Дослідження ДНК волосся для ідентифікації особистості

[ виправити ] текст може містити помилки, будь ласка перевіряйте перш ніж використовувати.

скачати

ДОСЛІДЖЕННЯ ДНК ВОЛОССЯ ДЛЯ ІДЕНТИФІКАЦІЇ ОСОБИСТОСТІ

Москва, 2009

ВСТУП

Ідентифікація людини по волоссю - одна з найважливіших цілей судово-біологічної експертизи. Волосся практично завжди вилучаються з місця події і часто бувають єдиним речовим доказом. В даний час при дослідженні цього об'єкта домінує морфометричний метод дослідження. При порівняльному дослідженні волосся, вилучених з місця події, і волосся підозрюваної особи експерт виявляє ряд морфометричних ознак (будова серцевини і кутикули, особливості пігментації та ін), що дозволяє зробити лише ймовірний висновок про належність волосся конкретній особі. Крім морфометричного методу можна використовувати серологічний метод визначення групової приналежності волосся за системою АВ0, а при наявності цибулини волосся визначати його статеву приналежність і фенотип ферменту фосфоглюкомутази. Проте ці методи не дозволяють ідентифікувати конкретної людини по волоссю, залишеним на місці події.

З цією метою необхідно використовувати новий метод дослідження волосся - метод визначення поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК). Відомо, що метод визначення поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів молекули ДНК із застосуванням ланцюгової реакції полімеризації (ампліфікація) дозволяє збільшувати кількість фрагментів виділеної з об'єкта ДНК в сотні тисяч разів, що робить можливою ідентифікацію мікрослідів біологічного походження, що містять хоча б одну ядерну клітку. При виділенні ДНК з плям крові не виникає тих проблем, що при виділенні ДНК з волоса. Кількість ядерних клітин (лімфоцитів) навіть у невеликому плямі крові достатньо велика, волосся містять значно менша кількість ДНК. Особливо мало ДНК у фолікулах випавшого волосся (у 10 - 20 разів менше, ніж у живих) і в стержнях волосся. У зв'язку з цим спеціальні методи екстракції ДНК з волосся є важливою проблемою і в значній мірі полегшують процес ідентифікації волосся.

Число зарубіжних публікацій з цього питання не велике [1 - 3]. Описано три варіанти методу екстракції ДНК з волосся: гідроліз ядер клітин цибулини волосся, і ампліфікація без попереднього очищення, очищення гідролізату фенольним методом і за допомогою іонообмінної смоли Chelex.

Волосся, вилучені з місця події, можуть або мати, або не мати цілу волосяну цибулину, а також окремі клітини (залишки) цибулини. Волосся можуть бути вирваними, що випали або зрізаними. Основна кількість ДНК в волосі міститься у волосяній цибулині, і дослідження такого волосся значно простіше, ніж дослідження стрижня волосся без луковичной частини.

У даній роботі описані дві методики виділення ДНК з волоса. Методики модифіковані та апробовані авторами в численних дослідженнях на експериментальних та експертних зразках волосся людини, що розрізняються за розміром, кольором, наявністю клітин цибулини, термінами зберігання.

Одна методика проста, але може бути використана тільки при наявності цибулини вирваного волосся. Друга методика дозволяє виділяти ДНК також прикореневій стрижневою частини волосся і ускладнено спеціальним способом концентрування та очищення виділеної ДНК перед ампліфікацією. Оцінку кількості та ефективності очищення виділеної ДНК визначали методом полімеразної ланцюгової реакції. Процес оптимізації цієї реакції для дослідження ДНК волосся не входив в завдання даної роботи.

ОСНОВИ БУДОВИ ВОЛОССЯ, мікроскопування ОБ'ЄКТА

Перш ніж приступити до виділення ДНК з досліджуваного волосся, необхідно провести його мікроскопування і встановити наявність або відсутність цибулини волосся, а також по виду цибулини визначити, живої або відмерлий волосся представлений на дослідження. Крім цього, в деяких випадках мікроскопування дозволяє встановити наявність певних забруднень на волосині. Особливо принциповим є наявність на волосі клітин крові або сперми (інших виділень), що може спотворити результат визначення генотипу ДНК волосся. Забруднені волосся особливо ретельно миють (див. нижче).

