Креатинфосфокиназа

, является лимитирующей. де стадія, що характеризується константою k, є лімітуючою.

Для чотирьох рівноважних реакцій

Е + А «ЕА, (2)

Е + В «ЕВ, (3)

ЕА + В «ЕАВ, (4)

ЕВ + А «ЕАВ, (5)

отримуємо чотири рівняння

(E - x _a - x _b - x) a = K _{S ^A} x _a, (6)

(E - x _a - x _b - x) b = K _{S ^B} x _b, (7)

= K _M ^B x , (8) x _a b = K _M ^B x, (8)

= K _M ^A x , (9) x _b a = K _M ^A x, (9)

, x , x _a , x _b – концентрации соответственно А, В, ЕАВ, ЕА и ЕВ; K _S ^A , K _S ^B , K _M ^A , K _M ^B – константы диссоциации четырех равновесных реакций. де а, b, x, x _a, x _b - концентрації відповідно А, В, ЕАВ, ЕА і ЕВ; K _S ^A, K _S ^B, K _M ^A, K _M ^B - константи дисоціації чотирьох рівноважних реакцій. Швидкість сумарної реакції пропорційна концентрації ЕАВ. Таким чином,

= kx . V = kx. (10)

Виключаючи х з наведених вище рівнянь, отримуємо:

Це рівняння містить лише три з чотирьох констант рівноваги. Четверта виявляється «зайвою», так як вона пов'язана з трьома іншими константами співвідношенням

= K _M ^A K _S ^B (12) K _S ^A K _M ^B = K _M ^A K _S ^B (12)

Можна показати, що член ke дорівнює максимальній швидкості. При виводі рівняння (11) не було зроблено припущення про вплив, який можуть мати взаємодія ферменту з одним із субстратів на взаємодію з іншим.

= K _M ^A и K _S ^B = K _M ^B ; уравнение (11) при этом упрощается до Якщо кожен субстрат взаємодіє тільки зі своєю ділянкою зв'язування і не впливає на спорідненість ферменту до іншого субстрату, то K _S ^A = K _M ^A і K _S ^B = K _M ^B; рівняння (11) при цьому спрощується до

Таким чином, обидві константи Міхаеліса можна визначити просто шляхом зміни концентрації одного з субстратів при постійній концентрації іншого. (Діксон М., Уебб Е., Ферменти, Т. 1, М., 1982, с. 134, 135).

Перенесення енергії з мітохондрій у цитоплазму клітини міокарда за допомогою ізоферментів КФК

Останнім часом з'явилися дані, що доводять, що креатинфосфат в м'язовій тканині (зокрема, у серцевому м'язі) здатний виконувати не тільки роль депо легкомобілізуемих макроергічних фосфатних груп, але також роль транспортної форми макроергічних фосфатних зв'язків, що утворюються в процесі тканинного дихання і пов'язаного з ним окисного фосфорилювання. Запропонована схема перенесення енергії з мітохондрій у цитоплазму клітини міокарда (рис. 20.7).

