Федеральне агентство з освіти
Пензенський державний педагогічний університет
ім. В. Г. Бєлінського
Факультет Кафедра
Природно-географічний біохімії
Дипломна робота
Кометаболізм ЕДТА і глюкози у бактеріального штаму LPM-4
Студент __________________________________________ Юдіна Є. І.
підпис
Керівники ___________________________________ Сметанін В. А.
підпис
__________________________________ Дедюхіна Е.Г.
підпис
До захисту допустити. Протокол № від «_» 200 г
Зав. кафедрою ______________________________________ Генгін М.Т.
підпис
Пенза, 2007 р
Зміст
Введення ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .4
Глава 1. Огляд літератури ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ... .. 6
1.1. Хелатуючим з'єднання ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... .. 6
1.1.1. Властивості, будова і комплексоутворення ЕДТА ... ... ... .... ... ... ... .61.2. Бактеріальна деградація ЕДТА ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .7
1.2.1 Бактерії, що руйнують ЕДТА ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 10
1.2.2. Характеристика штаму LPM-4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 12
1.3. Поняття про кометаболізме ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 14
1.4. Періодичне культивування ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 20
1.5. Періодичне культивування з підживленням ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .23
Глава 2. Матеріали та методи ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .25
2.1. Умови культивування ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .25
2.2. Методика приготування поживних середовищ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .26
2.3. Методи аналізу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ... ... .28
2.3.1 Обчислення енергетичного виходу росту штаму LPM-4 ... ... ... ... .. 29
2.3.2. Обчислення питомої швидкості росту штаму LPM-4 ... ... ... ... ... ... .. 32
Глава 3. Результати та їх обговорення ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 33
3.1. Дослідження впливу ступеня деградації ЕДТА на асиміляцію глюкози бактеріальним штамом LPM-4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 33
3.1.1. Динаміка зростання і споживання глюкози і ЕДТА ... ... ... ... ... ... ... ... .33
3.1.2. Динаміка накопичення біомаси і питома швидкість росту штаму LPM-4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .39
3.1.3. Накопичення амонію в процесі росту штаму LPM-4 ... ... ... ... ... ... .42
3.1.4. Показники росту штаму LPM-4 при кометаболізме ЕДТА і глюкози ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 44
3.2. Дослідження здатності штаму LPM-4 до асиміляції ЕДТА і глюкози в процесі тривалого культивування з додаванням субстрату ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 46
3.2.1. Дослідження асиміляції ЕДТА штамом LPM-4 в процесі культивування з додаванням ЕДТА ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 47
3.2.2. Дослідження ЕДТА-індукованої асиміляції глюкози штамом LPM-4 в процесі тривалого культивування з додаванням глюкози .. 50
3.2.3. Дослідження здатності штаму LPM-4 до перемикання метаболізму від асиміляції глюкози до асиміляції ЕДТА ... ... ... ... ... .. 52
Висновок ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 60
Висновки ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 62
Література ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 63
Додаток ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 66Введення
Проблема очищення стічних вод, виробництво яких в Росії сягає
Моніторинг навколишнього середовища показує, що в ній відбувається постійне накопичення ЕДТА. У світі виробляється приблизно 100 000 тонн ЕДТА на рік [2-5]. Численні дослідження показали, що деградації ЕДТА в очисних спорудах не відбувається, а в природі існує лише один значущий спосіб деградації ЕДТА - розкладання комплексу Fe (III) EDTA під дією УФ променів, який відбувається лише на поверхні води [3]. Накопичення ЕДТА у воді призводить до погіршення якості питної води, так як ЕДТА сприяє переходу в розчинений стан іонів металів (у тому числі важких і токсичних). Велика частина цих комплексів проникає в грунтові води та водопостачання, погіршуючи якість питної води. Слід звернути увагу на те, що здоров'ю людини в першу чергу загрожують комплекси ЕДТА з токсичними металами, а не ЕДТА, як хімічна сполука.
До теперішнього часу було виділено лише кілька змішаних культур і всього три чисті культури ЕДТА-деградуючих бактерій:
Agrobacterium sp. ATCC 55002, грам-негативний ізолят BNC 1,
грам-негативні бактерії DSM 9103 і Pseudomonas sp. LPM-410.
У лабораторії фізіології мікроорганізмів ІБФМ РАН було виділено новий ЕДТА-руйнує бактеріальний штам LPM-4 із специфічною потребою в ЕДТА [6]. Даний штам є унікальним, тому що здатний рости тільки на середовищах, що містять ЕДТА. Відмінною особливістю даного штаму є те, що він здатний метаболізувати глюкозу тільки в присутності ЕДТА.
І метою цієї роботи було дослідження спільного метаболізму ЕДТА і глюкози у бактеріального штаму LPM-4.
Відповідно були поставлені наступні завдання:
1. Дослідження впливу ступеня деградації ЕДТА на асиміляцію глюкози бактеріальним штамом LPM-4;
2. Вивчення здатності клітин до деградації ЕДТА при додатковому внесенні ЕДТА в середу;
3. Дослідження ЕДТА-індукованої здатності клітин асимілювати глюкозу в процесі тривалого культивування з додаванням глюкози;
4. Вивчення здатності штаму LPM-4 до перемикання метаболізму від асиміляції глюкози до асиміляції ЕДТА в процесі тривалого культивування в присутності глюкози.
Глава 1. Огляд літератури
1.1. Хелатуючим з'єднання (комплексони)Термін "хелат" був запропонований Морганом для позначення циклічних структур, які утворюються в результаті приєднання катіонів до двох або більше донорним атомам, що належить одній молекулі комплексоутворюючої агента. Назва "хелат" походить від грецького слова, яке означає "клешня", звідси і ще одна назва цих сполук - "клешневідние". Основною властивістю комплексонів є здатність утворювати з більшістю іонів металів у водних розчинах комплексонати. Виходить це наступним чином: при введенні комплексона в розчин, що містить катіон металу, створюються умови для конкуренції між молекулами гідратної оболонки катіона і молекулами внесеного в розчин хелату, відбувається це через високу, у порівнянні з водою, донорної здатності лігандних груп, їх стеричних доступності, а також відповідного значення рН розчину. Конкурує з водою коплексообразующй агент, що задовольняє цим вимогам, при відповідних умовах здатний витіснити з координаційної сфери аквакомплексу воду з утворенням нового комплексної сполуки (МеY) [7]. Для ЕДТА подібний процес виглядає наступним чином:
Ме (Н 2 О) х п + + Y 4 - = MeY (n-4) + + xH 2 O
1.1.1 Властивості, будова і комплексоутворення етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА)
Етилендіамінтетраоцтової кислоти (С 10 Н 16 Про 8 N 2) - чотирьохосновним амінокарбоксільная кислота. Молекулярний вага 292,35. Білий кристалічний порошок. Добре розчинний у воді, утворює стійкі розчини. Розчинність ЕДТА мінімальна при рН 1,6-1,8, при зменшенні концентрації іонів водню в розчині вона росте і проходить через максимум при [H] = 2,5 г-іон / л.
Структурна формула ЕДТА і ідеалізована октаедричні комплексу метал - ЕДТА наведено на рис. 1.
Аніон ЕДТА 4 - містить 10 активних центрів, здатних здійснювати координацію ліганду іонами металів: 2 атоми азоту і 8 атомів кисню. У твердій фазі в якості донорних атомів можуть виступати всі 10 центрів. Однак, геометрія ліганда така, що з одним атомом металу він може утворювати не більше 6 зв'язків: 2 з атомами азоту і 4 з атомами кисню різних ацетатних фрагментів ЕДТА. При цьому утворюється 5 п'ятичленних металлоціклов: один етілендіаміни (Е-цикл) і чотири гліцинатних (Gly-цикли). Центральний Е-цикл і два Gly-циклу лежать приблизно в одній площині, званої "екваторіальній" площиною координаційної октаедра. Ці два Gly-циклу позначаються як G-цикли. Середні площині двох інших гліцинатних циклів розташовуються майже перпендикулярно до екваторіальної площини і позначаються як R-цикли [7].
1.2. Бактеріальна деградація ЕДТА
ЕДТА характеризується дуже слабку біологічну разрушаемостью.
На малюнку 2 приведено передбачувана схема деградації ЕДТА, яка була вивчена у ЕДТА - руйнуючого штаму DSM-9103 [4]. Деградація ЕДТА здійснюється монооксигеназної системою. У бактеріальних клітинах оксігеназние системи виконують пластичну функцію, окислюючи углеродсодержащие речовини, забезпечують надходження вуглецю в клітини.
В. Ідеалізована октаедричні структура комплексу метал-ЕДТА
Фізіологічна роль оксигеназ зводиться до конкретного завдання збільшення водорозчинності, полярності окислюються молекули [8, 9].
ЕДТА-монооксигеназ складається з двох субодиниць [10]. Субодиниця В є оксидоредуктаз, яка переносить відновлювальні еквіваленти від NADH 2 на FMN, а субодиниця А трансформує комплекс метал-хелатуючим агент при поглинанні молекулярного кисню, тобто виконує роль власне оксигенази.
У результаті двох послідовних відщеплень ацетільних решт утворюється N, N 1-EDDA. Метаболізм N, N 1-EDDA до кінця не вивчений, передбачається, що він виглядає як показано на рис. 3. Тобто молекула N, N 1-EDDA втрачає ще один ацетільний залишок. Про метаболізмі EDMA нічого не відомо, тут можливі два варіанти: або відщеплюється остання ацетільная група і залишається етилендіамін, або відбувається розрив у молекулі етілендіаміна з утворенням гліцину і аміноацетальдегіда або аміаку і іміноацетальдегідацетата.
1.2.1. Бактерії, що руйнують ЕДТА
ЕДТА характеризується високою стійкістю; мікроорганізми, здатні руйнувати це з'єднання, зустрічаються в природі дуже рідко. В даний час відомо лише чотири штами ЕДТА-руйнують бактерій, виділені в чисту культуру:
1. Штам, що відноситься до роду Agrobacterium, здатний руйнувати комплекс Fe (III)-ЕДТА [11];
2. Штам BNC-1, грамнегативних бактерій, здатний деградувати комплекси ЕДТА з Mg 2 +, Ca 2 +, Mn 2 +, Zn 2 + [12];
3. Штам DSM-9103 Грамнегативна бактерія відноситься до підкласу α-Proteobacteria [4], здатний деградувати комплекси Mg 2 + -, Ca 2 + -, Mn 2 +-ЕДТА і частково хелати з Co, Cu, Zn, Pb.;
4. Штам LPM-410 ідентифікований як Pseudomonas sp. [13].
Характеристика штаму LPM-4
Штам LPM-4 був виділений в лабораторії фізіології мікроорганізмів ІБФМ РАН к.б.н. Чистякової Т. І. з активного мулу Пущинський очисних споруд методом накопичувальної культури [6]. Клітини нерухомі, колонії на твердому живильному середовищі з ЕДТА через тиждень зростання 0,1 -
Клітини штаму мають паличкоподібну форму (0,1-0,2 ч0 ,5-0, 6 мкм). На середовищі з ЕДТА клітини можуть бути поодинокими або парними. Це типова грамнегативних бактерій (рис. 4), про що говорить досить товста клітинна стінка з хвилястими краями. Клітка містить електронно-щільні включення (при споживанні ЕДТА), які, як показали дослідження на інших штамах, містять Ca 2 +, Mg 2 + і PO 4 3 - [4].