Відомо, що волосся, будучи похідними шкіри, складаються з кореня, розташованого в дермі, і стрижня, що виходить на поверхню шкіри через волосяну воронку. Корінь волосини оточений епітеліальними оболонками - це фолікули волосся. Розширена частина фолікула називається цибулиною волосу. Цибулини вирваного і випав волосся розрізняються за зовнішнім виглядом (рис. 1). Найбільше ядерних клітин міститься в цибулині волоса, з якої можна виділити достатню кількість ядерної ДНК. Стрижень волосся складається з кутикули (ороговілі клітини), коркового шару (кератіновие структури) і серцевини (фібрилярні система).

При дослідженні ДНК волосся, як показав аналіз опублікованих даних, велике значення має наявність і кількість пігменту волосся - меланіну. Показано, що меланін інгібує реакцію ампліфікації та її позитивний результат залежить від співвідношення в зразку кількості виділеної ДНК і кількості меланіну.

Меланін міститься в основному в серцевині волосся, і може бути у вигляді гранул або в дифузному стані. Меланіни є полімерами хіноїдного з'єднань і утворюються при ферментативному окисленні тирозину. Волосся чорного кольору містять еумеланін, що має в структурі азот, для волосся жовтого та червоного кольору характерний феомеланін. Меланін в епітеліальних клітинах коркового шару волосся утворює з білком волосся - кератином крейди-кератіновие комплекси, які мають підвищену хімічну стійкість в порівнянні з кератинами непігментовані волосся. Ефект інгібування реакції ампліфікації меланіном має місце, як правило, при дослідженні ДНК стрижня волосся і залежить від його кольору. Проте в описаній нижче методикою дію меланіну не враховується, так як екстрагована ДНК додатково очищається, в тому числі і від основної кількості меланіну, за допомогою спеціального пристрою для концентрування та очищення ДНК "Центрікон-100" (далі по тексту "Центрікон-100") .

Мікроскопування волосся проводять без застосування будь-яких хімічних реагентів, а саме без фіксації лаком, використання просвітлюючих рідин і т. п. Волос поміщають на предметне скло, додають 1 - 2 краплі води, накривають покривним склом і мікроскопують при збільшенні 200 ', 400' . Встановлюють наявність або відсутність цілої цибулини. При відсутності цілої цибулини визначають наявність окремих епітеліальних клітин фолікула волоса, а за відсутності епітеліальних клітин необхідно встановити наявність прикореневій частині стрижня волосся. У стрижні волосини основний зміст ядерних клітин локалізовано в прикореневій частині. На периферичному кінці волосся ядерних клітин немає. Виділення ДНК з періфіріческой кінця волосся рекомендується використовувати як негативний контроль для перевірки відсутності забруднення біологічними домішками.

Крім того, мікроскопіюванням визначають наявність біологічних забруднень волосся (кров, сперма, інші виділення), колір волосся або його штучну забарвлення.

ПІДГОТОВКА ВОЛОССЯ ДО ДОСЛІДЖЕННЯ, ОЦІНКА як виділення ДНК

Перед початком роботи зразки досліджуваних волосся миють у дистильованій воді 1 год при легкому погойдуванні (на гойдалці, на магнітній мішалці і т. п.). Волосся, забруднені кров'ю, спермою чи слиною, миють в 1% водному розчині гліцину 1 год при погойдуванні, потім обполіскують дистильованою водою. Гліцин, будучи слабким детергентом, підвищує розчинність білків і сприяє їх відмиванню. Крім того, відмиванню волосся від біологічних домішок сприяє їх попереднє витримування (1 - 2 год) при низькій температурі (- 20 ¸ - 70 ° С), а також у розчині абсолютованого спирту.

