Збір та зберігання матеріалу кількісне визначення 17 КС з реакції Циммермана

Збір та зберігання матеріалу, кількісне визначення 17 - КС з реакції Циммермана

1. Наднирники
Надниркові залози - невеликі парні органи внутрішньої секреції, розташовані в заочеревинному просторі над верхніми полюсами нирок, представляють собою ендокринну залозу. Розрізняються за формою: правий трикутний, а лівий у формі - півмісяця. Середня вага однієї залози 3,5 - 5 г . Кожен наднирник складається з внутрішнього мозкового шару і зовнішнього коркового речовини, кожен з яких є в свою чергу самостійної ендокринної залозою. Вони відрізняються один від одного будовою, секрецією різних груп гормонів і походженням.
Гормони, які продукують у кірковій речовині, відносяться до кортикостероїдів. Сама кора надниркових залоз морфо-функціонально складається з трьох шарів:
клубочкова зона
сітчаста зона
пучкова зона
У клубочковой зоні утворюються мінералокортикоїди: альдостерон, кортикостерон, дезоксикортикостерон. Вони підвищують реабсорбцію натрію і виділення калію в нирках.
У пучкової зоні утворюються глюкокортикоїди: кортизол, кортикостерон.
Глюкокортикоїди мають неабиякий дію практично на всі процеси обміну речовин. Вони стимулюють утворення глюкози з жирів і амінокислот (глюконеогенез), пригнічують запальні, імунні та алергічні реакції, зменшують розростання сполучної тканини, підвищують чутливість органів чуття і збудливість нервової системи. У сітчастій зоні виробляються статеві гормони - андрогени, які є речовинами - попередниками естрогенів. Їх роль: вони активні до статевого дозрівання і після дозрівання статевих залоз, у тому числі впливають на розвиток вторинних статевих ознак. Клітини мозкової речовини надниркових залоз виробляють катехоламіни - адреналін і норадреналін. У стані спокою вони постійно виділяють невелику кількість катехоламінів. Під впливом стресової ситуації продукція катехоламінів значно зростає. Крім катехоламінів клітини мозкового шару надниркових залоз виробляють пептиди, що виконують регуляторну функцію в ЦНС і ШКТ. Серед цих речовин: речовина Р, інтестинального вазоактивний пептид, соматостатин, бета - енкефалінів.
2. 17 - кетостероїди (17 - КС)
Викликавши біологічний ефект, кортикостероїди, піддаються катаболічним перетворенням у печінці. При цьому відбувається окислення бокового ланцюга, що розташовується в структурі молекули гормону у 17 - го атома вуглецю, в результаті чого утворюються 17 - КС. У жінок 17 - КС мають надниркової походження, у чоловіків - 2 / 3 утворюються за рахунок гормонів кори надниркових залоз, 1 / 3 - за рахунок - стероїдів сім'яників (тестостерону), що синтезуються в інтерстиціальних клітинах чоловічих статевих залоз. Період напіврозпаду тестостерону становить кілька десятків хвилин. У дорослих чоловіків з сечею екскретується не більше 1% незміненого тестостерону, що свідчить про його розпад у печінці до кінцевих продуктів обміну.
Невелика частина 17 - КС (близько 15%) є метаболітами в реакціях освіти глюкокортикоїдних гормонів (кортизол, кортизон, 11-дезоксикортизола). Основну фракцію 17 - КС в сечі представляє дегідроепіандростерон - сульфат і епіандростерон з надниркових залоз, а також метаболіти тестостерону (його попередники і похідні - андростендіон, андростерон, етіохоланолон, епіандростерон), які утворюються в яєчках. Вони виводяться із сечею в якості продуктів обміну.
Цілі дослідження 17 - КС в сечі:
1.Оценка функціонального стану коркового речовини надниркових залоз
2.діагностіка синдрому Кушинга, хвороби Аддісона, адреногенитального синдрому, пухлини яєчка і яєчника.
Підготовка до дослідження: Пояснити пацієнту мети дослідження. Будь - яких обмежень у дієті і режимі харчування не потрібно, однак пацієнту слід уникати надмірних фізичних навантажень і емоційних стресів під час збору сечі. Пацієнту повідомляють, що для аналізу використовують добову сечу, і пояснюють, як її зібрати. Співробітники лабораторії і лікуючий лікар повинні знати, чи приймає пацієнт препарати, які можуть вплинути на результат аналізу (у деяких випадках від їх застосування необхідно утриматися).