²⁺ ) при наличии в среде креатина образуется равновесный тройной фермент-субстратный комплекс креатин–креатинкиназа–АТФ- Mg ²⁺ , который затем распадается на креатинфосфат и АДФ Mg ²⁺ . АТФ, синтезований у матриксі мітохондрій, переноситься через внутрішню мембрану за участю специфічної АТФ-АДФ-транслокази на активний центр мітохондріального ізоферменту креатинкінази, який розташований на зовнішній стороні внутрішньої мембрани; в міжмембранну просторі (у присутності іонів Mg ^{2 +)} при наявності в середовищі креатину утворюється рівноважний потрійний фермент-субстратної комплекс креатин-креатинкінази-АТФ-Mg ^{2 +,} який потім розпадається на креатинфосфат і АДФ Mg ^{2 +.} Креатинфосфат дифундує в цитоплазму, де використовується в міофібріллярного креатінкіназной реакції для рефосфорілірованія АДФ, що утворився при скороченні. Висловлюються припущення, що не тільки в серцевому м'язі, але і в скелетних м'язах є подібний шлях транспорту енергії з мітохондрій в міофібрили. (Березів Т. Т., Коровкін Б. Ф., Біологічна хімія, М., 1998, с. 580, 654, 655). Ізоферменти КФК виявлені у всіх субклітинних структурах, які продукують або використовують енергію, - в мітохондріальній мембрані, міофібрил, мембрані саркоплазматичного ретикулуму (СПР), плазматичної клітинної мембрани і ін (Фролькіс Р. А., Воронков Г. С., Дубур Г. Я ., Ціомік В. А., Гомон І. В. - Деякі аспекти вивчення активності креатинфосфокінази в мембранах саркоплазматичного ретикулума міокарда в умовах експериментальної коронарної недостатності / / Бюлетень експериментальної біології і медицини, М., 1983, № 5, с. 53).

Активність КФК в мембранах саркоплазматичного ретикулума міокарда в умовах експериментальної коронарної недостатності

Ізоферменти КФК знаходяться в тісному функціональному сполученні з іншими ферментами, що забезпечують перенесення речовин та іонів через мембрани. -зависимой, Са-зависимой и Na , К-зависимой АТФ-азой. Так, в мітохондріях КФК функціонує в тісному поєднанні з АТФ-АДФ-транслоказой, в міофібрили, мембрані СПР і антисарколемальних - відповідно з Mg-залежної, Са-залежної і Na, К-залежної АТФ-Азою.

Важливість вивчення ролі мембранних утворень у процесах транспорту та утилізації енергії клітинами міокарда набуває особливого значення в умовах його ішемії, при якій спостерігаються істотні зміни у структурі та властивостях білково-ліпідного шару мембран і перш за все в їх фосфоліпідного складу. Остання обставина особливо важливо у зв'язку з наявними в літературі відомості про те, що деякі ізоферменти КФК, швидше за все, зв'язуються з мембраною за допомогою саме фосфоліпідів.

У лабораторії біохімії Українського НДІ кардіології ім. М. Д. Стражеска (Київ) і в лабораторії мембраноактівних сполук b-дикетонів Інституту органічного синтезу АН Латвійської РСР (Рига) вивчали активність мітохондріального ізоферменту КФК при дозованому обмеження коронарного кровотоку, а також питання про енергозабезпечення транспорту Са ^{2 +} через мембрани СПР клітин міокарда і зв'язки цього процесу з деякими іншими показниками, що визначають функціональний стан мембранного апарату СПР.

-156 Na . Досліди проводили на кроликах в умовах гострого обмеження коронарного кровотоку (внутрішньовенне введення вазопресину в дозі 0,5 од / кг), а також на тлі попереднього введення (за 1 год до вазопресину) тваринам антиоксидантного препарату AV -156 Na. У мембранах СПР визначали активність КФК, деякі показники перекисного окислення ліпідів, а також вміст фосфоліпідів.

Результати проведеного дослідження (таблиця № 2) свідчать про виражений вплив експериментальної ішемії на всі досліджувані ланки метаболізму міокарда. Так, активність ізоферменту КФК, пов'язаного з мембраною СПР, знижується при вазопрессіновой коронарної недостатності більш ніж на 25%.

