Кінетика дії ферментів

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

Кінетика дії ферментів
Кінетичні дослідження ферментативних реакцій необхідні не тільки для кількісного визначення ферментів і порівняння швидкостей їх функціонування, але, в ще більшому ступені, для розшифровки механізмів ферментативних реакцій. У цих цілях, перш за все, необхідно вміти коректно обчислювати кінетичні параметри ферментативних реакцій, оцінювати конкурентний або неконкурентний характер дії інгібіторів. Розглянемо основні рівняння, що описують ферментативну кінетику і способи обчислень. Основна увага буде приділена не строгості математичного виводу рівнянь, а правильного їх використання для отримання достовірних результатів.
При виведенні кінетичних рівнянь кількісно характеризують ферментативну активність, зазвичай роблять такі припущення.
1. Фермент і субстрат утворюють фермент-субстратної комплекс за рахунок сил фізичної природи. З цього комплексу надалі звільняються фермент і продукт. Таким чином, хімічною реакцією є тільки другий етап - розпад фермент-субстратного комплексу:

2. Концентрація субстрату зазвичай значно вища концентрації ферменту. Тому при розгляді початкових швидкостей реакції, коли

3. Константа дисоціації визначається співвідношенням:


концентрація продукту дуже низька, оборотністю другій стадії можна знехтувати. Отже, - const., А швидкість утворення продукту дорівнює:
Оскільки загальна концентрація ферменту дорівнює сумі концентрацій вільного ферменту і ферменту, пов'язаного в комплекс, то + або = -.

Підставляючи значення [Є] = [Е 0] - [ES] з (4), отримуємо:

З іншого боку, з рівняння слід:

У рівнянні вираження до +2 можна розглядати як максимальну швидкість, що досягається, коли концентрація фермент-субстратного комплексу чисельно дорівнює загальній концентрації ферменту. Отже:

Вираз є не що інше, як рівняння Міхаеліса-Ментен для ферментативної кінетики, а величина До га = K s представляє собою міру спорідненості ферменту до субстрату. Чисельно вона дорівнює такій концентрації субстрату, при якій початкова швидкість ферментативної реакції складає половину максимальної швидкості. Рівняння графічно виражається гіперболою.
Для практичного визначення кінетичних параметрів цей графік незручний, до того ж вимагає використання концентрацій субстрату, «насичують» фермент, що не завжди можна досягти лише при обмеженою розчинності субстрату. Тому зазвичай прагнуть перетворити рівняння Міхаеліса-Ментен в таку форму, щоб графічно воно зображувалося прямою лінією. Найчастіше для цього використовують метод Лайнуівера-Берка, представляючи рівняння Міхаеліса-Ментен у вигляді рівняння прямої лінії:


Останній вираз називають рівнянням Лайнуівера-Берка і для розрахунку кінетичних параметрів використовують графік, побудований в координатах: 1 / V проти 1 / S. У результаті виходить пряма, що відсікає на осі ординат відрізок, рівний 1 / V, а на продовженні осі абсцис відрізок, рівний - 1 / До га. Однак слід зазначити, що при використанні графіка Лайнуівера-Берка точки в області високих концентрацій субстрату розташовуються надто густо, а положення прямої лінії багато в чому залежить від точок в області низьких концентрацій субстрату, де визначення швидкості менш надійно. Крім того, реальні експериментальні дані не завжди адекватно апроксимуються у вигляді прямої лінії.

Тому запропоновано ще кілька прийомів для визначення кінетичних параметрів. Метод Еді-Хофсті також заснований на перетворенні рівняння Міхаеліса-Ментен. Помноживши обидві частини рівняння на і перетворивши, одержимо:

Графік цього рівняння в координатах V проти V / S являє собою пряму лінію, що відсікає на осях ординат і абсцис відрізки, рівні V max HV m> x / К го відповідно.
У деяких випадках для обчислення кінетичних параметрів зручніше використовувати метод Ейзенталя і Корніш-Боуден, заснований на перетвореному рівнянні Міхаеліса-Ментен:

У цьому випадку для кожного значення V і S будується пряма в координатах V і S. Точка перетину всіх цих прямих має координати: V max і К т.

