Деякі уявлення про біохімію живої клітини

Реферат на тему:
Деякі уявлення про біохімію живої клітини

До середини XX століття біохімія домоглася видатних успіхів у вивченні живих об'єктів на молекулярному рівні, тобто на рівні хімічних реакцій, що забезпечують життєдіяльність. Ці успіхи озброїли медицину способами діагностики захворювань та контролю за їх перебігом за допомогою хімічних аналізів крові, сечі, шлункового соку та інших виділень організму людини. У цих рідинах визначали вміст цікавлять лікаря порівняно невеликих молекул або сумарного білка.
Що ж до створення ліків, то тут в основному доводилося виходити з багатовікового досвіду людства з використання лікарських рослин. Процес пошуку нових ліків починався з ідентифікації хімічної сполуки, що грає лікувальну роль у складі апробованого рослини. Далі йшла розробка методик лабораторного синтезу цього з'єднання і його аналогів і оцінка лікувальної дії кожного з отриманих таким чином речовин. Нерідко синтезовані аналоги виявлялися набагато ефективніше, ніж екстракти з вихідних рослин. Проте вся фармакологія продовжувала спиратися тільки на лікувальну практику, забезпечену самою природою. У деяких, іноді рідкісних, а іноді і дуже частих випадках захворювань (наприклад, ракових) природне забезпечення способів лікування було відсутнє, і медицина виявлялася безсилою. Стало ясно, що справжня революція в ній відбудеться в результаті розуміння на молекулярному рівні всього безлічі складних хімічних процесів, що у живій клітині. Тоді відкриється перспектива цілеспрямованої коригування цих процесів з допомогою хімічних сполук, синтезованих в лабораторії на основі такого розуміння.
Спробуємо коротко розглянути деякі уявлення про біохімію живої клітини, як вони склалися до початку 50-х років минулого століття міцну «третинну структуру» ферменту, так і розташування каталітичного, або, як кажуть, «активного» центру на поверхні його глобули. Нарешті, що ж може представляти із себе сам активний центр? Та нічого іншого, окрім суворо фіксованого просторового розташування все тих же вільних і хімічно активних груп атомів амінокислот, оскільки нічого іншого в складі білка, як правило, немає. Скількох амінокислот? Нижче ми побачимо, що хімічна структура всіх амінокислот така, що будь-яка з них має тільки одну потенційно активну і вільну хімічну групу. Сили зв'язування субстратів ферментативної реакції в активному центрі повинні бути невеликі - адже продукти реакції повинні мати можливість легко його покинути. Розумно було припустити, що для утримання субстратів в активному центрі на час перебігу каталітичної реакції достатньо трьох-п'яти слабких зв'язків. Це означає, що до складу активного центру входить така ж кількість амінокислот. Вони (так само, як сполучні глобулу амінокислоти) можуть належати до вельми віддаленим один від одного ланкам білкового ланцюга ферменту, котрі опинилися поруч на його поверхні. Мало того. Просторове розташування активних груп цих амінокислот повинне виявитися суворо визначеним для того, щоб відповідати просторової конфігурації молекули субстрату (або субстратів).
ДНК - двунітевих полімери (у людини)
Не менш значні успіхи були досягнуті і в розумінні механізму спадковості. Ще в 40-х роках панувала думка, що її забезпечують спеціальні білки. Потім було переконливо показано, що за збереження і передачу потомству всіх ознак виду (а також індивідуальних особливостей батьків, якщо процес розмноження двостатевий) відповідає особлива речовина - дезоксирибонуклеїнова кислота («ДНК»). У бактерій ця речовина міститься в цитоплазмі, а іноді ще в особливих утвореннях - кільцевих «плазмідах». У більш високо організованих істот - у клітинному ядрі і (трохи) в мито-Хондрит. ДНК теж виявилися дивно близького елементарного хімічного складу у всіх живих організмів. Фізичні властивості дуже в'язких водних розчинів ДНК показали, що це гігантські молекули, маса яких у вищих організмів досягає декількох сотень мільярдів дальтон і навіть у бактерій вимірюється мільярдами дальтон.
Для зіставлення має сенс представити таблицю розмірів (число пар основ) і молекулярних мас (в Дальтона) ДНК з різних джерел.