Основним критерієм того чи іншого методу екстракції ДНК з волосся, як і з інших джерел, служить кількісний вихід добре очищеної ДНК. Відомо, що концентрація ДНК, виділеної з луковичной частини вирваних живих волосся, може досягати 200 нг на один волосся. У той же час вміст ДНК у фолікулах випавшого волосся з відмерлої цибулиною зменшується до 10 - 20 нг. Зміст же ДНК в стрижневою частини волосся практично неможливо виміряти відомими в даний час методами, в тому числі методом УФ-спектроскопії або флуориметрії.

У даній роботі ефективність методу екстракції ДНК оцінювали шляхом проведення реакції ампліфікації на міні-сателіти з парою праймерів системи Д1 S80, що дає після проведення ампліфікації специфічні ДНК-фрагменти розміром від 400 до 800 пар основ.

Ампліфікацію проводили в наступному режимі:

94 ° C - 4 хв;

94 ° C ü

60 ° C ý 30 циклів по 1 хв;

72 ° C þ

72 ° C - 8 хв.

Продукти полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) аналізували електрофорезом в 2% агарозному гелі, що містить 0,5 мкг / мл бромистого етидію, завдаючи по 25 мкл реакційної суміші, візуалізували в УФ-світлі і документували фотографуванням. В якості контролю ампліфікації використовували фрагменти ДНК з відомою молекулярною масою.

Позитивний результат реакції ампліфікації вказує на високий ступінь очищення досліджуваної ДНК. Особливо це важливо при виділенні ДНК із стрижня волосся, що містить багато меланіну. Відомо, що значна кількість сполук різної хімічної природи здатні інгібувати реакцію ампліфікації і навіть повністю блокувати синтез ДНК в процесі ампліфікації. Процес інгібування ПЛР носить яскраво виражений концентраційний характер, тобто збільшення концентрації інгібітора приводить до зменшення виходу цільового продукту ампліфікації. Меланін повністю інгібує ПЛР в концентрації 15 нг в 100 мл реакційної суміші. У добре очищеному екстракті не повинно бути інгібуючої дії меланіну.

МЕТОДИКА ВИДІЛЕННЯ ДНК ІЗ СТЕРЖНЯ ВОЛОССЯ

Методика використовується при дослідженні всіх варіантів волосся, в тому числі і волосся, що не має луковичной частини. При відсутності луковичной частини волосся досліджують прикореневу частину стрижня волосся довжиною не менше 3 см і не більше 10 см. Послідовність виконання методики:

1. Волос мікроскопують і відмивають (як описано вище).

2. Волос ріжуть на шматочки довжиною близько 1 см і поміщають в пробірку "Еппендорф" (V = 1,5 мл).

3. У пробірку з волоссям додають 500 мкл буфера I, 20 мкл 1 М ДТТ і 15 мкл розчину (10 мг / мл) протеїнази К. Пробірку поміщають у термостат і витримують при температурі 56 ° С протягом 6 ч. В процесі витримування волосся частково розчиняється .

4. Пробірку поміщають на Вортекс (прилад для струшування) і струшують 30 з при середній швидкості.

5. Потім до розчину в пробірці додають 20 мкл 1 М ДТТ і 15 мкл розчину (10 мг / мл) протеїнази К. Пробірку поміщають у термостат і витримують при температурі 56 ° С протягом 12 годин (ніч), після чого волосся повністю розчиняється.

6. Пробірку знову розміщують на Вортекс і струшують 30 з при середній швидкості, потім центрифугують 1 хв при 10 000 - 15 000 об / хв. Після центрифугування продукти лізису волосу переходять у супернатанті.

7. Супернатант відбирають в чисту пробірку "Еппендорф", додають 600 мкл суміші фенол-хлороформ, закривають кришкою, поміщають на Вортекс і перемішують 15 с на середній швидкості, а потім центрифугують 3 - 5 хв при 10 000 - 15 000 об / хв. Спостерігають поділ на дві фази: верхня водна фаза містить виділяється ДНК, нижня - фенол-хлороформ.

