполук на їх основі. Наприклад, мічений L-фенілаланін використаний в синтезах пептидних гормонів і нейротрансмітерів [12].
Важливим моментом у дослідженнях із застосуванням мічених амінокислот, є їх доступність. Ізотопномечение амінокислоти можуть бути отримані з використанням хімічних, ферментативних і біосинтетичні методів. Однак хімічні синтези часто багатостадійний, вимагають великих витрат коштовних реагентів і мічених субстратів і приводять у результаті до продукту, який представляє собою рацемічну суміш D - і L - форм, для поділу яких потрібні спеціальні методи [13]. Більш тонкі синтези мічених амінокислот пов'язані з використанням комбінації хімічних і ферментативних підходів [14-16].
Для багатьох цілей і насамперед для структурних досліджень білків біотехнологія пропонує альтернативний хімічному синтезу шлях отримання амінокислот, мічених стабільними ізотопами, який призводить до високих виходів синтезованих продуктів, до ефективного включення ізотопів у молекули, і, саме головне, до збереження природного конфігурації синтезованих сполук. При биосинтетической отриманні мічених амінокислот використовують кілька підходів, один з яких полягає в рівномірному збагаченні синтезованих сполук по всьому вуглецевому скелету молекули за рахунок вирощування штамів продуцентів на середовищах, що містять як джерел стабільних ізотопів наступні субстрати: 154 Сl [17], (13 С) метанол, (2 Н) метанол [18], і 2 Н 2 О [19]. Цей підхід включає в себе також комплексне використання хімічних компонентів біомаси, вирощеної в присутності стабільних ізотопів, для виділення і фракціонування потрібних ізотопномечених сполук. Інший підхід полягає в сайт-специфічному збагаченні амінокислот за певними положеннями молекул за рахунок асиміляції клітиною мічених попередників, наприклад, [1,4 - 13 С] сукцинату, [1, 2 - 13 С] ацетату, [1 - 13 С] лактату і ін [20, 21]. Методи отримання ізотопномечених амінокислот в аспекті їх використання для ЯМР-досліджень білків більш детально викладені в роботах ЛеМастера [22].
Ця робота є продовженням досліджень [23-25], спрямованих на біосинтетичні отримання [2 Н] - і [13 С] амінокислот за рахунок утилізації низькомолекулярних мічених субстратів - (2 Н) метанолу, (13 С) метанолу та 2 Н 2 О в клітинах мікроорганізмів і реалізацію можливості визначення стабільних ізотопів методом мас-спектрометрії електронного удару. Чутливість мас-спектрометрії становить 10 -9 -10 -11 нмоль, що істотно вище, ніж при використанні ІЧ-і ЯМР-спектроскопії. Даний метод у поєднанні з обернено-фазової ВЕРХ добре зарекомендував себе для дослідження рівня ізотопного збагачення молекул амінокислот у складі їх мультикомпонентного сумішей, якими є препарати культуральних рідин штамів-продуцентів амінокислот та гідролізати білків, отримані з середовищ, що містять стабільні ізотопи.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

Об'єктами дослідження служили отримані в результаті мутагенезу L-фенілаланінпродуцірующій штам факультативних метилотрофних бактерій Brevibacterium methylicum, асиміляційний метанол по рибулезо-5-монофосфатному шляху фіксації вуглецю, і L-лейцінпродуцірующій штам облігатних метилотрофних бактерій Methylobacillus flagellatum, який реалізує 2-кето-3-дезоксиглюконатальдолазный варіант рибулезо -5-монофосфатного шляху фіксації вуглецю. Для компенсації ауксотрофності по L-лейцин і L-ізолейцин ці амінокислоти додавали в ростові середовища в протоновану вигляді. При цьому рівні накопичення L-фенілаланіну і L-лейцину в культуральних рідинах штамів-продуцентів досягали величини 0.8 та 1.0 г / л відповідно [23]. Включення дейтерію в молекули секретується амінокислот і сумарних білків біомаси здійснювали за рахунок вирощування штаму B. methylicum на середовищах з 2 Н 2 О і звичайним метанолом, так як рівень включення 2 Н в молекули амінокислоти за рахунок асиміляції (2 Н) метанолу незначний [25].
Оскільки в клітині відбувається асиміляція водню (дейтерію) з Н 2 О (2 Н 2 O) середовища, ми підбирали умови включення дейтерію в молекули амінокислот і білків при ступінчастому зростанні концентрації 2 Н 2 O у ростових середовищах, як показано в табл. 1. Зростання бактерій на 2 H 2 O-з вмістом середовищах характеризується збільшенням тривалості лаг-фази, часу клітинної генерації і зниженням виходів мікробної біомаси (табл. 1), тому було необхідно проводити адаптацію бактерій до 2 Н 2 О. Метод адаптації штаму B. methylicum до зростання на 2 Н 2 О при збереженні здатності до біосинтезу L-фенілаланіну описаний в роботі [23]. У даній роботі були досліджені зразки культуральної рідини B. methylicum та гідролізати біомаси, отримані в ході багатоступінчастої адаптації бактерій до важкій воді на середовищах з різним вмістом 2 Н 2 О (від 24.5 до 98% 2 Н 2 О *). Оскільки даний штам метилотрофних бактерій вдалося адаптувати до зростання на 2 Н 2 О, дослідження рівнів включення дейтерію в молекули амінокислот уявлялося найбільш цікавим.
На відміну від культивування на 2 Н 2 О-середовищі, де необхідно проводити клітинну адаптацію до дейтерію, при отриманні [13 С] амінокислот за рахунок утилізації 13 СН 3 ОН даний етап не є обов'язковим, оскільки цей ізотопний субстрат не робить негативного біостатичні ефекту на ростові характеристики метілотрофов (див. табл. 1). Тому в разі M. flagellatum включення 13 С в молекули амінокислот здійснювали в одну стадію при вирощуванні бактерій на водних середовищах, що містять 1% (13 C) метанол.