Штам LPM-4 унікальний за потребами в поживних речовинах. Встановлено, що штам здатний рости тільки на середовищах, що містять ЕДТА, і не росте на середовищах, що містять глюкозу, етанол, органічні кислоти як єдине джерело вуглецю та енергії і неорганічні (сульфат амонію, нітрат калію) або органічні (сечовина, пептони, гідролізат казеїну, аминопептид, дріжджовий екстракт) джерела азоту [6].
Даний штам має позитивною реакцією на наявність оксидази і каталази. Температурний оптимум для росту штаму 32-34 ˚ С. Оптимум рН = 7. На рідкому поживному середовищі з ЕДТА йде защелачивание середовища в процесі росту клітин.
Клітини штаму здатні руйнувати різні комплекси ЕДТА з металами. Суспензія відмитих клітин штаму руйнувала ЕДТА і комплекси Ba 2 + -, Mg 2 + -, Ca 2 + -, Mn 2 +-ЕДТА з постійною швидкістю в діапозоні від 0,310 до 486 ммоль ЕДТА / (м · год), питома швидкість руйнування Zn -ЕДТА досягала найбільшого значення (0,137 ммоль ЕДТА / (м · год)) протягом перших 10 годин інкубації, а потім знижувалася [6].
Встановлено, що штам LPM-4 здатний спільно метаболізувати ЕДТА і глюкозу. Цей процес можна назвати кометаболізмом.
1.3. Поняття про кометаболізме
Кометаболізм - це особливий випадок утилізації змішаних субстратів. Кометаболізм вперше спостерігав Фостер [14] в 1962 році в бактерій, що утилізують вуглеводні. Ці бактерії можуть рости на метані, як на єдиному джерелі вуглецю, тобто вони є метанотрофами. Однак, вони не можуть утилізувати такі алкани, як етан або пропан, в якості єдиного джерела вуглецю. Коли бактерії росли на суміші метану, етану і пропану, клітини використовували метан, а також етан та пропан, які окислялись до продуктів, таких як ацетальдегід, оцтова кислота, пропіонова кислота і ацетон відповідно.
Фостер запропонував термін соокісленіе для опису подібного типу трансформації субстратів. Пізніше інші дослідники спостерігали подібне явище з іншими типами мікробної трансформації; вони включають не тільки окислення, але також і гідроліз, дегалогенірованіе і так далі, тобто термін "кометаболізм" було запропоновано використовувати в більш широкому сенсі.
У 1982 році Дальтон і Стірлінг запропонували наступне визначення кометаболізма. Кометаболізм - трансформація неростового субстрату в присутності ростового субстрату чи іншого метаболізуються з'єднання. Під неростовимі субстратами розуміють такі, які не забезпечують поділ клітин. Ростової субстрат виконує декілька функцій. По-перше, поставляє енергію для бактеріального росту і процесів підтримки метаболізму нерастущіх клітин. По-друге, постачає відновлювальні еквіваленти, які дозволяють деградувати неростовие субстрати. По-третє, ростові субстрати індукують синтез катаболічних ферментів, які виявляють забруднюючі сполуки (поллютантами) і каталізують їх трансформацію. Метаболізм неростових субстратів не постачає ніякої енергії або відновних еквівалентів для мікроорганізмів.
Структура трансформованого (соокісляемого) з'єднання часто не має ніякої аналогії з ростовим субстратом. У цьому випадку зв'язок між процесами окислення ростового і трансформованого (неростового) субстратів реалізується на рівні інтермедіатів катаболізму джерела вуглецю. Під цим мають на увазі, що при окисленні ростового субстрату генерується енергія, необхідна для функціонування ферментів, які здійснюють окислення неростових субстратів [14].
На основі різних механізмів трансформації неростового субстрату, а також залежно від того, є косубстрат ростовим або неростовим, умовно можна виділити чотири типи кометаболізма.
Перший тип - трансформація неростового субстрату до продукту при використанні як косубстрата ростового субстрату.
Другий тип - трансформація неростового субстрату без використання ростового субстрату. Неростовой субстрат використовується не як джерело вуглецю, а тільки як джерело енергії, необхідної для здійснення реакцій кометаболізма. В обох розглянутих випадках трансформація ростового субстрату повинна забезпечувати енергією метаболізм іншого субстрату, і цей процес здійснюється тільки до певного продукту, який далі не асимілюється клітинами.
Четвертий тип кометаболізма - сінтаболізм - здатність мікроорганізмів рости на суміші двох або більше неростових субстратів [16]. Сінтаболізм був виявлений у облігатних метанотрофами. Показано, що в певних умовах вони здатні рости при наявності двох субстратів одночасно, кожен з яких сам по собі не є ростовим. В основі сінтаболізма лежить здатність метанотрофних бактерій сооокіслять (внаслідок відсутності адресності Метанмонооксигеназа) С 2 Н 6 або СО. Встановлено, що для проходження реакції монооксігенірованія З 2 Н 6 необхідна енергія, джерелом якої може служити окислені похідні метану або етану (метанол, форміат, етанол). Відповідні експерименти показали, що метанотрофами здатні рости на етан (неростовой субстрат) в присутності названих вище додаткових неростових субстратів.
Кінцеві продукти трансформації можуть використовуватися іншими мікроорганізмами в співтоваристві. Кінцеві продукти кометаболізма складно прогнозувати, але кілька типів ефектів можна уявити: якщо косубстрат початково токсичний, то в результаті кометаболізма буде відбуватися його детоксикація. Кінцеві продукти кометаболізма будуть постачати поживні речовини для яких-небудь інших мікроорганізмів і це може призвести до більшого біологічного розмаїття. Кінцеві продукти можуть бути токсичними для даних продуцентів або інших мікроорганізмів і результатом цього може бути ефект інгібування. Кінцеві продукти кометаболізма можуть бути стійкими і це може бути результатом збільшення стійкості кінцевих продуктів [14].
У цілому, процеси кометаболізма вивчені недостатньо. Подальше дослідження їх механізмів має не тільки практичну цінність, а й велике теоретичне значення, оскільки може розкрити закономірності взаємодії мікроорганізмів з кількома субстратами [17].
Кометаболізм - важливий інструмент при вивченні процесів мікробіологічного розкладання ароматичних і циклічних сполук. Багато видів Pseudomonas, Nocardia, Corynebacterium, Alcaligenes, Mycobacterium, Micrococcus, Cellulomonas, Streptococcus, Flavobacterium, а також мікроміцетів кометаболізіруют ароматичні циклічні і поліциклічні вуглеводні, вищі поліциклічні ароматичні вуглеводні, їх алкілзаміщених та інші похідні. В одних і тих же мікроорганізмів можуть функціонувати різні механізми розщеплення ароматичного кільця, що обумовлено як будовою молекули неростового субстрату, так і умовами культивування.
Так, Nocardia sp. DSM 43251 здійснює кометаболізм фенолу, ізомерів крезолу і оксіанізола, 3,4-діметілфенола, галогенфенолов, 4 - (метилтіо)-фенолу в присутності косубстратов - сахарози, етанолу, фумарату. Фенол і монохлорзамещенние похідні метаболізуються через шлях 1,2-розщеплення катехола (катехол-1 ,2-диоксигеназа); заміщені похідні фенолу в пара-положенні (метокси-або метілтіогруппа) - через шлях 2,3 - розщеплення.
Деякі нокардії соокісляют n-ксилол і утворюють або n-толуіловую кислоту і дигідрокси-п-толуіловую кислоти, або α, α'-діметілмуконовую кислоту в залежності від рН середовища. п-Ксилол трансформується видами Nocardia двома шляхами. Регулювання здійснюється за рахунок зміни специфічності оксигенази при зміні рН. При рН 8 функціонує метильная група оксігеназной системи і утворюється п-толуіловая кислота і дигідрокси-п-толуіловая кислоти. При рН 6 метильная група оксигенази не функціонує, що призводить до утворення метілзамещенних муконових кислот шляхом прямого дігідроксілірованія і розриву бензольного кільця. Іноді п-ксилол окислюється до п-оксіметілбензойной кислоти. Соокісленіе метил-і етілзамещенних нафталинов клітинами Nocardia і Streptomyces, вирощеними на гексадекані, призводить до окислення тільки одного метильного або етільного заступника до відповідної карбонової кислоти. При цьому має значення стеричні положення метильної групи.
Вивчено соокісленіе циклоалканов. Культура грамнегативних бактерій при рості на 2-метілбутане соокісляла Циклоалкани і циклічні моноалкени. Тільки при соокісленіі циклопропану відбувався розрив кільця. Соокісленіе З 5-С 8 - циклопарафинов призводило до накопичення відповідних епоксидів, спиртів та кетонів.
Наведені приклади кометаболізма циклічних сполук свідчать про те, що типи реакцій перетворення цих неростових субстратів досить добре вивчені. Частіше за все здатність кометаболізіровать неростовие субстрати пояснюється неспецифічністю деяких ферментів. Якщо структурно неростовой субстрат подібний ростового, то найчастіше реакції окиснення двох субстратів катализируются одними і тими ж ферментами, однак процеси трансформації ростового і неростового субстратів не завжди аналогічні. Наприклад, клітини Arthrobacter продукують 2 -, 3 - і 4-гексадеканон з н-гексадекану при зростанні на дріжджовому екстракті, при цьому виявлено та відповідні 2 -, 3 - і 4-спирти. Глюкоза стимулює процес кометаболізма гексадекану. Освіта цих продуктів окислення, які далі не трансформуються, свідчить про те, що початкові реакції окислення гексадекану є результатом відсутності адресності ферментів, функції яких не полягають в окисненні вуглеводнів [17].
Класичний приклад кометаболізма: окислення етану метаноокісляющімі бактеріями: утворюється при початковій досить неспецифічної монооксигеназної реакції етанол не метаболізується далі метілотрофамі і може тільки служити субстратом для інших бактерій у даному місцеперебуванні. У результаті активність окислення етану метаноокісляющей популяцією не збільшується, поки присутній метан як додатковий субстрат [18].
Ще один приклад, при розкладанні деревини легко гідролізуемая целюлоза (косубстрат) служить джерелом енергії і електронів для утворення Н 2 О 2, за участю якого розщеплюється стійкий до деградації лігнін.
Такі мікроорганізми, як Bacillus cereus SNK 12, Paenibacillus polymyxa SNK 2, Azotobacter chroococcum ANK ΙΙ, Ochrobactrum intermedium ANK Ι cпособни до деградації азобензолу в умовах кометаболізма. При цьому В.cereus SNK 12 в якості більш доступного джерела вуглецю використовує глюкозу, а О. intermedium - хрізоідін і метиловий оранжевий [19].
Інший приклад: кометаболізм флуорен культурами Rhodococcus rhodochrous і Pseudomonas fluorescens. Досліджено залежність інтенсивності трансформації флуорен бактеріями Rhodococcus rhodochrous 172 при зростанні на сахарозі і Pseudomonas fluorescens 26K при зростанні на гліцерині від концентрації ростового субстрату і фази росту культур [20].