8. Верхню водну фазу переносять в чисту пробірку "Еппендорф" (V = 1,5 мл) і додають 500 мкл водонасиченого н-бутанолу з метою видалення залишку фенол-хлороформу, який може пошкодити мембрану "Центрікона-100". Поміщають на Вортекс, струшують 15 с на середній швидкості і центрифугують 1 хв при 10 000 - 15 000 об / хв при кімнатній температурі. Водна фаза збирається на дні пробірки, верхній шар - видаляють.

9. "Центрікон-100" збирають за відповідною інструкцією і згідно з рис. 3.

10. Нижню водну фазу, що містить екстракт ДНК, фільтрують і концентрують на "Центріконе-100", фільтруючому домішки з молекулярною вагою більше 100 000 дальтон. При даній фільтрації меланін волосся і його похідні, як більш низькомолекулярні, проходять через мембрану "Центрікона-100".

11. Додають 1,5 мл ТІ-буфера у верхній резервуар колонки "Центрікона-100". Зверху додають близько 500 мкл екстракту ДНК. Пробірку закривають парафільмом і, не торкаючись розчину, проколюють парафільм в декількох місцях тонкою чистої голкою. Центрифугують на центрифузі з фіксованим кутом ротора. Необхідно перерахувати швидкість центрифугування для використовуваної центрифуги в об / хв так, щоб вона становила 1000g. Нижче наведена формула перерахунку. Не можна центрифугувати зі швидкістю більше 1000g, щоб уникнути пошкодження мембрани "Центрікона-100". Час центрифугування підбирають дослідним шляхом так, щоб ДНК сконцентрувалася в обсязі 4 - 6 мкл, зазвичай не більше 20 хв при кімнатній температурі. Після центрифугування видаляють вміст нижнього резервуара.

12. У верхній резервуар колонки "Центрікона-100", де концентрується розчин ДНК в обсязі 4 - 6 мкл, додають 2 мл ТІ-буфера і повторюють фільтрацію 2 рази (закрити парафільмом, проколоти його голкою, центрифугувати зі швидкістю 1000 g при кімнатній температурі до обсягу 4 - 6 мкл ~ 20 хв, видалити вміст нижнього резервуара, додати 2 мл ТІ-буфера і т. д.).

13. Профільтрувавши розчин ДНК 3 рази через мембрану "Центрікона-100", очистивши його таким чином від домішок з молекулярною вагою нижче 100 000 дальтон і сконцентрувавши ДНК в заданому обсязі (4 - 6 мкл), переносять розчин ДНК з верхнього резервуара в ковпачок "Центрікона- 100 ", який приєднують до колонки верхнього резервуара і перевертають. Центрифугують 5 хв зі швидкістю 1000g при кімнатній температурі. Всі операції по фільтрації ДНК проводять з дотриманням максимально можливої ​​чистоти і стерильності.

14. У ковпачку "Центрікона-100" збирається виділена ДНК, готова до проведення ПЛР. Зразок можна зберігати при температурі - 20 ° С.

Для проведення ПЛР беруть 4 - 6 мкл супернатанту при сумарному обсязі реакційної суміші ПЛР 25 мкл.

Формула перерахунку швидкості обертання ротора центрифуги при використанні "Центрікона-100":

g = 118 × 10 -7 × n 2 × r;

де g - Центрифужні полі (g = 1000);

r - Радіус, см (відстань від центру ротора до осі обертання колонки фільтра, вимірюється емпірично для використовуваної центрифуги);

n - Швидкість обертання ротора, об / хв (задається на центрифузі).

Приготування розчинів для виділення ДНК із стрижня волосся

Нижче наводяться прописи шести розчинів, які готують заздалегідь і потім використовують при складанні сумішей розчинів, необхідних для даного методу. При приготуванні розчинів використовують деіонізірованная воду.