Таблиця 1
Вплив ізотопного складу середовища на ріст штамів B. methylicum та M. flagellatum
Номер досвіду
Середовище вирощування
Величина лаг-фази, год
Вихід біомаси,% від контролю
Час генерації, год
1
0
24.0
100
2.2
2
24.5
32.1
90.6
2.4
3
49.0
40.5
70.1
3.0
4
73.5
45.8
56.4
3.5
5
98.0
60.5
32.9
4.4
6
3 ОН
0
100
1.1
7
13 СН 3 ОН
0.1
72.0
1.0
Як інша модельної системи для включення ізотопної мітки в молекули білків, використовували бактеріородопсин [26], який синтезується в мембрані Halobacterium halobium ЕТ 1001. Вибір для цих цілей бактериородопсина, який функціонує як АТP-залежна транслоказа в клітинах галофільних бактерій, був продиктований можливістю дослідження з його допомогою процесів функціонування мембранних білків in vivo в умовах ізотопного збагачення середовища дейтерієм. Для включення дейтерієво мітки в молекулу бактериородопсина використовували метод сайт-специфічного збагачення білка за рахунок вирощування H. halobium ЕТ 1001 на синтетичному середовищі з дейтерійсодержащімі аналогами ароматичних амінокислот - L - [2,3,4,5,6 - 2 Н] фенилаланином, L - [3,5 - 2 Н] тирозином і L - [2,4,5 , 6,7 - 2 Н] триптофаном.
Основні етапи при виділенні [2 H]-і [13 C]-амінокислот полягали у вирощуванні штамів-продуцентів на середовищах з міченими субстратами - (2 Н) метанолом, (13 С) метанолом і 2 Н 2 О або L - [2, 3,4,5,6 - 2 Н] фенилаланином, L - [3,5 - 2 Н] тирозином і L - [2,4,5,6,7 - 2 Н] триптофаном (бактеріородопсин), відділенні культуральних рідин, містять секретуються амінокислоти, від мікробної біомаси, руйнуванні клітин, виділення фракції сумарних білків біомаси та бактериородопсина з наступним їх гідролізом, деріватізаціі сумішей амінокислот дансілхлорідом, бензилоксикарбонилхлоридом і діазометаном, поділі метилових ефірів N-Dns-похідних амінокислот і N-Cbz-похідних амінокислот методом обернено -фазової ВЕРХ, мас-спектрометрії електронного удару отриманих похідних амінокислот.
2 Н-і 13 C-Містять амінокислоти виділяли з ліофілізованих культуральних рідин штамів-продуцентів амінокислот B. methylicum та M. flagellatum, а також у складі гідролізатів сумарних білків біомаси. При виділенні фракції сумарних білків необхідно враховувати наявність в них вуглеводів, ліпідів та пігментів. У роботі використовували багаті по білку штами бактерій з порівняно невеликим вмістом вуглеводів в них. Гідролізу в якості фракції сумарних білків піддавали залишок після вичерпного відділення ліпідів та пігментів екстракцією органічними розчинниками (метанол-хлороформ-ацетон). В окремих випадках для повного відокремлення від супутніх компонентів вдавалися до солюбілізаціі білків в SDS або висолювання їх сульфатом амонію.
Виділення та очищення індивідуальних білків з метою подальшого вивчення їх просторової структури доцільно здійснювати методом солюбілізаціі з використанням відповідних детергентів (див. [27]) що особливо важливо для бактериородопсина, що є високоспіральним білком. Тому при виділенні бактериородопсина з пурпурових мембран галофільних бактерії H. halobium ЕТ 1001 ми солюбілізовалі його в 0.5% розчині SDS із збереженням a-спіральної конфігурації білка [28], а далі облягали його метанолом. Гомогенність очищеного бактериородопсина була підтверджена електрофорезом у 12.5% ​​ПААГ у присутності 0.1% SDS.
Гідроліз дейтеріймечених білків проводили в умовах запобігання реакцій ізотопного обміну водню на дейтерій в ході гідролізу і збереження залишків ароматичних амінокислот у білку. Були розглянуті два альтернативних варіанти проведення гідролізу - кислотний і лужний. Кислотний гідроліз білка в стандартних умовах (6 М HCl, 24 год, 110 0 С), як відомо, призводить до повного руйнування триптофану та часткового руйнування серину, треоніну та деяких інших амінокислот [29]. Іншим значним недоліком при проведенні гідролізу в HCl є ізотопний (1 Н-2 Н)-обмін ароматичних протонів (дейтеронов) в молекулах триптофану, тирозину і гістидину, а також протонів (дейтеронов) при атомі С3 аспарагінової і С4 глутамінової кислот [30]. Тому, щоб отримати реальні дані про биосинтетической включенні дейтерію в молекули амінокислот необхідно проводити гідроліз білка з використанням дейтерированного реагентів (6 М 2 НCl з 3% фенолом (у 2 Н 2 O)). Інший варіант гідролізу білка полягав у використанні 2 М Ba (OH) 2 (110 0 C, 24 год). У цих умовах гідролізу білка реакцій ізотопного обміну водню на дейтерій в ароматичних амінокислотах - тирозину і триптофану не відбувається, а триптофан не руйнується. Обидва методи гідролізу показали гарні результати по збереженню ароматичних амінокислот у гидролизатах білка та утримання дейтерію в молекулах амінокислот. Необхідно підкреслити, проте, що для препаративного отримання дейтерированного амінокислот з білка мікроорганізмів доцільніше використовувати гідроліз в 2 НСl в 2 Н 2 О (у присутності добавки фенолу для збереження ароматичних амінокислот), що дозволяє уникнути рацемізації. Для вивчення ж рівня включення стабільних ізотопів у залишки ароматичних кислот бактериородопсина і в аналітичних цілях краще застосовувати гідроліз білка в розчині Ва (ОН) 2, при якому відсутня (1 Н-2 Н)-обмін в амінокислотах і зберігаються залишки фенілаланіну, тирозину і триптофану . При лужному гідролізі можлива рацемізації амінокислот не впливає на результат подальшого мас-спектрометричного визначення рівнів включення дейтерію в амінокислоти.
Для отримання летючих похідних амінокислоти переводили в метилові ефіри N-Dns-амінокислот або N-Cbz-амінокислоти, які потім розділяли методами обернено-фазової ВЕРХ. Умови N-деріватізаціі амінокислот відпрацьовували таким чином, щоб отримати в мас-спектрах як можна більш інтенсивні піки їх молекулярних іонів М +. На рівні фону метаболітів середовища. Для цього проводили пряму деріватізацію амінокислот у складі ліофілізованих культуральних рідин і гідролізатів сумарних білків біомаси п'ятикратним надлишком дансілхлоріда або бензілоксікарбонілхлоріда.