Дослідження чисельності і функціонування різних груп бактеріобентоса водосховища поблизу м. Череповця виявили явище кометаболізма. При наявності легкозасвоюваних сполук органічних речовин, бактерійні групи піддають соокісленію трудномінералізуемие з'єднання стічних вод, таких як поліхлоровані біфеніли, поліароматичні вуглеводні, нафтопродукти, метали, феноли, сполуки азоту, сірки та інші речовини [21].
При дослідженні кометеболізма вінілхлориду та етена у Pseudomonas aeruginosa strain DL1 було виявлено, що при тривалому культивуванні (більше 40 діб) неростовой субстрат вінілхлорид стає ростовим [22].
1.4. Періодичне культивування
При внесенні бактерій в живильне середовище вони зазвичай ростуть до тих пір, поки вміст якого-небудь з необхідних їм компонентів середовища не досягає мінімуму, після чого ріст припиняється. Якщо протягом цього часу не додавати поживних речовин і не видаляти кінцевих продуктів обміну, то отримаємо періодичну культуру (популяцію клітин в обмеженому життєвому просторі) [24]. Крива росту бактеріальної культури показана на рис. 1.5. Кривий зростання називається крива, що описує залежність логарифма числа живих клітин від часу. Крива росту дозволяє розрізнити кілька фаз росту, що змінюють один одного в певній послідовності.
Лаг-фаза (початкова фаза). Ця фаза охоплює проміжок часу між інокуляцією і досягненням максимальної швидкості ділення. Якщо інокулят взятий зі старої культури (у стаціонарній фазі росту), то клітинам доводиться спочатку адаптуватися до нових умов шляхом синтезу РНК, освіти рибосом та синтезу ферментів. Якщо джерела енергії та вуглецю в новому середовищі відрізняються від тих, які були у попередній культурі, то адаптація до нових умов може бути пов'язана з синтезом нових ферментів, які раніше були не потрібні і тому не синтезувалися. Утворення нових ферментів індукується новим субстратом. Гарним прикладом впливу субстрату на синтез ферментів служить діауксія.
Експоненціальна фаза характеризується постійною максимальною швидкістю поділу клітин. Ця швидкість залежить від виду бактерій і від середовища. Величина клітин у багатьох бактерій залишається постійною. Але нерідко клітини періодичної культури зазнають зміни, тому що поступово змінюється середовище: зменшується концентрація субстрату, збільшується щільність клітинної суспензії і накопичуються продукти обміну. У зв'язку з тим, що в експоненційної фазі швидкість поділу клітин щодо постійна, ця фаза найбільш зручна для визначення швидкості поділу (і швидкості росту). Вивчаючи вплив факторів середовища (рН, температура), а також придатність різних субстратів, стежать за збільшенням числа клітин або за каламутністю (екстинкцій) клітинної суспензії під час експоненціального зростання.
Стаціонарна фаза настає тоді, коли число клітин перестає збільшуватись. Швидкість зростання залежить від концентрації субстрату - при зниженні цієї концентрації, ще до повного використання субстрату, швидкість зростання починає знижуватися. Тому перехід від експоненціальної фази до стаціонарної відбувається поступово. Швидкість зростання може зменшуватися також з-за великої щільності бактеріальної популяції, з-за низького парціального тиску або накопичення токсичних продуктів обміну. Всі ці фактори викликають перехід до стаціонарної фазі.
Фаза відмирання і причина загибелі бактеріальних клітин в нормальних поживних середовищах вивчені недостатньо. Число живих клітин може зменшуватися експоненціально. Іноді клітини лізуються під дією власних ферментів (Автоліз) (рис. 5) [24].
1.5. Періодичне культивування з підживленням (fed batch culture)
Термін «періодична культура з додаванням джерел живлення» ввели Іошіда та ін для позначення періодичної культури, у якому безупинно додається поживна cреда [25].
Просте періодичне культивування характеризується зростанням клітин без подання додаткових порцій субстрату після посіву культури. Ліміт субстрату або утворення токсичних компонентів можуть призвести до зниження продуктивності процесу. Для запобігання негативних наслідків ліміту субстрату застосовується техніка культивування з підживленням, при цьому субстрат або інші необхідні компоненти додаються або безперервно, або за сигналом від будь-якого датчика [26].
Періодична культура з додаванням джерел живлення розвивалася емпірично для деяких виробничих ферментаційних процесів, таких, як отримання пеніциліну, пекарських дріжджів та видалення відходів шляхом ферментації.
Для оптимізації виходу продуктів, що виділяються в середу, важливо посилити біосинтетичних здатність клітин бактерій, а метод культивування з підживленням дозволяє продовжити другу фазу зростання і підвищити вихід позаклітинних метаболітів. Обмеження швидкості поглинання субстрату швидкістю його доставки виявляється способом подолання «катаболітной репресії» освіти продукту. При виробництві пекарських дріжджів споживання кисню регулюється швидкістю додавання цукру.
Метод періодичних культур з підживленням використовували при культивуванні рекомбінантного штаму Escherichia coli для отримання аналога людського колагену. Культура з підживленням виявилася найбільш ефективним шляхом для досягнення високої щільності клітин і високої продуктивності [27].
У періодичному режимі з підживленням концентрованим субстратом досліджувалася деструкція фенолу при вдосконаленні процесу знешкодження токсичних стоків ксенобіотиків з використанням гібридної системи очищення з суміщенням процесу хімічного і біологічного окиснення по місцю і часу [28].
Періодична культура з додаванням джерел живлення, крім того, моделює деякі природні мікробні системи, як, наприклад, інфекцію сечових шляхів. Теорія такої культури показує, що вона повинна мати важливе і унікальне застосування в управлінні ферментаційним процесами [25].
Глава 2. Матеріали і методи
2.1 Умови культивування
Штам LPM-4 стерильно пересівали на скошені косяки ЕДТА-яке містить агару і витримували в термостаті 5 діб. Для отримання інокуляту здійснювали змив культури з косяків, засівали в рідку середу з ЕДТА і культивували 3-4 діб. Після чого інокулят в кількості 10 мл переносили в стерильні 750-мл колби з 200 мл стерильної рідкого середовища і культивували протягом 10 діб на гойдалці при 150 - 200 об / хв при температурі 28є-30єС.
Досвід включав два етапи. Експеримент першого етапу складався з 8 варіантів (рис. 6), а експеримент другого етапу - з 10 варіантів (рис. 7).
1 |
3 |
5 |
7 |
ЕДТАДодавання глюкози |
8 |
6 |
4 |
2 |
|
|
6 діб |
|
|
|
|
Рис. 6. Схема експерименту першого етапу дослідів
2 |
3 |
6 |
глюкоза |
4 |
глюкоза |
8 |
глюкоза |
7 |
9 |
ЕДТА |
ЕДТА |
5 |
ЕДТА |
10 |
1 |
|
| |||||||||||||||||||||
| |||||||
Рис. 7. Схема експерименту другого етапу дослідів
2.2. Методика приготування поживних середовищ
При культивуванні штаму використовували середовища з ЕДТА.
Тверда живильне середовище використовується для отримання свіжої культури штаму.
Рідку живильне середовище застосовували для отримання посівного матеріалу і для періодичного культивування. Тверду живильне середовище готували, як рідку, з додаванням 3% агару.
Приготування рідкого живильного середовища
1) MgSO 4 * 7 H 2 0 10 мл / л
2) CaCl 2 * 2 H 2 O 20 мл / л
3) KH 2 PO 4 + NaH 2 PO 4 * 12 H 2 O 10 мл / л
4) EDTA 10 мл / л
5) Мікроелементи 1 мл / л
(Доводили до рН = 4,2) + 5,6 г / л ЕДТА:
FeCl 2 * 4 H 2 O 1,5 г / л
H 3 BO 3 0,06 г / л
MnCL 2 * 6 H 2 O 0,1 г / л
CaCl 2 * 6 H 2 0 0,12 г / л
ZnCl 2 0,07 г / л
NiCl 2 * 6 H 2 0 0,025 г / л
CuCl 2 * 2 H 2 O 0,015 г / л
Na 2 MoCl чотири 0,025 г / л
6) Вітаміни
Піридоксин 20 мг
Тіамін 10 мг
Рибофлавін 10 мг
Нікотинова кислота 10 мг
Р - амінобензойна кислота 10 мг
Ліпоєва кислота 10 мг
Нікотинамід 10 мг
Вітамін В 12 10 мг
Біотин 4 мг
Фолієва кислота 4 мг
Розчиняли всі компоненти в 200 мл води, стерилізували при 0,5 атм. 30 хвилин і додавали в рідку живильне середовище в кількості 1 мл / л.
Компоненти поживних середовищ зважували на технічних та аналітичних електронних вагах і розчиняли у дистильованій воді. Досвід з приготування поживних середовищ показав, що її зручно готувати з заздалегідь стерилізованих концентрованих розчинів.
2.3. Методи аналізу.
Проби з колб відбирали один раз на добу і проводили вимірювання рН, біомаси, концентрації глюкози, ЕДТА і амонію.
Біомасу визначали спектрофотометрично на приладі Specol 221 (Germany) при 546 нм, після підкислення проби 5% розчином НNO 3 до рН = 2,0 для розчинення солей, що випадають в осад у процесі культивування. Зміст біомаси розраховували на підставі оптичної щільності клітинної суспензії використовуючи раннє побудовану калібрувальну криву.
Концентрацію ЕДТА визначали високоефективної рідинної хроматографією на хроматографі HPLC (Waters. Great Britan), оснащеному колонкою Nukleosil 100 (Machery und Nagel, Germany) при 285 нм. Як елюента використовували розчин, що містить Fe (NO 3) 3 * 9H 2 O 0,5 г / л, бромід ліганду 0,4 г / л, HNO 3 (65%) 0,8 мл, рН 2,1. Концентрацію ЕДТА розраховували, використовуючи калібрувальну криву
Концентрацію глюкози визначали ензиматичних з використанням реактиву Глюкоза ФС "ДДС" ("Диякон"). Принцип методу: глюкозооксидаза каталізує окислення β-D-глюкози киснем повітря з утворенням еквімолярних кількостей глюколактона і перекису водню. Пероксидаза каталізує окислення хромогенних субстратів перекисом водню в присутності фенолу з утворенням забарвленого з'єднання, інтенсивність забарвлення якого прямо пропорційна концентрації глюкози в пробі і вимірюється фотометричним при довжині хвилі 500 нм. Склад реагенту: буферно-ферментний розчин, який содержащию калій фосфорнокислий -250 ммоль / л, фенол - 5 ммоль / л, 4-аміноантіпірін - 0,5 ммоль / л, глюкозооксидазу - 10 000 Е / л, пероксидазу - 1000 Е / л . Проби центрифугували при 8 000 об / хв протягом 6 хвилин. Потім відбирали 20 мкл надосадової рідини і додавали 2 мл реагенту. Проби перемішували і инкубировали при кімнатній температурі протягом 20 хвилин. Потім вимірювали оптичну щільність при 500 нм. Вміст глюкози визначали за калібрувальним графіком.
