Клітинна інженерія
Клітинна інженерія у людини і тварин
Передумовою до розвитку клітинної інженерії у людини і тварин є розробка методів культивування їх соматичних клітин на штучних поживних середовищах, а також отримання гібридів соматичних клітин, включаючи міжвидові гібриди. У свою чергу, успіхи в культивуванні соматичних клітин вплинули на вивчення статевих клітин і запліднення у людини і тварин. Починаючи з 60-х рр.., В кількох лабораторіях світу були виконані численні експерименти по пересадці ядер соматичних клітин в яйцеклітини, штучно позбавлені ядер. Результати цих експериментів часто були суперечливі, але в цілому вони привели до відкриття здатності клітинних ядер забезпечувати нормальний розвиток яйцеклітинНа основі результатів вивчення розвитку запліднених яйцеклітин у 60-і рр.. були розпочаті також дослідження щодо з'ясування можливості запліднення яйцеклітин поза організмом матері. Дуже швидко ці дослідження привели до відкриття можливості запліднення яйцеклітин сперматозоїдами в пробірці і подальшого розвитку утворених таким шляхом зародків при імплантації їх у матку жінки. Подальше вдосконалення розроблених у цій галузі методів призвело до того, що народження "пробіркових" дітей стало реальністю. Вже до 1981 р. в світі було народжене 12 дітей, життя яких була дана в лабораторії, в пробірці. В даний час цей розділ клітинної інженерії набув великого поширення, а кількість "пробіркових" дітей становить вже десятки тисяч. У нашій країні роботи по отриманню "пробіркових" дітей були розпочаті в 1986 р. У 1993 році була розроблена методика отримання монозиготних близнюків людини in vitro, шляхом поділу ембріонів на бластомери та дорощування останніх до 32 клітин, після чого вони могли бути імплантовані в матку жінки .
Під впливом результатів, пов'язаних з отриманням "пробіркових" дітей, у тварин теж була розроблена технологія, що отримала назву трансплантації ембріонів. Вона пов'язана з розробкою способу індукції поліовуляції, способів штучного запліднення яйцеклітин та імплантації зародків в організм тварин - прийомних матерів. Суть цієї технології зводиться до наступного. Високопродуктивної корові вводять гормони, в результаті чого настає поліовуляції, що полягає у дозріванні відразу 10-20 клітин. Потім яйцеклітини штучно запліднюються чоловічими статевими клітинами в яйцепровід. На 7-8-й день зародків вимивають з матки і трансплантують в матки іншим коровам (прийомним матерям), які потім дають життя телятам-близнюках. Телята успадковують генетичний статус своїх справжніх батьків.
Інший областю клітинної інженерії у тварин є отримання трансгенних тварин. Найбільш простий спосіб отримання таких тварин полягає у введенні в яйцеклітини вихідних тварин лінійних молекул ДНК. Тварини, що розвинулися з запліднених таким чином яйцеклітин, будуть містити в одній зі своїх хромосом копію введеного гена. Більше того, вони і будуть передавати цей ген у спадок. Більш складний спосіб отримання трансгенних тварин розроблений на мишах, що розрізняються за забарвленням вовняного покриву і зводиться до наступного. Спочатку з організму вагітної сірої миші витягають чотириденних зародків і подрібнюють їх на окремі клітини. Потім з ембріональних клітин витягають ядра, переносять їх в яйцеклітини чорних мишей, попередньо позбавлені ядер. Яйцеклітини чорних мишей, що містять чужі ядра, поміщають у пробірки з живильним розчином для подальшого розвитку. Розвинені з яйцеклітини чорних мишей зародки імплантують в матки білих мишей. У виконаних за цією методикою експериментах від п'яти білих мишей ("прийомних матерів") було отримано 36 мишей, серед яких троє були сірими. Таким чином, в цих експериментах вдалося отримати клон мишей із сірою забарвленням вовняного покриву, тобто клонувати ембріональні клітини із заданими властивостями. У § 35 ми розглянули результати запліднення штучно позбавлених ядер яйцеклітин овець ядерним матеріалом соматичних клітин тварин цього ж виду. Зокрема, з яйцеклітин овець видаляли ядра, а потім у такі яйцеклітини вводили ядра соматичних клітин (ембріональних, плодових або клітин дорослих тварин), після чого запліднені таким чином яйцеклітини вводять в матки дорослих овець. Народжуються ягнята виявилися ідентичними вівці-донору. Як було зазначено у § 35, таке отримання трансгенних тварин являє собою прямий шлях клонування тварин з господарсько-корисними ознаками, включаючи особин певної статі.
