Зорові пігменти

Якщо ми проектуємо на білий екран два пучка світла різних кольорів одночасно ... ми бачимо тільки один колір, більш-менш відмінний від обох цих квітів. Ми зможемо краще зрозуміти видатний факт того, що ми здатні сприймати всі відтінки у складі зовнішнього світла шляхом суміші трьох основних кольорів, якщо ми порівняємо очей сухому ... У разі звуку ... ми чуємо більш довгі хвилі як низькі тони, а короткі хвилі - як високі і пронизливі, крім цього вухо здатне вловлювати одночасно багато звукових хвиль, тобто багато нот. данном случае не сливаются в один сложный аккорд, подобно тому, как различные цвета... Однак вони β даному випадку не зливаються в один складний акорд, подібно до того, як різні кольори ... зливаються в один складний колір. Око не може показати різницю, якщо ми замінюємо помаранчевий колір на червоний або жовтий, але якщо ми чуємо ноти до і ми, що звучать одночасно, нам таке звучання не здається нотою ре. Якщо б вухо сприймало музичні тони подібно до того, як око сприймає кольори, кожен акорд міг би бути представлений комбінацією трьох постійних нот, однієї дуже низькою, однієї дуже високою і однієї проміжної, викликаючи всі можливі музичні ефекти тільки шляхом змін відносної гучності цих трьох нот. .. Однак ми здатні бачити плавний перехід кольорів одного в інший через нескінченну безліч відтінків і градацій ... Те, яким чином ми сприймаємо кожен з квітів ... залежить е основному від будови нашої нервової системи. Треба зізнатися, в даний час ні у людини, ні в чотириногих не описана анатомічна база для підтвердження теорії сприйняття кольору.

Ці точні і далекоглядні прогнози були підтверджені серією різних спостережень. За допомогою спектрофотометрії Вальд, Браук, МакНікол і Дартнел з колегами показали наявність в сітківці людини трьох типів колб з різними пігментами. Было обнаружено, что три популяции колбочек имеют различные, но перекрывающиеся диапазоны чувствительности к голубой, зеленой и красной части спектра. Також Бейлор з колегами зуміли відвести струми від колб мавп і людини. Було виявлено, що три популяції колб мають різні, але перекриваються діапазони чутливості до блакитної, зеленої та червоної частини спектру. Оптимальні довжини хвиль для порушення електричних сигналів в точності збіглися з піками поглинання світла зоровими пігментами, встановленими за допомогою спектрофотометрії і при психофізичних експериментах по вимірюванню чутливості ока до колірного спектру. У кінцевому підсумку Натаісом були клоновані і секвенований гени, що кодують пігмент опсин в трьох типах колбочек, чутливих до червоного, зеленого і синього спектру.

Яким же чином молекули різних зорових пігментів здатні переважно вловлювати світло певної довжини хвилі? Виявляється, родопсин - зоровий пігмент паличок і всі три зорових пігменту колб містять у своєму складі один і той же хромофор, 11-цис-ретиналь. Однак амінокислотні послідовності білкової частини пігменту відрізняються один від одного. Відмінностями всього в декількох амінокислотах і пояснюється різна їх чутливість до спектру.

_{Колірна сліпота}

Хоча один тип фоторецептора не здатен сам по собі сприймати колір, три типи колбочок, як показано на рис. 4, уже здатні.

У принципі, двох типів колб з різними пігментами було б досить для розпізнавання кольору, проте в цьому випадку ряд комбінацій довжин хвиль сприймався б однаково. Подібна ситуація виникає у разі, коли людина страждає колірною сліпотою. У таких людей, як було показано Натансом, є генетичні дефекти, що призводять до відсутності одного з пігментів. З висоти нинішнього стану науки ми не можемо не здивуватися тому, як красиво молекулярні механізми підтверджують блискучі й на диво точні роздуми Янга і Гельмгольца.

Рис. 4. "Темновой" струм в паличці. (А) У темряві іони натрію проходять через катіонні канали в зовнішньому сегменті паличок, викликаючи деполяризацію; іони кальцію також здатні проходити через зти катіонні канали. Петля струму проходить через перешийок палички за рахунок того, що калієвий струм тече в напрямку назовні у внутрішньому сегменті мембрани. (В) Коли відбувається освітлення зовнішнього сегмента, канали закриваються через зменшення внутрішньоклітинної концентрації цГМФ, і паличка гіперполярізуется. Гиперполяризация проводить до зменшення вивільнення медіатора. Концентрації натрію, калію і кальцію підтримуються всередині палички спеціальними насосами і іонообмінниками, розташованими в області внутрішнього сегмента (чорні кружки). Транпортери кальцію також знаходяться і в зовнішньому сегменті.

Їхня ідея про те, що основні атрибути кольорового зору і колірної сліпоти повинні бути виявлені в самих фоторецепторах, були підтверджені за допомогою прямих фізіологічних вимірювань, а також щодо відмінностей будова пігментів на генетичному та білковому рівнях вий потенціал становить порядку - 40 мВ, що далеко від рівноважного калієвого потенціалу Е _К, становить - 80 мВ.