Вміст іонів амонію визначали потенціометричним методом за допомогою іонселективного електрода "Еком-NH 4". Метод аналізу полягає у вимірі величини рівноважного потенціалу іонселективного електрода, зануреного в розчин аналізованого іона. Потенціал вимірюють щодо електрода порівняння, за допомогою іономір Екотест - 120 (ІЕЛРАН НПП ЕКОНІКС). Занурювали в розчин електрод "Еком-NH 4" і електрод порівняння і вимірювали значення рівноважного потенціалу.
2.3.1. Обчислення енергетичного виходу росту штаму LPM-4
Енергетичний вихід росту штаму LPM-4 обчислювали на підставі теорії матеріально-енергетичного балансу росту мікроорганізмів. Відповідно до цієї теорії доступними називаються електрони, які акцептуються вільним киснем при окисленні органічного матеріалу з утворенням вуглекислого газу і води. [29].
Зміст доступних електронів (ДЕ) в органічних сполуках зручно виражати в розрахунку на один атом вуглецю, тобто як ступінь відновлення вуглецю (γ).
Для з'єднання СН р Про n N q величина ступеня восстановленности вуглецю обчислюється за формулою:
g = 4 + p-2n-3q
Цифра 4 означає число ДЕ вуглецевого атома, до неї додаються ДЕ водню, число яких дорівнює числу p, що припадають на один атом вуглецю. З цієї суми віднімаються електрони енергетично знецінені киснем. Їх число дорівнює подвоєному числу атомів кисню n, що припадають на один атом вуглецю, так як у кисню валентність дорівнює - 2. З отриманої різниці віднімається утроенное число атомів азоту q, так як валентність азоту дорівнює - 3, а енергетичний стан електронів, пов'язаних з азотом, не змінюється в процесі росту.
Наведемо рівняння кількісної зв'язку енергетичного балансу з показником матеріального балансу, як вихід по субстрату Y s.
Енергетичний вихід (η) характеризує частку енергії субстрату, яка перейшла в біомасу.
h = g в s в / g s s s × Y s,
де g в - відновлене вуглецю в біомасі;
g s - відновлене вуглецю в субстраті;
σ s - частка (за масою) вуглецю в органічному субстраті;
σ в - частка (за масою) вуглецю в біомасі;
g в s в / g s s s - відношення енерговміст рівних за вагою кількостей біомаси та субстрату;
g в s в = 2, для бактерій не синтезують ліпіди;
Y s - вихід клітин за масою, г / г;
Вихід клітин за масою Y:
Y x / s = Х / S,
де Х-концентрація біомаси, г / л;
S-кількість спожитого субстрату, г / л.
Вихід клітин за масою з ЕДТА (Y ЕДТА) розраховували як відношення біомаси, утвореної з ЕДТА, до кількості спожитої ЕДТА. А вихід клітин за масою з глюкози розраховували як відношення біомаси, утвореної з глюкози, до кількості спожитої глюкози.
Теоретична межа для енергетичного виходу зростання h = 1, так як у біомасі не може бути більше енергії, ніж у використаному субстраті.
Розрахунок величини η для ЕДТА:
З 10 Н 16 Про 8 N 2
γ = (4 * 10 +16- 2 * 8 - 3 * 2) / 10 = 3,4
М (ЕДТА) = 292
М (вуглецю) = 120
292 - 100%
120 - δ
δ = 0,410
γδ = 3,4 * 0,410 = 1,4
h = U s (γ b δ b / γ s δ s) = U s (2 / 1, 4)
Розрахунок η для глюкози:
З 6 Н 12 О 6 СН 2 О
γ = 4 +2-2 = 4
М (глюкоза) = 180
М (вуглецю) = 72
180 - 100%
72 - δ
δ = 0,4
γδ = 4 * 0,4 = 1,6
η = Υ s (2 / 1, 6)
2.3.2. Обчислення питомої швидкості росту штаму LPM-4
Питома швидкість росту m:
m = (ln x 2 / x 1) / (t 2-t 1),
де х 2 - концентрація біомаси в кінцевий момент часу, мг / л;
x 1 - концентрація біомаси в початковий момент часу, мг / л;
(T 2-t 1) - проміжок часу, протягом якого зросла біомаса, ч.
Глава 3. Результати та їх обговорення
Відомо, що бактеріальний штам LPM-4 характеризується унікальною потребою в ЕДТА для росту клітин і не росте на середовищах за відсутності ЕДТА. Спільну асиміляцію ЕДТА і глюкози штамом LPM-4 можна розглядати як процес кометаболізма, при якому ЕДТА є ростовим субстратом, а глюкоза - косубстратом, її метаболізм залежить від присутності ЕДТА.
Досвід проводили у два етапи:
1) Дослідження впливу ступеня деградації ЕДТА на асиміляцію глюкози бактеріальним штамом LPM-4;
2) Дослідження здатності штаму LPM-4 до асиміляції ЕДТА і глюкози в процесі тривалого культивування з додаванням субстрату.
3.1. Дослідження впливу ступеня деградації ЕДТА на асиміляцію глюкози бактеріальним штамом LPM-4
Бактерії вирощували на ЕДТА-яка містить середовищі з додаванням глюкози в різні періоди культивування: до посіву або на 1, 2, 3, 4, 5, і 6 добу росту клітин (рис. 6).
3.1.1 Динаміка зростання і споживання глюкози і ЕДТА бактеріальним штамом LPM-4
Дані про зміну щільності біомаси, рН, концентрації ЕДТА і амонію в різних варіантах середовищ представлені в таблицях 1-8.
У всіх варіантах досліду деградація ЕДТА відзначалася вже на 1 добу росту і закінчувалася на 3 доби, незалежно від присутності глюкози в середовищі. Таким чином, можна зробити висновок, що присутність косубстрата (глюкози) не впливало на деградацію ростового субстрату (ЕДТА).
При внесенні глюкози в середу до посіву бактерій (варіант 2) споживання глюкози почалося тільки на 3 добу росту, після повної деградації ЕДТА, і завершилася на 8 добу росту (додаток 2, рис. 3.1.1.1). Можна припустити, що енергія, що утворюється в процесі деградації ЕДТА, використовується клітинами для індукції ферментів метаболізму глюкози або для її транспорту. Споживання глюкози супроводжувалося збільшенням щільності біомаси в два рази в порівнянні з контролем.
При внесенні глюкози в середу на 1 добу росту бактерій (варіант 3) динаміка її асиміляції була такою ж, як у варіанті 2. Споживання глюкози почалося після вичерпання ЕДТА з середи (3 доба), закінчилося на 8 добу культивування і призвело до двократного збільшення щільності біомаси (додаток 3, рис. 3.1.1.2).
Інша картина асиміляції глюкози спостерігалася при її внесення в середу на 2 добу росту бактерій, коли залишкова концентрація ЕДТА знизилася в 1,7 рази (варіант 4). Споживання глюкози почалося тільки на 4 добу, потім спостерігалася тривала лаг фаза, коли концентрація глюкози в середовищі не змінювалася; інтенсивна асиміляція глюкози відбувалася з 6 до 10 доби культивування (додаток 4, рис. 3.1.1.3).
При внесенні глюкози в середу на 3 добу росту клітин, коли деградація ЕДТА закінчилася (варіант 5), глюкоза не споживалася протягом 6 діб і лише з 9 діб почалася її інтенсивна асиміляція (додаток 5, рис. 3.1.1.4). Таким чином, при внесенні косубстрата в період, коли закінчений метаболізм ростового субстрату, індукція асиміляції косубстрата вимагає тривалої лаг фази, ймовірно, через нестачу енергії.
При внесенні глюкози в середу на 4-6 добу культивування (варіанти 6, 7 і 8), тобто через 1, 2 і 3 діб після повного споживання ЕДТА, не виявлено її асиміляції (додаток 6-8, рис. 3.1.1.5-3.1.1.7).
3.1.2. Динаміка накопичення біомаси і питома швидкість росту штаму LPM-4
На рис. 3.1.2.1. представлена динаміка накопичення біомаси і питома швидкість росту штаму LPM-4 при культивуванні на середовищі з ЕДТА. Як видно з малюнка, максимальна питома швидкість досягається на 2 доби і становить 0,042 год -1.
У випадку, коли додавали глюкозу в середу до посіву (рис. 3.1.2.2), максимальна питома швидкість була вищою, ніж у контролі, і становила 0,057 год -1 (2 доби). При додаванні глюкози в середу на 1 і 3 добу росту бактерій (рис. 3.1.2.3 .- 3.1.2.5.) Спостерігалося два (а при додаванні глюкози на 2 добу - три) піку питомих швидкостей. Перший пік характеризує зростання за рахунок споживання ЕДТА. У варіанті 3 (рис. 3.1.2.3.) Він складає 0,055 год -1 (2 доби), у варіанті 4 (рис. 3.1.2.4.) -0,049 Ч -1, а у варіанті 5 (рис. 3.1.2.5. ) - 0,042 год -1. Другий пік швидкості росту - за рахунок споживання глюкози - був значно нижче, ніж за рахунок споживання ЕДТА. Максимальна питома швидкість росту за рахунок споживання глюкози в третьому варіанті склала 0,007 год -1, в четвертому -0,006 год -1 і 0,016 год -1, а в п'ятому -0,022 год -1. Таким чином, додавання в середовище глюкози на 1-3 добу призводить до повторного збільшення швидкості росту бактерій, але в значно меншому ступені, ніж при початковій асиміляції ЕДТА.
Найбільше значення питомої швидкості росту характерно для варіанту, коли глюкоза додавалася у середу до посіву бактерій. Отже, час додавання косубстрата в середу значно впливає на швидкість росту бактерій.
3.1.3. Накопичення амонію в процесі росту штаму LPM -4
Аналізуючи рис. 3.1.3., Можна зробити висновок, що концентрація амонію в середовищі збільшується в міру деградації ЕДТА, оскільки іони амонію - продукти деградації ЕДТА. У всіх варіантах концентрація амонію досягає максимального значення і залишається на постійному рівні протягом декількох днів. Зниження концентрації амонію при тривалому культивуванні бактерій пояснюється, мабуть, тим, що клітини споживають його.
При додаванні глюкози зниження концентрації іонів амонію починається раніше, ніж у контролі. Цікавий той факт, що накопичення амонію в процесі росту штаму LPM-4 на середовищах з додаванням глюкози до посіву і на 1 добу росту бактерій відбувається подібним чином, причому концентрація амонію в дослідах значно менше такої в контролі. Концентрація амонію в досвіді на середовищі з додаванням глюкози на 2 та 3 доби зростання також нижче контролю. Ймовірно, це пов'язано з тим, що амоній використовується для росту клітин у присутності глюкози.
3.1.4. Показники росту штаму LPM-4 при кометаболізме ЕДТА і глюкози
У таблиці 3.1.4. представлені порівняльні результати показників росту штаму LPM-4 на різних варіантах середовищ. На середовищах з глюкозою сумарна біомаса включає біомасу, утворену як за рахунок споживання ЕДТА, так і за рахунок споживання глюкози. Оскільки концентрація ЕДТА у всіх варіантах середовищ була однаковою (0,873 г / л), можна припустити, що кількість біомаси, утвореної з ЕДТА на середовищах з глюкозою, було таким же, як у контролі (0,196 г / л). Отже, якщо відняти з сумарною біомаси кількість біомаси, утвореної з ЕДТА, ми отримаємо кількість біомаси, утвореної з глюкози.