Молекули ДНК виявилося можливим навіть «побачити» за допомогою електронного мікроскопа. Вони виглядають як дуже довгі і тонкі «нитки». Ці нитки вдалося розщепити на утворюючі їх порівняно низькомолекулярні складові - «нуклеотиди» (М = 320 дальтон). Таких виявилося всього чотири типи. Структура нуклеотидів підказувала, що вони, подібно амінокислот у білку, зв'язуються між собою хімічно однаковими («фосфодіефірних») зв'язками в одномірні ланцюги. З урахуванням співвідношення молекулярних ваг ДНК і нуклеотидів ці ланцюги можуть нараховувати більше мільйона ланок у бактерій і близько 3-х мільярдів у людини. Вся спадкова інформація повинна міститися («бути збережені») в такому колі. Єдино можливий спосіб «записи» являє собою певне чергування чотирьох нуклеотидів. Цей спосіб не здасться недостатнім, якщо ми згадаємо, що азбукою Морзе (чергування тире і точок) можна записати, наприклад, «Війну і мир».
Передача спадкової інформації означає, в першу чергу, завдання «первинної» структури всіх білків даного організму. Тобто визначення всієї унікальної послідовності 20-ти амінокислот у ланцюгу кожного з них. Звідси випливає необхідність «генетичного коду». Чотири певним чином чергуються нуклеотиду повинні однозначно визначати положення кожної амінокислоти в ланцюзі білка. Для цього необхідно використовувати, як мінімум, двадцять (за кількістю амінокислот) різних комбінацій з стоять поряд, нуклеотидів. Якщо припустити, що кожну амінокислоту буде визначати послідовність чотирьох (будь-яких) нуклеотидів, то таких можливих комбінацій виявиться 256. Це - занадто багато. Якби «кодує» комбінацію утворювала послідовність двох нуклеотидів, то можливих комбінацій виявилося б занадто мало - всього 16. Залишається єдиний варіант «кодує трійки» (триплетів) нуклеотидів. З чотирьох елементів можна утворити 64 різних комбінацій по три. Такі комбінації отримали назву «кодонів» у складі ДНК. Генетичний код виявляється надмірним або, як кажуть, «виродженим». У середньому на кожну амінокислоту припадає по три можливих кодон (втім, розподіл може і не бути рівномірним). Така надмірність ще не вносить таким катастрофічним невизначеності, яку б породили 256 комбінацій «кодують четвірок». Однак в середині минулого століття концепція тричленного генетичного коду була не більше, ніж робочою гіпотезою.
У 1953 р. відбулася важлива подія в історії біологічної науки. На основі результатів рентгеноструктурного аналізу ДНК Вотсон і Крик досить переконливо показали, що її «нативні» молекули являють собою не одну, а дві паралельно йдуть ланцюга, пов'язані між собою відносно слабкими зв'язками (при нагріванні розчину ДНК до 90 ° С або при обробці 0, 3 М NaOH ці ланцюги розділяються - молекула ДНК «денатурує»). Аналіз хімічної структури нуклеотидів показував, що такого роду «спаровування» ланцюгів можливо за допомогою відносно слабких «водневих зв'язків» між нуклеотидами, які перебувають у двох «комплементарних» ланцюжках ДНК. (З такими зв'язками ми познайомимося трохи пізніше). За спаровування ланцюгів ДНК «відповідають» хімічно активні групи в нуклеотидах. Це забезпечує збереження структури всієї молекули ДНК, а значить і записаної в ній спадкової інформації протягом усього часу життя клітини. Зважаючи на відмінності просторових розмірів нуклеотидів (два з них більше, ніж два інших) умова паралельності ланцюгів виключало можливість спаровування двох однакових нуклеотидів, а тільки одного з великих з одним з найменших у кожній парі. Це означало, що послідовності нуклеотидів в спарених ланцюгах ДНК не можуть бути однаковими. Звідси, у свою чергу, випливало припущення, що якщо одна з ланцюжків ДНК несе в собі інформацію для синтезу білка (назвемо її «значущою» або «кодує» ланцюгом), то друга - виконує тільки захисну функцію. На початку 50-х років вчені ще не уявляли собі механізму «зчитування» спадкової інформації з ДНК і передачі її в систему білкового синтезу. Тим не менш, було ясно, що цей механізм повинен бути пов'язаний з повним або локальним звільненням значущої ланцюга ДНК від її «захисту».