Процедури:
Сечу збирають у спеціальний контейнер протягом 24 годин, при цьому першу (ранкову) порцію сечі зливають, а останню зберігають для аналізу. Для підтримки рН 4,0 - 4,5 в контейнер додають консервант. Під час всього періоду збору сеча зберігається в холодильнику на нижній полиці. Після закінчення збору, ретельно перемішується, в інший контейнер наливають 100 -200 мл перемішаної сечі і доставляють в лабораторію.
Хід дослідження
1.Екстракція. Для екстракції використовують не змішуються з водою розчинники, в які переходять екстрагуються речовини. У цілому, чим більше в екстрагуються речовині полярних груп (оксо -, окси -, альдегідних ...), тим краще воно переходить у змішуються з водою полярні розчинники - вищі спирти, етилацетат. Чим менше полярних груп, тим більше підходять неполярні розчинники - гексан, хлороформ. Ефір займає проміжне становище. Ефективність екстракції залежить від рН водного розчину і вмісту солей. Найефективніше екстракція відбувається, якщо спочатку утворюється одна фаза, яка потім розділяється на дві при додаванні надлишку одного з інгредієнтів, але такі умови вдається підібрати не завжди, значно частіше просто струшують дві незмішувані рідини. Обсяги фаз після екстракції дуже часто не відповідають обсягам взятих розчинів і розчинників, т до разом з екстрагуються речовиною в іншу фазу часто переходить і частина розчинника і навпаки; це дуже ускладнює точний відбір аліквотах з будь - якої фази. Якщо речовина погано екстрагується, часто використовують повторну екстракцію тим же розчинником, а потім обидва екстракту змішують. Важливо при проведенні екстракції стежити, щоб не утворилася стійка емульсія, яка заважає поділу фаз. Це залежить від домішок, тому потрібно струшувати обережно, в той же час досить енергійно, щоб настала рівновага. Утворенню емульсії перешкоджає збільшення утворення солі в розчині, емульсію можна спробувати розділити центрифугуванням. Можна проводити екстракцію в ділильних воронках, конічних колбах або в пробірках з пришліфованою скляними або поліетиленовими кришками. Якщо працюють з колбами, треба використовувати магнітні мішалки. При роботі з пробірками їх струшують вручну або на встряхиватель (шюттель), пробірки зручні тим, що якщо утвориться емульсія, її можна дозволити центрифугуванням. Після екстракції один шар відокремлюють від іншого, зазвичай значно легше відсмоктати верхній шар і кількісно перенести його в чистий посуд, ніж нижній. Зручно відсмоктувати пастерівських піпетками з грушею, переносячи верхній шар невеликими порціями, при цьому, якщо помилково буде захоплена невелика порція нижнього шару, її легко повернути на місце.
3. Очищення етанолу
Абсолютний етанол готують з 90 - 96% етилового спирту кип'ятінням з CaO або ВаО на водяній бані з електропідігрівом із зворотним холодильником до тих пір, поки точка кипіння не стане 78,3 С при нормальному барометричного тиску.
Виявлення альдегідів: до 5 мл етанолу додають 0,2 мл розчину калію перманганату, що містить 200 мг на 1 л (1: 5000), розчин не повинен знебарвлюватися протягом 20 хвилин. Зміна забарвлення вказує на присутність альдегідів. Харчовий спирт містить більше альдегідів, ніж гідролізний.
Способи видалення альдегідів:
1. З 2, 4 дінітрофінілгідрозіном. До 1 л етанолу додати 2 г гідрохлориду 2, 4 дінітрофінілгідрозіна і 0,5 мл концентрованої соляної кислоти, закривають пробкою і залишають стояти 2суток в темряві, та переганяють.
2. З нітратом срібла. У 100 мл гарячого етанолу розчиняють 7 г нітрату срібла і додають туди 15 г їдкого калію, розчин виливають у 4 л що підлягає очищенню етанолу. Випадає темний осад, який поступово осідає на дно. Через добу його відокремлюють фільтруванням, етанол переганяють, відкидають першу і останню порції.