З таблиці видно, що найбільший вихід клітин за масою з глюкози досягається на середовищі з додаванням глюкози на 3 добу росту бактерій. Оскільки ЕДТА і глюкоза характеризуються різним енерговміст, правильніше порівнювати вихід з цих субстратів не за масою, а по енергії. З цією метою розраховували енергетичний вихід клітин. Найбільший вихід біомаси по енергії з глюкози характерний для досвіду на середовищі з додаванням глюкози на 3 добу росту бактерій.
Таким чином показано, що бактеріальний штам LPM-4, облігатний деструктор ЕДТА, не може використовувати глюкозу як єдине джерело вуглецю та енергії, але здатний метаболізувати її в присутності ЕДТА. Встановлено, що ЕДТА індукує асиміляцію глюкози і є джерелом азоту для росту клітин на глюкозі. Індукція асиміляції неростового субстрату у штаму LPM-4 вимагає тривалої лаг-фази і пов'язана з деградацією ЕДТА. Явище спільного метаболізму ЕДТА і глюкози можна назвати кометаболізмом.
Кометаболізм - трансформація неростового субстрату в присутності ростового субстрату чи іншого метаболізуються з'єднання. У даному
Таблиця 3.1.4.
Показники росту штаму LPM-4 при асиміляції ЕДТА і глюкози
Показники | ЕДТА | ЕДТА + глюкоза (До посіву) | ЕДТА + глюкоза (1 добу) | ЕДТА + глюкоза (2 на добу) | ЕДТА + глюкоза (3 діб) |
| Максимальна питома швидкість росту, ч -1 | 0,042 | 0,057 | 0,055 | 0,049 | 0,042 |
| ЕДТА, г / л | 0,873 | 0,873 | 0,873 | 0,873 | 0,873 |
| Глюкоза, г / л | - | 0,910 | 0,977 | 1,020 | 1,060 |
| Біомаса сумарна | 0,196 | 0,378 | 0,391 | 0,399 | 0,423 |
| Біомаса, утворена з ЕДТА | 0,196 | 0,196 | 0,196 | 0,196 | 0,196 |
| Біомаса, утворена з глюкози | - | 0,182 | 0,195 | 0,203 | 0,227 |
| Вихід клітин за масою з ЕДТА, Y ЕДТА,% | 22,4 | 22,4 | 22,4 | 22,4 | 22,4 |
| Вихід клітин за масою з глюкози, Y глюкоза,% | - | 20,0 | 20,0 | 19,9 | 21,4 |
| Вихід клітин по енергії з ЕДТА, h ЕДТА,% | 32,0 | 32,0 | 32,0 | 32,0 | 32,0 |
| Вихід клітин по енергії з глюкози, h глюкоза,% | 25,0 | 25,0 | 24,9 | 26,8 |
Не виявлено асиміляції глюкози при її внесення в середу через 1-3 діб після споживання ЕДТА.
3.2 Дослідження здатності штаму LPM-4 до асиміляції ЕДТА і глюкози в процесі тривалого культивування з додаванням субстрату
У попередньому розділі було показано, що асиміляція глюкози бактеріальним штамом LPM-4 індукується у процесі деградації ЕДТА, а кометаболізм ЕДТА і глюкози у штаму LPM-4 не робить впливу на деградацію ЕДТА.
У даному розділі метою роботи було дослідження:
1) чи зберігається здатність клітин до деградації ЕДТА при додатковому внесенні ЕДТА в середу;
2) чи зберігається ЕДТА-індукована здатність клітин асимілювати глюкозу в процесі тривалого культивування з додаванням глюкози;
3) чи зберігається здатність штаму LPM-4 до перемикання метаболізму від асиміляції глюкози до асиміляції ЕДТА в процесі тривалого культивування в присутності глюкози.
Схема експерименту представлена на малюнку 2.1.2.
У першій серії дослідів бактерії вирощували на середовищі з ЕДТА (варіант 1); потім додатково вносили ЕДТА на 4 доби (варіант 2) і на 6 добу (варіант 3) зростання бактерій.
У другій серії дослідів бактерії вирощували на середовищі, що містить ЕДТА і глюкозу (варіант 4) і додатково вносили глюкозу на 9 діб (варіант 6), 13 діб (варіант 8) і 21 діб (варіант 10).
У третій серії дослідів бактерії вирощували на середовищі з ЕДТА з підживленням глюкозою; після споживання глюкози вносили ЕДТА на 9 діб (варіант 5), 13 діб (варіант 7) і на 21 діб (варіант 9).
3.2.1. Дослідження асиміляції ЕДТА штаму LPM -4 в процесі культивування з додаванням ЕДТА
Опис: Культуру вирощували на середовищі з ЕДТА (варіант 1 - контроль). Асиміляція ЕДТА відбувалася досить швидко і закінчилася на четверту добу росту (рис. 3.2.1.1, додаток 9), при цьому спостерігалося зростання біомаси до 0,190 г / л. На четверту добу росту культури додали ЕДТА (варіант 2). При цьому культура спожила ЕДТА дуже швидко, на наступну добу були присутні лише сліди цього з'єднання, а приріст біомаси склав 0,244 г / л. На шосту добу росту культури, тобто через добу після споживання ЕДТА, ще раз додали ЕДТА (варіант 3). У даному випадку споживання ЕДТА проходило повільно, і асиміляція його закінчилася тільки на 12 добу росту; біомаса почала рости тільки на 10 добу і досягла максимального значення 0,661 г / л на 12 добу. Після споживання ЕДТА настала стаціонарна фаза і подальшого росту клітин вже не відбувалося. Приріст біомаси у варіанті 3 склав 0,287 г / л, що набагато вище, ніж у попередніх варіантах.
Затримка споживання ЕДТА і росту бактерій у варіанті 3 можливо пояснюється тим, що протягом 1-добового голодування по ЕДТА відбулося зниження активності ферменту, відповідального за деградацію ЕДТА.
Згідно з літературними даними, фермент первинної деградації ЕДТА (ЕДТА-монооксигеназ) є індуцебельним і його активність різко знижується за відсутності ЕДТА [30].
Значення виходу клітин за масою і по енергії з ЕДТА були максимальні у контролі і склали 20,2% і 28,9% відповідно, а мінімальні у варіанті 3 і склали 17,1% і 24,4% відповідно (табл. 3.2.1.1 ). У варіантах 1 і 2 дані показники мало відрізнялися один від одного.
Таблиця 3.2.1.1
Показники росту штаму LPM-4 при багаторазовому внесення ЕДТА в середу
Показники | Час внесення добавок ЕДТА | ||
| До посіву (Варіант 1) | 4 доби (Варіант 2) | 6 добу (Варіант 3) | |
ЕДТА спожитий, г / л | 0,94 | 1,26 | 1,68 |
Біомаса спожита, г / л | 0,190 | 0,444 | 0,662 |
| Біомаса в день добавки, г / л | - | 0,200 | 0,374 |
| Біомаса, утворена з внесеного ЕДТА, г / л | 0,190 | 0,244 | 0,288 |
| Вихід клітин за масою з ЕДТА, U ЕДТА% | 20,2 | 19,4 | 17,1 |
| Вихід клітин по енергії з ЕДТА, h ЕДТА% | 28,9 | 27,7 | 24,4 |
3.2.2. Дослідження ЕДТА-індукованої асиміляції глюкози штамом LPM -4 в процесі тривалого культивування з додаванням глюкози
Опис: культуру вирощували на середовищі, що містить ЕДТА і глюкозу (варіант 4 - контроль). Споживання глюкози в контролі почалося тільки після споживання ЕДТА, тобто на четверту добу, і завершилася на дев'яту добу (рис. 3.2.2.1, додаток 10). При цьому спостерігалося збільшення біомаси від 0,075 г / л до 0,507 г / л. Потім після споживання глюкози в середу додатково внесли глюкозу (варіант 6). Її асиміляція почалася відразу ж і закінчилася вже на 13 добу росту культури, при цьому біомаса продовжувала інтенсивно рости, і приріст біомаси склав 0,295 г / л. На 13 добу після споживання глюкози ще додали глюкозу (варіант 8).
На цей раз її асиміляція почалася відразу ж, як і в попередньому варіанті, але тривала довше і практично закінчилася на 22 добу росту культури.
Таблиця 3.2.2.1.
Показники росту штаму LPM-4 при багаторазовому внесення глюкози в середу
Показники | Час внесення добавок глюкози | |||
| До посіву (Варіант 4) | 9 добу (Варіант 6) | 13 добу (Варіант 8) | 21 добу (Варіант 10) | |
| Глюкоза спожита, г / л | 1,38 | 1,69 | 1,64 | 1,35 |
Біомаса максимальна, г / л | 0,507 | 0,721 | 0,839 | 0,868 |
| Біомаса, утворена з ЕДТА г / л | 0,28 | 0,426 | 0,682 | 0,818 |
| Вихід клітин за масою з глюкози, U Глюкоза% | 16,5 | 17,5 | 9,6 | 3,7 |
| Вихід клітин по енергії з глюкози, h Глюкоза% | 20,6% | 21,9 | 12.0 | 4,6 |
Вихід клітин за масою і по енергії з глюкози були максимальні у четвертому та шостому варіанті і склали 16,5% і 20,6%; 17,5% і 21,9% відповідно, а мінімальні в 10 варіанті і склали 3,7% і 4,6% відповідно (табл. 3.2.2.1).
Таким чином, ми переконалися ще раз, що асиміляція глюкози починається тільки після повного споживання ЕДТА і призводить до збільшення біомаси. Крім того, штам LPM-4 зберігає здатність асимілювати глюкозу при багаторазовому її введенні. Кілька знижена асиміляція глюкози у варіанті 8 і дуже повільна її асиміляція у варіанті 10, у порівнянні з контролем (варіант 4), а також незначний приріст біомаси у цих варіантах пояснюється тим, що в середовищі вужеві відсутні живильні компоненти: азот, макроелементи (такі, як фосфор, калій, сірка), мікроелементи і вітаміни, необхідні для росту клітин. Низькі показники виходу клітин по енергії в 8 і 10 варіантах говорять про те, що хоч глюкоза і споживається, але синтезу біомаси не відбувається.
3.2.3. Дослідження здатності штаму LPM -4 до переключенню метаболізму від асиміляції глюкози до асиміляції ЕДТА
Опис: культуру вирощували на середовищі, що містить ЕДТА і глюкозу (варіант 4 - контроль), а після вичерпання глюкози на дев'яту добу зростання додавали ЕДТА (варіант 5). ЕДТА дуже швидко спожила і вже на 11 добу росту культури ЕДТА в середовищі не було виявлено (рис. 3.2.3.1, додаток 11). Біомаса значно збільшилася і приріст її на цей період склав 0,325 г / л, після чого настала стаціонарна фаза.
Вихід клітин за масою і по енергії з ЕДТА у контролі склали 22,8% і 32,6% відповідно, а в досвіді 16,9% і 24,1% відповідно (табл. 3.2.3.1).