У цих умовах для лізину, гістидину, тирозину, серину, треоніну та цистеїну поряд з монопроізводнимі утворювалися ді-Dns і ді-Cbz-похідні. Крім цього, з аргініну синтезувався N-три-Dns-(Cbz)-аргінін. Тому в мас-спектрометричних дослідженнях молекулярні іони М +. Цих сполук відповідали ди-або три-похідним.
Ефективність використання N-Cbz-похідних амінокислот в обернено-фазової ВЕРХ і в мас-спектрометричних дослідженнях була показана раніше [31, 32]. Летючість N-похідних амінокислот при мас-спектрометричного аналізу може бути підвищена за рахунок додаткової деріватізаціі по карбоксильної групи, тому N-Dns-амінокислоти були переведені в їх метилові ефіри. Для запобігання зворотного ізотопного обміну ароматичних протонів (дейтеронов) при етерифікації дейтеріймечених амінокислот, в даній роботі віддали перевагу використанню діазометана для цих цілей [33]. Свіжоприготованим розчином діазометана в діетиловому ефірі обробляли сухі залишки сумішей амінокислот. При деріватізаціі амінокислот діазометаном відбувалося додаткове N-метилювання по a-NH-(Dns)-групі амінокислот, що призводило до появи у мас-спектрах метилових ефірів N-Dns-амінокислот додаткових піків, що відповідають сполукам з молекулярною масою на 14 масових одиниць більше вихідних .
У даній роботі включення ізотопів 2 Н і 13 С в молекули амінокислот мультикомпонентного сумішей у складі культуральних рідин і білкових гідролізатів визначали методом мас-спектрометрії електронного удару. Метилові ефіри N-Dns-похідних амінокислот або N-Cbz-похідні амінокислот препаративного поділяли методом обернено-фазової ВЕРХ. Ступені хроматографічної чистоти 2 Н-та 13 С-вмісних амінокислот, виділених з культуральних рідин B. methylicum та M. flagellatum і гідролізатів білків у вигляді їх N-Cbz-похідних амінокислот склали 96-98%, при виходах - 67-89%. Для окремих амінокислот виявилося більш зручним поділ у вигляді метилових ефірів N-Dns-похідних амінокислот. При цьому ступінь хроматографічної чистоти отриманих з гідролізатів бактериородопсина метилових ефірів N-Dns-фенілаланіну, N-Dns-тирозину і N-Dns-триптофану склали 96, 97 і 98% відповідно. Даний результат важливий тому, що саме метилові ефіри N-Dns-амінокислот внаслідок своєї хімічної стабільності, наявності високоінтенсивних молекулярних іонів М +. При високих молекулярних масах виявилися досить зручними для мас-спектрометричних досліджень і дозволяють ідентифікувати амінокислоти в присутності низькомолекулярних метаболітів середовища та інших продуктів деріватізаціі. Останній факт дуже важливий для вивчення складу пулу амінокислот, секретується в культуральні рідини штамів-продуцентів.
Шляхи фрагментації метилових ефірів N-Dns-фенілаланіну і N-Dns-лейцину при мас-спектрометрії електронного удару призводять до формування піків їх молекулярних іонів при m / z 412 і m / z 378 і до утворення дансільних фрагментів і продуктів їх подальшого розпаду до N -діметіламінонафталіна, а також до отримання амінних А + і аміноацільних фрагментів В + (рис. 1). Показана на рис. 1 фрагментація метилових ефірів N-Dns-фенілаланіну і N-Dns-лейцину характерна для цих похідних всіх інших амінокислот, що дозволяє проводити мас-спектрометричний моніторинг ізотопномечених амінокислот у складі інтактних культуральних рідин штамів-продуцентів, які містять суму амінокислот та інших метаболітів середовища, до стадії їх хроматографічного розділення, а також дослідити включення стабільних ізотопів в амінокислоти білкових гідролізатів.

При використанні як джерела стабільних ізотопів (13 С) метанолу та 2 Н 2 О, в клітині синтезуються ізотопнозамещенние амінокислоти, що розрізняються кількістю атомів, заміщених на 13 С і 2 Н. При цьому, чим вище молекулярна маса амінокислот, тим можливий більший набір іонів, відповідних ізотопнозамещенним формам. Піки при m / z 323.2; 337.4; 368.5; 382.3; 420.5 в мас-спектрі [13 С] амінокислот деріватізованной культуральної рідини M. flagellatum, отриманої з водного середовища, що містить 1% (13 С) метанол (рис. 2 б), відповідають за масою метиловим ефірів N-Dns-гліцину, N-Dns-аланіну, N-Dns-валіну, N-Dns-лейцину / ізолейцин і N-Dns-фенілаланіну. Слід підкреслити, що величина m / z для молекулярного іона метилових ефірів N-Dns-лейцину і ізолейцин у мас-спектрах електронного удару однакова, тому даним методом не можна точно ідентифікувати ці амінокислоти. Максимальні рівні включення 13 С в молекули амінокислот, виміряні за збільшення усередненого значення m / z для молекулярного іона ізотопномеченого зразка в порівнянні з молекулярною масою природного амінокислоти варіюють від 35% для [13 C] аланіну до 95% для [13 С] фенілаланіну (табл . 2). Враховуючи ауксотрофность штаму по L-ізолейцин, розкид значень може бути пояснений внеском екзогенного L-ізолейцин в рівень ізотопного включення лейцину, а також інших метаболічно пов'язаних з ним амінокислот (див. текст нижче).


Для штаму B. methylicum спостерігалося специфічне зростання рівнів ізотопного включення дейтерію в молекули індивідуальних амінокислот культуральних рідин (табл. 2) при ступінчастому збільшенні концентрацій 2 Н 2 O у ростової середовищі. Рівні включення дейтерію в молекули різних амінокислот при однакових умовах культивування розрізняються. Такий результат зафіксовано у всіх експериментах, де джерелом стабільних ізотопів служила 2 Н 2 О.