Підпис:



Інгібування ферментів
Вивчення придушення активності ферментів служить одним із способів розшифровки механізму їх дії. Підходом до вирішення останнього завдання є вивчення специфічності дії ферментів. У свою чергу, це вимагає коректного вимірювання кінетичних параметрів у присутності досліджуваного аналога субстрату. Розглянемо способи визначення характеру взаємовідносин субстратів, їх аналогів та інгібіторів ферментативної активності шляхом обчислення ряду кінетичних параметрів.
При цьому, якщо константа дисоціації комплексу K s = K m дорівнює:


Інгібітори ферментів можна розділити на дві основні групи: оборотні та необоротні. Після видалення інгібітора першого типу активність ферменту відновлюється, у другому випадку інгібітор видалити не вдається або активність ферменту не відновлюється навіть після видалення інгібітору. Необоротне інгібування досягає максимуму, коли весь фермент пов'язаний з інгібітором. Оборотне інгібування досягає стану рівноваги, положення якого визначається константою інгібування, що характеризує спорідненість ферменту до інгібітору. Схема оборотного інгібування наведена нижче:
При конкурентному інгібуванні субстрат і інгібітор зв'язуються з одним і тим же активним центром ферменту. У присутності інгібітора знижується спорідненість ферменту до субстрату. Величина не змінюється, тому що при «насичує» концентрації субстрат витісняє інгібітор з комплексу з ферментом.
При неконкурентном інгібуванні субстрат і інгібітор зв'язуються з різними центрами ферменту. При цьому величина До га не змінюється, а величина V max знижується.
Можливі також проміжні або альтернативні випадки, наприклад, коли інгібітор пов'язується не з ферментом, а з фермент-субстратною комплексом, як у випадку безконкурентного інгібування, при якому змінюються обидва кінетичних параметра.
Для визначення типу інгібування зазвичай використовують графік Лайнуівера-Берка, отриманий для даного субстрату за відсутності та в присутності інгібітору.
При конкурентному інгібуванні, якщо визначена величина К т в присутності інгібітора, можна розрахувати константу інгібування за такою формулою:

При неконкурентном інгібуванні за допомогою визначення зміненої величини V можна розрахувати К. за такою формулою:

Всі біохімічні процеси в клітині взаємопов'язані і взаємозалежні, проте частина з них переважно виконує функцію побудови клітинного матеріалу, а частина - постачання джерелами енергії цих «будівельних робіт». Тому прийнято розділяти біохімічні процеси на два основних типи: асиміляційні, звані анаболизмом, що включає синтез низькомолекулярних попередників і побудови з них молекул біополімерів, і Діссіміляціонний, звані катаболизмом, що складається в забезпечення джерела енергії, «енергетичного приводу», що приводить у рух анаболізм.
Розглянемо основні механізми процесів трансформації енергії в клітині, тобто механізми катаболічних процесів.
Шляхи та механізми перетворення енергії в живих системах
Головне завдання енергетичного метаболізму - акумуляція енергії, отриманої в результаті окисно-відновних перетворень субстратів в таку форму, яка може бути використана для росту клітин і здійснення всіх їх функцій.
Основними формами акумуляції енергії в клітинах є трансмембранний різниця електрохімічних потенціалів іонів, а також «макроергічні» хімічні сполуки.
У клітинах, як і в неживих системах, мимовільно протікають тільки ті хімічні процеси, які призводять до зменшення вільної енергії системи, тобто тієї частки загальної енергії, яка може бути перетворена в роботу. Такі реакції називають екзергоніческімі. Навпаки, якщо ДОО, то реакція не може протікати спонтанно, так як потребує притоку енергії.
Рівняння Гіббса описує взаємозв'язок між вільною енергією, ентальпією і ентропією.
Коротко розглянемо основні рівняння хімічної термодинаміки.

де ДН - зміна ентальпії; AS - зміна ентропії.
При реакціях в розчинах зміна вільної енергії визначається рівнянням:

де R - газова стала, Т - абсолютна температура;
- Константа рівноваги хімічної реакції.
При стандартних умовах кожна хімічна реакція характеризується вільною енергією, що обчислюється за формулою:
AG ° = -2,303 RT lgK або AG = -1,363 lgK eq ккал / моль -1 при 25C.
При окисно-відновних реакціях зміна вільної енергії визначається рівнянням:

де п - кількість перенесених електронів:
F - число Фарадея: заряд одного моля електронів; Е «'- стандартний окисно-відновний потенціал для окислювача і відновника, В.
Ці рівняння зручно застосовувати при розрахунках. Наприклад, можна підрахувати, скільки енергії виділяється в результаті дихання;

Таким чином, AG = 2 • 23062 кал • моль - 1 - В-[0,815 - (-0,32)] В = 52351 кал / моль.