3.Очістка хлороформу і дихлорметан.
Для визначення гормонів краще всього використовувати хлороформ марки «для наркозу», що містить невелику кількість спирту, що робить його біліше стабільним. Для очищення хлороформу інших марок, а також для регенерації тих порцій розчинника, які вже один раз використовувалися для екстракції гормонів, їх збовтують з концентрованою сірчаною кислотою протягом 1 - 2 робочих днів, при цьому сірчана кислота темніє тим швидше, чим біліша забруднений розчинник. Струшування проводиться в темряві, зручно користуватися магнітною мішалкою, закриваючи колбу світлонепроникні ковпаком. Після цього кислоту відсмоктують, хлороформ промивають водою, а потім протягом декількох годин концентрованим розчином аміаку, 1 н гідроксидом натрію або насиченим розчином натрію карбонату, потім знову промивають водою і осушують безводним натрію сульфатом або натрію карбонатом. Після осушення розчинник переганяють, використовуючи скляний перегінний апарат на шліфах, нагрівач - електричний з водяною лазнею. Конкретний режим очищення залежить від якості вихідного розчинника. Про ефективність очищення краще всього судити, поставивши холостий або калібрувальний досвід.
4. Очищення ефіру
Для видалення перекисів ефір збовтують з 10% розчином сульфіду заліза (2) в 1 н сірчаної кислоти, потім промивають водою. Перевірка наявності перекисів: 200 мл ефіру випарюють, залишок розчиняють в 2 мл абсолютного етанолу. З цієї кількості відбирають 0,2 мл, до яких додають 0,2 мл 2% спиртового розчину метадинитробензолом і 0,2 мл 5 н розчину їдкого калію в метанолі. Забарвлення не повинна перевищувати тієї, яка розвивається при додаванні до тих же реактивам 5 мкг кристалічного кетостероїдів.
5. Визначення змісту 17 - КС в сечі по реакції з метадинитробензолом (реакція Циммермана в модифікації Крехові).
Принцип методу: кількісне встановлення змісту специфічно забарвлених у фіолетовий колір екстрагованих хромогеном, що утворюються в результаті реакціі17 - КС з метадинитробензолом в лужному середовищі.
Реактиви:
1.діетіловий (медичний) ефір, вільний від перекисів
2.абсолютний етанол, очищений від альдегідів і кетонів - см вище
3.концентрірованная соляна кислота, 1,19 кг / л
4.ледяная оцтова кислота
5.раствор їдкого натру, 100 г / л
6.5 н. розчин їдкого калію в метанолі (застосовуваний в якості розчинника метанол робить реактив більш стійким, збільшуючи термін його зберігання). 28 г їдкого калію доводять до 100 мл метанолом, після чого розчин негайно фільтрують (у спиртовому розчині лугу утворюються жовто-пофарбовані продукти, які обумовлюють високі значення абсорбції контрольної проби). Після фільтрування розчин лугу титрують 0,1 н. соляною кислотою з індикатором метилоранжа. Реактив зберігають в темній запарафінірованной склянці в холодильнику. Він придатний до 1,5 міс.
7.спіртовой розчин метадинитробензолом, 20 г / л.
Перед використанням перевірити чистоту метадинитробензолом: 400 мг реагенту розчиняють в 20 мл абсолютного етанолу, він не повинен давати забарвлення протягом 1 години після додавання до нього рівного об'єму 3 н. розчину їдкого калію. В іншому випадку реактив перекрісталлізовивают.
Перекристалізація метадинитробензолом: 10 г його препарату розчиняють в 375 мл 96% етанолу та нагрівають до 40 С. До розчину доливають 50 мл 2 н. їдкого натру і суміш залишають на 5 хвилин. Потім її охолоджують і додають до неї при помішуванні 1,25 л дистильованої води. Розчин фільтрують через воронку Бюхнера і промивають метадинитробензолом на фільтрі абсолютним етанолом (1 раз - 60 мл і 2 рази - по 40 мл). Кристалізацію слід здійснювати дуже швидко, щоб утворювалися дрібні кристали, тому що великі погано розчиняються в спирті. Отримані дрібні ігловідние кристали повинні мати вказану температуру плавлення. Спиртовий розчин метадинитробензолом тримають в темній склянці з притертою пробкою 8.метанол 9.хлороформ («для наркозу») 10.раствор формальдегіду, 400 г / л (формалін). Розчин розводять у співвідношенні 1: 5 дистильованою водою. 11.стандартниераствори кетостероїдів, одержувані з кристалічних дегідроепі андростерона і андростерону. Стандартні розчини готують у концентрації 100 мкг / мл, для чого 5 мг дигідроепіандростерону або андростерону розчиняють в 50 мл абсолютного етанолу. Зберігають у холодильнику в темній склянці з притертою пробкою, еталон стійкий протягом декількох місяців. Хід визначення: включає в себе кілька етапів.
