Досягнення генної інженерії та біотехнології

Державний університет управління

Інститут державного і муніципального управління

Спеціальність державне і муніципальне управління

Курсова робота

на тему:

«Досягнення генної інженерії та біотехнології»

Виконана студенткою

Дата виконання роботи 15.12.2000г.

Керівник Міронченко В.І.

План

Введення	Стор.2
Будова ДНК	Стор.2
I Біотехнологія	Стор.4
Виникнення біотехнології	Стор.4
Специфіка біотехнології	Стор.4
Розділи біотехнології	Стор.6
А) Біоенергетика	Стор.6
Б) біологізації та екологізація	Стор.6
Практичні досягнення біотехнології	Стор.7
II Генна інженерія	Стор.7
Генна інженерія	Стор.7
Методи генної інженерії	Стор.8
Генетична рекомбінація in vitro	Стор.11
Методи введення ДНК в бактеріальні клітини	Стор.12
Досягнення генної інженерії	Стор.14
Молекулярна геноміка	Стор.17
Генна терапія	Стор.19
Біотехнологічні та генно-інженерні компанії та їх розробки.	Стор.19
А) Компанії США	Стор.19
Б) Компанії СРСР	Стор.23
В) Компанії Західної Європи	Стор.23
Г) Міжнародне співробітництво	Стор.24
Висновок	Стор.26
Список термінів	Стор.27
Список літератури	Стор.28
Додаток 1	Стор.30
Додаток 2	Стор.31

Введення

У своїй роботі я розкриваю тему досягнень генної інженерії і біотехнології. Можливості, що відкриваються генетичною інженерією перед людством як в галузі фундаментальної науки, так і в багатьох інших областях, вельми великі і нерідко навіть революційні. Так, вона дозволяє здійснювати індустріальне масове виробництво потрібних білків, значно полегшує технологічні процеси для отримання продуктів ферментації - ензимів і амінокислот, в майбутньому може застосовуватися для поліпшення рослин і тварин, а також для лікування спадкових хвороб людини. Таким чином, генна інженерія, будучи одним з магістральних напрямів науково-технічного прогресу, активно сприяє прискоренню вирішення багатьох завдань, таких, як продовольча, сільськогосподарська, енергетична, екологічна.

Але особливо великі можливості генна інженерія відкриває перед медициною і фармацевтикою, оскільки застосування генної інженерії та гібридомних методів може призвести до корінних перетворень медицини. Багато хвороб, для яких в даний час не існує адекватних методів діагностики та лікування (ракові, серцево-судинні, вірусні і паразитні інфекції, нервові і розумові розлади), за допомогою генної інженерії та біотехнології стануть доступні і діагностиці, і лікуванню. Під впливом біотехнології медицина може перетворитися з переважно емпіричною у фундаментально теоретично обгрунтовану дисципліну з ясним розумінням відбуваються в організмі молекулярних і генетичних процесів.

Будова ДНК

Ще в минулому столітті біологи вивчили процес клітинного ділення, якому передує розбіжність хромосом, завдяки чому в кожний сперматозоїд і в кожну яйцеклітину попадає половина хромосом з вихідної клітини. Тоді вже було показано, що носіями генетичної інформації є хромосоми.

З точки зору хіміків хромосоми складаються з білка і дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК). Білки - складна група речовин, що складається з 20 мономерних ланок (амінокислот), які з'єднані в самих різних комбінаціях. У ДНК - всього чотири види амінокислот. Спочатку припустили, що ДНК будується поєднанням цих чотирьох одиниць в одноманітному порядку. В якості носіїв генетичної інформації передбачалися білки, як більш складні структури. Тільки в 40-з роки було встановлено, що саме ДНК, незважаючи на простоту своєї структури, є носіями інформації, і, більш того, забезпечують освіту своїх точних копій для передачі наступним поколінням.

Гени - це ділянки молекули ДНК, яка "розмножується" шляхом компліментарного прилаштовування один до одного чотирьох нуклеотидів (підстав), і у разі помилок в цьому процесі відбуваються мутації. Гени управляють синтезом білків, що складають протоплазму, перемикаючись час від часу з побудови власних клітин на побудову інших молекул. У клітинах вищих організмів кількість ДНК сильно розрізняється, звідси відмінності між організмами і в наборі синтезованих білків, і в складності будови організмів.

На початку 50-х років з'ясувалося, що хімічний склад ДНК (а не білків) у одного виду майже однаковий, дуже розрізняючи у різних видів. Будь-яка ДНК складається з чотирьох типів нуклеотидів: А, Т, Г, Ц (початкові літери чотирьох азотистих основ-аденін, тимін, гуанін і цитозин), які присутні в ДНК в різних пропорціях у різних видів і мають близькі пропорції у одного виду. У 1938 р. Вільям Астбері (автор терміну молекулярна біологія) отримав разом зі своїм співробітником Флоріном Беллом рентгенограми ДНК, які показали, що азотисті основи розташовуються одне за іншим, побудовані як платівки. Незабаром американський біохімік Ервін Чаргафф (нар. 1905) встановив, що відносини А / Т і Г / Ц приблизно дорівнюють одиниці. Ці результати були важливі для розуміння структури ДНК.

Інтерес до ДНК як носія генетичної інформації різко зріс до початку 50-х років, і структура ДНК була незабаром встановлена. Хіміки розуміли, що ДНК зібрана з нуклеотидів, кожен з яких має фосфатну групу, пов'язану ковалентно з п'яти-вуглецевим цукром. Кожен такий цукор пов'язаний з одним із чотирьох азотистих основ. Історія відкриття структури ДНК описана американським біохіміком Джеймсом Уотсоном (р.1928) в його книзі «Подвійна спіраль» (1968). Кембриджі Уотсон познайомився з Криком, фізиком, який перекваліфікувався в біохіміка. Зі спілкування з хіміками Уотсон дізнався, що структурні формули, якими вони користувалися далекі від досконалості. Розібравшись у структурі пуринів (А, Г) і піримідинів (Т, Ц), Уотсон і Крик вирішили, що вони повинні бути тісно пов'язані між собою. Якщо це так, то ДНК повинна складатися з двох ланцюгів. Ланцюги повинні закручуватися між собою так, щоб зберігалися певні кути між групами атомів. Так виникла подвійна спіраль, в якій пурини і піримідинові збудовані за типом сходинок сходів: роль "перекладин" грають підстави, "мотузок" - сахарофосфатним остови. Кожна перетинку утворена з двох підстав, приєднаних до двох протилежних ланцюгах, причому у одного з підстав одне кільце, в іншого - два. Отже, це може бути А і Т або Г і Ц. Оскільки в кожній парі є одна підстава з одним кільцем і одне - з двома, величина перекладин однакова, і остови ланцюгів знаходяться на одній відстані. Два ланцюги утримуються разом водневими зв'язками між основами. Стаття Уотсона і Крику, в якій повідомлялося про розшифрування структури ДНК, зайняла всього дві сторінки в науковому журналі, але вона відкрила нову епоху в розкритті таємниці життя. У першій же публікації (1953) Крік і Уотсон відзначили, що така структура добре пояснює і процес "відтворення" цієї молекули. При роз'єднанні ланцюгів можливе приєднання нових нуклеотидів до кожної з них, тоді біля кожної старої виникне нова ланцюг, наче їй відповідна. Так вперше прийшли до структури, яка була здатна до самовідтворення. Фізики Крік і Вілкінс разом з біохіміком Уотсоном стали лауреатами Нобелівської премії з фізіології і медицини за 1962 рік.

Дослідження показали, що ДНК може існувати в двох формах: А (при низькій вологості) і В (при високій). Для обох форм побудували молекулярні моделі. З дифракційних картин волокон ДНК інформацію отримати було досить важко, оскільки ланцюга ДНК розташовані вздовж осі волокна безладно, але була підтверджена її спіральна структура. До теперішнього часу дослідники навчилися синтезувати в необхідній кількості та одержувати в досить чистому вигляді короткі ділянки ДНК заданої послідовності.

Будова рекомбінантної ДНК.

Гібридна ДНК має вигляд кільця. Вона містить ген (або гени) і вектор. Вектор - це фрагмент ДНК, що забезпечує розмноження гібридної ДНК і синтез кінцевих продуктів діяльності генетичної системи - білків. Велика частина векторів отримана на основі фага лямбда, з плазмід, вірусів SV40, поліоми, дріжджів та ін бактерій. Синтез білків відбувається в клітці-хазяїні. Найбільш часто в якості клітини-господаря використовують кишкову паличку, однак застосовують і ін бактерії, дріжджі, тварини або рослинні клітини. Система вектор-господар не може бути довільною: вектор підганяється до клітини-хазяїна. Вибір вектора залежить від видової специфічності і цілей дослідження. Ключове значення в конструюванні гібридної ДНК несуть два ферменти. Перший - рестріктаза - розсікає молекулу ДНК на фрагменти за строго певних місць. І другий - ДНК-лігази - зшивають фрагменти ДНК в єдине ціле. Тільки після виділення таких ферментів створення штучних генетичних структур стало технічно здійсненним завданням.

Біотехнологія Виникнення біотехнології

Сучасна біотехнологія - це новий науково-технічний напрям, який виник у 60-70-х роках нашого століття. Особливо бурхливо вона стала розвиватися з середини 70-х років після перших успіхів генно-інженерних експериментів. Незважаючи на такий короткий термін свого існування, біотехнологія привернула пильну увагу як вчених, так і широкої громадськості. Біотехнологія, по суті, не що інше, як використання культур клітин бактерій, дріжджів, тварин чи рослин, метаболізм і біосинтетичні можливості яких забезпечують вироблення специфічних речовин. Біотехнологія на основі застосування знань і методів біохімії, генетики і хімічної техніки дала можливість отримання за допомогою легко доступних, поновлюваних ресурсів тих речовин і які важливі для життя та добробуту.

У промисловому масштабі подібна біотехнологія являє собою вже біоіндустрії.

Одне з пояснень живого інтересу до біотехнології можна знайти насамперед у тому, що саме до цього часу була усвідомлена дійсна гострота глобальних проблем, що постали перед людством: нестача продовольства, обмеженість енергії та мінеральних ресурсів, різке, майже катастрофічне, погіршення навколишнього середовища і, як наслідок, погіршення здоров'я людини. Стало зрозуміло, що величезний індустріально-промисловий комплекс не тільки не допомагає вирішити ці проблеми, а й ще більше погіршує їх. Виникла нагальна практична потреба в принципово нових технологіях і нові способи організації виробництва. В цей же час фізико-хімічна біологія в союзі з генетикою, молекулярною біологією і мікробіологією запропонували нову технологію, як ніби здатну допомогти у вирішенні цих проблем. Тим більше що перші досліди біотехнологічного виробництва дали непогані результати і тому дозволили будувати оптимістичні плани на майбутнє.

Специфіка біотехнології

Біотехнологія - надзвичайно наукомістка технологія. Так, наприклад, виникла першою в США фірма «Дженетек» витрачає 76% доходів на дослідницькі розробки замість звичайних для інших фірм 12%. Серед загальної кількості працівників НБФ близько 35% становлять доктора наук. [3]

Таким чином, нова біотехнологія-це більше науково-технічне новаторське напрямок, ніж виробниче, хоча і з досить великими виробничими перспективами. Однак це таке науково-технічний напрям, яке саме виступає виробництва, причому такого виробництва, яке вже не може зробити буквально жодного кроку без глибоких фундаментальних і систематичних прикладних наукових розробок. Підкреслюючи специфіку нової технології, тобто відрізняючи її і від сільського господарства, і від традиційної промисловості, можна так визначити біотехнологію: це технологія промислового застосування та експлуатації природних і цілеспрямовано створених живих систем, перш за все мікроорганізмів, як автоматично діючих сил природи для задоволення.