Таблиця № 2. Активність КФК, вміст фосфоліпідів у мебранах СПР міокарда кроликів при експериментальній ішемії

Умови дослідів	КФК, мкмоль креатиніну на 1мг білка за 1ч	Фосфоліпіди, мкмоль Р на 1 мг білка
Контроль	11,90 ± 0,36	0,37 ± 0,01
Вазопресин Вазопресин на тлі антиоксиданту	8,22 ± 0,10 10,28 ± 0,70	0,22 ± 0,01 0,42 ± 0,01

Зрушення, виявлені з боку активності КФК, тісно пов'язані зі структурними змінами в мембранах СПР, перш за все їх ліпідного складу. Так, в умовах коронарної недостатності спостерігається деяке зниження вмісту мембранозв'язаних холестерину, а також різке падіння рівня фосфоліпідів (на 40%),

-156 Na наблюдалось однонаправленное изменение изучаемых показателей в сторону их нормализации. При введенні антиоксидантного препарату AV -156 Na спостерігалося односпрямоване зміна досліджуваних показників у бік їх нормалізації. Цей ефект вказує на те, що рівень протікання перекисних реакцій у міокарді багато в чому визначає характер зміни окремих метаболічних процесів в мембранах.

Виявлене зниження активності КФК мембран СПР в умовах експериментальної ішемії може свідчити про певний порушенні нормального постачання енергією транспортної Са-АТФ-ази мембран СПР. При цьому зміна активності КФК відбувається на тлі значного зниження в мембранах СПР серця кроликів рівня фосфоліпідів. Можливо, ізофермент КФК. Пов'язаний з мембраною СПР, є ліпідзавісімим ферментом і для прояву повної його активності збереження нормальної ліпідної структури мембран - важлива і необхідна умова. (Фролькіс Р. А., Воронков Г. С., Дубур Г. Я., Ціомік В. А., Гомон І. В. - Деякі аспекти вивчення активності креатинфосфокінази в мембранах саркоплазматичного ретикулума міокарда в умовах експериментальної коронарної недостатності / / Бюлетень експериментальної біології і медицини, М., 1983, № 5, с. 53, 54).

Вплив алкогольної інтоксикації і процесів старіння на активність креатинфосфокінази та її ізоферментів

У відділі фармакології Інституту експериментальної медицини АМН СРСР (Ленінград) проводили досліди з виявлення вікових змін активності КФК в сироватці крові інтактних тварин у віці 4 і 24 місяців, а також вивчали вплив гострої алкогольної інтоксикації на активність КФК та її ізоферментів в тканинах і біологічних рідинах щурів 2 груп: 1) тварини у віці 4 місяців, яким за 3 години до початку експерименту внутрішньочеревно вводили 25% розчин етанолу в дозі 3 та 5 г / кг; 2) контроль - щури, яким вводили відповідні обсяги фізіологічного розчину. Перед декапітація у цих тварин під легким ефірним наркозом брали ліквор. У екстракт головного мозку, отриманому з кори великих півкуль, лікворі та сироватці крові визначали активність КФК та її ізоферментний профіль. Загальну активність ферменту визначали колориметричним методом. Ізоферменти поділяли за допомогою хроматографії на колонці на сефадексе ДЕАЕ А50. Кількість білка визначали мікробіуретовим методом. Статичну обробку проводили за Стьюдента.

Аналізуючи дані про загальну активності КФК в сироватці крові щурів з гострою алкогольною інтоксикацією, а також у інтактних щурів різного віку, можна зробити висновок про те, що інтактні тварини віком 4-5 місяців за активністю КФК та її ізоферментному спектру різко відрізняються від інтактних щурів у віці 24 місяців (таблиця № 3).

Таблиця № 3.Общая активність КФК в сироватці крові щурів різного віку і щурів з гострою алкогольною інтоксикацією

Спостережуваний факт вікового зниження загальної активності КФК у крові, можливо, є наслідком зміни рівня загального метаболізму, уповільнення процесів оновлення тканин, зменшення рухової активності і т. д.

При введенні етанолу в дозі 3 г / кг, загальна активність в крові різко збільшується за рахунок зростання активності всіх трьох форм ферменту. Поряд з цим спостерігається різка зміна процентного вмісту ізоферментів (рис. 1).