Рис. 5. Роль цГМФ у відкритті натрієвих каналів зовнішнього сегмента паличок. Проводилася реєстрація активності поодиноких каналів за допомогою inside-out patch clamp, що знаходяться в розчині з різною концентрацією цГМФ. Відкриття каналу призводить до відхилення струму вгору. Частота відкриття каналів була дуже низька в контролі, додавання цГМФ призводило до збільшення частоти відкриття поодиноких каналів, яка прямо залежала від концентрації цГМФ

Вхідний струм у темряві переноситься в основному іонами натрію, наступними за електрохімічного градієнту через катіонні канали зовнішнього сегмента. Гиперполяризация фоторецептора при дії світла обумовлена ​​закриттям цих каналів, що приводить до зрушення мембранного потенціалу в бік Е _К.

_{Властивості каналів фоторецептора}

Катіонні канали зовнішнього сегмента при фізіологічних умовах мають співвідношення в провідності іонів кальцію / натрію / калію як 12,5: 1,0: 0,7 і провідність одиночного каналу близько 0,1 ПСМ ^21). Через те, що концентрація натрію набагато вище, ніж концентрація кальцію, близько 85% вхідного струму припадає на іони натрію. Рушійна сила іонів калію спрямована назовні клітини. При проходженні каналу іонами кальцію, ці іони міцно зв'язуються зі стінкою пори і заважають, таким чином, проведення інших іонів. Саме через це видалення кальцію з позаклітинної середовища призводить до більш легкому проходженню іонів калію і натрію через канали, провідність яких зростає до 25 ПСМ.

Фесенко, Яу, Бейлор, Страйер з колегами показали, що циклічна ГМФ відіграє роль внутрішнього переносника сигналу від диска до поверхні мембрани. Як показано на рис.4, висока концентрація цГМФ у цитоплазмі підтримує катіонні канали у відкритому стані. При зменшенні концентрації цГМФ з внутрішньої поверхні мембрани відкриття катіонних каналів стає рідкісною подією. Таким чином, мембранний потенціал фоторецепторів є відображенням концентрації цГМФ у цитоплазмі: чим вище концентрація цГМФ, тим більше деполяризація клітини. Концентрація ж цГМФ, у свою чергу, залежить від інтенсивності падаючого світла. Підвищення інтенсивності світла призводить до зменшення концентрації цГМФ та зменшує частку відкритих каналів. У відсутності цГМФ майже всі канали закриті, і опір мембрани зовнішнього сегмента наближається до значення опору ліпідного бішару.

_{Молекулярна структура цГМФ-керованих каналів}

Була виділена кДНК для іонних каналів зовнішнього сегмента паличок та визначено амінокислотні послідовності субодиниць даних каналів в сітківці людини, бика, миші та курки. Було виявлено значну подібність ДНК для цих та інших цГМФ-керованих іонних каналів - наприклад, знайдених в нюхової

_{Передача сигналу в фоторецепторах}

Яким чином фотоизомеризации родопсину призводить до зміни мембранного потенціалу? Протягом багатьох років було зрозуміло, що необхідний якийсь внутрішній посередник для порушення електричних сигналів в паличках і колбах. Однією з причин підозрювати, що інформація про поглинання фотонів в області зовнішнього сегмента палички передається за допомогою переносника, був той факт, що сам пігмент родопсин знаходиться усередині диска, а сигнал поширюється через цитоплазму до зовнішньої мембрани. Другою причиною було значне посилення відповіді. Бейлор з колегами, вивчаючи фоторецептори черепахи, показав, що зменшення мембранної провідності та реєстрованих електричних сигналів виникає вже при поглинанні всього одного фотона і активації однієї з ¹⁰ серпня пігментних молекул.

Послідовність подій, при яких активована молекула фотопігмента змінює мембранний потенціал, була з'ясована при вивченні зовнішніх сегментів паличок і колбочок, використовуючи методи двоелектродної фіксації потенціалу і методів молекулярної біології. Схема передачі сигналу від поглинання фотона світла до електричного сигналу показана на рис. 3.

У темряві в зовнішніх сегментах паличок і колбочок протікає постійний вхідний "темнової" струм. У результаті їх мембран системі. Мембранні ділянки цих каналів виявляють структурну схожість з іншими катіон-селективними каналами, особливо в області S4 і в області, формує іонну пору. Іонні канали фоторецептора є тетрамерами, складеними, принаймні, з 2 різних білкових субодиниць з молекулярною масою 63 і 240 кДа відповідно.

Внутрішньоклітинні місця зв'язування нуклеотидів розташовані близько карбоксильного кінця субодиниць. Експресія цих субодиниць в ооцитах призводить до формування катіонних каналів, що мають властивості подібні каналах, розташованим у зовнішніх сегментах паличок: вони активуються цГМФ і мають очікувані співвідношення провідності і проникності.

Рис. 6. Механізм активації G-білка при активації молекули фотопігмента. G-білок трансдуцін пов'язує ГТФ в присутності метародопсіна II, що призводить до активації фосфодіестерази, яка, у свою чергу, гідролізує цГМФ. При падінні концентрації цГМФ закриваються натрієві канали.