Розчин № 1. 1 М розчин трис-HCl, pH 7,5 (1 л):

розчинити 121,1 г трис-HCl в 800 мл води, довести pH розчину до 7,5 концентрованою соляною кислотою (приблизно 65 мл), додати воду до об'єму 1 л.

Розчин № 2. 0,5 М розчин ЕДТА, рН 8,0 (1 л):

розчинити 186,1 г двозаміщений солі ЕДТА '2Н 2 О в 800 мл води, довести рН розчину до 8,0 їдким натром (динатрієва сіль ЕДТА не розчиняється до тих пір, поки рН розчину не буде 8,0), додати воду до об'єму 1 л. Зберігати при кімнатній температурі.

Розчин № 3. 5 М розчин NaCl (1 л):

розчинити 292,2 г NaCl в 800 мл води і довести об'єм розчину до 1 л. Розлити по 100 мл.

Розчин № 4. 20% розчин натрію додецилсульфату SDS (100 мл):

розчинити 20 г SDS у 80 мл води при 60 ° С, довести об'єм розчину до 100 мл.

Розчин № 5. 1 М розчин ацетату Na, рН 5,2 (100 мл):

розчинити 13,6 г CH COONa '3H 2 O у 80 мл води, довести рН розчину до 5,2 оцтовою кислотою (приблизно 2 мл), додати воду до об'єму 100 мл.

Розчин № 6. 1 М розчин трис-НСl (1 л):

розчинити 121,1 г трис-HCl в 800 мл води, довести рН розчину до 8,0 концентрованою соляною кислотою (приблизно 45 мл), додати воду до об'єму 1 л.

За допомогою розчинів № 1 - 6 готують такі суміші, використовувані в методикою:

Буфер 1.

10 мМ трис-НСl, рН 7,5;

10 мМ ЕДТА;

50 мМ NaCl;

2% SDS.

Змішати 1 мл 1 М трис-НСl (рН 7,5), 2 мл 0,5 М ЕДТА, 1 мл 5 М NaCl, 10 мл 20% SDS і 86 мл води. Зберігати при температурі 4 ° С.

1 М ДТТ.

Розчинити 770 мг детіотреітола в 5 мл води і додати 50 мкл 1 М ацетату натрію. Зберігати в аліквотах не більше 200 мкл при температурі - 20 ° С.

10 мг / мл протеиназа К.

Розчинити 10 мг протеїнази К у 10 мл води. Зберігати в аліквотах не більше 200 мкл при температурі - 20 ° С.

Фенол-хлороформ.

Смешать10 частин фенолу, насиченого 1 М трис-НСl (рН 7,5), з 9 частинами хлороформу. Зберігати при температурі 4 ° С не більше двох місяців, в темній ємності.

н-Бутанол.

Додати 100 мл води до 100 мл н-бутанолу, перемішати. Бутанол знаходиться у верхній фазі. Зберігати при температурі 4 ° С.

ТІ-Буфер.

10 мМ трис-НСl, рН 8,0;

0,1 мМ ЕДТА.

Змішати 10 мл 1 М трис-НСl (рН 8,0) з 200 мкл 0,5 М ЕДТА і 990 мл води. Зберігати при температурі 4 ° С.

МЕТОДИКА ВИДІЛЕННЯ ДНК ІЗ ЦИБУЛИНИ ВОЛОССЯ

Ця методика використовується при дослідженні волоса, на кореневій частині якого присутні піхвові оболонки; це, як правило, буває у вирваних життєздатних волосся (див. рис. 1). Використовують 20% суспензію іонообмінної смоли Chelex, приготовану в стерильній дистильованій воді. Принцип методу полягає в гідролізі, "розчиненні" волоса при кип'ятінні з іонообмінної смолою Chelex, яка сорбує різні домішки, і в тому числі домішки білків.