«Двунітевих» структура ДНК підказувала і зручну модель її «редуплікації» - подвоєння кількості ДНК перед поділом клітини, за умови збереження всієї спадкової інформації в кожній з дочірніх клітин. Передбачалося, що дві нитки ДНК розходяться і кожна з них служить «шаблоном» для «комплементарного» (додаткового) синтезу другої нитки. Комплементарність в цьому випадку означає більш сувора вимога: не просто постановку в новосінтезіруемой нитки великого нуклеотиду проти дрібного, але однозначність пар нуклеотидів. Тобто для чотирьох нуклеотидів, які поки позначимо А, В, С і D, в силу їх хімічної будови виявлялися можливими тільки дві пари, наприклад, А-В і С-D. Неважко зміркувати, що в цьому випадку за шаблоном кодує нитки буде синтезуватися захисна нитка, точно така, як у вихідній молекулі ДНК, а за шаблоном захисної нитки буде синтезуватися повноцінна кодує нитку. Якщо при цьому обидві новостворені пари ниток залишаться комплементарно пов'язаними, то вони виявляться точними копіями «материнської» двунітевой ДНК.
Ця гарна (і, як потім переконалися, вірна) гіпотеза тут же натрапила на, здавалося б, непереборне заперечення. Справа в тому, що результати рентгеноструктурного аналізу, розшифровані Уотсоном і Криком, зовсім виразно вказували ще й на те, що подвійні нитки ДНК згорнуті в досить щільні спіралі з кроком в 3,4 міллімікронов при діаметрі спіралі -2 міллімікронов. Для того, щоб роз'єднати дві нитки ДНК очевидно треба було б спочатку розкрутити спіраль, яка налічує сотні тисяч, а то й сотні мільйонів витків. (У кожен виток укладається десять пар нуклеотидів.) Важко уявити собі яким чином така спіраль може бути розкручена.
РНК - однониткових полімери з масою до 4 мільйонів дальтон
На початку 60-х років з'явилися і перші відомості про учасників самого процесу білкового синтезу. У цитоплазмі клітин були виявлені молекули рібонукленовой кислоти («РНК»), дуже схожі за своїм складом і будовою на ДНК. Вони представляють собою теж ланцюжка чергування чотирьох нуклеотидів - таких же, як в ДНК, за винятком одного з них, втім, що відрізняється лише трохи. Головна відмінність полягає в тому, що до складу нуклеотидів ДНК входить якийсь «цукор» - дезоксирибоза, а в нуклеотидах РНК його місце займає рибоза, що має на одну ОН-групу більше.
Частина молекул цітоплазменних РНК виявилися досить великими і нестабільними («короткоживучими»). Притому визначено однониткових. Оскільки в клітині синтез одних ферментів може змінювати синтез інших (зростання, зміна харчування та ін), в цих нестабільних молекулах РНК запідозрили переносників спадкової інформації від ДНК до білка. Їх назвали «інформаційними» (іРНК). Гіпотеза про механізм редуплікації ДНК підказувала можливий спосіб зчитування і перенесення цієї інформації. Можна було припустити, що на ділянці ДНК, що кодує синтез певного білка (на ділянці «гена»), за шаблоном нитки, яку ми раніше назвали «захисної», синтезується молекула іРНК. Очевидно, що послідовність нуклеотидів в ній буде точно повторювати послідовність кодує нитки. Таким чином, інформація на синтез певного білка перейде на іРНК, і разом з нею може бути з ядра перенесена в цитоплазму. Зрозуміло, в цьому випадку нитки ДНК теж повинні розійтися, хоча б на ділянці гена.
Крім великих молекул іРНК (ген може нараховувати кілька тисяч нуклеотидів) у цитоплазмі були знайдені малі (завдовжки менше сотні нуклеотдіов) і стабільні молекули РНК. Їм приписали роль переносників амінокислот до місця синтезу білка і тому назвали «транспортними» (тРНК).
Саме місце синтезу були підстави пов'язати з виявленими в цитоплазмі за допомогою електронного мікроскопа досить великими, - порядку 25 тр. в діаметрі, - частинками, які були названі «рибосомами». (У їх складі опинилися і білки, і якісь ще специфічні РНК.) Проте до ясного розуміння механізмів ферментативного каталізу, редуплікації ДНК і білкового синтезу було ще дуже далеко.