Виникнення соціальних проблем біотехнології зумовлено насамперед тим, що це нове виробництво є одне з найважливіших напрямів науково-технічного прогресу, якісно перетворюють зміст науково-технічної революції. Є всі підстави припускати, що в недалекому майбутньому біотехнологія перетвориться на одне з найважливіших пріоритетних напрямків науково-технічного прогресу і тим самим може привести до переосмислення і самих критеріїв цього прогресу. Це припущення грунтується на тому, що глобальні проблеми сучасності, і особливо екологічну, продовольчу та енергетичну, дуже важко (якщо не неможливо) буде вирішувати без самого безпосереднього і широкого застосування біотехнології. Найважливіші соціальні проблеми виникають також і в зв'язку з тим, що розвиток біотехнології веде до розмивання традиційних кордонів між сільським господарством та промисловістю. Більш того, виникає в даний час необхідність спочатку екологізації, а потім і в більш широкому сенсі біологізації всієї виробничої і господарської діяльності людства може привести не тільки до перебудови і навіть заміні (спочатку, звичайно, часткової) звичного сільського господарства біотехнологією, а й до перетворення промисловості і техніки. [3]

Примітно, що у сфері біотехнології цілий ряд біологічних наук, і перш за все мікробіологія, генетика та фізико-хімічна біологія, вже перетворюються в безпосередню продуктивну силу.

Злиття науки і виробництва, перетворення науки в безпосередню продуктивну силу, а виробництва в предметно - втілює науку як не можна краще характеризує це новаторське напрямок. Мабуть, тому воно виявляється тим фокусом, який стягує в собі як проблематику, традиційно относимую до сфери філософії та методології наукового пізнання, так і проблеми соціально-філософського та методологічного осмислення практики, виробництва, промисловості. К. Маркс підкреслював, що перетворення виробництва в матеріальну творчу науку стає можливим лише «по відношенню до людини склався, в голові якого закріплені накопичені суспільством знання». [3]

Так, скажімо, якщо Альбер Сассон стверджує, що <розвиток біотехнології та переваги, які вона обіцяє, ставить великий комплекс проблем, які пов'язані з еволюцією загального напрямку біологічних досліджень »[2], то інтуїтивно це видається вірним. Однак детального й аргументованого обгрунтування цієї тези не просто досягти, і не тільки в силу ще дуже значної обмеженості біотехнологічного досвіду.

Біотехнологія привертає до себе перш за все можливістю пристосування природних, органічних технологій живої клітини, тканини, організму, біоценозу і біосфери в цілому для потреб людини як таких технологій, які природним чином зможуть бути вбудовані в біологічний кругообіг планети. Однак це тільки ідея, поки існуюча ще в якості важкодосяжним мрії, оскільки тепер діюча біотехнологія - це більшою мірою хімічна технологія, в якій використовуються фрагменти живого. Тим не менш і в якості навіть ідеї-мрії вона виявляє помітний благотворний вплив: саме в руслі цієї мрії народилися і завдання екологізації, і - в більш широкому плані - біологізації всієї виробничо-господарської діяльності людини на планеті.

Ще на початку століття найбільший французький хімік П. Бертло вважав, що можна створювати ідеальну їжу, яка у вигляді поживних порошків або розчинів буде вводитися прямо в шлунково-кишковий тракт або безпосередньо в кров. Ця ідея фактично підтримувалася до самого останнього часу (70-і роки), однак тепер ясно, що вона ніколи не може бути реалізована. Як зазначає А. М. Уголев, останнім часом були зроблені найбільші відкриття, які впливають на всю стратегію харчування. Були «виявлені невідомі раніше типи травлення (лізосомальні, внутрішньоклітинний і мембранне). А також поглинання харчових речовин. Крім того, встановлено, що відносно метаболізму людина (і інші вищі тварини) «представляє собою не власне організм, а надорганізм, оскільки він включає в себе цілий комплекс мікроорганізмів». [3]. Остання обставина особливо цікаве тим, що воно призвело до формування уявлень про ендоекології. тобто внутрішньої екології людини та інших багатоклітинних організмів, а також до уявлення про те, що в процесі еволюції ми сформувалися як організми з певними природними «технологіями», обійти які не представляється можливим.

Розділи біотехнології Біоенергетика як розділ біотехнології

Встановлення однаковості механізмів енергетичних процесів у всьому живому світі - від мікроорганізмів і рослин до людини, і розтин механізмів перетворення енергії в живих клітинах створило передумови управління енергетичними процесами окремих організмів і їх спільнот, а також конструювання біоенергетичних установок різних типів, у тому числі біологічних генераторів струму . Це дозволяє говорити про перетворення біоенергетики в один з розділів біотехнології і в один з перспективних напрямків НТП, інтенсивно розвивається в даний час і обіцяє ефективне дозвіл енергетичної та сировинної проблем.

Біоенергетика в широкому сенсі слова означає сукупний енергетику біологічного кругообігу біосфери Землі, яка відбувається за участю всіх населяють біосферу організмів - мікроорганізмів, рослин, тварин. Висхідна лінія біологічного кругообігу - накопичення хімічної енергії органічних сполук у процесі фотосинтезу - хімічного процесу зв'язування води і вуглекислого газу за рахунок енергії сонячного випромінювання з утворенням вуглеводів і інших більш складних з'єднань. На планеті за рік відтворюється близько 232.5 млрд. тонн сухої органічної речовини, що відповідає приблизно 6000.10 '2 кдж енергії. Енергоозброєність життя в ході еволюції зростає. Однак діяльність людей у ​​масштабах біосфери все більш виявляється руйнівною, що обмежує можливості подальшого розвитку біоенергетики. Відбувається не тільки знищення окремих видів рослин і тварин, не тільки порушення їхніх природних комплексів - біогеоценозів - руйнується структура біосфери, її циклічна організація, здатність до самоочищення. Але за допомогою розширюваного прогнозно-планового регулювання відбувається поступове перетворення біосфери в сферу розуму - ноосферу. Все в більш розширення масштабах буде здійснюватися екологізація і біологізація виробничої діяльності людей, тобто все більшого включення цієї діяльності в біологічний кругообіг біосфери. З'єднання в ноосферу двох способів забезпечення стійкості систем - енергетичного (відбір і збереження систем з більшою енергією) та інформаційного (відбір більш складних систем, тобто з великим запасом інформації) - призведе до утворення якісно нового стану біоенергетики. Настане епоха збалансованої енергетики планети на поновлюваних енергоресурсах.

Біологізація і екологізація

Ще раз підкреслю, що стратегія перетворення і панування над природою в сучасному світі вже дискредитувала себе. Ми все більше усвідомлюємо необхідність гармонійного, спільного розвитку природи і людства. Саме тому в даний час набувають популярності ідеї екологізації і в більш широкому сенсі біологізації всієї господарської і виробничої діяльності. Здається, що під екологізації, як початковим етапом біологізації, можна розуміти скорочення шкідливих викидів виробництва в навколишнє середовище, створення маловідходних і безвідходних промислових комплексів із замкнутим циклом, скажімо, по воді або вуглеводню і т. п.

Біологізацію ж слід, мабуть, розуміти більш широко, як радикальне перетворення виробничої діяльності на основі біологічних законів біотичного кругообігу біосфери. Метою подібного перетворення повинно бути вбудовування всієї господарсько-виробничої діяльності в біотичний кругообіг.

Особливо наочно ця необхідність видно на феномені стратегічної безпорадності хімічного захисту рослин. Справа в тому, що в даний час немає в світі жодного пестициду, до якого б не пристосувалися шкідники рослин. Більше того, тепер чітко виявилася закономірність подібного пристосування: якщо в 1917 р. з'явився один вид комах, що пристосувалися до ДДТ, то у 1980 р. таких видів стало 432. Застосовувані пестициди і гербіциди вкрай шкідливі не тільки для всього тваринного світу, але і для людини. Точно так само в даний час стає зрозумілою і стратегічна безперспективність застосування хімічних добрив. У цих умовах абсолютно природний перехід до біологічного захисту рослин та біоорганічної технології з мінімумом хімічних добрив. Вирішальну роль у процесі біологізації сільського господарства може зіграти біотехнологія.

Можна і потрібно говорити також і про біологізації техніки, промислового виробництва та енергетики. Вона особливо нагальною не стільки з економічної точки зору, скільки для доль людства та збереження біосфери. Активно розвивається біоенергетика обіцяє революційні перетворення, оскільки вона орієнтована на поновлювані джерела енергії та сировини. Нафта, вугілля, природний газ і навіть уран - це не поновлювані джерела, і, як відомо, запаси їх на Землі вкрай обмежені.

Біологізація енергетики покликана зіграти вирішальну роль у процесі звільнення людства від атомної енергетики, оскільки ми тепер вже можемо говорити також і про стратегічну безперспективність атомних електростанцій. Справа тут не тільки в тому, що запаси урану також обмежені, але головним чином у тому, що до теперішнього часу в світі накопичилося вже багато десятків тисяч тонн відпрацьованого палива, що становить грізну небезпеку для всього живого. Як відомо, проблема захоронення відпрацьованого палива (його радіоактивність після використання в АЕС багаторазово зростає) до цих пір не вирішена. Проте, найголовніша небезпека полягає в можливості серйозних аварій на АЕС.

Практичні досягнення біотехнології

За допомогою біотехнології отримано безліч продуктів для охорони здоров'я, сільського господарства, продовольчої та хімічної промисловості. Причому важливо те, що багато хто з них не могли бути отримані без застосування біотехнологічних способів. Особливо великі надії пов'язуються зі спробами використання мікроорганізмів і культур клітин для зменшення забруднення середовища і виробництва енергії.

Розподіл основних продуктів біотехнології показано у додатку 1.

Генна інженерія Генна інженерія

За останні 10-15 років були створені принципово нові методи маніпулювання з нуклеїновими кислотами in vitro, на основі яких зародився і бурхливо розвивається новий розділ молекулярної біології та генетики - генна інженерія. Принципова відмінність генної інженерії від використовувалися раніше традиційних прийомів зміни полягає в тому, що вона дає можливість конструювати функціонально активні генетичні структури in vitro у формі рекомбінантних ДНК. Поняття «генна» і «генетична» інженерія часто вживають як синоніми, хоча останнє є більш широким і включає маніпулювання не тільки з окремими генами, а й з більш великими частинами геному. Робота по переробці генотипу тварин чи рослин за допомогою схрещувань обмежені межами виду або близьких у видовому відношенні форм. Навпаки, генна інженерія, як буде показано нижче, стирає міжвидові бар'єри, забезпечуючи можливість створення організмів з новими, в тому числі і не зустрічаються в природі, комбінаціями спадкових властивостей. Генна інженерія є сукупність методів, що дозволяють не тільки отримувати реконбінантние ДНК із фрагментів геномів різних організмів, але і вводити такі рекомбінантні молекули в клітину, створюючи умови для експресії в ній введених, часто абсолютно чужорідних генів. Таким чином, в цьому випадку дослідник оперує безпосередньо з генами, причому їх перенесення може не залежати від таксономічного спорідненості використовуваних організмів. Ця особливість генної інженерії представляє її головна відмінність від раніше використовувалися прийомів зміни генотипу.

Провідну роль у формуванні генної інженерії зіграла генетика мікроорганізмів, ідеї та методи, розроблені молекулярною генетикою і хімією нуклеїнових кислот. Формальною датою народження генної інженерії вважають 1972 р., коли група П. Берга в США створила першу рекомбінантів ДНК in vitro, що об'єднала у своєму складі генетичний матеріал з трьох джерел: повний геном онкогенного вірусу мавп SV40, частина генома помірного бактеріофага К і гени галактозним оперона Є. coli. Сконструйована рекомбінантна молекула не була досліджена на функціональну активність, оскільки у авторів цієї роботи виникли побоювання, що методи генної інженерії можуть призвести до появи мікроорганізмів, небезпечних для здоров'я людини, наприклад бактерій Є. coil, здатних перенести онкогенні віруси тварин у кишечник людини. Розроблені пізніше правила роботи з рекомбінантними молекулами дозволили практично усунути можливість шкідливих наслідків створення рекомбінантних ДНК, що поєднують у своєму складі гени різного походження.