З мас-спектра метилових ефірів N-Dns-похідних амінокислот культуральної рідини, отриманої з середи, що містить 49% 2 Н 2 О (рис. 3 б) видно, що молекула фенілаланіну містила 6 ізотопнозамещенних форм із середнім значенням m / z 414.2, яке зростає в порівнянні з контрольними умовами (m / z 412.0, рис. 3 а) на 2.2 одиниці, тобто 27.5% від загальної кількості атомів водню в молекулі заміщені на дейтерій. Область мас-спектра зі значеннями m / z 90-300 відповідає продуктам деріватізаціі метаболітів ростової середовища. Пік з m / z 431.0, зафіксований в мас-спектрі культуральної рідини і виявляється у всіх дослідах, відповідає продукту додаткового метилювання фенілаланіну по a-NH-(Dns) - групі. Пік з m / z 400 (рис. 3 б) найімовірніше відповідає продукту відщеплення метильної групи від дейтерированного похідного фенілаланіну.


Присутність в мас-спектрі зразка культуральної рідини B. methylicum, отриманої на середовищі з 73.5% 2 Н 2 О (рис. 4) піку молекулярного іона метилового ефіру N-Dns-фенілаланіну з m / z 416.1 вказує на збільшення молекулярної маси фенілаланіну на 4.1 одиницю, тобто, 51.2% атомів водню в молекулі фенілаланіну в цьому випадку заміщені на дейтерій. Очевидно, що вишеобозначенние атоми дейтерію включилися в молекулу фенілаланіну за рахунок процесу біосинтезу de novo, тобто з вуглецевого скелету молекули. До легко обмінюваних слід віднести протони (дейтерони) при гетероатома в NH 2 - і СООН-групах амінокислот, які заміщуються за рахунок легкості дисоціації в Н 2 О (2 Н 2 О).
Таблиця 2
Рівні включення 2 Н і 13 С в молекули амінокислот, секретується в культуральну рідину (ЯЖ) B. methylicum та M. flagellatum, і в амінокислотні залишки білків (дані отримані для метилових ефірів N-Dns-амінокислот і N-Cbz-амінокислот)
Амінокислоти
Зміст 2 Н 2 О в середовищі,% *
24.5 49.0 73.5 98.0
ЯЖ білок ЯЖ білок ЯЖ білок ЯЖ білок
1% 13 СН 3 ОН **
ЯЖ білок
Гліцин
- 15.0
- 35.0
- 50.0
- 90.0
60.0 90.0
Аланін
24.0 20.0
37.5 45.0
62.5 62.5
77.5 97.5
35.0 95.0
Валін
20.0 15.0
46.3 36.3
43.8 50.0
58.8 50.0
50.0 50.0
Лейцин / ізолейцин
15.0 10.0
47.0 42.0
46.0 45.0
51.0 49.0
38.0 49.0
Фенілаланін
15.0 24.5
27.5 37.5
51.2 50.0
75.0 95.0
95.0 80.5
Тирозин
- 20.0
- 25.6
- 68.8
- 92.8
- 53.5
Серін
- 15.0
- 36.7
- 47.6
- 86.6
- 73.3
Аспарагінова кислота
- 20.0
- 36.7
- 60.0
- 66.6
- 33.3
Глутамінова кислота
- 20.0
- 40.0
- 53.4
- 70,0
- 40.0
Лізин
- 10.0
- 35.3
- 40.0
- 58.9
- 54.4

З таблиці. 2 видно, що умовах ауксотрофності по L-лейцин рівні включення 2 Н в молекули лейцину / ізолейцин нижче, ніж для фенілаланіну. Зазначена особливість найвиразніше проявляється на середовищі з максимальною концентрацією 2 Н 2 О. Ще раз цей результат підтвердили рис. 5, де показаний мас-спектр [2 Н] амінокислот культуральної рідини у вигляді метилових ефірів N-Dns-похідних амінокислот після вирощування бактерій B. methylicum в зазначених умовах. Видно, що величина m / z 418.0 піку молекулярного іона метилового ефіру N-Dns-фенілаланіл збільшується в порівнянні з контрольними умовами на 6 одиниць, що відповідає заміщенню 75% від загальної кількості атомів водню в молекулі. На відміну від фенілаланіну рівень включення дейтерію в лейцин / ізолейцин склав 51.0%, а в валін - 58.8%. Примітно, що в мас-спектрі цього зразка фіксується пік збагаченого дейтерієм бензильного фрагмента при m / z 97.0 (замість m / z при 91.0 у контролі), що вказує на часткову локалізацію атомів дейтерію в молекулі фенілаланіну в положеннях С2-С6 ароматичного кільця і ​​суміжні з ними положенні при вуглецевому атомі b. Незважаючи на те, що в інших дослідах піки бензильних фрагментів не були зафіксовані, логічно припустити, що за інших концентраціях 2 Н 2 О дейтерій також включається в ароматичне кільце фенілаланіну, так як у 2 Н 2 О метаболізм у штаму B. methylicum не зазнає суттєвих змін [25].

Аналогічна закономірність у рівнях включення 13 С в молекули амінокислот, пов'язаних з ауксотрофним метаболізмом, проявляється при вирощуванні L-ізолейцінзавісімого штаму M. flagellatum на середовищі з 1% (13 С) метанолом. Як видно з табл. 2, на відміну від спостережуваного для [13 С] фенілаланіну (рівень ізотопного включення - 95.0%), рівні включення ізотопу 13 С в молекули лейцину / ізолейцин, аланіну і валіну склали 38.0; 35.0; 50.0% відповідно. Рівень ізотопного включення для [13 C] гліцину (60%) хоча і вище, ніж для трьох останніх амінокислот, але набагато нижче, ніж для фенілаланіну.
Підсумовуючи отримані дані за рівнями включення 2 Н-та 13 С в молекули секретується амінокислот, можна зробити висновок про збереження мінорних шляхів метаболізму, пов'язаних з біосинтезом лейцину і метаболічно споріднених з ним амінокислот de novo. Іншим логічним поясненням спостережуваного ефекту, якщо взяти до уваги походження лейцину і ізолейцин різноманітні шляхах біосинтезу, може бути асиміляція клітиною немічених лейцину з середи на тлі біосинтезу міченого изолейцина de novo. З огляду на дані ефекти слід підкреслити, що використання ауксотрофних форм мікроорганізмів для отримання ізотопномечених амінокислот не виправдовує себе практично через множинного включення ізотопів у молекули. Навпаки, використання для цих цілей прототрофних форм мікроорганізмів здається більш перспективним.   