Волос мікроскопують, відмивають (як описано вище), відрізають цибулину волосся з 2 - 3 мм стрижня і поміщають в пробірку "Еппендорф". У пробірку додають 100 мкл 20% суспензії іонообразной смоли Chelex. Витримують у термостаті при температурі 56 ° С протягом 12 годин (ніч). Струшують 5 - 10 с на вортексі при високій швидкості. Потім поміщають пробірку з волоссям в киплячу воду на 8 хв. Волос повинен бути повністю занурений в розчин. Знову поміщають на Вортекс для струшування протягом 5 - 10 с при високій швидкості.

Гідролізат волосу центрифугують 2 - 3 хв при 10 000 - 15 000 об / хв. Супернатант використовують для постановки реакції ПЛР. У реакцію беруть не більше 15 мкл зразка при сумарному обсязі реакційної суміші ПЛР 25 мкл.

ВИСНОВОК

При розробці методики виділення ДНК з волоса з використанням іонообмінної смоли Chelex досліджували численні зразки волосся, що розрізняються по довжині, кольором, термінами зберігання, наявності більшої чи меншої кількості епітеліальних клітин цибулини, забруднення волосся біологічними домішками (кров, сперма та ін.) Перевагою даної методики є простота її використання. Волос витримують під суспензії іонообмінної смоли Chelex в термостаті протягом 12 годин (ніч) і потім протягом ~ 15 хв (8 хв кип'ятять) отримують гідролізат волоса, що містить очищений розчин ДНК, готовий до ампліфікації. На отримання позитивного результату (виділена ДНК ампліфікувати) не впливають такі фактори, як довжина, колір, терміни зберігання волосся. Недоліком методики є необхідна наявність цибулини волосся, що звужує коло дослідження волосся, що надходять на експертизу. Волосся, що мають забруднення біологічним матеріалом, вимагають спеціальної обробки розчином гліцину і паралельного контрольного дослідження периферичного кінця стрижня волосся.

Методика виділення ДНК шляхом хлороформ-фенольної екстракції і наступних концентрування та фільтрації екстракту на "Центріконе-100" є більш досконалою і більш трудомісткою. З використанням цієї методики можливо дослідити різні зразки волосся, в тому числі і стрижень одиничного волосся. Однак робота з такими низькими кількостями ДНК, які виділяють із стрижня одиничного волосся, вимагає, по-перше, високого ступеня спеціалізації експерта і, по-друге, особливих заходів обережності (з дотриманням чистоти і стерильності), щоб уникнути отримання помилкових результатів. У перспективі, у міру того як концентрування ДНК на "Центріконе-100" буде впроваджуватися в практику, очевидно, методика отримає подальший розвиток і досконалість.

ЛІТЕРАТУРА

1. Deoxyribonucleic acid (DNA) typing of human leukocyte antigen (HLA) - DGA1 from single hair in Japanese / R. Uchihi, K. Tamaki, T. Kojima, etc. / / J. Forens. 200 2. Vol. Science. - 200 2. - Vol. № 3. Р . 37. - № 3. - Р. 853-859.

2. 19 9 8. Vol. Higuchi R., Beroldingen C., Sensabaugh G., Erlich H. DNA typing from single hair / / Nature. - 19 9 8. - Vol. № 7. Р . 332. - № 7. - Р. 543-546.

3. 2006. PCR applications methods / / The Cetus-Perkin-Elmer corporation. - 2006.

Додати в блог або на сайт

Цей текст може містити помилки.

Біологія | Реферат
60.1кб. | скачати


Схожі роботи:
Маркетингові дослідження з вибору фарби для волосся
Соціологічне дослідження Чи фарбуєте Ви волосся
Вибір фарби для волосся
Методи дослідження особистості
Дослідження конфліктності особистості
Інтегративні дослідження особистості
Проективні методи дослідження особистості
Дослідження особистості сучасних керівників
Дослідження особистості у фрейдизмі і неофрейдизм
© Усі права захищені
написати до нас