_{Метаболічний каскад циклічного ГМФ}

Ланцюжок подій, що призводять до зменшення концентрації цГМФ і до подальшого закриття іонних каналів, показана на рис.5. Зменшення внутрішньоклітинної концентрації цГМФ викликається світлом, що призводить до утворення метародопсіна II, проміжного продукту у розпаді фотопігмента. Метародопсін II впливає, у свою чергу, на G-білок трансдуцін, який складається з 3 поліпептидних ланцюгів ·

Взаємодія метародопсіна II і трансдуцін призводить до заміни пов'язаної з G-білком молекули ГДФ на ГТФ. Це активує? Субодиницю G-білка, яка відділяється від субодиниць і, у свою чергу, активує розташовану в прімембранной області фосфодіестеразу: фермент, який гідролізує цГМФ. Концентрація цГМФ падає, стає менше відкритих іонних каналів, паличка гіперполярізуется. Каскад переривається при фосфорилюванні С-кінця активного метародопсіна II. Ключова роль цГМФ у регулюванні стані катіонних каналів була підтверджена біохімічними експериментами. Освітлення фоторецепторів може викликати 20% падіння рівня цГМФ у клітці.

_{Рецептори хребетних, деполярізующего при дії світла}

Цікавим винятком з механізму фоторецепції, наведеного вище, є деякі рецептори хребетних. У ящірок є третє око, розташований на маківці. У ньому перебувають маленькі "колбочки", здатні сприймати зображення, схоже на сприйманим основними (бічними) очима. Ці фоторецептори, однак, примітні тим, що деполярізуется при освітленні. Канали, керовані нуклеотидами, тут мають подібну будову і функціонування з фоторецепторами інших хребетних, за одним винятком: активація фоторецептора і G-білка призводить до збільшення концентрації цГМФ. У результаті цього канали зовнішнього сегмента відкриваються, і катіони направляються усередину клітини, формуючи "світловий" струм. Це відбувається завдяки пригніченню активності фосфодіестерази в темряві. У результаті в оці ящірки відбувається наступна послідовність подій: світло - [цГМФ] - Відкритий катіонних каналів зовнішнього сегмента - деполяризація.

_{Посилення сигналу в каскаді цГМФ}

Двоетапний каскад цГМФ забезпечує значне посилення вихідного сигналу, чим і пояснюється виключна чутливість паличок до світла. По-перше, одна молекула активного метародопсіна II каталізує приєднання багатьох молекул ГТФ замість ГДФ і, таким чином, звільняє сотні субодиниць G-білка. По-друге, кожна субодиниця активує одну молекулу фосфодіестерази в диску, яка здатна розщепити величезна кількість молекул цГМФ, що знаходяться в цитоплазмі, і таким чином привести до закриття великої кількості каналів.

_{Сигнали у відповідь на одиночні кванти світла}

Дані про те, що поодинокі кванти світла можуть викликати сприймається відчуття світла, викликали велику кількість запитань. Наскільки великий цей одиничний відповідь? Яким чином цей сигнал виділяється з рівня шуму? І яким чином така інформація достовірно передається з сітківки до вищих зорові центри? Щоб виміряти сигнали у відповідь на одиночні кванти світла, Бейлор з колегами реєстрували струми від окремих паличок в сітківці жаби, мавпи і людини. Ці досліди представляють собою унікальний приклад експерименту, в якому показано, як такий складний процес, як сприйняття слабких спалахів світла, може корелювати зі змінами, що відбуваються на рівні окремих молекул.

Процедура по ізоляції фрагмента сітківки від тварини або трупного матеріалу повинна для цих експериментів проводитися в темряві. Для вимірювання струму зовнішній сегмент палички засмоктується в тонку піпетку. Як і очікувалося, ці експерименти показують, що в темряві струм постійно тече всередину зовнішнього сегмента. Спалахи світла призводять до закриття каналів у зовнішньому сегменті, викликаючи зменшення "темнового" струму. Амплітуда струмів невелика і пропорційна числу поглинених квантів. Іноді спалах викликає одиночний відповідь, іноді - подвійний, а іноді - взагалі ніякої реакції.

У паличках мавпи зменшення струму у відповідь на поглинання одного фотона, складає близько 0,5 пА. Це відповідає закриття близько 300 каналів, тобто від 3 до 5% всіх відкритих в темряві каналів. Це досягається завдяки значному посиленню сигналу в метаболічному каскаді цГМФ. Більш того, з-за крайньої стабільності зорових пігментів, згаданої раніше, випадкова ізомеризація й помилкове закриття каналів - події дуже рідкісні. Це призводить до того, що ефекти окремих квантів світла виділяються на тлі дуже низького постійного шуму. Було показано, що електрична зв'язок за допомогою щілинних контактів між фоторецепторами забезпечує додатковий згладжує ефект, який зменшує фоновий шум і покращує відношення сигнал / шум відповідей паличок на одиночні кванти.