Загальні принципи вивчення рівнів ізотопного включення в молекули амінокислот при даному способі введення мітки були продемонстровані на прикладі аналізу складних мультикомпонентного сумішей, отриманих після гідролізу сумарних білків біомаси метилотрофних бактерій, а також індивідуального білка - бактериородопсина, що виконує роль АТФ-залежної транслокази в клітинах галофільних бактерії Halobacterium halobium. Як видно з рис. 6, до десяти амінокислот можуть бути ідентифіковані в гідролізаті білка B. methylicum по пікам молекулярних іонів метилових ефірів їх N-Dns-похідних амінокислот.
Як і у випадку з секретується амінокислотами, піки М +. Відповідали сумішей ізотопнозамещенних форм амінокислот. Для лізину і тирозину піки М +. Відповідали метиловим ефірів ді-похідних амінокислот - a, e-ді-Dns-лізину (з М +. При m / z 631.0) і О, N-ді-Dns-тирозину (з М + . при m / z 663.9). Рівні ізотопного включення дейтерію в молекули амінокислот при утриманні 2 Н 2 O у ростової середовищі 49% варіюють від 25.6% для тирозину до 45.0% для аланіну (рис. 6 б і табл. 2). У молекулах гліцину, валіну, фенілаланіну, серину, лізину, аспарагінової та глутамінової кислот вони знаходяться в межах 35 - 40%. Що стосується інших амінокислот, не детектіруемих даним методом, очевидно, що рівні ізотопного включення до них приблизно такі ж. Це підтверджується даними по розділенню білкових гідролізатів метилотрофних бактерій методами обернено-фазової ВЕРХ у вигляді N-Cbz-похідних амінокислот або метилових ефірів їх N-Dns-похідних амінокислот та іонообмінних хроматографії, де детектується вже 15 амінокислот (див., наприклад, рис. 7 ).

Отримані дані свідчать про можливість досягнення максимальних рівнів включення стабільних ізотопів 2 Н і 13 С в амінокислотні залишки сумарних білків біомаси (за винятком лейцину / ізолейцин і валіну, знижені рівні включення для яких пояснюються ефектом ауксотрофності по L-лейцин і по L-ізолейцин). Наприклад, у випадку з дейтерированного амінокислотами повного заміщення на стабільні ізотопи вдалося досягти за рахунок використання в якості джерела дейтерію 98% 2 Н 2 О (табл. 2). Як видно з табл. 2, при зростанні B. methylicum на середовищі з 98% 2 Н 2 О, рівні включення дейтерію в залишки гліцину, аланіну, фенілаланіну і тирозину складають 90.0; 97.5; 95.0 і 92.8%. В експериментах по включенню ізотопу 13 С в сумарні білки біомаси за рахунок утилізації (13 С) метанолу метилотрофних бактерій M. flagellatum також спостерігалися вищі рівні ізотопного включення до гліцин (90%), аланін (95.0%) і фенілаланіну (80.5%) (табл. 2). Як і у випадку з секретується амінокислотами, знижені рівні включення стабільних ізотопів в лейцин / ізолейцин (49%), а також у метаболічно пов'язаних з ним амінокислотах в цих умовах можуть бути пояснені ефектом ауксотрофності штаму по L-ізолейцин, який додавали в ростовую середу в немічених вигляді.
У всіх експериментах по включенню стабільних ізотопів в молекули амінокислот рівні включення 2 Н і 13 С в метаболічно пов'язані амінокислоти виявили певну коррелляцію. Так, рівні ізотопного включення для валіну та лейцину (сімейство пірувату), фенілаланіну і тирозину (сімейство ароматичних амінокислот) корелюють (див. табл. 2). Рівні ізотопного включення для гліцину і серину (сімейство серину), аспарагінової кислоти і в лізину (сімейство аспарагіну) також мають близькі величини. З даних табл. 2 видно, що рівні ізотопного включення секретується амінокислот та відповідних амінокислотних залишків сумарного білка при вирощуванні бактерій на середовищах з однаковим ізотопним насиченням, в цілому, також корелюють. Причина деяких можна побачити розбіжностей в рівнях включення ізотопів у молекули амінокислот до кінця не вивчена.
Даний біосинтетичних підхід дав позитивні результати з вивчення введення дейтерієво мітки в молекулу бактериородопсина, вирощеного на середовищі, що містить L - [2,3,4,5,6 - 2 Н] фенілаланін, L - [3,5 - 2 Н] тирозин і L - [2,4,5,6,7 - 2 Н] триптофан (рис. 8). Як видно з рис. 8, у мас-спектрі деріватізованного гідролізату бактериородопсина детектируются піки, відповідні молекулярним іонів збагачених дейтерієм метилових ефірів N-Dns-фенілаланіну з молекулярним іоном при m / z 417 (СР m / z 412 для немічених похідного фенілаланіну), N-Dns-тирозину з М +. при m / z 429 (СР m / z 428 для похідного тирозину) та N-Dns-триптофану з М +. при m / z 456 (СР m / z 451 для похідного триптофану). Всі вони відповідають суміші ізотнопозамещенних форм амінокислот, що розрізняються кількістю атомів водню, заміщених на дейтерій. Множинний характер включення дейтерію свідчить про можливий внесок біосинтезу de novo в рівні дейтерірованності ароматичних амінокислот, але також не виключено, що він визначається самим способом отримання ізотопномечених молекул. Крім вищеозначених амінокислот в мас-спектрі фіксуються піки молекулярних іонів метилових ефірів-N-Dns-гліцину (m / z 322), N-Dns-аланіну (m / z 336), N-Dns-валіну (m / z 364) і N-Dns-лейціна/ізолейціна (m / z 378). Як і слід було очікувати, ці амінокислотні залишки в бактеріородопсин не містять дейтерію.