Методи генної інженерії

Можливість виділення окремих генів у складі відносно невеликих фрагментів ДНК була продемонстрована незадовго до виникнення генної інженерії в експериментах in vitro. У 1969 р. Дж. Беквіт, Дж. Шапіро та інші опублікували роботу з виділення генів лактозного оперона Е.coli, засновану на поєднанні традиційних методів генетики мікроорганізмів і фізичних методів виділення і гібридизації молекул ДНК.

Окремі гени з метою їх подальшого молекулярного клонування в складі рекомбінантних ДНК методами генної інженерії можуть бути отримані такими способами:

безпосереднім виділенням з природних джерел;

шляхом хімічного синтезу;

3) копіюванням відповідної гену і РНК для отримання компліментарної ДНК-вої репліки (до ДНК).

Перший метод широко використовувався на ранньому етапі розвитку генної інженерії. Тотальну ДНК з різних джерел піддавали деградації різними рестріктазами, зшивали з векторними молекулами, вводили в реципієнтного клітини і відбирали клони з гібридними молекулами, що включали потрібний ген, по появі відповідних маркерів донора (наприклад, стійкості до певного антибіотику) або за допомогою спеціальних імунологічних та гібрідізаціонних методів. Цей метод не втратив свого значення і успішно застосовується, наприклад для створення банку генів.

Штучний синтез гена вперше здійснено хімічним шляхом в 1969 р. групою Корани зі співробітниками. Хімічному синтезу генів істотно сприяло вдосконалення методів вивчення первинної структури білків або інших продуктів, що кодуються синтезується геном, а також методів визначення первинної структури (секвенування) нуклеїнових кислот. Секвенування ДНК відіграє велику роль не тільки в роботах по хімічному синтезу генів, але і при вивченні їх функції, їх регуляторних послідовностей, а також цілих генетичних систем, наприклад мобільних диспергованих генів у еукаріотів.

Аналіз первинної структури ДНК, тобто встановлення послідовності нуклеотидних залишків в її молекулі, в даний час заснований на двох методах - методі хімічної деградації (А. Максам і В. Гілберт, 1977) і метод полімеразної копіювання з використанням терминируются аналогів нуклеотидів (Ф . Сенгер, 1977).

У практиці генної інженерії широко поширений і третій метод штучного одержання генів, заснований на їх ферментативному синтезі з допомогою механізму зворотної транскрипції. Цей механізм пов'язаний з активністю РНК-залежної ДНК-полімерази або зворотної транскриптази - ферменту, вперше виявленого при дослідженні реплікації РНК онкогенних вірусів. Фермент здатний будувати ДНК-копії на різних РНК, включаючи синтетичні полирибонуклеотидов. За допомогою зворотної транскриптази, званої іноді ревертаза, можна синтезувати практично будь-який індивідуальний ген в присутності відповідних іРНК, методи виділення яких достатньо розроблені. У 70-і роки з'явилися методи виділення в чистому вигляді фрагментів ДНК за допомогою електрофорезу. У руки вчених потрапили "молекулярні ножиці". Транспортним засобом перенесення генетичної інформації в клітку став вірус. Явище трансдукції - перенесення генів з однієї клітини в іншу за допомогою вірусів вивчали ще з 50-х років. Але вірус не повинен був відразу знищувати всю клітку, тому не всі віруси підходили для цієї ролі. Відомо, що бактеріальні клітини можуть обмінюватися генетичним матеріалом за допомогою плазмід (невеликих частинок з фрагментами ДНК). Тому введення потрібного гена в плазміду дозволяє в подальшому перенести цей ген в бактерію (це ще один з механізмів транспорту в генній інженерії). З'явилася можливість вивчати розподіл нуклеотидів в певному гені або отримувати потрібний білок. Для цього створюється рекомбінантна ДНК, яка виникає, коли ДНК одного організму впроваджується в клітини іншого. В якості останнього використовуються клітини організму, який розмножується багато швидше першого, наприклад, бактерії. Так, у 80-і роки були розроблені інтерферони ~ білки, здатні пригнічувати розмноження вірусів. Були обрані найбільш підходящі для перенесення гени і мобільні ділянки ДНК. Наприклад, культурним рослинам вводять гени, що підвищують їх імунітет і стійкість.

У 1983р. Барбара Мак-Клінток при вивченні генетики кукурудзи виявила в її геномі один "моторний" ген, відповідальний за колір качана. Незалежно від ніс рухливі гени були відкриті методами молекулярної генетики радянським ученим Г. П. Георгісвим. У 1981 р. процес виділення генів і отримання з них різних ланцюгів був автоматизований.

При всій різноманітності методів основна схема будь-генно-інженерної роботи залишається незмінною. Вона включає:

обробку кільцевої векторної молекули рестриктазою з утворенням лінійної форми ДНК;

сплавлення її з фрагментом чужорідної ДНК, що веде до формування гібридної структури;

введення гібрида в клітку реципієнта;

відбір клонів трансформованих клітин на селективних середовищах;

доказ присутності рекомбінантної ДНК в цих клонах шляхом її виділення з клітин, обробки відповідними рестріктазами та аналізу утворилися фрагментів методом електрофорезу в агарозному гелі.

Відомо кілька методів об'єднання фрагментів ДНК з різних джерел, що дозволяють включити клонованої донорно ДНК до складу вектора. Один з них заснований на з'єднанні фрагментів, кожен з яких несе ідентичні «кволі» кінці, отримані під дією однієї і тієї ж рестріктази. При іншому методі, ферментативному, використовується можливість з'єднання двохланцюжкової решт фрагментів ДНК за допомогою ДНК-лігази. Для підвищення ефективності лігази до кінців зшиваються фрагментів ДНК хімічно приєднують компліментарні однонітівие олігонуклеотиди, наприклад полі-А та полі-Т, створюючи тим самим штучні «липкі» кінці.

Методи введення рекомбінантних молекул в клітини залежать від особливостей самих клітин і використовуваних векторів. У тих випадках, коли векторами служать плазміди, рекомбінантні ДНК вводять в реципієнтного бактерії шляхом трансформації. Розроблено і методи трансформації клітин тварин, а також протопластів рослин. Для захисту екзогенного клітинного матеріалу, що вводиться в клітини ссавців або в протопласти рослин, використовують ліпосоми - сферичні тільця, оболонка яких складається з фосфоліпідів. У складі ліпосом у клітини вищих еукаріот введені значні вірусні РНК. У всіх випадках ліпосоми надійно захищали молекули нуклеїнових кислот від руйнування нуклеазами.

Один із шляхів передачі генетичної інформації в культурі клітин людини, тварин і рослин - гібридизація соматичних клітин, розроблене Б. Ефруссі і Г. Барських (1960). Ефективність цього методу значно підвищилася після того, як було виявлено, що частки інактивованого вірусу парагрипу типу Сендай збільшують частоту злиття клітин з самих різних джерел. Показана можливість передачі генів з ізольованих хромосом китайського хом'ячка у клітини сполучної тканини миші. Описано гібриди клітин людини і миші, з яких частина хромосом людини видаляється, а частина залишається функціонально активною. Для введення ДНК в різні культури клітин ссавців чи що розвиваються ембріони використовують метод мікро ін'єкцій ДНК в ядро ​​з допомогою мікроманіпулятори. Розвиток методів мікрохірургії клітин дозволило замінювати ядра запліднених яйцеклітин на ядра із соматичних клітин і в результаті отримувати абсолютно ідентичні організми. Створення гібридів вищих рослин в обхід статевого схрещування можливе шляхом злиття протопластів і соматичної гібридизації рослинних клітин, в результаті чого в ряді випадків з'являються цілі гібридні рослини. Всі ці методи можуть бути використані для конструювання нових форм мікроорганізмів, тварин і рослин шляхом введення і стабільного спадкування в них рекомбінантних ДНК, що несуть, гени, що детермінують бажані ознаки. [4]

Слід, однак, відзначити, що, незважаючи на очевидні успіхи подібних робіт зі створення мікроорганізмів, які синтезують ряд важливих продуктів еукаріотичного походження, проблема експресії чужорідних генів у прокаріотів має ряд обмежень. Деякі з них пов'язані з тим, що при сверхпродукціі корисних для людини і не потрібних клітці сполук, кодованих гібридної плазмидой, посилюється нестійкість самих гібридів і ймовірність елімінації з них вбудованих генів. Стабільність гібридних ДНК знижується і з збільшенням розмірів вставки у вектор. Тому розробляються методи, спрямовані на збереження цілісності гібридної структури. Використання регульованих промоторів охороняє клітину від надмірної для неї метаболічної активності, пов'язаної з надлишковою продукцією чужорідного білка. Разом з тим проблема стабільності гібридних молекул остаточно не вирішена. Обмеження можливостей конструювання мікроорганізмів - гіперпродуцентов цінних препаратів - поширюються на випадки клонування та експресії будь-яких генів як про -, так і еукаріотичного походження.

Поряд з цим існують і обмеження, специфічно пов'язані з виразом еукаріотичних генів в прокаріотів.

Перше з них визначається тим, що еукаріотичні промотори можуть не розпізнаватися бактеріальної РНК - полімераза.

Друге полягає в тому, що і РНК транскрибується з еукаріотичних генів, що не містить послідовності Шайн-Далгарно, необхідної для її зв'язування з рибосомами.

По-третє, така іРНК може містити інтрони, які слід вирізати.

Нарешті, еукаріотичні білки часто стають субстратами для бактеріальних протеаз, впізнаючий такі білки як чужорідні. [4].

Перші два обмеження долаються за рахунок створення векторів, несучих власні промотори і послідовність Шайн-Далгарно, третє можна обійти шляхом використання кДНК або хімічно синтезованих генів. Протеазной активність реципієнтного бактерій придушується мутаціями.

Подолання усіх цих обмежень відкриває подальші перспективи використання методів генної інженерії при створенні мікроорганізмів - продуцентів гормонів, вакцин, антисироваток і ферментів, що представляють інтерес для медицини, ветеринарії, сільського господарства та мікробіологічної промисловості.

Генетична рекомбінація in vitro

Генетична рекомбінація полягає в обміні генами між двома хромосомами. За визначенням, яке Понтекорво в 1958 р., рекомбінація-це будь-який процес, здатний привести до виникнення клітин або організмів з двома або більше спадковими детермінантами, за якими їх батьки різнилися між собою і які з'єднані новим способом. Така рекомбінація обов'язково відбувається у ссавців при утворенні статевих клітин. У ході мейозу гомологічні хромосоми обмінюються генами; саме ці обміни дозволяють пояснити перетасовку спадкових ознак в ряді поколінь. У вірусів і бактерій генетична рекомбінація відбувається рідше, ніж у тварин. Обмін генетичним матеріалом, за яким слід рекомбінація, відбувається між організмами одного і того ж чи близьких видів. Всі живі організми мають рестрикційний ендонуклеаза, які дізнаються чужорідну ДНК, проникла в організм, і розщеплюють її, таким чином зводячи нанівець генетичну рекомбінацію між еволюційно віддаленими геномами.

Обмін генами, так само як і введення в клітину гена, що належить іншому виду, можна здійснити за допомогою генетичної рекомбінації in vitro. Цей підхід був розроблений на бактеріях, зокрема на кишкової палички, в клітини якої вводили гени тварин і людини і домагалися їх реплікації.

Метод рекомбінації in vitro полягає у виділенні ДНК з різних видів, отриманні гібридних молекул ДНК і введення рекомбінантних молекул в живі клітини з тим, щоб домогтися прояви нової ознаки, наприклад синтезу специфічного білка.