На 13 добу до культури, вирощеної на глюкозі, додали ЕДТА (варіант 7). Споживання ЕДТА відбувалося швидко і завершилася на 15 добу росту (рис. 3.2.3.2, додаток 12). Приріст біомаси був невеликим, і склав за цей період 0.146 г / л.
Вихід клітин за масою з ЕДТА у варіанті 7 склав 9,2%, а по енергії 13,1% (табл.3.2.3.2).
При додаванні ЕДТА до 13-добової культури, вирощеної в присутності глюкози (варіант 9), споживання ЕДТА сталося швидко і закінчилося на наступну добу (рис. 3.2.3.3 і додаток 13), проте приріст біомаси був незначний. Вихід клітин за масою з ЕДТА склав 6,6%, а вихід клітин по енергії - 9,4% (табл. 3.2.3.3).
У підсумку можна зробити наступний висновок. По-перше, культура зберігає здатність до асиміляції ЕДТА, доданого на різні добу росту штаму LPM-4 в присутності глюкози. Отже, клітини зберігають здатність до перемикання метаболізму від асиміляції глюкози до асиміляції ЕДТА навіть після тривалого споживання глюкози.
По-друге, значення виходу клітин за масою і по енергії з ЕДТА зі збільшенням часу росту культури зменшуються, що, мабуть, пов'язано з виснаженням поживних компонентів середовища. По-третє, вихід клітин за масою і енергії з ЕДТА і вихід клітин за масою і енергії з глюкози мало відрізняються один від одного.
Таблиця 3.2.3.1.
Показники росту штаму LPM-4 при додаванні ЕДТА або глюкози до 9 добової культури, вирощеної в присутності глюкози
Показники | Добавки | ||
| Контроль (Варіант 4) | ЕДТА (Варіант 5) | Глюкоза (Варіант 6) | |
ЕДТА спожитий, г / л | 1,23 | 1,92 | - |
| Глюкоза спожита, г / л | 1,38 | - | 1,69 |
Біомаса максимальна, г / л | 0,507 | 0,759 | 0,721 |
| Біомаса, утворена з ЕДТА г / л | 0,28 | 0,434 | 0,426 |
Біомаса, утвореназ глюкози, р / л | 0,227 | 0,325 | 0,295 |
| Вихід клітин за масою з ЕДТА, U ЕДТА% | 22,8 | 16,9 | - |
| Вихід клітин за масою з глюкози, U Глюкоза% | 16,5 | - | 17,5 |
| Вихід клітин по енергії з ЕДТА, h ЕДТА% | 32,6 | 24,1 | - |
| Вихід клітин по енергії з глюкози, h Глюкоза% | 20,6 | - | 21,9 |
Показники росту штаму LPM-4 при додаванні ЕДТА або глюкози до 13-добової культури, вирощеної в присутності глюкози
Показники | Добавки | ||
| Контроль (Варіант 6) | ЕДТА (Варіант 7) | Глюкоза (Варіанти 8) | |
ЕДТА спожитий, г / л | - | 1,58 | - |
| Глюкоза спожита, г / л | 1,69 | - | 1,64 |
Біомаса максимальна, г / л | 0,721 | 0,845 | 0,839 |
Біомаса в день добавки, г / л | 0,426 | 0,699 | 0,682 |
Біомаса, утворена з внесеного субстрату, г / л | 0,295 | 0,146 | 0,157 |
| Вихід клітин за масою з ЕДТА, U ЕДТА% | - | 9,2 | - |
| Вихід клітин за масою з глюкози, U Глюкоза% | 17,5 | - | 9,6 |
| Вихід клітин по енергії з ЕДТА, h ЕДТА% | - | 13,1 | - |
| Вихід клітин по енергії з глюкози, h Глюкоза% | 21,9 | - | 12.0 |
Показники росту штаму LPM-4 при додаванні ЕДТА або глюкози до 21-добової культури, вирощеної в присутності глюкози
Показники | Добавки | ||
| Контроль (Варіант 8) | ЕДТА (Варіант 9) | Глюкоза (Варіант 10) | |
| ЕДТА спожитий, г / л | - | 1,57 | - |
| Глюкоза спожитий, г / л | 1,64 | - | 0,87 |
Біомаса максимальна, г / л | 0,839 | 0,880 | 0,851 |
| Біомаса в день добавки, г / л | 0,682 | 0,777 | 0,818 |
| Біомаса, утворена з внесеного субстрату, г / л | 0,157 | 0,103 | 0,033 |
| Вихід клітин за масою з ЕДТА, U ЕДТА% | - | 6,6 | - |
| Вихід клітин за масою з глюкози, U Глюкоза% | 9,6 | - | 3,8 |
| Вихід клітин по енергії з ЕДТА, h ЕДТА% | - | 9,4 | - |
| Вихід клітин по енергії з глюкози, h Глюкоза% | 12.0 | - | 4,8 |
Висновок
У результаті проведених досліджень встановлено, що присутність косубстрата (глюкози) не впливає на деградацію ростового субстрату (ЕДТА) штамом LPM-4.
При внесенні глюкози в середу до посіву її споживання почалося після завершення деградації ЕДТА і супроводжувалося збільшенням щільності біомаси в два рази в порівнянні з контролем. При внесенні косубстрата в момент вичерпання ростового субстрату, індукція асиміляції косубстрата вимагає тривалої лаг фази, ймовірно, через нестачу енергії. Не виявлено асиміляції глюкози при її внесення в середу через 1-3 діб після споживання ЕДТА.
Величини виходу клітин за масою з ЕДТА та глюкози (при внесенні глюкози до посіву або на 1-3 добу) мало розрізнялися і склали 22,4% і 19,9-21,4% відповідно. Однак, оскільки ЕДТА і глюкоза характеризуються різним енерговміст, більш правильно порівнювати енергетичний вихід клітин з цих субстратів. Енергетичний вихід характеризує частку енергії субстрату, яка перейшла в біомасу. Оскільки енерговміст глюкози вище, ніж ЕДТА (значення gs становлять 1,6 і 1,4 відповідно), вихід біомаси по енергії з ЕДТА був вище, ніж з глюкози і становив 32%, тоді як вихід клітин по енергії з глюкози змінювався в межах від 24,9 до 26,8%.
Аналізуючи результати другого етапу дослідів, ми переконалися, що культура зберігає здатність асимілювати ЕДТА при додатковому внесенні ЕДТА в середу. Повторне додавання ЕДТА в середу наводить до збільшення біомаси, тобто запасу поживних компонентів середовища достатньо для підтримки зростання клітин.
Показано, що штам LPM-4 зберігає ЕДТА-індуковану здатність асимілювати глюкозу при багаторазовому її введенні. Кілька знижена асиміляція глюкози в порівнянні з контролем і незначний приріст біомаси при тривалому культивуванні бактерій (протягом 13-21 діб) пояснюється тим, що в середовищі вже відсутні компоненти поживного середовища, необхідні для росту культури. Низькі показники виходу клітин за масою і енергії при тривалому культивуванні говорять про те, що хоч глюкоза і споживається, але синтезу біомаси не відбувається.
Показано, що клітини штаму LPM-4 зберігають здатність до перемикання метаболізму від асиміляції глюкози до асиміляції ЕДТА в процесі тривалого культивування.
Результати даного дослідження є важливими для подальшої розробки нового біопрепарату з очищення стічних вод, який буде включати ЕДТА-руйнує штам LPM-4. Отримані дані допоможуть у виборі умов, оптимальних для діяльності штаму. Але потрібно провести ще багато роботи, щоб отримати цей біопрепарат.
Висновки
1. Встановлено, що кометаболізм ЕДТА і глюкози у штаму LPM-4 не робить впливу на деградацію ЕДТА.
2. Показано, що асиміляція глюкози бактеріальним штамом
3. LPM-4 індукується тільки в процесі інтенсивної деградації ЕДТА.
4. Виявлено, що штам LPM-4 зберігає здатність до деградації ЕДТА при додатковому внесенні ЕДТА в середу.
5. Доведено, що бактерії зберігають здатність до ЕДТА-індукованої асиміляції глюкози в процесі тривалого культивування з багаторазовим додаванням глюкози.
6. Встановлено, що штам LPM-4 здатний до перемикання метаболізму від асиміляції глюкози до асиміляції ЕДТА в процесі тривалого культивування в присутності глюкози.
Література
1. Біологічне очищення стічних вод. http://www.rfbr.ru
2. Босоло Ф. Хімія координаційних сполук .- М.: Світ, 1966.-145С.3. Kari FG Modeling the photochemical degradation of ethylenediaminetetraacetate in the river Glatt / FG Kari, W. Giger / / Environ.Ski Technol .- 1995.-V.29.-P.2814-2827.
4. Bucheli-Witschel M., T. Egli Environmental fate and microbial degradation of aminopolycarboxylic acids / / FEMS Microbiol. Rev. - 2001. - V.25. - P.69 - 106
5. Gschwind N. Biologischer Abbau von EDTA in einem Modelwasser / / Wasser Abwasser. - 1992. - V.133. - P.546 - 549.
6. Chistyakova TI, Dedyukhina EG, Satroutdinov AD, Kaparullina EN,
Gavrish E.Yu., Eroshin VK EDTA-dependent bacterial strain. / / Process Biochem. 2005. V. 40. N 2. P. 601-605.
7. Бек М. Хімія рівноваг реакцій комплексоутворення. - М.: Світ, 1973. 145С.
8. Арчаков А.И. Оксигенази біологічних мембран. - М.: Наука, 1983. - 120 с.
9. Ляхович В.В. Структурні аспекти біохімії монооксигеназ. - Новосибірськ.: Наука, 1978. - 47 с.
10. Witschel M., Nagel S., Egli T. Identification and characterization of the two-enzyme system catalyzing the oxidation of EDTA in the EDTA-degrading bacterial strain DSM-9103 / / J. Bacteriol. - 1997. - V.179. - P.6937 - 6943.
11. Lauff JJ, Steele DB, Coogan LA, Breitfeller JM Degradation of the ferric chelate of EDTA by a pure culture of an Agrobacterium sp. / / Appl. Environ. Microbiol. 1990. V.56. P. 3346-3353.
12. Nцtermann B. Total degradation of EDTA by mixed cultures and a bacterial isolate / / Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. P. 671-676.
13. Chistyakova TI, EN Kaparullina, E.Yu. Garvish, VK Eroshin. A novel-EDTA-degrading Pseudomonas sp. / / World Journal of Microbiology and Biotechnology 2003 P.977-980
14. Foster JW Hidrocarbons as substrates for microorganisms. / / Antonie van Leeuwenhock J. Microbiol. And Serol. 1962
15. Higgins IJ, Best DJ, Hammond RC New findings in methane-utilizing bacteria highlight their importance in the biosphere and their commercial potential / / Nature (London). - 1980. - 286
16. Malashenco Yu.R. Syntabolism, the transformation of non-growth substrates up to biomass by obligate methane-oxidizing bacteria / / 4 th Int. symp. Microbial growth on C 1 - compounds (Minneapolis, Sept., 1983): Abstrs. - Minneapolis, 1983. - Thes. 2-10
17. Малашенко Ю.Р., Соколов І.Г., Романовська В.А. Мікробний метаболізм неростових субстратів .- Київ. Вид-во "Наукова думка" 1987
18. Сучасна мікробіологія. Прокаріоти. Під редакцією Ленгелера Й., Древс Г. - М.: Світ 2005.