Таким чином, проведені дослідження продемонстрували ефективність мас-спектрометрії електронного удару N-Cbz-похідних амінокислот і метилових ефірів N-Dns-похідних амінокислот для дослідження рівнів ізотопного збагачення молекул амінокислот у складі їх мультикомпонентного сумішей, отриманих біосинтетичних з використанням мікроорганізмів. Метод незамінний для вивчення складу пулу амінокислот, секретується в культуральні рідини штамів-продуцентів, вирощених на середовищах із стабільними ізотопами.
Експериментальна частина
У роботі використовували D, L-амінокислоти (Reanal, Угорщина), аденозин-і уридин-5-монофосфату (Sigma, США), панкреотіческую телячу дезоксирибонуклеаза I (Fluka Chemie AG, Швейцарія), додецилсульфат натрію (Chemapol, Чехо-Словаччина). L - [2,3,4,5,6 - 2 Н 5] фенілаланін (90 ат.% 2 Н), L - [3,5 - 2 Н 2] тирозин (96 ат.% 2 Н) і L - [2,4,5,6,7 - 2 Н 5] триптофан (98 ат.% 2 Н) (способи отримання вказані в роботах [34, 35]), були надані А. Б. Пшеничникова (МІТХТ ім. М. В. Ломоносова). Для синтезу похідних амінокислот використовували N-діметіламінонафталін-5-сульфохлорид (дансілхлорід) (Sigma, США), бензілоксікарбонілхлорід (Войківський хімзавод, РФ) і діазометан, одержуваний з N-нітрозометілмочевіни (Merck, Німеччина).
Дослідження проводили з генетично маркованими штамами бактерій, отриманими з колекції культур Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ) Державного науково-дослідного інституту генетики та селекції промислових мікроорганізмів:
Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, L-лейцінзавісімий штам факультативних метилотрофних бактерій, продуцент L-фенілаланіну;
Methylobacillus flagellatum KT, L-ізолейцінзавісімий штам облігатних метилотрофних бактерій, продуцент L-лейцину;
Halobacterium halobium ЕТ 1001, пігментсодержащій штам галофільних бактерій, здатний синтезувати бактеріородопсин;
Вирощування метилотрофних бактерій B. methylicum та M. flagellatum здійснювали на мінеральному середовищі М9 [36] у колбах Ерленмейера об'ємом 250 мл з наповненням середовищем 50 мл за методикою [23], використовуючи як джерел стабільних ізотопів (2 H) метанол, (13 С) метанол і 2 Н 2 O у присутності L-лейцину для B. methylicum і L-ізолейцин для M. flagellatum в концентраціях 10 мг / л. Клітини відділяли центрифугуванням (10000 g, 20 хв). У культуральної рідини аналізували секретуються амінокислоти.
Для виділення фракції сумарних білків біомаси клітини двічі промивали дистильованою водою з наступним центрифугуванням (10000 g, 20 хв), експонували ультразвуком при 40 кГц (3 x 15 хв) і центрифугували. Отриманий осад (10 мг) після відділення ліпідів та пігментів сумішшю органічних розчинників хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) використовували як фракції сумарних білків біомаси.
Для отримання дейтеріймеченого бактериородопсина використовували синтетичну середу, що містить 18 амінокислот, в якій немічених L-амінокислоти фенілаланін, тирозин і триптофан були замінені їх дейтерированного аналогами - [2,3,4,5,6 - 2 Н] фенилаланином, [3,5 - 2 Н] тирозином, і [2,4,5,6,7 - 2 Н] триптофаном (кількості компонентів наведені в г / л): (D, L-аланін 0.43, L-аргінін 0.4, D, L-аспарагінова кислота 0.45; L-цистеїн 0.05; L-глутамінова кислота 1.3; L-гліцин 0.06; D, L-гістидин 0.3; D, L-ізолейцин 0.44; L-лейцин 0.8; L-лізин 0.85; D, L-метіонін 0.37; D , L-фенілаланін 0.26; L-пролін 0.05; D, L-серин 0.61; D, L-треонін 0.5; L-тирозин 0.2; D, L-триптофан 0.5, D, L-валін 1.0); нуклеотиди (аденозин-5 -монофосфат 0.1; уридин-5 монофосфат 0.1); солі (NaCl 250; MgSO 4 x 7H 2 O 20; KСl 2; NH 4 Cl 0.5; KNO 3 0.1; KH 2 PO 4 0.05; K 2 HPO 4 0.05; цитрат натрію 0.5; MnSO 4 x H 2 O 3 x 10 -4; CaCl 2 x 6H 2 O 0.065; ZnSO 4 x 7H 2 O 4 x10 -5; FeSO 4 x 7H 2 O 5 x 10 -4; CuSO 4 x 5H 2 O 5 x 10 -5), гліцерин 1.0; ростові фактори (біотин 0.1 x 10 -3; фолієва кислота 10 x10 -3; вітамін В 12 0.02 x 10 -3).
Для виділення фракції пурпурних мембран клітини, отримані після відділення культуральної рідини та дворазовою промивання дистильованою водою (100-150 мг), суспендованих у 100 мл 0.1 М буфера трис-HCl (рН 7.6), додавали 1 мг дезоксирибонуклеази I і инкубировали протягом 5 - 6 год при 37 0 С, потім розбавляли дистильованою водою до 200 мл і инкубировали 15 год при 4 0 С. Осад промивали дистильованою водою з наступним відділенням водяній фракції до отримання безбарвних промивних вод. Чистоту отриманої суспензії пурпурних мембран (Н 2 О) контролювали на спектрофотометрі Beckman DU-6 (США) за співвідношенням смуг поглинання 280/568 нм (e 280 1.1 x 5 жовтня М -1 см -1 [37] і e 568 6.3 x 10 4 м -1 см -1 [38]).
Бактеріородопсин виділяли за методом [39], солюбілізіруя препарати пурпурних мембран (50 мг) в 2 мл 0.5% розчину SDS в Н 2 О і облягаючи продукт 5-кратним надлишком метанолу на холоду (0 0 С). Вихід бактериородопсина склав 17-20 мг.
            Електрофорез препаратів бактериородопсина проводили у 12.5% ​​ПААГ з 0.1% SDS. Зразки для електрофорезу готували стандартним способом (протокол фірми LKB, Швеція). Для кількісного визначення вмісту синтезованого в клітці білка проводили сканування прокрашенний в розчині Кумассі-блакитний R-250 електрофоретичного гелю на лазерному денситометрі CDS-200 (Beckman, США).