Виділення генів, які представляють собою сегменти ДНК, здійснюється на основі біохімічних методів; складність виділення залежить від величини геному. У той час як певний ген вірусу виділити відносно просто, для гена людини це дуже складне завдання. Тому дослідники вдаються до непрямого методу, заснованого на виділенні інформаційної РНК (мРНК). У клітинах тварин транскрипція мРНК на ДНК здійснюється у клітинному ядрі; молекули мРНК переносять інформацію з ядра в цитоплазму, де вона використовується при трансляції білків, амінокислотні послідовності яких закодовані в послідовностях нуклеотидів мРНК

(Тобто в кінцевому рахунку в ДНК). У клітинах бактерій (бактерій), які не мають ядра, транскрипція і трансляція відбуваються одночасно і пов'язані; мРНК пов'язана з рибосомами, в яких здійснюється з'єднання амінокислот з утворенням білків. Рибосоми грають ключову роль в трансляції і в клітинах тварин.

Поряд з інформацією про структуру білків (записаної за допомогою генетичного коду) молекула ДНК містить ряд регуляторних сигналів, записаних у вигляді специфічних нуклеотидних послідовностей. Ці сигнали служать точками початку транскрипції або трансляції, інші (зокрема, між генами) вказують точки припинення зчитування генетичної інформації. Генетичний код, мабуть, універсальний для всіх живих організмів, іншими словами, дана послідовність ДНК обов'язково кодує один і той же білок у клітинах різних організмів, тоді як регуляторні сигнали в клітинах тварин і в бактеріальних клітинах не однакові. У клітинах тварин інформація про структуру білка може кодуватися не одним безперервним ділянкою ДНК, а кількома сегментами, розділеними ділянками ДНК, що носять назву нітронів. Інформаційна РНК, яка транскрибується з ДНК, піддається розщепленню, в ході якого всі інтрони видаляються з її послідовності, а інші залишаються фрагменти, або Екзони, зшиваються разом з утворенням молекули мРНК, яка володіє послідовністю, що кодує послідовність амінокислот білка, а також містить ругуляторние сигнали , необхідні для початку та припинення процесу трансляції.

Для експресії в бактеріальній клітині гена з клітки тварини необхідно, щоб в клітку була введена молекула ДНК з послідовністю нуклеотидів, яка кодує білок, з якої інтрони вже вилучені; іншими словами, потрібна молекула ДНК, синтезована на відповідній мРНК зворотного транскриптазою. Більш того, регуляторні сигнали повинні бути схожі на такі бактеріальної клітини. Нарешті, для отримання потрібного білка в достатніх кількостях бувають необхідні додаткові зміни бактеріальної клітини. [2]

Методи введення ДНК в бактеріальні клітини

Для введення ДНК (генів) у клітини бактерій використовуються два методи. Перший заснований на застосуванні плазміди як вектор.

На початку 1950-х рр.., Незабаром після відкриття Ледербергом процесу кон'югації Escherichia coli, було встановлено, що типи «спаровування» клітин бактерій обумовлені генетично і що генетична інформація переноситься з клітин чоловічого типу в клітини жіночого типу, або реципієнтного клітини. Здатність служити донорними клітинами (або фактор плодючості F) передавалася при кон'югації значно частіше, ніж будь-який інший генетичний ознака. F-фактор передавався також незалежно від будь-якого іншого відомого гена донорной клітини. Ледербергом помітив, що F-фактор нагадує позахромосомних генетичні елементи, наявні в цитоплазмі вищих організмів. Це спостереження дозволило йому в 1952 р. привласнити подібним позахромосомних генетичним системам загальна назва-плазміди.

У 1953 р. Хейс, який у той час працював у лікарні Хаммерсміта в Лондоні, встановив, що в певних умовах F-фактор може виявитися зчепленим з генетичними маркерами та індукувати послідовний їх перенесення в ході кон'югації. F-фактор приєднується до бактеріальної хромосомі в специфічному ділянці (сайті); саме в цій точці хромосома розривається при кон'югації і починається її перенесення в реципієнтного клітку. F-фактор здатний також відділятися від хромосоми, захоплюючи часом невеликі фрагменти хромосоми; тому його можна розглядати як віехромосомний елемент, який іноді інтегрує в хромосому.

Жакоб і Вольман, співробітники Інституту Пастера в Парижі, відзначили подібність у поведінці F-фактора, помірного бактеріофага X, та іншої плазміди-Со1Е1 (яка кодує коліцін-білок, що вбиває клітини Є. coli). Для позначення генетичного елементу, який може реплицироваться або у вільному стані, або з'єднавшись з бактеріальною хромосомою, вони запропонували новий термін-«епісома».

У 1959 р. в Японії при дослідженні хворих бактеріальною дизентерією, які не піддавалися лікуванню зазвичай ефективними антибіотиками, було зроблено чудове відкриття. У клітинах патогенних бактерій (Shigella dysenteriae) були знайдені гени, що додавали їм стійкість одночасно до кількох антибіотиків; така стійкість передавалася іншим кишковим бактеріям багато в чому подібно до того, як передається F-фактор. Ці фактори стійкості (звані R-факторами) володіли схожістю з F-фактором; так, вони були здатні індукувати передачу самих себе від клітини до клітини при кон'югації. Пізніше вдалося показати, що деякі з них містять послідовності нуклеотидів, близькі до таких F-фактора.

На початку 1960-х рр.. Новік виявив подібні фактори стійкості у мікроорганізмів; вони містили ген, що кодує фермент пеніцилін-β-лактамазу, або пеніциліназу; остання розщеплює пеніцилін і таким чином забезпечує стійкість до цього антибіотика. R-фактори стафілококів, мабуть, не здатні забезпечувати передачу самих себе за допомогою кон'югації і переносяться лише пасивно в процесі трансдукції, тобто при їх вбудовування в ДНК бактеріофага. Це відкриття вказувало на наявність декількох R-факторів у клітинах кишкових бактерій.

До середини 1960-х рр.. стало очевидним, що більшість R-факторів кишкових бактерій і стафілококів (як і плазміда Со1Е1) відрізняються від F-фактора і фага λ [І.С.1] тим, що залишаються позахромосомних елементами; їх оборотного вбудовування в хромосому клітини не відбувається. У строгому сенсі вони не відповідали визначенню еф. У 1963 р. Новік запропонував користуватися переважно терміном «плазміда», як більш загальним, а не «епісома». В даний час термін «плазміда» є загальноприйнятим.

Плазміди знайдені майже у всіх видів бактерій. Штам, що містить плазміду, здатний давати початок варіантів, у яких плазміда втрачена; в подібних випадках плазміда втрачається остаточно, клітина не здатна її регенерувати і може тільки отримати її з іншої бактеріальної клітини.

Плазміди є кільцеві молекули ДНК, за розміром відповідні 1-3% геному бактеріальної клітини, проте навіть настільки мала частина спадкового апарату кодує важливі генетичні ознаки, які зазвичай сама бактеріальна хромосома не кодує. Наприклад, вони містять інформацію, необхідну для кон'югації бактеріальних клітин, ними обумовлений ряд захворювань рослин і тварин. Вони дозволяють клітинам використовувати багато складні сполуки в якості джерел живлення і забезпечують стійкість до різноманітних токсичних агентів, особливо до антибіотиків. Плазміди стафілококів несуть гени стійкості до пеніциліну, з'єднанням ртуті і ряду важких металів, що викликають летальний ефект (солей сурми, вісмуту, кадмію і свинцю, іонів арсената і арсенита). Гени стійкості до важких металів виявлено також у складі R-плазмід Є. соli. Наявністю плазмід обумовлені також деякі захворювання з вираженою діареєю, стафілококовий імпедіго, сгущення молока і перетворення його в сир молочнокислими бактеріями, а також різноманітні біохімічні реакції, характерні для бактерій роду Pseudomonas .. Плазміди можуть керувати синтезом інсектициду в клітинах Bacillus thuringiensis [2]. Використання плазмід в якості векторів для введення чужорідних генів в бактеріальні клітини починаючи з 1975 р. послужило поштовхом для інтенсивних досліджень їх структури та характеру реплікації.

Кількість плазмід у клітині може коливатися від однієї до більше сотні; в цілому, чим крупніше плазміда, тим менша кількість її копій в клітці. Зазвичай реплікація плазміди регулюється незалежно від реплікації хромосоми. Оскільки плазміди можуть розрізнятися за кількістю копій водної і тій же клітині, кількість копій; має визначатися регуляторною системою, властивою самій плазміді. Така система була описана в 1972 р. данцем Нордстрема з Університету Оденсе для плазміди R1 Є. со1i; подібні регуляторні системи були знайдені у плазмід стафілококів. Кількість копій плазміди R1 залежить, мабуть, від білка або білків, які пригнічують її реплікацію. Сегмент ДНК довжиною не більше двох тисяч пар нуклеотидів управляє реплікацією плазміди, яка більш ніж у 50 разів його крупніше.

Довгий час вважалося, що генетична конституція всіх клітин даного виду однакова і не змінюється протягом тривалого часу, проте, як виявилося, значна частина генетичних ознак, причому не тільки у бактерій, але й у вищих організмів, нестабільна (ці ознаки є в одних клітинах або штамах і відсутні в інших,, клітини можуть втрачати їх і купувати знову) і мобільна (здатна переноситися між клітинами або переміщатися в одній і тій же клітині з одного локусу в іншій). Така нестабільність об'ясняетcя тим, що ці ознаки визначаються плазмідами і тугими атиповими генетичними системами.

При зв'язуванні бактеріальних клітин може відбуватися обмін плазмідами між бактеріями, які належать до різних видів і навіть родів, які не здатні обмінюватися генами, які у хромосомах. Нарешті, такий обмін може призводити до перенесення генів, що знаходяться в плазміді, з одного виду в інший при спільному рості і конкуренції, в результаті чого реципієнтного клітини набувають здатність виживати за рахунок донорних клітин. Ці властивості показують, що плазміди здатні до виживання незалежно від долі містять їх клітин, вони не тільки не знижують загальної пристосованості клітини, але, навпаки, забезпечують її додатковими адаптивними функціями. У самому справі, плазміди мають здатність включати в себе нові гени, а вже містяться в них гени «перетасовують» так, що це, з одного боку, не впливає на ефективність реплікації самих плазмід, а з іншого-наділяє клітку резервуаром генетичної інформації, яку вона використовує в міру потреби.

Другий метод, яким дослідники користуються для введення гена в бактеріальні клітини, заснований на застосуванні бактеріофага як вектор. Ген вбудовують у геном вірусу (який містить 10-50 генів), і він реплікується разом з генами вірусу при розмноженні останнього в бактеріальній клітині. [2]

Досягнення генної інженерії.

Група Корани синтезувала ген аланіновой тРНК дріжджів, структура якого на той час була повністю розшифровано. Цей ген довжиною 77 п. н. не містив регуляторних послідовностей і тому не мав функціональною активністю. Пізніше та ж група авторів синтезувала перший функціонально активний ген - ген супресорної тирозинових тРНК Є. coli довжиною близько 200 п. н.

Генна інженерія відкрила шлях для виробництва продуктів білкової природи шляхом введення в клітини мікроорганізмів штучно синтезованих кодують їх генів, де вони можуть експресуватися у складі гібридних молекул. Першою вдалою спробою такого роду стала робота К. Ітакури і Г. Бойєра з співавторами (1977) за експресією в Є. coil хімічно синтезованого гена, що кодує гормон ссавців - соматостатин. Ген соматостатину був отриманий на основі відомостей про первинний будові цього пептидного гормону, який складається всього з 14 амінокислот. Використаний в цій роботі підхід виявився досить перспективним для отримання та багатьох інших пептидних гормонів.