19. Ваккер-Коузова Н.Д. Характеристика грунтових бактерій, що трансформують азобензол. / / Прикладна біохімія та мікробіологія. 2005, № 2. М.: Наука.
20. Бабошин М. А. Кометаболізм флуорен культурами Rhodococcus rhodochrous і Pseudomonas fluorescens / Бабошин М. А., Фінкельштейн З. І., Головльова Л. А. / / Мікробіологія. - 2003. - Т. 72, N 2. - С. 194-198
21. Дзюбан О. М., Косолапов Д. Б., Кузнєцов І. А. Вплив промислово-комунальних стоків м. Череповця на функціонування бактеріальних спільнот мулів Рибінського водосховища / / 11 Міжнародний симпозіум з біоіндикаторами "Сучасні проблеми біоіндикації та біомоніторингу" Сиктивкар, 17 - 21 верес., 2001 - С. 51-52. Укр.; Рез. англ.
22. Matthew F. Verce, Ricky L. Ulrich and David L. Freedman. Transition from Cometabolic to Growth-Linked Biodegradation of Vinil Chloride by a Pseudomonas sp. Isolated on Ethene. / / Environ. Sci. Technol. 2001. V.35. P. 4242-4251.
23. Ленінджер А. Біохімія. Молекулярні основи структури та функціонування клітини. - М: Світ. 1974-957с.
24.Шлегель Г. Загальна мікробіологія. М: Світ 1987. c. 194-197
25. Перт С.Дж. Основи культивування мікроорганізмів і клітин. - М: Світ. 1978. 331с.
26. bioengineering@yandex.ru, copyright 2003
27. Характеристики культур з підживленням рекомбінантної Escherichia coli, що містять аналог людського колагену кДНК при різних питомих швидкостях росту. http://www.biogene.ru/articles2.html
28. Гібридні системи біодеструкції з використанням біологічно агресивного хімічного реагенту / Кузнєцов А. Є., Сафронов В. В. / / Сб. наук. тр. - Ріс. хім.-технол. ун-т. , 2001. № 179 .- С. 227-241.].
29. Мінкевич І.Г. Матеріально-енергетичний баланс і кінетика росту мікроорганізмів .- Москва-Іжевськ: НДЦ "Регулярна і хаотична динаміка"; Інститут комп'ютерних досліджень, 2005.-352с.
30. Satroutdinov A., Dedyukhina E., Chistyakova T., Witschel M., Minkevich I., Eroshin V., Egli T. Degradation of Metal-EDTA Complexes by Resting Cells of the Bacterial Strain DSM 9103. Environ. Sci. Technol. 2000, 34, 1715-1720
Додаток 1.
Таблиця. Зростання культури на середовищі з ЕДТА (варіант 1)
| Час культивування, добу | рН | Біомаса, г / л | ЕДТА, г / л | Амоній, г / л |
| 0 | 7,35 | 0,025 | 0,873 | 0 |
| 1 | 8,13 | 0,026 | 0,734 | 7,0 |
| 2 | 8,52 | 0,072 | 0,526 | 8,0 |
| 3 | 9,21 | 0,183 | 0 | 9,9 |
| 4 | 9,64 | 0,179 | 0 | 13,6 |
| 5 | 9,77 | 0,196 | 0 | 30,0 |
| 6 | 9,64 | 0,182 | 0 | 33,8 |
| 7 | 9,59 | 0,160 | 0 | 36,2 |
| 8 | 9,76 | 0,157 | 0 | 36,6 |
| 9 | 9,55 | 0,149 | 0 | 27,0 |
| 10 | 9,53 | 0,128 | 0 | 30,5 |
Додаток 2
Таблиця. Зростання культури на середовищі з ЕДТА з додаванням глюкози до посіву бактерій (варіант 2)
| Час культивування, добу | рН | Біомаса, г / л | ЕДТА, г / л | Глюкоза, г / л | Амоній, мг / л |
| 0 | 7,50 | 0,019 | 0,873 | 0,91 | 0 |
| 1 | 8,18 | 0,031 | 0,735 | 0,86 | 7,7 |
| 2 | 8,33 | 0,121 | 0,440 | 0,88 | 8,2 |
| 3 | 9,18 | 0,257 | 0 | 0,72 | 9,7 |
| 4 | 9,39 | 0,297 | 0 | 0,61 | 14,3 |
| 5 | 9,40 | 0,293 | 0 | 0,46 | 28,6 |
| 6 | 9,27 | 0,311 | 0 | 0,39 | 32,3 |
| 7 | 8,95 | 0,348 | 0 | 0,09 | 31,4 |
| 8 | 9,61 | 0,378 | 0 | 0 | 28,2 |
| 9 | 8,72 | 0,442 | 0 | 0 | 14,8 |
| 10 | 8,82 | 0,528 | 0 | 0 | 13,9 |
| 11 | 8,85 | 0,599 | 0 | 0 | 9,0 |
| 12 | 8,87 | 0,657 | 0 | 0 | 8,0 |
| 14 | 8,62 | 0,594 | 0 | 0 | 6,9 |
Додаток 3.
Таблиця. Зростання культури на середовищі з ЕДТА з додаванням глюкози на першу добу росту (варіант 3)
| Час культивування, добу | рН | Біомаса, г / л | ЕДТА, г / л | Глюкоза, г / л | Амоній, мг / л |
| 1 | 8,20 | 0,022 | 0,743 | 0,98 | 7,8 |
| 2 | 8,33 | 0,082 | 0,452 | 0,98 | 8,7 |
| 3 | 9,16 | 0,232 | 0 | 0,80 | 10,4 |
| 4 | 9,36 | 0,268 | 0 | 0,71 | 19,2 |
| 5 | 9,23 | 0,274 | 0 | 0,60 | 27,2 |
| 6 | 9,25 | 0,306 | 0 | 0,50 | 34,3 |
| 7 | 8,90 | 0,360 | 0 | 0,22 | 31,0 |
| 8 | 9,52 | 0,391 | 0 | 0 | 26,4 |
| 9 | 9,49 | 0,371 | 0 | 0 | 14,6 |
| 10 | 9,55 | 0,361 | 0 | 0 | 14,9 |
Додаток 4
Таблиця. Зростання культури на середовищі з ЕДТА з додаванням глюкози на 2 добу росту (варіант 4)
| Час культивування, добу | рН | Біомаса, г / л | ЕДТА, г / л | Глюкоза, г / л | Амоній, мг / л |
| 2 | 8,43 | 0,069 | 0,477 | 1,02 | 9,2 |
| 3 | 9,19 | 0,223 | 0 | 0,98 | 11,4 |
| 4 | 9,47 | 0,205 | 0 | 0,78 | 15,1 |
| 5 | 9,45 | 0,235 | 0 | 0,79 | 29,4 |
| 6 | 9,53 | 0,244 | 0 | 0,76 | 34,7 |
| 7 | 9,40 | 0,208 | 0 | 0,64 | 33,8 |
| 8 | 9,05 | 0,304 | 0 | 0,34 | 32,8 |
| 9 | 9,42 | 0,392 | 0 | 0,06 | 22,0 |
| 10 | 9,56 | 0,399 | 0 | 0 | 14,1 |
Додаток 5
Таблиця. Зростання культури на середовищі з ЕДТА з додаванням глюкози на 3 добу росту (варіант 5)
| Час культивування, добу | рН | Біомаса, г / л | Глюкоза, г / л | Амоній, мг / л |
| 3 | 9,64 | 0,183 | 1,06 | 13,2 |
| 4 | 9,62 | 0,201 | 0,95 | 15,9 |
| 5 | 9,65 | 0,199 | 0,95 | 34,8 |
| 6 | 9,77 | 0,196 | 0,93 | 34,4 |
| 7 | 9,75 | 0,165 | 0,89 | 32,3 |
| 8 | 9,64 | 0,188 | 0,86 | 31,0 |
| 9 | 9,37 | 0,211 | 0,83 | 21,3 |
| 10 | 8,57 | 0,362 | 0,34 | 12,5 |
| 11 | 9,09 | 0,413 | 0 | 10,7 |
| 12 | 9, .48 | 0,423 | 0 | 9,5 |
| 14 | - | 0,389 | 0 | 6,4 |
Додаток 6
Таблиця. Зростання культури на середовищі з ЕДТА з додаванням глюкози на 4 добу росту (варіант 6)
| Час культивування, добу | рН | Біомаса, г / л | Глюкоза, г / л | Амоній, мг / л |
| 4 | 9,60 | 0,179 | 0,98 | 18,1 |
| 5 | 9,67 | 0,197 | 0,98 | 30,9 |
| 6 | 9,81 | 0,199 | 0,96 | 37,5 |
| 7 | 9,75 | 0,142 | 0,99 | 34,2 |
| 8 | 9,75 | 0,168 | 0,98 | 36,2 |
| 9 | 9,65 | 0,146 | 0,94 | 27,9 |
| 10 | 9,62 | 0,145 | 0,92 | 26,9 |
Додаток 7
Таблиця. Зростання культури на середовищі з ЕДТА з додаванням глюкози на 5 добу росту (варіант 7)
| Час культивування, добу | рН | Біомаса, г / л | Глюкоза, г / л | Амоній, г / л |
| 5 | 9,73 | 0,223 | 1,09 | 39,9 |
| 6 | 9,77 | 0,221 | 1,10 | 38,9 |
| 7 | 9,75 | 0,162 | 1,08 | 42,5 |
| 8 | 9,72 | 0,181 | 1,02 | 38,2 |
| 9 | 9,66 | 0,164 | 1,02 | 33,0 |
| 10 | 9,63 | 0,171 | 0,98 | 31,5 |
Додаток 8
Таблиця. Зростання культури на середовищі з ЕДТА з додаванням глюкози на 6 добу посіву (варіант 8)
| Час культивування, добу | рН | Біомаса, г / л | Глюкоза, г / л | Амоній, мг / л |
| 6 | 9,64 | 0,227 | 0,78 | 47,1 |
| 7 | 9,75 | 0,179 | 0,77 | 44,2 |
| 8 | 9,72 | 0,193 | 0,72 | 41,6 |
| 9 | 9,67 | 0,166 | 0,75 | 36,8 |
| 10 | 9,73 | 0,149 | 0,71 | 35,6 |
Додаток 9
Таблиця. Вплив добавок ЕДТА в середу на зростання штаму LPM-4
Часкультивує-нування, добу | Час внесення добавок ЕДТА | |||||
| Контроль (до посіву) (варіант 1) | 4суткі (Варіант 2) | 4, 6 добу (Варіант 3) | ||||
| ЕДТА, г / л | Біомаса, г / л | ЕДТА, г / л | Біомаса, г / л | ЕДТА, г / л | Біомаса, г / л | |
| 0 | 0,94 | 0,010 | 0,94 | 0,010 | 0,94 | 0,010 |
| 1 | 0,78 | 0,016 | 0,78 | 0,016 | 0,78 | 0,016 |
| 2 | н / о | 0,026 | - | 0,026 | - | 0,026 |
| 3 | 0,62 | 0,092 | 0,62 | 0,084 | 0,62 | 0,084 |
| 4 | 0 | 0,190 | 1,26 | 0,200 | 1,26 | 0,200 |
| 5 | - | 0,188 | 0,01 | 0,380 | 0,01 | 0,380 |
| 6 | - | 0,177 | 0 | 0,366 | 1,68 | 0,374 |
| 7 | - | 0,175 | - | 0,389 | 0,98 | 0,432 |
| 8 | - | 0,180 | - | 0,444 | 0,90 | 0,436 |
| 9 | - | 0,165 | - | 0,402 | 0,84 | 0,429 |
| 10 | - | 0,158 | - | 0,428 | 0,46 | 0,502 |
| 11 | - | 0,173 | - | 0,417 | 0,03 | 0,661 |
| 12 | - | 0,182 | - | 0,437 | 0 | 0,637 |
| 13 | - | 0,179 | - | 0,404 | - | 0,602 |
| 14 | - | 0,177 | - | 0,400 | - | 0,662 |
| 15 | - | 0,170 | - | 0,392 | - | 0,649 |
| 16 | - | - | - | - | - | 0,642 |
| 17 | - | - | - | - | - | 0,649 |
Додаток 10.