1 етап. Гідроліз сечі. До поміщеним у конічну (на 100 мл) колбу 20 мл сечі, взятої з її добової кількості, додають 3 мл концентрованої соляної кислоти, 1 мл крижаної оцтової кислоти і 0,2 мл розчину формальдегіду. Вміст колби перемішують, накривають її лійкою і ставлять у киплячу водяну баню на 15 хвилин. Після цього колбу охолоджують під струменем холодної водопровідної води і вміст її переносять в ділильну воронку.
2 етап. Екстракція і очищення екстракту (здійснюється в ділильній воронці). Екстракцію виробляють діетіловим ефіром (2 рази по 10 мл) протягом 1 - 1,5 хвилин. Нижній шар сечі видаляють. Ефірні екстракти об'єднують, промивають трьома порціями по 10 мл розчину їдкого натру (по 3 хвилини). Водну, що містить естрогени та інші речовини кислого характеру, лужну фазу прибирають і екстракт промивають 1 раз 10 мл дистильованої води. Воду ретельно відокремлюють, ефірний екстракт порціями переносять в центрифужну пробірку і випарюють на теплій (з температурою не вище 50 С) водяній бані. Сухі екстракти (при формальдегідної способі вони повинні бути безбарвні) на цьому етапі можна залишити до наступного дня в холодильнику.
3 етап. Кількісне визначення за Ціммерманн в модифікації Крехові.
До сухого залишку доливають 0,2 мл абсолютного етанолу, 0,2 мл метанольного розчину їдкого калію і 0,2 мл спиртового розчину метадинитробензолом. Вміст пробірки ретельно перемішують і залишають для розвитку забарвлення на 1 год (у темряві!) При кімнатній температурі. По закінченні інкубації додають 3 мл водного розчину етанолу (500 г / л) і 2 мл хлороформу, суміш енергійно струшують. Пофарбований у фіолетовий (пурпурний) колір продукти переходять у нижній, хлороформенний шар, а продукти з неспецифічною забарвленням - жовто - коричневою або коричневою - залишаються у верхньому спиртоводного шарі. Через пару хвилин верхній шар видаляють відсмоктуванням (пастерівською піпеткою). Робити це потрібно акуратно, ретельно збираючи краплі водного шару зі стінок пробірки, не засмоктувати хлороформенний шар.
У хлороформенний шар додають 1 мл абсолютного етанолу. Після перемішування інтенсивність забарвлення розчину вимірюють на фотометрі із зеленим (500 - 560Нм) світлофільтром в кюветі на на 5 мм . Результати порівнюють з аналогічними даними контрольної проби. Забарвлення стабільна протягом години, а потім інтенсивність її знижується: через 1 год вона виявляється слабкіше вже на 10 - 15%. У зв'язку з цим на одне визначення допустимо брати не більше 10 - 15 проб.
Приготування контрольної проби: у дві пробірки долити по 0,2 мл абсолютного етанолу, по 0,2 мл метанольного розчину їдкого калію і по 0,2 мл спиртового розчину метадинитробензолом. Вміст пробірки перемішують і справі обробляють як досвідчену пробу.
Розрахунок ведуть за формулою або калібрувальним графіком. Для отримання даних до розрахунку за формулою паралельно досвідченим пробам через процедуру аналізу пропускають 0,5 мл основного стандартного розчину, що містить 50 мкг андростерону або дигідроепіандростерону.