Трансгенні тварини отримані також при використанні вихідного матеріалу, що належить різним видам, зокрема, відомий спосіб передачі гена, контролюючого гормон росту, від щурів в яйцеклітини мишей, а також спосіб комбінування бластомерів вівці з бластомерах кози, що призвело до отримання гібридних тварин (ковец) . Ці експерименти вказують на можливість подолання видовий несумісності на самих ранніх етапах розвитку. Особливо привабливі перспективи відкриваються (якщо видова несумісність буде подолана повністю) на шляху запліднення яйцеклітин одного виду ядрами соматичних клітин іншого виду. Мова йде про реальну перспективу отримання господарсько-цінних гібридів тварин, яких неможливо отримати шляхом схрещувань.
Слід зазначити, що ядерно-трансплантаційні роботи ще не дуже ефективні. Експерименти, виконані на земноводних і ссавців, в цілому показали, що їх результативність є невеликий, причому вона залежить від несумісності між донорськими ядрами і реципієнтного овоцита. Крім того, перешкодою на шляху до успіхів є також утворюються хромосомні аберації в трансплантованих ядрах у ході подальшого розвитку, які супроводжуються загибеллю трансгенних тварин.
На стику робіт з вивчення гібридизації клітин та імунологічних досліджень виникла проблематика, пов'язана з отриманням та вивченням про моноклональних антитіл. Як зазначено вище (див. § 96), антитіла, які продукують організмом у відповідь на введення антигену (бактерії, віруси, еритроцити і т.д.), представляють собою білки, звані імуноглобулінами і складові фундаментальну частину захисної системи організму проти збудників хвороб. Але будь-яке чужорідне тіло, що вводиться в організм, являє собою суміш різних антигенів, які будуть порушувати продукцію різних антитіл. Наприклад, еритроцити людини володіють антигенами не тільки для груп крові А (II) і В (III), але і багатьма іншими антигенами, включаючи резус-фактор. Далі, білки клітинної стінки бактерій або капсида вірусів також можуть діяти в якості різних антигенів, що викликають утворення різних антитіл. У той же час лімфоїдні клітини імунної системи організму зазвичай представлені клонами. Значить, навіть тільки з цієї причини в сироватці крові імунізованих тварин антитіла завжди являють собою суміш, що складається з антитіл, які продукуються клітинами різних клонів. Тим часом для практичних потреб необхідні антитіла тільки одного типу, тобто необхідні так звані моноспецифічний сироватки, що містять антитіла тільки одного типу, або, як їх називають, моноклональні антитіла.
У пошуках методів отримання моноклональних антитіл швейцарськими дослідниками в 1975 р. був відкритий спосіб отримання гібридів між лімфоцитами мишей, імунізованих тим чи іншим антигеном, і культивуються пухлинними клітинами кісткового мозку. Такі гібриди отримали назву "гібридоми". Від "лімфоцитарною" частини, представленої лимфоцитом одного клону, одиночна Гібридома успадковує здатність викликати утворення необхідних антитіл, причому одного типу, а завдяки "пухлинної (мієломної)" частини вона стає здатною, як і всі пухлинні клітини, нескінченно довго розмножуватись на штучних поживних середовищах , даючи численну популяцію гібридом. Лінії мишачих клітин, що синтезують моноклональні антитіла, виділяють шляхом злиття мієломних клітин з лімфоцитами з селезінки миші, імунізованих за п'ять днів до цього бажаним антигеном. Злиття клітин досягають змішуванням їх в присутності поліетиленгліколю, який індукує злиття клітинних мембран, а потім у висіві їх на поживне середовище, що дозволяє ріст і розмноження тільки гібридних клітин (гібридом). Розмноження гібридоми розводять в рідкому середовищі, де вони ростуть далі і секретують антитіла в культуральну рідину, причому тільки одного типу, до того ж у необмежених кількостях. Ці антитіла отримали назву моноклональних.