У різних лабораторіях в СРСР і за кордоном були створені штами Е. coli, синтезують у складі гібридних білків гормон росту людини (соматотропін), пептидні гормони - брадикінін і ангіотензин, нейропептид лей-енкефалінів та ін

Ген гормону росту людини довжиною 584 п. н .- найдовший зі штучно синтезованих в даний час. Він був вмонтований в плазміду, реплікується в Є. coli під контролем промотора триптофанового оперону. Трансформовані отриманої химерною плазмидой клітини Є. coli продукували при індукції промотора близько 3 млн. молекул гормону росту людини в розрахунку на клітину. Цей поліпептид, як було встановлено в експериментах на щурах з віддаленим гіпофізом, за функціями виявився повністю ідентичний гормону росту людини.

У 1976 р. Гілберт і Максам в Гарвардському університеті, а також Сенгер розробили найшвидший метод хімічного аналізу ДНК; з'явилася реальна можливість визначати послідовність до 1000 нуклеотидів на тиждень силами одного дослідника. У 1982-1985рр. стало можливо створити прилад для автоматичного аналізу нуклеїнових кислот (а значить, генів). Аналіз ДНК дозволяє дедуціровать, грунтуючись на генетичному коді, амінокислотні послідовності білків, синтез яких знаходиться під контролем відповідних генів. За допомогою створеного в результаті вдосконалення аналізу білків мікроаналізатора Худа-Ханкепіллера (Каліфорнійський технологічний інститут, 1980) за день вдається визначати послідовність з 100-200 амінокислот, причому для цього потрібно всього 10 нг білка (1 нг = 10 -9 г) 2 [2 ].

Ще один важливий етап-це синтез біополімерів за встановленою структурі. Перші комерційні прилади, що виробляють автоматизований синтез поліпептидів, були розроблені на основі досліджень Мерріфілд в 1963 р. Вони використовуються у дослідницьких лабораторіях і у фармацевтичній промисловості.

Метод хімічного синтезу генів забезпечив також можливість отримання штамів бактерій продуцентів інсуліну людини, важливого лікувального препарату для хворих на діабет. «Ген інсуліну синтезували в виду більш 40 в основному шестичленних олігонуклеотидів, які потім об'єднували в єдину структуру з допомогою ДНК-лігаеи. Отримані двох цепочечниє полінуклеотіди довжиною 271 і 286 пар основ були вбудовані в плазмідні вектори. Туди ж були вбудовані і регуляторні ділянки ДНК, що забезпечують експресію гібридних молекул. Клоновані гени кодували синтез проінсуліну, який шляхом нескладної хімічної обробки можна перетворити на активний інсулін, включає дві поліпептидні ланцюги А і В з 21 і 30 амінокислотних залишків, сполучених між собою сульфгідрильними зв'язками »[4].

Таким способом отримані і клоновані гени, що кодують глобіну людини, тварин і птахів, білок кришталика ока бика, яєчний білок, фиброин шовку, що продукується тутового шовкопряда, та ін Цей же принцип був застосований для отримання, клонування та експресії генів інтерферону людини в бактеріях. Інтерферон - цінний лікарський препарат, який широко використовується для боротьби з вірусними інфекціями та лікування ряду інших захворювань, включаючи злоякісні пухлини. Інтерферон виробляється в клітинах тварин і людини, але має виражену видоспецифичностью. Ю. А. Овчинников та В. Г. Дебабов з співробітниками отримали мікроорганізми, ефективно синтезують інтерферони людини. Цим дослідникам вдалося сконструювати рекомбінантні плазміди, які обумовлюють синтез інтерферону людини в Є. coli (рис. 16.2). Очищений з клітин бактерій інтерферон за своїми фізико-хімічними та біологічними властивостями виявився близький інтерферону, що знаходиться в крові донорів. За рахунок введення в векторну плазміду сигнальних послідовностей, що ініціюють синтез іРНК і білка, вдалося отримати бактерії, здатні синтезувати до 5 мг інтерферону а розрахунку на 1 л суспензії бактерій. Це в 5000 разів більше, ніж міститься в 1 л крові донорів. Заміна Є. coli на мікроби деяких інших видів дозволяє ще більше збільшити продуктивність такої «фабрики інтерферону».

У 1980 р. Ітакура створив перший синтезатор генів. Незабаром після цього компанія «Біо-Лоджікалс» (Торонто) випустила прилад, сконструйований Огілві в Університеті Макгілла в Монреалі; прилад був здатний протягом 6 год синтезувати 12-членний олігонуклеотиди із заданою послідовністю. У 1981 р. Худ, винахідник білкового мікроаналізатора, створив інший автомат, що випускається фірмою «Генетик інстраментс».

Компанія «Біо-Лоджікалс» мала намір до кінця 1982 р. випустити дві моделі синтезаторів олігонуклеотидів-одну напівавтоматичну, а другу в комплексі з комп'ютером. У 1982 р. ціна цих приладів на американському ринку становила 36000-39500 дол [2].

До відкриттів пов'язаних з досягненнями генної інженерії потрібно додати те, що величезний генетичний «креслення» багатоклітинного істоти прорахований повністю. Я думаю це можна назвати досягненням минулого століття.

Після восьми років роботи багатьох дослідницьких груп вдалося точно визначити 97 мільйонів пар нуклеотидів і їх місцезнаходження в спіралі ДНК, що зберігає повну спадкову інформацію мікроскопічного черв'ячка Сaenorhabditis elegans довжиною близько міліметра Хоча це дуже маленький хробак, швидше черв'ячок, з нього без жодного перебільшення починається нова ера в біології. Геном цієї нематоди складається з 97 мільйонів пар нуклеотидів ДНК, округлено 0,1 мільярда пар. Геном людини, відповідно до більшості оцінок, - 3 мільярди нуклеотидних пар. Різниця в 30 разів. Однак саме ця робота, про яку йде мова, остаточно переконала навіть найзатятіших скептиків, що розшифровка будови всього геному людини не тільки можлива, а й досяжна в найближчі роки.

У лабораторіях світу повним ходом іде розшифровка геному людини. Ця міжнародна програма була розпочата в 1989 році, тоді ж завдяки ініціативі та енергії видатного біолога, нині покійного академіка А. А. Баєва, до програми підключилася і Росія. У лютому цього року в Чорноголовка під Москвою пройшла конференція "Геном людини-99", присвячена десятиріччю початку цих робіт і пам'яті їх ініціатора, що керував російською частиною програми перші п'ять років. Зараз в різних країнах світу, в лабораторіях, що поділили між собою "фронт робіт" (всього треба прочитати близько трьох мільярдів пар нуклеотидів), щодня розшифровується більше мільйона нуклеотидних пар, причому темп робіт всі прискорюється. [6]

Розшифровка, або, як говорять біологи, секвенування, геному C. elegans була здійснена за спільним проектом двома дослідницькими групами: з Центру геномного секвенування Вашингтонського університету (США) і Сенгеровского центру (Кембридж, Англія). У журналі "Science" від 11 грудня 1998 року опублікована серія статей, що детально розповідає про цю воістину грандіозною роботі.

Природно, розшифрувати геном таких гігантських розмірів, як у названої нематоди (нагадаю: 97 мільйонів пар нуклеотидів ДНК), неможливо без величезної підготовчої роботи. Її в основному завершили до 1989 року. Перш за все була побудована фізична карта всього геному нематоди. Фізична карта являє собою невеликі ділянки ДНК відомої структури (маркери), розташовані на певних відстанях один від одного.

І ось з 1990 року почалося саме секвенування. Його темп становив у 1992 році 1 мільйон пар нуклеотидів в рік. Якщо б такий темп зберігся, на розшифровку усього генома знадобилося б майже 100 років! Прискорити роботи вдалося найпростішим способом - число дослідників у кожному центрі зросла приблизно до 100. У міру того, як розкривалася нуклеотидна послідовність ДНК

C. elegans, довелося розлучитися з двома помилками. По-перше, виявилося, що генів у неї не 15 тисяч, як припускали спочатку, а 19099. По-друге, надія на те, що гени зосереджені в середині хромосом, а до кінців сильно рідшають, виправдалася лише почасти, гени розподілені уздовж хромосом відносно рівномірно, хоча в центральній частині їх все-таки більше.

Якщо у дріжджів функція половини генів у геномі невідома (так звані мовчазні гени), то у хробака ця частка ще більше: з 19 тисяч генів 12 тисяч залишаються поки загадковими.

Значення секвенування генома нематоди, звичайно, виходить далеко за рамки того, що можна назвати полігоном для розшифровки генома людини. C. elegans - перший багатоклітинний організм, геном якого розкрито практично повністю. Можна нагадати: два роки тому був розшифрований перший геном еукаріотичного організму - дріжджів, тобто організму, клітини якого містять оформлені ядра. (До еукаріотів відносяться всі вищі тварини і рослини, а також одноклітинні і багатоклітинні водорості, гриби та найпростіші. Дріжджі, згідно біологічної систематики, належать до одноклітинних грибів.) Інакше кажучи, за два роки був пройдений шлях від генома одноклітинного до геному багатоклітинного організму.

Програма "Геном людини", як уже говорилося, - програма загальнолюдська. Кожна лабораторія, в якій би країні вона не знаходилася, вносить до неї посильний внесок. І як тільки комусь вдається розкрити структуру нового гена, ця інформація негайно надходить в Міжнародний банк даних, доступний кожному досліднику. У Росії за цією програмою працюють близько 100 дослідницьких груп. [6]

Молекулярна геноміка.

Особливо мені хотілося б відзначити зміни в медицині відбуваються за рахунок досягнень генної інженерії. Наступаючий ХХI століття багато проголошують століттям генетики. Сучасну генетику, що вивчає хімічні механізми спадковості, називають молекулярною геноміки. Сьогодні молекулярна геноміка - пріоритетний напрям наукових досліджень. Вона впливає на розвиток науки в цілому та охорони здоров'я і медицини зокрема. Молекулярна геноміка створила передумови вирішення таких ключових питань сучасної науки, як походження людини (філогенез), виникнення рас і націй, шляхи їх розселення по планеті (етногенез), розвиток організму з однієї єдиної клітини (онтогенез), проблема клонування ссавців і людини. "Генетізація" суспільства відбувається буквально на наших очах. А це, у свою чергу, не може не привести до якісних змін і в медичній науці: в ній наступає епоха молекулярної медицини. Молекулярна медицина це - діагностика, лікування та профілактика спадкових і неспадкових хвороб на генному рівні.

Вже в підході до постановки діагнозу молекулярна медицина принципово відрізняється від звичайної. Головне питання традиційної медицини: "Чим ви вболіваєте?", А молекулярної: "Чим ви можете захворіти при вашому геномі?". Тобто молекулярна медицина виявляє генетичну схильність людини до різних хвороб.

Наступна характерна риса молекулярної медицини - лікування захворювань (як спадкової, так і неспадкової природи) проводиться на генному рівні. В якості лікарського препарату виступають гени (точніше - спеціальні генетичні конструкції). Генна терапія не просто усуває певні симптоми захворювання, а коригує функції клітин і організму в цілому. Її терапевтичний ефект може досягатися різними шляхами: заміна "хворого" гена на "здоровий", спрямована корекція структури і, відповідно, функції "хворого" гена, часткове або повне придушення "хворого" гена.

І, нарешті, ще один важливий принцип молекулярної медицини: будь-яке медикаментозне лікування повинне підбиратися суворо індивідуально, враховуючи особливості геному хворого. Цим займається нещодавно виникла наука - фармакогенетика.

Вже сьогодні практичне застосування молекулярної медицини дуже різноманітно. Це - і молекулярна діагностика спадкових захворювань на будь-якій стадії розвитку організму, у тому числі і до народження (пренатальна діагностика), та визначення генів схильності до деяких поширених хвороб, і геномна "дактилоскопія" - точна ідентифікація особистості на основі аналізу особливостей структури його генома ( саме цей метод був з успіхом застосований при генетичному аналізі останків царської сім'ї).