Втім, одне вражаюче відкриття було вже зроблено. Хоча описані вище уявлення про основні процеси життєдіяльності ще були тільки робочими гіпотезами, обгрунтування цих гіпотез можна було з рівним успіхом почерпнути з вивчення будь-яких живих організмів від бактерій до людини. У всіх випадках білки, ДНК і РНК мають приблизно однаковий елементарний склад і вдають із себе однаково побудовані ланцюга відповідно з 20-ти вільно чергуються амінокислот або 4-х нуклеотидів. Навіть розміри білків, незважаючи на відмінність розмірів цілих організмів, виявилися одного порядку величини. (Чого не можна сказати про ДНК, що й зрозуміло, оскільки необхідна кількість спадкової інформації безпосередньо пов'язано зі складністю організму). Було показано, що цілий ряд ферментів, що каталізують одні й ті ж реакції в клітинах вищих і нижчих організмів, за своїми фізичними і хімічними параметрами схожі один на одного. І навіть часом виявлялися взаємозамінними в реакціях, здійснюваних «in vitro» (у пробірці). Були також достатні підстави припускати, що редуплікація ДНК і синтез білка в будь-яких живих клітинах відбуваються подібним чином. Природа виявилася дуже економною у відборі засобів реалізації життя!
Все викладене вище показує, що хоча до середини минулого століття наука про молекулярну природу життя («молекулярна біологія») досягла чималих успіхів, перед нею постала ціла низка важких проблем. Для розуміння роботи ферментів треба було знайти способи виділення та очищення індивідуальних білків, потім розшифрувати всю послідовність утворюють ці білки амінокислот. Для кожного з ферментів визначити його просторову структуру, склад і конфігурацію активного центру. Для перевірки гіпотези генетичного коду необхідно було знайти способи ретельного очищення ДНК, визначення послідовності нуклеотидів в ній і кордонів генів. Ще більш складні завдання треба було вирішити для розуміння механізмів редуплікації ДНК, зчитування спадкової інформації, зашифрованої в генах, способу передачі її до місць синтезу білка (рибосомам?) І, нарешті, самого механізму цього синтезу, керованого послідовністю кодують трійок (?) Нуклеотидів в гені . При цьому слід було очікувати виявлення цілої гами спеціальних ферментів і регуляторних факторів, що здійснюють всі ці процеси. Їх належало виділити, очистити і всебічно охарактеризувати.
Незабаром стало ясно, що для вирішення цих складних проблем арсеналу суто хімічних методів дослідження явно недостатньо. Біологам і біохімікам необхідно було скористатися сучасними фізичними методами дослідження. Такими, як електрофорез, ультрацентрифугирование, гель-фільтрація, рідинна хроматографія, використання флуо-ресцентних міток, радіоактивних ізотопів, рентгеноструктура-ного аналізу. Все це - назви тем і розділів пропонованого курсу. Історичні обставини склалися так вдало, що саме на початку 50-х років багато видатних фізиків, що не бажали з гуманних міркувань продовжувати працювати в області вдосконалення атомної зброї, прийшли у біологію. Цей процес почався в США і незабаром продовжився в Західній Європі і Радянському Союзі.
Історію розвитку фізичних методів дослідження в біології за другу половину XX століття можна умовно розбити на два етапи, 1-й етап - до 1980 року. У цей час фізичні методи розвивалися й модифікувалися для потреб молекулярної біології. Кількості вихідного біологічного матеріалу, які були потрібні для застосування цих методів, вимірювалися грамами або, в кращому випадку, міліграмами, 2-й етап - з 1980 р. до кінця століття. Бурхливий розвиток «генної інженерії», як методичного підходу, зажадало переходу на роботу з мікрограммовимі кількостями біологічного матеріалу. А також - автоматизації і роботизації рутинних досліджень, що вимагають часом одночасного проведення сотень однотипних операцій. Для обробки тисяч експериментальних даних були створені спеціальні комп'ютерні програми.
Плідне використання в біологічних експериментах сучасних фізичних методів не терпить бездумного копіювання описаних у науковій літературі процедур. Результати, отримані цими методами, занадто сильно залежать від вибору біологічного об'єкта, якості хімічних реактивів, робочих характеристик наявних у наявності приладів і безлічі інших об'єктивних чинників. Для їх обліку та осмисленого вибору умов експерименту необхідне розуміння фізичної сутності кожного використовуваного методу.