Ліпіди і пігменти екстрагували сумішшю хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) за методом Блай і Дайера [40].
Гідроліз білка проводили 6 М 2 НСl (3% фенолу в 2 Н 2 О) або   2 М Ва (ОН) 2 (110 0 С, 24 год) [41].
N-Dns-амінокислоти. До 4-5 мг ліофілізованих препаратів культуральної рідини і білкових гідролізатів в 1 мл 2 М NaHCO 3 рН 9-10 порціями при перемішуванні додавали 25.6 мг дансілхлоріда в 2 мл ацетону. Реакційну суміш витримували 1 год при перемішуванні при 40 0 С, потім підкисляють 2 М HСl до рН 3.0 і екстрагували етилацетатом (3 x 5 мл). Об'єднаний екстракт промивали водою до значення рН 7.0, сушили безводним сульфатом натрію, розчинник видаляли при 10 мм. рт. ст.
Метилові ефіри N-Dns-амінокислот. Для отримання діазометана до 20 мл 40% КОН у 40 мл діетилового ефіру додавали 3 г вологою нітрозометілмочевіни і перемішували на водяній бані з льодом протягом 15-20 хв. Після закінчення інтенсивного газовиділення ефірний шар відокремлювали, промивали крижаною водою до рН 7.0, сушили безводним сульфатом натрію і використовували для обробки препаратів N-дансіламінокіслот у складі культуральної рідини або гідролізатів сумарних білків біомаси.
N - Cbz-амінокислоти. До 1.5 мл охолодженого до 0 0 С розчину культуральної рідини (50 мг) або білкових гідролізатів (4-5 мг) в 4 М NaOH додавали порціями при перемішуванні 2 мл 4 М NaOH і 28.5 мг бензілоксікарбонілхлоріда. Реакційну суміш витримували при 0 0 С, перемішували 3 год, підкисляють 2 М HCl до рН 3 та продукти екстрагували етилацетатом (3 x 5 мл). Об'єднаний екстракт промивали водою до рН 7.0, сушили безводним сульфатом натрію, розчинник видаляли при 10 мм. рт. ст.
ТШХ похідних амінокислот здійснювали на платівках Silufol UV-254 (Чехо-Словаччина) у системах розчинників: хлороформ-метанол-оцтова кислота, 10:1:0,3 (А) для N-Cbz-амінокислот і хлороформ-метанол-ацетон, 7 : 1:1 (Б) для метилових ефірів N-Dns-амінокислот.
N-Cbz-амінокислоти детектувала з поглинання при 254 нм. Метилові ефіри N-Dns-амінокислот детектувала по флуоресценції в УФ-світлі.
Аналітичне та препаративної розділення суміші N-Cbz-амінокислот культуральної рідини і білкових гідролізатів здійснювали методом обернено-фазової ВЕРХ [31].
Метилові ефіри N-Dns-амінокислот поділяли методом обернено-фазової ВЕРХ на рідинному хроматографі Knauer (ФРН), обладнаним насосом Knauer, УФ-детектором 2563 та інтегратором С-R 3A (Shimadzu, Японія). Використовували нерухому фазу: Separon SGX C 18; 18.7 мкм, 150 x 3.3 мм (Kova, Чехо-Словаччина); система розчинників: (А) - ацетонітрил-трифторуксусной кислота, (20:80 об / об) і (В) - ацетонітрил . Використовували градієнтне елюювання: від 0 до 20% У 5 мін, 20 до 100% У 30 хв, 100% У 5 хв, від 100 до 0% У 2 хв, 0%, в 10 хв.
Іонообмінних хроматографію білкових гідролізатів здійснювали на приладі Biotronic LC 5001 (ФРН); 230   x 3,2 мм; робочий тиск 50-60 атм; швидкість подачі натрій-цитратного буфера 18,5; нингидрина - 9,25 мл / год; детекція при 570 і 440 нм (для проліну).
Секретується L-фенілаланін і L-лейцин визначали на приладі Beckman DU-6 (США) при 540 нм, у зразках культуральної рідини, об'ємом 10 мкл після її обробки нінгідрином.
Мас-спектри електронного удару похідних амінокислот знімали на приладі MB-80 A (Hitachi, Японія) при ионизирующем напрузі 70 еВ.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ.
1. Beaufrere B., Fournier V., Salle B., Putet G. / / American Journal of Physiology. 1992. V. 263. №. 1. P. 214-220.
2. McIntosh LP, Dahlquist FW / / Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. P. 1-38.
3. Young VR, Tu YM, Krempf M. / / New techniques in nutritional research / Ed. Whitehead RG New York. Academic Press. 1990. V. 9. P. 17-72.
4. Fesic SW & Zuiderweg ER / / Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. № 2. P. 97-131.
5. Haris PI, Robillard GT, Vandijk AA, Chapman D. / / Biochemistry. 1992. V. 31. № 27. P. 6279-6284.
6. Rothschild KJ, Braiman MS, Yi-Wu He., Marti T. and Khorana HG / / J. of Biological Chemistry. 1990. V. 121. P. 16985-16990.
7. Raap J., Winkel C., de Wit AHM, van Houten AHH, Hoff AJ, Lugtenburg J. / / Anal. Biochem. 1990. V. 191. P. 9-18.
8. Stockman B. J., Reily MD, Westler WM, Ulrich EL, Markley JL / / Biochemistry. 1989. V. 28. P. 230-236.
9. Ellman JA, Volkman BF, Mendel D. / / J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 7959-7961.
10. Redfield C. , Dobson CM / / Biochemistry. 1988. V. 27. P. 122-136.
11. Zuiderweg ERP, McIntosh LP, Dahlquist FW, Fesik SW / / J. Magn. Reson. 1986. V. 2. P. 210-216.
12. Hruby VJ / / J. Synth. and Appl. Isot. Labelled Compounds. 1985. V. 4. P. 287-292.
13. Berger A., Smolarsky M., Kurn N., Bosshard HR / / J. Org Chem. 1973. V. 38. P. 457-460.
14. Raap J., Wolthuis WNE, Hehenkamp JJJ, Lugtenburg J. / / Amino Acids. 1995. V. 8. P. 171-186.
15. Lugwig SN, Unkefer CJ / / J. Labelled Compd. Radiopharm. 1992. V. 31. P. 95-102.
16. Van der Berg EMM, van Liemt JH, Willem BS / / Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. 1989. V. 108. № 9. P. 304-313.