У геномі людини налічується 35-50 тисяч різних генів, зміни в деяких з них призводять до декількох тисяч спадкових хвороб. Гени практично всіх найбільш частих (близько 320) і порівняно рідкісних (близько 170) спадкових хвороб вже відомі. Методи їх виявлення досить прості та універсальні і тому широко застосовуються в медицині.

Зараз у нас в країні можна визначити близько 40 найбільш важких спадкових хвороб. Молекулярна діагностика генів спадкових хвороб проводиться в НДІ акушерства і гінекології в Санкт-Петербурзі, в Науковому центрі медичної генетики та Інституті неврології РАМН в Москві, в Інституті біохімії та генетики наукового центру РАН в Уфі, в Інституті медичної генетики в Томську та в Медико-генетичному центрі в Новосибірську.

Методи молекулярної діагностики дозволяють виявити не тільки гени спадкових хвороб, а й гени схильності до того чи іншого захворювання. Гени схильності - об'єкт дослідження багатьох наукових груп по всій Росії. Так, у Санкт-Петербурзі на кафедрі медичної генетики Педіатричної академії активно вивчаються гени схильності до тромбофілії, варикозного розширення вен, серцево-судинних захворювань, діабету, атеросклерозу; в Інституті експериментальної медицини РАМН досліджуються гени гіперхолестеринемії, що призводять до атеросклерозу та хронічних захворювань легень та печінки , а в НДІ онкології імені професора М. М. Петрова - гени схильності до пухлин легенів і молочної залози. Роботи з цієї тематики проводяться у Москві: у Всеросійському кардіологічному центрі РАМН, в Інституті молекулярної генетики РАН і у Всеросійському онкологічному центрі РАМН, а також у Томську - в Інституті медичної генетики.

Молекулярна геноміка вже застосовується в Європі та Сполучених Штатах для вирішення різноманітних завдань медицини та медичної генетики. Наприклад, у Великобританії створені інформаційні центри, і кожен, який подзвонив туди, може отримати консультацію з будь-яких питань, що стосуються своєї спадковості та генетичної схильності до різних захворювань. У Франції створена і використовується на практиці комп'ютерна експертна система Сезам (SESAM - Systeme Expert Specialisee aux Analyses Medicales) для визначення схильності людини до різних захворювань. Вона включає власне експертну систему оцінки ризику виникнення захворювання, засновану на численних лабораторних (імунологічних, біохімічних, серологічних і генетичних) тестах (більше 80), програму для навчання лікарів основ молекулярної медицини, медичне консультування з результатами лабораторних тестів і популярний довідник для населення. Програма чудово зарекомендувала себе у Франції, і хочеться вірити, що російські медики в недалекому майбутньому теж зможуть її використовувати. [5]

Генна терапія.

В даний час в світі близько 400 проектів з генної терапії перебувають на різних стадіях клінічних випробувань: 261 з них проходить першу стадію (оцінка токсичності), 133 - другу (випробування на невеликій групі тяжкохворих пацієнтів) і тільки 3 проекту (два з лікування раку мозку і один по гемофілії) - на завершальній третій стадії (масштабні клінічні випробування). Поки генна терапія застосовується в основному в онкології (більше 60% проектів). Приблизно по 15% припадає на генну терапію інфекційних (СНІД, гепатит В, туберкульоз) і моно генних захворювань (муковісцидоз, сімейна гіперхолестеринемія, мукополісахаридози, гемофілія А та ін). Методи генної терапії дозволяють лікувати різні генетичні патології в період внутрішньоутробного розвитку. Введений ген або генна конструкція потрапляє в безліч інтенсивно діляться клітин, запобігаючи початок розвитку захворювання. Після такої терапії немає необхідності штучного переривання вагітності - дитина народжується здоровим. Але тим не менше питання про її доцільність піднімається все частіше і частіше - теоретично існує небезпека впровадження штучних генних конструкцій у геном статевих клітин, що може призвести до "засмічення" генофонду.

Генна терапія успішно застосовується для лікування не тільки спадкових, але і значно більш поширених мультифакторіальних хвороб (діабет, остеопороз, ревматоїдний артрит, різні пухлини). Для лікування таких захворювань застосовується не одна, а відразу багато генетичних конструкцій, що виправляють дефекти різних стадій перебігу патологічного процесу.

На жаль, з усіх проектів з генної терапії, затверджених Американським і Європейським комітетами з генної терапії, немає жодного проекту з Росії або країн СНД. Тим не менш наукові роботи в цій області ведуться і в Росії. В Інституті акушерства і гінекології імені Д. О. Отта РАМН розробляються нові підходи до генної терапії таких тяжких спадкових захворювань, як м'язова дистрофія Дюшенна і муковісцидоз. Роботи з генної терапії також проводяться в наукових установах Москви (Інститут молекулярної біології імені В. О. Енгельгардта РАН, Інститут молекулярної генетики РАН, Інститут медичної хімії РАМН, Науковий центр медичної генетики РАМН) і Новосибірська. [5]

Біотехнологічні та генно-інженерні компанії та їх розробки. Компанії США

З 1978 р. федеральний уряд США підтримує різні біотехнологічні дослідження, особливо пов'язані з рекомбінантними ДНК. Національний інститут здоров'я уклав 365 контрактів з досліджень у цій галузі на загальну суму 42 млн. дол 19 університетів трьох регіонів-Гарварду, Станфорда і Великих озер (де знаходиться Вісконсінський університет)-проводять фундаментальні дослідження, пов'язані з розвитком біотехнології. У 1975-1980 рр.. в 25 компаній, що займаються генною інженерією, було вкладено понад 266 млн. дол Компанії використовували патенти і результати досліджень, виконаних в університетах США. За даними нью-йоркської фірми «Еберстадт і К º» і Бюро оподаткування промислової діяльності, в кінці 1979 р. в країні налічувалося не більше 14 компаній з генної інженерії. На 20 січня 1982 таких фірм було вже 145. (Див. додаток 2)

У більшості випадків біотехнологічні компанії з'являлися при об'єднанні одного-двох дослідників з заповзятливим підприємцем, готовим ризикнути. Вчені вкладали в цей союз свої ідеї та досвід, підприємець-необхідні кошти. На наступному етапі у фінансування компаній включалися промислові групи, при цьому відбувався прискорює ріст числа все більш авторитетних вкладників. Нарешті, наступав момент, коли акції компаній починали котируватися на біржі. У випадку фірми «Генентек» це сталося на п'ятий рік існування компанії, «Цетус» - на десятий.

Особливих успіхів у застосуванні та розробці технологій, пов'язаних з рекомбінантними ДНК, досягли чотири фірми: «Цетус», «Генентек», «Генекс» і «біогени».

Найстаріша з них-«Цетус» була заснована в Берклі (шт. Каліфорнія) Д. А. Глазер, Нобелівським лауреатом у галузі фізики, і біохіміком Кейп. Вони ставили перед собою завдання відібрати найбільш продуктивні мікроорганізми для промислового застосування.

Спочатку були використані традиційні методи генетичної селекції, потім провідну роль у діяльності компанії зайняли методи генної інженерії. Наукову роботу компанії з даної проблематики очолив генетик Дж. Ледербергом. В області органічної хімії фірма «Цетус» зосередила зусилля на розробці методів перетворення етилену і пропилену в окису і гліколі з використанням іммобілізованих ферментів і клітин. Створені фірмою технології із застосуванням біокаталізаторів були дешевші, тоді як традиційні процеси на основі металевих каталізаторів вимагали високих температур і тисків. Для промислового отримання зазначених речовин спільно з корпорацією «Стандарт ойл» було заплановано створення дослідного виробництва. «Цетус» розробляє також технологію виробництва високоякісних мастильних матеріалів, одержуваних з нафти за допомогою мікроорганізмів і покликаних замінити жир кашалота. Вартість таких речовин становить сотні мільйонів доларів. Користуючись методами генної інженерії, компанія розробить особливі смоли для вилучення залишків нафти з виснажуються свердловин. Спільно з "Нешнл дістеллерс» «Цетус» розробила безперервний процес конверсії цукру в етиловий спирт. Для цього відібраний виведений дослідниками фірми високопродуктивний штам дріжджів. Крім перелічених напрямів фірма «Цетус» займається синтезом фармацевтичних речовин, таких, як інтерферон, фактор згортання крові VIII і білки одноклітинних організмів. Фірма має дуже великою лабораторією, що працює в умовах високого ступеня біологічної безпеки.

У 1980 р. пакет акцій компанії «Цетус» оцінювався в 100 млн. дол 61% акцій належав фірмам «Стандарт ойл Каліфорнія», «Стандарт ойл Індіана» та «Неншл дістіллерс», власниками 39% акцій були засновники «Цетус» і приблизно 200 дрібних вкладників. До того часу фірма налічувала 250 співробітників, з них 35 мали докторський ступінь.

Компанія «Генентек» також знаходиться в Каліфорнії, в прибережній зоні Сан-Франциско. Її заснували Свонсон (президент і головний адміністратор) і Бойєр (професор біохімії університету в Сан-Франциско, який став віце-президентом). Початковий капітал компанії становив 1 млн. дол До 1980 р. у ній вже працювало 70 фахівців, 30 з них зі ступенем доктора. За контрактами з компанією працює приблизно таке ж число консультантів. Значні успіхи, досягнуті в синтезі соматостатину, інсуліну, гормону росту людини та інтерферону, багато в чому пояснюються успішною співпрацею з видатними університетськими вченими і тим, що дослідники є одночасно акціонерами компанії

За свідченням газети «Уолл-стріт джорнал», перший день появи на біржі акцій компанії «Генентек» можна було назвати одним з найбільш вражаючих дебютів сучасного ділового світу. Компанія випустила 1 млн. акцій вартістю 20-30 дол, але ажіотаж навколо них був настільки великий, що вихідна продажна ціна склала 35 дол У жовтні 1980 р. були випущені ще 100 000 акцій. Загальний капітал компанії склав 36 млн. дол Під час бурхливого першого дня продажу більше половини акцій були віддані початковими покупцями по 80 дол за акцію; потім вартість акцій опустилася до 71 дол Оскільки компанія володіє 7,5 млн. акцій, її капітал оцінювали більш ніж у 500 млн. дол (за обережними оцінками, 180-300 млн. дол.)

Два засновника компанії мають по 1 млн. акцій кожен (15%). Найбільший акціонер, фірма «Lab-Різоля, інк.» (Клівленд), придбала 1,5 млн. акцій всього по 10 дол за штуку (24%). На частку фірми «Клейнер і Перкінс» припадає майже 1 млн. акцій (14%), а «Уіл-мінгтон Секьюрітіс, інк." Має менш ніж 500000 акцій (6,2%). Інші акції розподілені між науковим персоналом і директоратом компанії «Генентек».

За даними, представленим в прес-релізах компанії в серпні 1980 р., прибуток за першу половину поточного року склала 3,8 млн. дол в порівнянні з 3,4 млн. дол за той же період у 1979 р. Більшу частину прибутку забезпечили дослідні контракти з фірмою «Елі Ліллі», шведською компанією «Кабі вітрум» і французької «Хофман-Ла Рош». Контракти передбачали розробку технології отримання комерційної інсуліну, гормону росту людини та інтерферону відповідно. За заявою представників «Генентек», у другій половині 1980 р. прибуток від контрактів повинна була скласти 2,7 млн. дол

У квітні 1982 р. фірма «Корнінг гласі» (шт. Нью-Йорк) заявила про купівлю протягом двох років 571 000 акцій (за ціною 35 дол за штуку) фірми «Генентек» на суму 20 млн. дол Ця сума становить приблизно 6% усього капіталу «Генентек». Нові вкладення послужили поштовхом до створення дочірньої компанії «Гененкор, інк.», Яка спеціалізувалася на розробці, одержанні і продажу ферментів, іммобілізованих на інертних носіях для використання в харчовій промисловості. «Корнінг гласі» передала нової компанії фірму «Ензим Дівіжн», придбану в американської фірми «Ром і Хаас» в 1981 р.