Щоб підвищити частоту утворення антитіл, вдаються до клонування гібридом, тобто до селекції окремих колоній гібридом, здатних викликати утворення найбільшої кількості антитіл бажаного типу. Моноклональні антитіла знайшли широке застосування в медицині для діагностики та лікування ряду хвороб У той же час найважливіша перевага моноклональній технології полягає в тому, що з її допомогою можуть бути отримані антитіла проти матеріалів, які неможливо очистити. Навпаки, можна отримати моноклональні антитіла проти клітинних (плазматичних) мембран нейронів тварин. Для цього мишей імунізують виділеними мембранами нейронів, після чого їх селезінкові лімфоцити об'єднують з мієломні клітинами, а далі надходять, як описано вище.
Клітинна інженерія у рослин
Клітинна інженерія у рослин полягає в отриманні рослин з однієї клітини, а також у генетичні маніпуляції з ізольованими клітинами, спрямованими на перетворення їх генотипів.Метод отримання рослин з однієї клітини заснований на здатності тканин рослин ряду видів до неорганическому зростанню на спеціальних штучних середовищах, що містять поживні речовини і регулятори росту. При культивуванні тканин рослин на таких середовищах багато клітин виявляються здатними до необмеженого розмноження, утворюючи шари (масу) недиференційованих клітин, які отримали назву калюсу. Якщо потім каллус розділити на окремі клітини і продовжити культивування ізольованих клітин на поживних середовищах, то з окремих (одиночних) клітин можуть розвинутися справжні рослини. Здатність одиночних соматичних клітин рослин розвиватися в даний (ціле) рослина, називають тотіпотентностио. Можливо, тотіпотентность властива клітинам всіх листостеблових рослин. Але поки вона виявлена у рослин обмеженого кола. Зокрема, ця здатність виявлена у клітин картоплі, моркви, тютюну і ряду інших видів сільськогосподарських культур. Цей метод клітинної інженерії рослин уже ввійшов у широку практику. Однак рослини, що розвинулися з однієї клітини, характеризуються генетичною нестабільністю, що пов'язано з мутаціями їх хромосом. Оскільки генетична нестабільність дає різноманітні форми рослин, вони дуже корисні в якості вихідного матеріалу для селекції.
Однак рослини можна отримати і з так званих протопластів рослинних клітин, під якими розуміють клітини, у яких штучно за допомогою гідролітичних ферментів (пектиназу і целюлази) вилучено клітинна стінка. Зазвичай протопласти отримують з клітин листя, коріння, пелюсток, проростає пилку, плодів та інших структур рослин. Здатність протопластів давати початок рослинам виявлена у дуже великої кількості видів.
Отримання рослин з однієї клітини або протопласта часто називають клонального мікророзмноження. Найголовніша перевага цього методу полягає в тому, що він дозволяє різко скоротити строки розмноження багатьох видів рослин, а також дуже швидко відтворити одне і те ж рослина в сотнях тисяч примірників, що має винятково важливе значення в селекційній роботі і в отриманні посадкового матеріалу, незараженої збудниками хвороб
Генетичні маніпуляції, пов'язані з рослинними клітинами, спрямовані на перетворення генотипів клітин рослин, що досягають або шляхом соматичної гібридизації (отримання гібридних клітин) або шляхом переносу в клітини генетичного матеріалу, що походить від інших організмів. У всіх випадках вихідним матеріалом є протопласти клітин.
Соматичну гібридизацію здійснюють у кілька етапів, а саме:
1. Отримання і злиття протопластів, що походять від клітин рослин різних видів.
2. Культивування гібридних протопластів, використовуючи селективні поживні середовища.
3. Регенерація рослин із соматичних гібридів (гібридів протопластів) через освіту останніми калюсу.
Перенесення генетичного матеріалу від одних клітин до інших здійснюють шляхом трансформації протопластів чужорідної ДНК або введенням в протопласти чужорідної ДНК за допомогою плазмід. З утворюється потім калюсу вирощують рослини, що містять цікавить ген. Рослини, отримані таким шляхом, називають трансгенними рослинами.
Список літератури:
1. Біологія. У 2 кн. (Підручник) Під ред. В.Н. Яригіна (2003, 5-е вид., 432с., 32. Мікробіологія. (Підручник) Гусєв М.В., Мінєєва Л.А. (2003, 464с)
3. Біологія з основами екології. (Підручник) Пехов А.П. (2000,