Таблиця
ЕДТА-індукована асиміляція глюкози у штаму LPM-4 при багаторазовому додаванні глюкози в середу.
Таблиця
ЕДТА-індукована асиміляція глюкози у штаму LPM-4 при багаторазовому додаванні глюкози в середу.
Часкультивує-нування,добу | Час внесення добавок глюкози | ||||||||
| Контроль (до посіву) (варіант 4) | 9суткі (Варіант 6) | 13 добу (Варіант 8) | 21 добу (Варіант10) | ||||||
| ЕДТА, г / л | Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | |
| 0 | 1,23 | 1,35 | 0,011 | 1,35 | 0,011 | 1,35 | 0,011 | 1,35 | 0,011 |
| 1 | н / о | 1,39 | 0,014 | 1,39 | 0,014 | 1,39 | 0,014 | 1,39 | 0,014 |
| 2 | 1,06 | 1,38 | 0,019 | 1,38 | 0,019 | 1,38 | 0,019 | 1,38 | 0,019 |
| 3 | 0,91 | 1,38 | 0,075 | 1,38 | 0,075 | 1,38 | 0,075 | 1,38 | 0,075 |
| 4 | 0 | 1,04 | 0,280 | 1,04 | 0,280 | 1,04 | 0,280 | 1,04 | 0,280 |
| 5 | - | 1,0 | 0,262 | 1,0 | 0,262 | 1,0 | 0,262 | 1,0 | 0,262 |
| 6 | - | 0,91 | 0,287 | 0,91 | 0,287 | 0,91 | 0,287 | 0,91 | 0,287 |
| 7 | - | 0,62 | 0,293 | 0,62 | 0,293 | 0,62 | 0,293 | 0,62 | 0,293 |
| 8 | - | 0,22 | 0,383 | 0,22 | 0,359 | 0,22 | 0,359 | 0,22 | 0,359 |
| 9 | - | 0 | 0,422 | 1,69 | 0,426 | 1,69 | 0,426 | 1,69 | 0,426 |
| 10 | - | - | 0,423 | 0,96 | 0,550 | 0,96 | 0,550 | 0,96 | 0,550 |
| 11 | - | - | 0,446 | 0,67 | 0,622 | 0,67 | 0,622 | 0,67 | 0,622 |
| 12 | - | - | 0,477 | 0,31 | 0,721 | 0,31 | 0,721 | 0,31 | 0,721 |
Часкультивує-нування,добу | Час внесення добавок глюкози | ||||||||
| Контроль (до посіву) (варіант 4) | 9суткі (Варіант 6) | 13 добу (Варіант 8) | 21 добу (Варіант10) | ||||||
| ЕДТА, г / л | Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | |
| 13 | - | - | 0,477 | 0,05 | н / о | 1,64 | 0,682 | 1,64 | 0,682 |
| 14 | - | - | 0,507 | 0 | 0,693 | 1,61 | 0,743 | 1,61 | 0,743 |
| 15 | - | - | 0,474 | - | 0,661 | 1,18 | 0,777 | 1,18 | 0,777 |
| 16 | - | - | - | - | 0,637 | 1,05 | 0,792 | 1,05 | 0,792 |
| 17 | - | - | - | - | 0,614 | 0,85 | 0,805 | 0,85 | 0,805 |
| 18 | - | - | - | - | 0,621 | 0,64 | 0,802 | 0,64 | 0,802 |
| 19 | - | - | - | - | 0,585 | 0,40 | 0,781 | 0,40 | 0,781 |
| 20 | - | - | - | - | 0,575 | 0,22 | 0,780 | 0,22 | 0,780 |
| 21 | - | - | - | - | 0,612 | 0,17 | 0,794 | 1,35 | 0,818 |
| 22 | - | - | - | - | 0,572 | 0,05 | 0,811 | 1,19 | 0,834 |
| 23 | - | - | - | - | 0,598 | 0 | 0,839 | 1,14 | 0,868 |
| 24 | - | - | - | - | 0,583 | - | 0,734 | 0,94 | 0,847 |
| 28 | - | - | - | - | 0,603 | - | 0,625 | 0,4 | 0,843 |
| 29 | - | - | - | - | 0,611 | - | 0,639 | 0,36 | 0,846 |
| 30 | - | - | - | - | - | - | н / о | 0,31 | 0,851 |
Додаток 11
Таблиця. Асиміляція ЕДТА 9-добової культури штаму LPM-4, вирощеної в присутності глюкози
Таблиця. Асиміляція ЕДТА 9-добової культури штаму LPM-4, вирощеної в присутності глюкози
Часкультивування,добу | Час внесення ЕДТА | |||||||||
| Контроль (до посіву) (варіант 4) | 9 добу (варіант 5) | |||||||||
| ЕДТА, г / л | Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | ЕДТА, г / л | Біомаса. г / л | ||||||
| 0 | 1,23 | 1,35 | 0,011 | 1,23 | 0,011 | |||||
| 1 | н / о | 1,39 | 0,014 | н / о | 0,014 | |||||
| 2 | 1,06 | 1,38 | 0,019 | 1,06 | 0,019 | |||||
| 3 | 0,91 | 1,38 | 0,075 | 0,91 | 0,075 | |||||
| 4 | 0 | 1,04 | 0,280 | 0 | 0,280 | |||||
| 5 | - | 1,0 | 0,262 | - | 0,262 | |||||
| 6 | - | 0,91 | 0,287 | - | 0,287 | |||||
| 7 | - | 0,62 | 0,293 | - | 0,293 | |||||
| 8 | - | 0,22 | 0,383 | - | 0,371 | |||||
| 9 | - | 0 | 0,422 | 1,92 | 0,434 | |||||
| 10 | - | - | 0,423 | 0,01 | Н / о | |||||
| 11 | - | - | 0,446 | 0 | 0,682 | |||||
| 12 | - | - | 0,477 | - | 0,710 | |||||
Часкультивування,добу | Час внесення ЕДТА | |||||||||
| Контроль (до посіву) (варіант 4) | 9 добу (варіант 5) | |||||||||
| ЕДТА, г / л | Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | ЕДТА, г / л | Біомаса. г / л | ||||||
| 13 | - | - | 0,477 | - | 0,713 | |||||
| 14 | - | - | 0,507 | - | 0,679 | |||||
| 15 | - | - | 0,474 | - | 0,700 | |||||
| 16 | - | - | - | - | 0,733 | |||||
| 17 | - | - | - | - | 0,748 | |||||
| 18 | - | - | - | - | 0,759 | |||||
| 19 | - | - | - | - | 0,716 | |||||
| 20 | - | - | - | - | 0,666 | |||||
| 21 | - | - | - | - | 0,725 | |||||
| 22 | - | - | - | - | 0,739 | |||||
| 23 | - | 0,748 | ||||||||
| 24 | - | 0,747 | ||||||||
Додаток 12
Таблиця. Деградація ЕДТА 13-добової культури штаму LPM-4, вирощеної в присутності глюкози.
Додаток 13
Таблиця. Асиміляція ЕДТА 21-добової культури штаму LPM-4, вирощеної в присутності глюкози.
Таблиця. Деградація ЕДТА 13-добової культури штаму LPM-4, вирощеної в присутності глюкози.
Часкультивування,добу | Час внесення ЕДТА | |||
| Контроль (Варіант 6) | 13 добу (Варіант 7) | |||
| Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | ЕДТА, г / л | Біомаса. г / л | |
| 8 | - | 0,359 | 1,58 | 0,359 |
| 9 | 1,69 | 0,426 | 0,27 | 0,426 |
| 10 | 0,96 | 0,550 | 0 | 0,550 |
| 11 | 0,67 | 0,622 | - | 0,622 |
| 12 | 0,31 | 0,721 | - | 0,721 |
| 13 | 0,05 | 0,699 | - | 0,699 |
| 14 | 0 | 0,693 | - | 0,693 |
| 15 | - | 0,661 | - | 0,747 |
| 16 | - | 0,637 | - | 0,794 |
| 17 | - | 0,614 | - | 0,809 |
| 18 | - | 0,621 | - | 0,807 |
| 19 | - | 0,585 | - | 0,771 |
| 20 | - | 0,575 | - | 0,780 |
| 21 | - | 0,612 | - | 0,796 |
| 22 | - | 0,572 | - | 0,787 |
| 23 | - | 0,598 | - | 0,814 |
| 24 | - | 0,583 | - | 0,811 |
| 28 | - | 0,603 | - | 0,827 |
| 29 | - | 0,611 | - | 0,845 |
Додаток 13
Таблиця. Асиміляція ЕДТА 21-добової культури штаму LPM-4, вирощеної в присутності глюкози.
Часкультивування,добу | Час внесення добавок ЕДТА | |||
| Контроль (Варіант 8) | 21 добу (Варіант 9) | |||
| Глюкоза, г / л | Біомаса. г / л | ЕДТА, г / л | Біомаса. г / л | |
| 13 | 1,64 | 0,682 | 0 | 0,682 |
| 14 | 1,61 | 0,743 | 0 | 0,743 |
| 15 | 1,18 | 0,777 | 0 | 0,777 |
| 16 | 1,05 | 0,792 | 0 | 0,792 |
| 17 | 0,85 | 0,805 | 0 | 0,805 |
| 18 | 0,64 | 0,802 | 0 | 0,802 |
| 19 | 0,40 | 0,781 | 0 | 0,781 |
| 20 | 0,22 | 0,780 | 0 | 0,780 |
| 21 | 0,17 | 0,794 | 1,57 | 0,777 |
| 22 | 0,05 | 0,811 | 0,01 | 0,836 |
| 23 | 0 | 0,839 | 0 | 0,854 |
| 24 | - | 0,734 | 0 | 0,819 |
| 28 | - | 0,625 | 0 | 0,828 |
| 29 | - | 0,639 | 0 | 0,880 |