Група «Корнінг голосі», пов'язана зі скляної промисловістю з моменту, її створення наприкінці минулого століття, з 1965 р. почала спеціалізуватися в галузі біотехнології. Її відділення «Корнінг біосістемз» виробляє ферменти і мікроорганізми, іммобілізовані на склі або пористої кераміки. Продукція фірми посіла важливе місце в харчової та сільськогосподарської промисловості, особливо в переробці молочної сироватки-побічного продукту сироваріння: У грудні 1981 р. для отримання з сироватки білків і вирощування пекарських дріжджів в США була створена фірма «Натрісерч К °». Для тих же цілей в січні 1982 р. відбулося об'єднання «Спешіаліст Дайрі інгредієнт К °» і «Мілк маркетинг боард». Фірма «Корнінг гласі» спільно з французькою «Юньон летьер Норманд» планувала створити об'єднаний філію у Франції для промислової переробки сироватки.

У 1977 р. біохімік Глік і промисловець Джонстон в Роквілле, поблизу м. Бетесда (шт. Меріленд), заснували компанію «Генекс» приблизно з 30 дослідниками. Наукову діяльність компанії очолив Д. Джексон з Мічиганського університету. Компанія спеціалізувалася на біохімічному отриманні проміжних метаболітів. За оцінками, її актив в 1980 р. перевищував 10 млн. дол Трохи більше третини акцій належало засновників і працівників «Генекс», інші дві третини-промисловим фірмам, які фінансують діяльність компанії («іннова», створеної спільно фірмами «Монсанто» і « Емерсон електрик », 25% акцій і« Копперс »30% акцій).

Засновники «біогени» зареєстрували свою компанію, в Люксембурзі, а штаб-квартиру перенесли до Женеви. Ініціатива виходила від Д. Адамса з «Інтернешнл нікелю К °», якій належать 24% капіталу «біогени». Інвестиції фармацевтичної фірми «Шерінг-Плау» в «біогени» складають 16%. Серед інших пайовиків-«Монсанто» і «Дженерал метрополітен». Наукову групу в компанії складають в основному європейські вчені. Серед них слід згадати Вейсман з Цюріхського університету, Мюррея з Единбурзького університету та Хартлі з Королівського коледжу в Лондоні. Американські вчені представлені Гілбертом з Гарвардського університету та Шарпом з Массачусетського технологічного інституту. Штат наукових співробітників компанії налічує 50 осіб. Фонди «біогени» в 1980 р. обчислювалися 50 млн. дол У жовтні 1981 р. компанія отримала додаткову фінансову підтримку в 20 млн. дол від банків і страхових компаній, переважно англійських. Перша продукція «біогени» з'явилася в 1983 р.:

лейкоцитарний інтерферон людини, який синтезується бактеріями, отриманими методами генної інженерії, був випущений в Цюріху фірмою "Шерінг-Плау». Клінічні випробування препарату проводилися в Нідерландах. Мюррей успішно клонував ген поверхневого антигену вірусу гепатиту В, що стало важливим етапом у створенні вакцини проти цієї хвороби. Вакцина була перевірена на тварин. Фірма «біогени» домовилася про остаточне її випуск на ринок з японської фармацевтичної компанією «Грін крос корп.» (Осака). Проводилися також випробування вакцини проти ящуру. «Біогени», раніше при збуті своєї продукції розраховуємо на підтримку солідних компаній-виробників, з 1983 р. розробляє інші методи організації цієї діяльності.

У жовтні 1981 р. від компанії відбрунькувалася дочірня фірма, «біогени, інк.», Розташувавшись по сусідству з Массачусетським технологічним інститутом. Президентом став Гілберт, Нобелівський лауреат 1980 р. і професор Гарвардського університету. Він співпрацював з компанією «біогени» з моменту її заснування в 1978 р., будучи главою наукової ради, а з середини 1979 співголовою Ради директорів. В кінці 1982 р. була створена група з 17 фахівців; її діяльність була пов'язана з різними біохімічними інженерними процесами, головним чином з розробкою бактеріальних методів отримання етанолу та інших речовин. Проводилися також дослідження області Н-2 геному миші, в якій зосереджені детермінанти основного комплексу гістосумісності. Відповідна область геному людини НЬА також стала предметом вивчення фахівців з далекої метою одержання речовин, що впливають на диференціювання тканин. Цією групою вчених чисельністю в 20 чоловік керував Флавел, англійський фахівець в області клонування генів, до початку 1982 р. працював в Національному інституті медичних досліджень у Лондоні.

Поряд зі згаданими чотирма компаніями в Каліфорнії, а також у районах Бостона, Бетесда і Нью-Йорка створено цілий ряд біотехнологічних фірм (див. табл. 2). Крім того, багато фармацевтичні фірми оволоділи методами генної інженерії. Дослідницькі програми фірми «Елі Ліллі» пов'язані з ферментацією, сільським господарством і медициною. «Пфіцер» і «Хоф-ман-Ла Рош» активно працювали над створенням інтерферону, конкуруючи в цьому з «біогени». Фірма «Апджон» зосередила свої зусилля на поліпшенні методів бродіння і виробництва антибіотиків. Одному з фахівців фірми, Фрейзеру, вдалося клонувати ген овальбуміна курчати в кишкової палички і отримати його експресію в цьому микроорганизме. Лабораторії «Г. Д. Серл »вели дослідження в області генної інженерії в дослідницькому центрі в Хай Уайкоме (Англія). Дослідники фірми домоглися синтезу гемаглютиніну вірусу грипу в бактеріальних клітинах. Компанія «Дюпон де Немур» з 1979 р. проводить дослідницьку програму, пов'язану з генетикою, включаючи розвиток методів рекомбінантних ДНК. У 1980 р. група з 10 учених цієї найбільшої хімічної компанії працювала над створенням біотехнологічних способів одержання білків, фармацевтичних засобів та інших органічних сполук.

Фонди генно-інженерних компаній «Цетус», «Генен-тек», «Генекс» і «біогени» в 1980 р. перевищували 400 млн. дол, що гарантувало комерційну та промислову значимість проведених ними робіт в очах вкладників. Майбутнє і успішна діяльність цих фірм залежали від зростання числа патентів не менше, ніж від розробки великомасштабних виробництв і просування на ринок власної продукції. Конкуренція між фірмами у цій сфері стала ще більш жорсткою особливо після того, як рекомендації Національних інститутів здоров'я, пов'язані з безпеки генно-інженерних досліджень, пом'якшилися [2].

Компанії СРСР

У СРСР широкий розвиток досліджень у різних сферах біології відноситься до початку 1960-х рр.., Коли був створений ряд інститутів: Інститут молекулярної біології; Інститут біоорганічної хімії ім. М. Шемякіна (1959); Центр біологічних досліджень АН СРСР в Пущино-на-Оке (розташований в 100 км на південь від Москви); нові інститути на Уралі, в Сибіру; інститути Академій наук союзних республік; інститути філій АН СРСР у Казані, Махачкалі і Мурманську. Всі вони зіграли важливу роль у посиленні науково-дослідницької активності [44]. За ініціативою АН СРСР створена мікробіологічна промисловість, яка виробляє білки одноклітинних організмів, вітаміни та інші речовини.

Після Постанови від 21 травня 1974 залучення великих фінансових і людських ресурсів забезпечила розвиток біології і молекулярної генетики, а також їх додатків в сільському господарстві, медицині і промисловості. Дослідження, здійснювані методами генної інженерії, в основному були зосереджені на виробництві гормонів (інсуліну), інтерферону і моноклональних антитіл. Важливість подальшого розвитку біотехнології була підкреслена в Генеральному плані економічного і соціального розвитку СРСР на 1981-1985 рр.. і до 1990 р., який був прийнятий на XXVI з'їзді КПРС.

У липні 1981 р. ЦК КПРС і Рада Міністрів СРСР поклали на Академію наук СРСР, Державний комітет СРСР з науки і техніки, Держплан і уряди союзних республік завдання, пов'язані із застосуванням біотехнології в сільському господарстві, промисловості та медицині. Розвиток фундаментальних досліджень доручено АН СРСР і зацікавленим міністерствам.

В Інституті фізіології рослин АН СРСР ім. К. А. Тімірязєва та на підприємствах Главмікробіопрома СРСР для збільшення виробництва біологічно активних речовин використовували культури клітин женьшеню та інших лікарських рослин. Методи культивування рослинних клітин застосовували також для поліпшення властивостей сільськогосподарських рослин [2].

Західна Європа

У Західній Європі в 1981 р. налічувалося близько 200 наукових колективів, зайнятих у 1000 з гаком генно-інженерних проектах. Діяльність 170 компаній в основному або частково пов'язана з біотехнологією. Однак тільки 20 фірм використовували у своїй діяльності найбільш сучасні методи, такі, як генна інженерія, іммобілізовані ферменти та культури клітин.

У ФРН має старі традиції, пов'язані з ферментаційним процесами: виробництвом вина, пива, ацетон-бутаноловим бродінням. Важливі заходи уряду на початку 1970-х рр.. послужили вирішальним поштовхом до розвитку біотехнології. Біотехнологічна Програма, сформульована в 1974 р. і діє по сей день, присвячена задоволенню харчових потреб, вирішення проблем очищення навколишнього середовища, поліпшення медичної діагностики і терапії. Крім того, в програму входять розробка нових джерел сировини, збільшення обсягу прикладних досліджень та розвиток методів, пов'язаних з біотехнологією.

Товариство з вивчення біотехнології, засноване в середині 1960-х рр.. фондом концерну «Фольксваген» і згодом підтримане урядом, являє собою національний інститут, де в основному проводяться фундаментальні дослідження. Одночасно співробітники цього закладу займаються і прикладними розробками, які покликані сприяти зближенню науки і промисловості. Інститут розташований у Брауншвейзі, поблизу Ганновера; до кінця 1980 р. в ньому працювали 79 учених, 101 технічний співробітник і 23 фахівці з докторським ступенем. Діяльність інституту пов'язана переважно з генною інженерією і біореактора. Дослідження мікробного розкладання целюлози і роботи з отримання метану проводяться в Дослідницькому центрі «Юліх» неподалік від Центру атомних досліджень.

У 1974-1981 рр.. в біотехнологічну програму ФРН вкладено 267 млн. марок, що в десять разів перевищує інвестиції в Англії і у Франції. Державні субсидії, що складали в 1982 р. 65,9 млн. марок, в наступні роки були значно збільшені. Основну увагу, як і раніше зосереджена на мікробіологічних дослідженнях, в які вкладено 40% усіх коштів. У першу чергу це відноситься до робіт з удосконалення техніки культивування, створення колекції штамів і до генної інженерії. [2].

У Великобританії в кінці 1960-х рр.. у дослідження з ферментної технології було вкладено 500 000 ф.ст, що дозволило розробити ряд промислових процесів з іммобілізованими ферментами. Найбільшу важливість з них мали отримання фруктози і деацілірованіе бензилпеніциліну. Оскільки для ферментативних реакцій крім самих ферментів необхідні кофактори, переважно иммобилизировать цілі клітини. На думку вчених університетського коледжу в Лондоні, біотехнологічна промисловість повинна орієнтуватися на випуск продукції, яка має високої Додатковою вартістю, ціни на яку мало схильні ринкових коливань (тоді як промислова перегонка цукру в спирт залежить від ринкових цін на цукор, а отримання білка одноклітинних організмів визначається цінами на конкуруючу з ним сою).

Роботи з генної інженерії, в основному з клонування генів, проводяться Національним інститутом медичних досліджень у Мілл-Хіллі, поблизу Лондона, і в ряді інших лабораторій Медичного дослідницького ради, наприклад у Хіллз-Роуд (Кембридж). Учені в Мілл-Хіллі досліджують Н-2 область геному миші, яка кодує антигени, що визначають сумісність тканин, а також глобинового гени [2].