Класифікація енергетичних процесів
Енергетичні процеси в нефототрофних організмах поділяються на аеробні та анаеробні в залежності від участі або не участі в них молекулярного кисню.
Аеробне дихання - енергетичний процес, при якому кінцевим акцептором електронів окислюваного субстрату, що передаються за електрон-транспортного ланцюга, є молекулярний кисень.
У анаеробному диханні кінцевими акцепторами електронів стають інші окислювачі: нітрат-, сульфат-аніони, катіони металів, органічні речовини.
Бродіння - енергетичний процес, при якому електрони передаються безпосередньо від донора до акцептору без участі електрон-транспортного ланцюга: гліколіз, молочнокисле бродіння і ін
Перераховані процеси можна класифікувати на основі механізму утворення АТР, що є основним макроер-ня з'єднанням, запасають енергію в своїх хімічних зв'язках. Розрізняють освіта АТР в результаті переносу електронів по дихальному ланцюгу - окислювальне фосфорилювання, а також утворення АТР у процесах, не пов'язаних з перенесенням електронів по ланцюгу - субстратних фосфорилювання. В даний час перший тип процесів правильніше називати утворенням АТР за рахунок трансформації енергії трансмембранного електрохімічного потенціалу або скорочено - мембранним фос-форілірованіем.
У фототрофних організмів основним способом запасання енергії є фо-тофосфорілірованіе, тобто освіта АТР за рахунок трансформації енергії ТЕП, формованого шляхом утилізації світлової енергії.

Роль АТР і ТЕП в запасі енергії
АТР був відкритий в 1929 р. К. Фіске та І. Суббароу, а в 1930 р. В. Енгельгард показав можливість його утворення в процесі переносу електронів по дихальному ланцюгу. У 1941 р. Ф. Ліпман висунув концепцію, яка розглядає АТР як «конвертовану енергетичну валюту».
Чому в процесі еволюції саме АТР випала така роль? Для цього є кілька причин, обумовлених властивостями даного з'єднання.

Якщо необхідна енергія ненабагато більша, ніж 10 ккал / моль - за реакцією Б. При необхідності енергії, значно перевищує 10 ккал / моль, використовується кілька молекул АТР в одному процесі. Іноді додаткова енергія виділяється при сорбції АТР на фермент.
1. Зміна вільної енергії при гідролізі фосфоангідрідних зв'язків досить велика - близько 10 ккал / моль. Коли необхідна енергія менша або дорівнює 10 ккал / моль, гідроліз йде по
2. Швидкість неферментативного гідролізу АТР мала, тобто молекула хімічно стабільна, і запасена у ній енергія не розсіюється у вигляді тепла при спонтанному гідролізі. Однак заміна Р на As різко підвищує лабільність. Цією обставиною пояснюється інгібуючий дію арсената на енергетичний метаболізм: конкуруючи з ортофосфатів, він включається замість нього в АТР, а утворене з'єднання підлягає спонтанному гідролізу.
3. Малі розміри молекули АТР дозволяють їй вільно проникати в різні ділянки клітини, в той же час цитоплазматична мембрана для неї непроникна, отже, «витік» АТР не відбувається.
4. «Вибір» АТР як нуклеотиду був викликаний, мабуть, необхідністю взаємодії з білками, так як взаємодія білків з моно-і полинуклеотидами лежить в основі життєдіяльності.
5. «Вибір» як пуриновий частини молекули аденозину, ймовірно, обумовлений його проміжними електроннодонорнимі і акцепторними властивостями, що забезпечує взаємодію з широким колом партнерів. Крім того, серед азотистих основ аденін найбільш стійкий до дії ультрафіолету, що могло мати значення на ранніх етапах формування живих систем.
При описі механізму утворення АТР шляхом мембранного фосфорилювання в даний час загальноприйнятою є хеміосмотічеськой теорія сполучення окислення і фосфорилювання, запропонована П. Мітчеллом в 1961 р. Відповідно до цієї теорії в «сполучають» мембранах локалізовані два типи систем, здатних до транслокації протонів: електрон-транспортна ланцюг і Н +-АТРази, координована робота яких призводить до формування трансмембранної різниці електрохімічного потенціалу протонів, - а потім АТР. Таким чином, первинною формою запасання енергії при диханні є ТЕП.
Кількість енергії, запасеної у формі ТЕП, прямо пропорційно кількості транслоцірованних протонів: AG - ПДЦ н + і складається з двох складових: хімічної і електричної:



де 2,3 RT / F = Z = 59 мВ при 25 ° С;
Др - протондвіжущая сила.
Для утворення АТР необхідна AG близько 250 мВ. Приблизно така величина ТЕП і створюється на мембранах мітохондрій та прокаріотичних клітин, хоча внесок кожної зі складових різний. Наприклад, у ацидофільних бактерій ТЕП практично повністю складається з ЛРН, а у алкалофілов - з Л <р.
Важливо відзначити, що АТРазною комплекс може не тільки утилізувати ТЕП з утворенням АТР, а й формувати його за рахунок гідролізу АТР, здійснюючи таким чином взаємне перетворення цих двох форм енергії.
Первинні та вторинні генератори ТЕП
Первинні генератори використовують енергію світла або хімічних зв'язків субстратів для формування ТЕП. АТР в цих процесах не бере участь. До первинних генераторам ТЕП відносяться:
дихальна ланцюг, що містить від 1 до 3 протонних насосів;
фотосинтетична ланцюг, що містить 1-2 протонних насоса;
бактеріродопсін галофільних архей;
системи екскреції кислих продуктів бродіння у бактерій в неіонізованій формі.
Вторинні генератори використовують енергію АТР для формування ТЕП. Вони являють собою Н +-АТФази, основною функцією яких є не синтез, а гідроліз АТР. Такі АТРази характерні для цитоплазматичної мембрани анаеробних бактерій, плазми-малемми клітин еукаріот, мембрани вакуолей рослин і грибів.
Таким чином, основні шляхи трансформації енергії в клітині можна підсумувати у вигляді схеми.