17. McIntosh LP, Griffey RH, Muchmore DC, Nielson CP, Redfield AG, Dahlquist FW / / Proc. Natn. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 1244-1248.
18. Karnaukhova EN, Reshetova OS, Semenov SY, Skladnev DA, Tsygankov DY / / Amino Acids. 1994. V. 6. № 2. P. 165-176.  
19. Katz JJ, Crespi HL / / Pure Appl. Chem. 1972. V. 32. P. 221-250.
20. Patel GB, Sprott GD, Ekiel I. / / Applied and Environmental Microbiology. 1993. P. 1099-1103.
21. LeMaster DM, Cronan JE / / Journal of Biological Chemistry. 1982. V. 257. № 3. P. 1224-1230.
22. LeMaster DM / / Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. P. 133-174.
23. Мосін О. В., Карнаухова Є. Н., Пшеничникова О. Б., складні Д. А., Акімова О. Л. / / Біотехнологія. 1993. N. 9. С. 16-20.
24. Єгорова Т. А., Мосін О. В., Єрьомін С. В., Карнаухова Є. Н., Звонкова Є. Н., Швець В. І. / / Біотехнологія. 1993. N. 8. С. 45-50.
25. Мосін О. В., складні Д. А., Єгорова Т. А., Юркевич О. М., Швець В. І. / / Біотехнологія. 1996. № 3. С. 3-12.
26. Stoeckenius W., Bogomolni RA / / Annu. Rev. Biochem. 1982. V. 51. P. 587-616.
27. Первушин К. В., Арсеньєв А. С. / / Біоорганічна хімія. 1995. Т. 21. № 2. С. 83-111.
28. Steel JCH, Reynolds JA / / J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 1633-1638
29. Звонкова Є. Н., Зотчік Н. В., Філліпович Є. І., Митрофанова Т. К., Мягкова Г. І., Серебреннікова Г. А. / / Хімія біологічно активних природних сполук. М.: Хімія, 1970. С.65-68.
30. Cohen JS, Putter I. / / Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 222. P. 515-520.
31. Egorova TA, Eremin SV, Mitsner BI, Zvonkova EN, Shvets VI / / Journal of Chromatography B. 1995. V. 665. P. 53-62.
32. Daniely B. / / J. Org. mass spectrometry. 1989. V. 24. P. 225-229.
33. Фізер Л. Ф., Фізер М. / / Реагенти для органічного синтезу. М.: Світ, 1971. Т. 2. С. 92.
34. Griffiths DV, Feeney J., Roberts GC, Burgen AS / / Biochim. et Biophys. Acta. 1976. V. 446. P. 479-585.
35. Matthews HR, Kathleen S., Matthews K. and Stanley J. / / Biochim. et Biophys. Acta. 1977. V. 497. P. 1-13.
36. Miller JH / / Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1976. P. 393.
37. Oesterhelt D., Hess B. / / Eur. J. Biochem. 1973. V.37. № .1. P. 316-326.
38. Tokunada F., Ebrey T. / / Biochemistry. 1978. V.17. № .10. P. 1915-1922 ..
39. Oesterhelt D., Stoeckenius W. / / Methods Enzymol. 1974. V. 31. P. 660-668.
40. Bligh EG, Dyer WJ / / Can. J. Biochem. Physiol. 1959. V. 37. №. 8. P. 911-918.
41. Мосін О. В., Єгорова Т. А., Чеботаєв Д. В., складні Д. А., Юркевич О. М., Швець В. І. / / Біотехнологія. 1996. № 4. С. 27-32.
MASS-SPECTROMETRY EVALUATION OF 2 H AND 13 C ENRICHMENT LEVELS OF AMINO ACIDS, OBTAINED FROM BACTERIAL OBJECTS
OVMOSIN
MV Lomonosov State Academy of Fine Chemical Technology, Moscow, 117571
The high-sensitive method of electron impact mass-spectroscopy was employed for evaluation of 2 H and 13 C enrichment levels of secreted amino acids of methylotrophic bacteria Brevibacterium methylicum and Methylobacillus flagellatum, and amino acid resigues of total protein obtained from media contaning as a sourse of stable isotopes (2 H) methanol, (13 C) methanol and 2 H 2 O. The incorporation of L-[2,3,4,5,6 - 2 Н] phenylalanine, L-[3,5 - 2 Н] tyrosine and L-[2,4,5,6,7 - 2 Н] tryptopan in bacteriorhodopsin synthesised in membrane of halophilic bacterium Halobacterium halobium ET 1001 was also made. For mass-spectrometric analysis the multicomponential mixures of amino acids, derived from cultural media and protein hydrolysates after hydrolysis in 6 M 2 H З l (3% phenol) and 2 M Ва (OH) 2 were modified to N-benzyloxycarbonyl-derivatives of amino acids as well in methyl esters of N-dansyl-derivatives of amino acids which were divparative separated using a method of reverse-phase high column liquid chromatography (HCLP). [2 H] - and [13 C] amino acids obtained redivsented the mixures differing in quantities of isotopes incorporated into molecule. The levels of 2 H and 13 С enrichment of secreted amino acids and amino acid resigues of protein were found to vary from 10% to L-leucine/isoleucine up to 97.5% for L-alanine depending on concentration of labelled substrates.
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Стаття
119кб. | скачати


Схожі роботи:
Мас-спектрометричний оцінка рівня включення дейтерію та вуглецю-13 у молекули амінокислот бактеріальних
Схеми з`єднання гальванічних елементів Схема включення реостата Схема включення потенціометра
Оцінка рівня якості продукції
Оцінка рівня міжособистісних відносин
Оцінка рівня розвитку соціальної політики в РФ
Оцінка естетичного рівня автомобіля Volkswagen Polo
Оцінка рівня розвитку персоналу ТОВ Алькон М
Аналіз та оцінка рівня організації праці менеджменту
Оцінка рівня фінансового стану ВАТ ПОКрасноярскій завод комбайнів
© Усі права захищені
написати до нас