Міжнародне співробітництво

Міжнародне і регіональне співробітництво відіграє важливу роль у визначенні потрібного напрямку розвитку біотехнології, забезпечуючи вибір технологій, найбільш придатних для соціальних та економічних умов менш привілейованих країн. Виробництво біогазу, біоенергії, дешевих і надійних вакцин-ось області, де можна в короткий термін отримати вірну вигоду і які будуть служити розвитку високоякісних досліджень. Крім того, в цих областях можливе широке поширення досліджень і технологій, розвиток яких в даний час обмежена всього декількома країнами.

Прикладом регіональної кооперації в біотехнології може служити Центрально-Американський інститут промислових досліджень (ICAITI). Цей інститут, розташований в столиці Гватемали, був створений в 1955 р. для сприяння промисловому розвитку регіону, який в змозі забезпечити самостійне розвиток біопромишленності: сільськогосподарська промисловість виробляє великі кількості побічних продуктів і відходів, є площі, доступні для інтенсивного сільського господарства, кліматичні умови сприяють такої інтенсифікації. Дослідження та розробки з біологічної інженерії почалися в ICAITI в 1970 р.; був створений біотехнологічний відділ, який об'єднав інженерів-хіміків, мікробіологів і біохіміків. Відділ є штаб-квартирою Міжнародного центру з дослідження мікробних ресурсів (MIRCEN) цього регіону, субсидованого ЮНЕСКО.

Дослідницькі проекти інституту присвячені двом основним видам сільськогосподарської промисловості регіону: переробці кавових зерен і отримання цукру і його похідних. У 1981 р. в Центральній Америці вироблялося 10,6% від загального тоннажу кави у світі і 2,1% цукру; ці два товари є найважливішими видами сільськогосподарського експорту.

При вологій переробки кави-бобів липка оболонка бобів віддаляється в процесі природного бродіння в твердому середовищі в аеробних або анаеробних умовах пектиновими ферментами самих плодів або мікрофлори, що росте на плодах. Робилися спроби використовувати м'якоть кавових бобів, слиз, що оточує їх зерна, соки та стічні води від різних процесів переробки кави для виробництва біогазу і біомаси. У лабораторії і на дослідній промисловій установці проводилися досліди з культурами філаментозних грибів [2].

У лабораторії розроблено процес безперервного виробництва спирту з соків тропічних фруктів і подальшого напівбезперервного виробництва оцтової кислоти, потім цей процес був перенесений у промислові умови. За допомогою дріжджових ферментів, іммобілізованих на поліуретановій губці, здійснено виробництво фруктозного сиропів з цукрового очерету.

Прагнучи забезпечити перенесення технологій з розвинених країн у що розвиваються, ООН запланувала створення Міжнародного центру генної інженерії і біотехнології [2]. На нараді у Відні в лютому 1981 р. під егідою Організації промислового розвитку ООН (UNIDO) група експертів з генної інженерії рекомендувала створити комісію для вивчення думки держав-членів і фахівців щодо організації такого центру, а також його ролі і функцій.

Комісія прийшла до висновку, що такий центр повинен служити інтересам як розвинених, так і країн, що розвиваються, які можуть внести вагомий внесок у розвиток генної інженерії та біотехнології для підвищення добробуту населення. Крім того, проведення дослідницьких робіт та впровадження їх результатів будуть служити чудовою школою для вчених, надісланих до центр країнами, що розвиваються. Комісія експертів рекомендувала і області досліджень, включаючи видобуток нафти з виснажуються свердловин, використання енергії біомаси, удосконалення методів ферментації, розробку більш ефективних вакцин для людини і домашніх тварин, виділення або синтез ліків проти тропічних хвороб, селекцію сортів рослин з корисними сільськогосподарськими властивостями і перенесення генів азот фіксації в рослини. Центр повинен складатися з п'яти відділів: трьох дослідних (молекулярної біології та біохімії; мікробіології і молекулярної генетики; біотехнології), відділу біоінформатики та відділу загальних послуг.

Потім структуру центру обговорили делегати з країн, що розвиваються. Вони прийшли до висновку, що крім розповсюдження адекватних технологій центр повинен відігравати важливу роль в якості бази для навчання спеціалістів. Його завданням має також бути рішення проблем, спільних для менш розвинених країн. При центрі необхідно створити координаційну та інформаційну мережу.

За даними UNIDO, цей проект зустрів теплий прийом в країнах, що розвиваються. Разом з тим ряд керівників дослідницьких робіт у цих країнах вказали, що, перш ніж приймати рішення про будівництво такого центру, ООН повинна зміцнити національні інфраструктури, особливо в галузі освіти [2].

Потрібно також відзначити, що протягом багатьох років програми ФАО, ВООЗ і ЮНЕСКО сприяли розвитку і розширенню міжнародного співробітництва у прикладній мікробіології і технології.

Так, в 1962 р. ЮНЕСКО субсидіювала створення Міжнародної організації дослідження клітини (ICRO), а в 1972 р. спільно з цією організацією і Програмою навколишнього середовища ООН (UNEP) заснувало міжнародну програму, покликану охороняти генетичне багатство мікробних ресурсів і зробити їх доступними для країн. У 1975 р. почала створюватися мережа міжнародних центрів з дослідження мікробних ресурсів (MIRCEN) з наступними цілями: інтеграція і співпраця між лабораторіями, відповідальними за управління; розподіл і використання мікробних ресурсів; збереження мікроорганізмів, розробка нових видів місцевої і недорогий технології; додаток мікробіології в сільських районах; навчання персоналу та розповсюдження інформації, пов'язаної з загальної та прикладної мікробіологією.

Першим кроком на шляху до розвитку мережі MIRCEN було створення в Брісбені (Австралія) Міжнародного центру даних про мікроорганізми, який володіє величезною колекцією мікробних штамів і світовим покажчиком колекцій культур мікроорганізмів. У системі MIRCEN є й інші центри: у Бангкоку-для Південно-Східної Азії, в Найробі-для Африки, в Порто-Алегро (Бразилія)-для Південної Америки, в Гватемалі-для Центральної Америки, в Каїрі-для арабських країн. М1КСЕМ на Гаваях присвятив свою роботу головним чином азот фіксації в тропічних бобових, а центр у Стокгольмі спеціалізується на розробці медичних діагностичних наборів.

ЮНЕСКО також допомагає державам-членам у формулюванні дослідницької політики та у створенні проектів з прикладної мікробіології та біотехнології, в яких основна увага зосереджена на навчанні фахівців і підвищення рівня компетентності, необхідного для вибору найбільш адекватної технології.

Висновок

На закінчення хочу сказати, що широке використання мікроорганізмів не може не породжувати нових взаємин з живою природою, що цілком природно веде до бажання осмислити самі ці взаємини і співвіднести їх зі сформованими уявленнями, з одного боку, про роль живої природи в життєдіяльності людини, а з інший - про роль людини в біотичному круговерті біосфери. Наявний поки не дуже багатий досвід розвитку біотехнології все-таки, містить у собі багато незвичного і разом з тим багатообіцяючого для можливої ​​оптимізації людської життєдіяльності. А гостро постала перед Homo sapiens проблема самозбереження змушує його до гарячковим пошукам можливих варіантів стратегії своєї життєдіяльності. Цьому залученню природи, причому саме світу мікроорганізмів, і поклала початок нова біотехнологія.

Можна, мабуть, сказати, що біотехнологія в сукупності з іншими науковими напрямками відкриває нову еру взаємодії людини з навколишнім середовищем і особливо з живою речовиною біосфери.

«З'явившись прямим результатом наукових розробок, біотехнологія виявляється безпосереднім єднанням науки і виробництва, ще однією сходинкою до єдності пізнання та действования, ще одним кроком, який наближає людини до подолання зовнішньої і до осягнення внутрішньої доцільності». [3]

І все-таки тільки невеликим кроком. Оскільки, як влучно зауважив Б. Шоу, наука завжди помиляється. Вона ніколи не дозволяє якоїсь проблеми, не створивши ще десять нових. Оцінюючи з цієї позиції біотехнологію і весь комплекс наук, що її породжують і забезпечують, можна бачити, що і тут навряд чи ми зможемо досягти бажаної мети: біотехнологія і екологізованих традиційна промисловість дуже обтяжені тягарем попереднього. Вона сама виявляється всього лише великої індустрією, з'єднанням технічних і біологічних елементів і, природно, успадковує негативні властивості вже існуючого індустріально-промислового комплексу. Їх дійсне подолання і вирішення проблеми людини передбачають вихід людства на нові, більш досконалі щаблі соціокультурного розвитку, заснованого на нових способах пізнання і действования.

Тому досить істотне значення набуває проблема вибору стратегії взаємодії людини і природи: чи це самовпевнене управління природою або ж свідоме і цілеспрямоване пристосування всієї життєдіяльності діяльності, до існуючого біотичному кругообігу біосфери [3].

У результаті інтенсивного розвитку методів генетичної інженерії отримані клони безлічі генів рибосомальної, транспортної та 5S РНК, гістонів, глобіну миші, кролика, людини, колагену, овальбуміна, інсуліну людини та ін пептидних гормонів, інтерферону людини та інше. Це дозволило створювати штами бактерій, які виробляють багато біологічно активні речовини, використовувані в медицині, сільському господарстві та мікробіологічної промисловості.

На основі генетичної інженерії виникла галузь фармацевтичної промисловості, названа «індустрією ДНК». Це одна із сучасних гілок біотехнології.

Для лікувального застосування допущений інсулін людини (хумулін), отриманий за допомогою рекДНК. Крім того, на основі численних мутантів по окремих генів, одержуваних при їх вивченні, створені високоефективні тест-системи для виявлення генетичної активності факторів середовища, в тому числі для виявлення канцерогенних сполук.

Список термінів

Генетична інженерія - це розділ молекулярної генетики, пов'язані з цілеспрямованим створенням нових комбінацій генетичного матеріалу

ДНК (дезоксирибонуклеїнової кислоти) - молекула спадковості, яка містить весь набір генів організму

Ген-матеріальний носій спадкової інформації

Геном - сукупність генів, що містяться в одинарному наборі хромосом даної рослинної або тваринної клітини

Нуклеотиди - азотисті основи: аденін, тимін, гуанін і цитозин

Штам - термін для позначення серії культури мікробів.

Еукаріоти - це організми, клітини яких містять ядро, відокремлене оболонкою від цитоплазми

Прокаріоти - організми, позбавлені оформленого ядра (віруси, бактерії, синьо-зелені водорості)

Клонування - отримання генетично ідентичних особин з однієї клітини

Трансдукція - перенесення генів з однієї клітини в іншу за допомогою вірусів

Синтез - поєднання різних елементів об'єкта в єдине ціле (систему)

Трансляція - синтез білка на робосомах

Плазміди - невеликі частинки з фрагментами ДНК

Рекомбінація - це будь-який процес, здатний привести до виникнення клітин або організмів з двома або більше спадковими детермінантами, за якими їх батьки різнилися між собою і які з'єднані новим способом

Біосфера - область поширення життя на Землі. Включає нижню частину атмосфери, гідросферу і літосферу, населені живими організмами

Біоенергетика - сукупна енергетика біологічного кругообігу біосфери Землі

Біологізація - радикальне перетворення виробничої діяльності на основі біологічних законів біотичного кругообігу біосфери

Екологізація - початковий етап біологізації

Список літератури

1. Карпенків С.Х. Концепції сучасного природознавства. М.: Юніті, 1997.

2. Сассон А. Біотехнологія: звершення і надії. М.: Світ, 1987

3. Карпінська Р.С. Біологія в пізнанні людини. М.: Наука, 1989

4. Аліханян С.І. Загальна генетика. М.: Вища школа, 1985

5. «Наука і життя», № 9 / 2000

6. «Наука і життя», № 3 / 1999

7. Дубніщева Т. Я. Концепції сучасного природознавства. Новосибірськ: ЮКЗА, 1997