Ізоферментний спектр КФК в сироватці крові щурів різного віку і щурів з гострою алкогольною інтоксикацією

Рис. 1. По осі абсцис - ізоферментних профілі різних груп щурів. А - інтактні щури у віці 4 міс., Б - інтактні щури у віці 24 міс., В - інтактні щури у віці 4 міс. + Гостра алкогольна інтоксикація. 1 - ММ-ізофермент КФК, 2 - МВ-КФК ізофермент, 3 - ВВ-ізофермент КФК. По осі ординат - вміст ізоферментів КФК в крові (у%).

Ці дані свідчать про те, що етанол викликає структурні пошкодження мембран клітин на рівні всього організму, мозок і міокард страждають при цьому більше всього, так як абсолютний приріст активності для МВ-і ВВ-ізоферментів найбільший. (В 4 і 10 разів відповідно), в той час як активність ММ-КФК збільшується всього в 1,4 рази. Можна припустити, що джерелом сироваткової активності ВВ-КФК є тканину мозку. Для перевірки цього припущення була вивчена динаміка активності КФК в системі мозок - ліквор - кров (таблиця № 4).

Таблиця № 4. =12) Активність КФК в головному мозку, лікворі та сироватці крові щурів при гострої алкогольної інтоксикації (n = 12)

Активність КФК при введенні етанолу щурам, знижується в мозку, а в лікворі та крові збільшується, причому дані вимірювання носять дозозалежний характер. Це дозволяє говорити про те, що під дією гострої алкогольної інтоксикації порушується проникність гематоенцефалічного бар'єру і клітин кори головного мозку, в результаті чого стає можливою витік глобулярного білка КФК з цитоплазми клітин в ліквор, а потім в кров, що й може призводити до зміни змісту ВВ -ізоферменту в крові. (Чуваев І. В. - Характеристика ізоферментного спектру креатинкінази у сироватці крові щурів при старінні і гострої алкогольної інтоксикації / / Бюлетень експериментальної біології і медицини, М., 1993, № 12, с. 390, 391).

Висновок

Креатинфосфокиназа - ключовий фермент біосинтезу макроергічних субстрату - креатинфосфату, що грає разом з АТФ видатну роль в біоенергетиці серцевого м'яза і всього організму.

Визначення активності креатинкінази служить цінним діагностичним тестом при інфаркті міокарда та інших патологіях. На підставі послідовних вимірювань активності креатинкінази у сироватці крові можна судити про ступінь некротичного процесу в міокарді і оцінити ефективність проведеної терапії.

Але не всі аспекти функцій креатинфосфокінази вивчені. Важлива інформація може бути отримана при вивченні креатінкіназной системи в мозку, КФК цитоплазми і мітохондрій якого представлена ​​іншими, ніж у м'язах, ізоформами, а також у м'язових клітинах різних видів тварин, що стоять на різних щаблях еволюції; при різних патологічних станах.

Список літератури

1. Березів Т. Т., Коровкін Б. Ф. Біологічна хімія, М., 1998.

2. Діксон М., Уебб Е. Ферменти, Т. 1, М., 1982.

3. Кнооре Д. Г. Біологічна хімія, М., 2000.

4. Ленінджер А., Біохімія, М., 1976.

5. Липська Т. Ю. Фізіологічна роль креатінкіназной системи: еволюція уявлень, М., 2001.

6. Маррі Р., Біохімія людини, Т. 2, М., 1993.

7. Фролькіс Р. А., Воронков Г. С., Дубур Г. Я., Ціомік В. А., Гомон І. В. Деякі аспекти вивчення активності креатинфосфокінази в мембранах саркоплазматичного ретикулума міокарда в умовах експериментальної коронарної недостатності / / Бюлетень експериментальної біології і медицини № 5, М., 1983.

8. Чуваєв І. В. Характеристика ізоферментного спектру креатинкінази у сироватці крові щурів при старінні і гострої алкогольної інтоксикації / / Бюлетень експериментальної біології і медицини № 4, М., 1991.