Енергетичний заряд і енергетична ефективність росту
Кількість АТР, що утворюється в різних метаболічних шляхах, розрізняється в багато разів. Так, при катаболізмі глюкози по гликолитическому шляху з подальшим включенням циклу трикарбонових кислот і дихання утворюється 38 міль АТР на моль глюкози.
У деяких бактерій в дихальному ланцюзі існує лише два пункти сполучення і кількість утвореного АТР складе 26 моль на моль глюкози. Сам по собі гліколіз в анаеробних умовах призводить до утворення лише 2 молей АТР на моль глюкози.
Не тільки загальна кількість синтезованого АТР, але і витрата АТР на освіту одиниці біомаси сильно залежить від типу метаболізму. Так, наприклад, при вирощуванні бактерій на середовищі з глюкозою 1 моль АТР забезпечує утворення 1927 біомаси, тоді як на середовищі з С0 2 1 моль АТР - тільки 5 г біомаси. При різних типах анаеробних бродінь вихід біомаси на міль синтезованого АТР все-таки досить постійний і складає близько 10. Цей показник отримав позначення Y ATp і використовується для характеристики росту поряд з економічним коефіцієнтом.
Певна частина клітинної енергії витрачається на процеси, не пов'язані безпосередньо з ростом. Їх називають процесами підтримки життєдіяльності. Витрати на підтримку життєдіяльності складають 10-20% всіх енергетичних витрат.
Важливе значення має не тільки абсолютну кількість АТР у клітині, але і співвідношення компонентів аденілатного системи, так як АТР, ADP і AMP є потужними регуляторами метаболічних процесів.

Д. Аткінсон ввів поняття енергетичного заряду, як заходи «заповнення» аденілатного системи макроергів.
Теоретично ЕЗ може варіювати від 0 до 1, проте реально в експоненціально зростаючих клітинах він становить 0,8-0,9, а при зниженні його величини до 0,5 клітина гине.

Основні типи сполучення енергетичних і конструктивних процесів
Спочатку біологи підрозділяли всі живі організми за типом харчування на дві групи: автотрофів і гетеротрофів.
В даний час застосовується більш детальна класифікація, заснована на вказівці природи джерела енергії і природи джерела вуглецю.
Таким чином, рослини слід віднести до фото-літо-автотрофів, а тварин - до хемооргана - гетеротрофам. Всього ж при поєднанні цих характеристик можливі вісім основних типів співвідношень між енергетичними та конструктивними процесами.
Деякі організми здатні здійснювати тільки одні з перерахованих типів харчування, тоді як інші можуть переключатися з одного типу харчування на інший. Останні організми називають факультативними.
Таблиця 1. Основні типи живлення
Джерело енергії
Донор електронів
Джерело вуглецю
Тип харчування
Організми-представники
Неорганічні речовини
С0 2
Хемолітоавтотрофами
Прокаріоти
Хімічні
Органіч. речовини
Хемолітогетеротрофія
Прокаріоти
реакції
Органічні речовини
С0 2
Хеморганоавто-трофі
Прокаріоти
Органіч. речовини
Хемоорганоге-теротрофія
Тварини і багато прокаріоти
Джерело енергії
Донор електронів
Джерело вуглецю
Тип харчування
Організми-представники
Неорганічні речовини
з 2
Фотолітоавтотрофія
Рослини, ціанобакте-рії, пурпурні і зелені бактерії
Світло
Органіч. речовини
Фотолітогетеротрофія
Прокаріоти
Органічні речовини
з 2
Фотоорганоавтотрофія
Прокаріоти
Органіч. речовини
Фотоорганогетеротрофія
Прокаріоти
Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Контрольна робота
52.5кб. | скачати


Схожі роботи:
Застосування ферментів у медицині
Способи отримання ферментів
РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ
Властивості ферментів як біологічних каталізаторів
Фізіологічне значення цитоплазми ферментів і фотосинтезу
Склад і особливості ферментів ензимів молока
Активність ферментів енергетичного обміну ембріональних трансплантатів
Рівень речовини Р і активність ферментів обміну регуляторних пепто
Вплив попередника лей енкефаліну на активність ферментів обм
© Усі права захищені
написати до нас