Для отримання даних до побудови калібрувального графіка через всі етапи аналізу проводять стандартний розчин андростерону (дігдроепіандростерона) у кількості від 0,1 до 1,0 мл основного розчину. Лінійна залежність зберігається до концентрації стандартного розчину 100 мкг / мл (100 мг / л). Екскрецію 17 - КС з сечею розраховують за формулою:
Х (мг / добу) = А _оп * d * 50 / А _ст * 20 * 1000 = А _оп * d / А _ст * 400
50 - зміст (мкг) андростерону або дигідроепіандростерону в стандартній пробі
d - діурез (мл / добу)
20 - кількість взятої в досвід сечі (мл)
1000 - коефіцієнт перерахунку, який використовується для перекладу мкг в мг.
Розрахунок за калібрувальним графіком проводиться з використанням формули:
Х = С * d / 20 * 1000
С - знайдена за калібрувальним графіком вміст 17 - КС у пробі (мкг стандартного речовини андростерону або дегідроепіандростерона). Для переведення отриманого за формулою значення з мг на мкмоль його множать на коефіцієнт 3,467.
При великих концентраціях 17 - КС в сечі (понад 100 мкг в пробі) подальше дослідження зводиться до:
1.Використання кювети на 10 - досягається розведення сечі у 5 разів ро
2.развесті сечу фізіологічним розчином
У формулу ввести поправку на розведення.
Референтні значення:
Максимальна величина екскреції у чоловіків і жінок спостерігається в возрасте25 років, після чого починається її повільне зниження. Виділення 17 - КС вище в години неспання, ніж у години сну. За будь-яких станах напруги екскреція 17 - КС зростає.

4. Клініко-діагностичне значення визначення 17 - КС в сечі
1.Виделеніе 17 - КС з сечею значно збільшується при:
1.інтерстіціально - клітинної пухлини яєчка
2.арренобластоме
3.лютеоцітароной пухлини яєчника
2. Виділення 17 - КС помірно збільшується при:
1.опухолі надниркових залоз
2.врожденной та набутої гіперплазії наднирників
При раку кори надниркових залоз рівень 17 - КС в сечі зростає в 2 - 10 разів, досягаючи іноді 300 мг на добу. Метастазуючим ракова пухлина наднирників - до 1000 мг / добу.
3.Виделеніе 17 - КС з сечею знижується при:
1.аддісоновой хвороби (складає не більше 1 / 5 - 1 / 3 від нормальної величини)
2.діенцефально - гіпофізарної кахексії
3.гіпофізарном карликовій зростанні
4.гіпотеріозе
5.сіндроме залишкових гонад
6.анорхіі
7.ціррозе печінки
8.нефротіческом синдромі
9.істощеніі
Фактори, що впливають на результат дослідження:
1.Іскажающіе результат:
1.несоблюденіе вимог, що пред'являються до дослідження
2.неправільное зберігання контейнера
3.невозможность зібрати всю сечу за час дослідження
4.несвоевременная відправка сечі в лабораторію
2.Повишающіе результат:
1.цефалотін
2.дігітоксін
3.мепробамат
4.напроксен
5.пенеціллін
6.фенотіазін
7.АКТГ
8.кортізон ацетат
9.гідрокортізон
3.Поніжающіе результат:
1.хлордіазепоксід
2.глюкоза
3.меглумін
4.ампіціллін
5.дексаметазон
6.естрогени
7.пероральние контрацептиви
8.преднізолон

Бібліографія
1.Камишніков В.С. «Клініко - біохімічна лабораторна діагностика», том 2, Мінськ «Інтерпрессервіс», 2003 р , Стор 350 - 366
2.Меньшіков В.В. «Довідник. Лабораторні методи дослідження в клініці », Москва« Медицина », 1987 р , Стор 250 - 253
3.Елесеев Ю.Ю. «Аналізи. Повний довідник », Москва« Ексмо », 2006 р стр 187 - 190.
4.Земцов В.К. «Діагностика за основними показниками лабораторних досліджень», Ростов - на - Дону, «Фенікс», 2008 р , Стор 15 - 16
5.Баулін С.І. «Довідник медсестри - лаборантки», Ростов - на - Дону, «Фенікс», 2008 р , Стор 175 - 177
6.Покровскій В.М. «Фізіологія», Москва, «Медицина», 2006 р., том 3, стор 234 - 256.