Група пневмовірусов

1.1 Загальне введення

1.2 Номенклатура

1.3 Виділення вірусу

1.4 Зберігання вірусу

2. Основні методи

2.1 Культивування респіраторно-синцитиального вірусу

2.1.1 Чутливі культури клітин

2.1.2 цитопатогенну дію

2.1.3 Методи підвищення інфекційне ™

2.1.4 Методи стабілізації інфекційне

2.2 Методи визначення інфекційності

2.3 гемаглютинація

2.4 гемадсорбції

2.5 Імунофлуоресцентний методи

2.6 Твердофазний імуноферментний аналіз

3. Аналітичні методи

3.1 Радіоактивне лікування, радіоіммуноаналіз і радіоіммунопреціпітація

3.1.1 Введення радіоактивної мітки у вірусні білки в заражених РСВ клітинах

3.1.2 Радіоіммуноаналіз

3.1.3 Радіоіммунопреціпітація

3.2 Метод виявлення дефектних интерферирующих частинок

3.3 Електронна мікроскопія

3.3.1 Морфологія віріонів

3.3.2 Морфогенез віріонів

3.3.3 Скануюча електронна мікроскопія

3.3.4 Локалізація та кількісне визначення вірусних антигенів щодо зв'язування стафілококів

3.4 Концентрування вірусу

3.5 Очищення і радіоактивне мічення РСВ

3.5.1 Градієнтні центрифугування

3.5.2 Очищення РСВ методом ізопікніческого центрифугування

3.6 Радіоактивне мічення віріонів РНК

3.7 Аналіз вірусних РНК і білків методом електрофорезу в поліакриламідному гелі

3.7.1 Аналіз білків

3.7.2 Аналіз РНК

3.8 Очищення матричної РНК для трансляції

3.9 Молекулярне клонування і олігонуклеотидно секвенування

3.10 Очищення вірусних білків

3.10.1 Вірусні поліпептиди

3.10.2 Очищення капсидного білка

3.10.3 Очищення віріони глікопротеїнів

4. Спеціальні біологічні методи

4.1 Отримання моноклональних антитіл

4.2 Виділення температурно-чутливих мутантів

4.3 Отримання персистентно інфікованих клітинних культур

1. Унікальні особливості пневмовірусов

1.1 Загальне введення

До складу групи входять пневмовірусов респіраторно-синцитіальний вірус людини, респіраторно-синцитіальний вірус великої рогатої худоби і вірус пневмонії мишей. Прототип цієї групи, респіраторно-синцитіальний вірус, - це плеоморфний оболончатий вірус, геном якого представлений несегментірованное РНК негативної полярності. , который вместе с родами Paramyxovirus и Morbillivirus образует семейство Paramyxoviridae . РСВ належить роду Pneumovirus, який разом з пологами Paramyxovirus і Morbillivirus утворює сімейство Paramyxoviridae. Однозначно доведено етіологічна роль РСВ при щорічних спалахи респіраторних захворювань у дітей. . Унікальність біологічних, біохімічних і клінічних характеристик цього вірусу не дозволяє об'єднати його з представниками роду Paramyxovirus. РСВ виявляють у сільськогосподарських тварин; РСВ великої рогатої худоби викликає у тварин респіраторне захворювання. Антитіла до РСВ часто присутні і в сироватці крові інших домашніх і лабораторних тварин, що контактують з людиною, але виділення вірусу від цих тварин не описано. Ізоляти РСВ, виділені від людини і великої рогатої худоби, мають антигенну спорідненість; серед людських ізолятів не виявлена ​​зв'язок між антигенної варіабельністю і клінікою захворювань. . Вірус пневмонії мишей, що викликає у цих тварин респіраторне захворювання, яке не має антигенного спорідненості з РСВ, проте в деякій мірі схожий з ним, в усякому разі це єдиний вірус, досить близький до РСВ, щоб бути включеним в рід Pneumovirus. Антитіла до ВПМ з високою частотою виявляються в сироватці крові людини; є неопубліковані дані, які вказують на те, що в лабораторні колонії мишей цей вірус потрапив від людини.

Основні властивості РСВ наведені в табл.1. и G ), отсутствием гемагглютинина и нейраминидазы, а также характерными размерами нуклеокапсида и поверхностных выступов. РСВ відрізняється від інших параміксовірусів великим числом ідентифікованих білків, порядком генів (маються два гени неструктурних білків, один з яких розташований між З'-кінцевий лидерной послідовністю і геном нуклеопротеїнів, а інший - між гіпотетичними генами глікопротеїнів F і G), відсутністю гемаглютиніну і нейрамінідази , а також характерними розмірами нуклеокапсиду і поверхневих виступів.

Таблиця 1. Загальні властивості пневмовірусов

1.2 Номенклатура

-вирус, а не RSV , чтобы отличать его от вируса саркомы Рауса, типичного представителя ретровирусов. В англомовній літературі для позначення респіраторно-синцитиального вірусу має сенс використовувати скорочення RS-вірус, а не RSV, щоб відрізняти його від вірусу саркоми Рауса, типового представника ретровірусів. Крім того, респіраторно-синцитіальний вірус великої рогатої худоби слід відрізняти від неспорідненого йому синцитій-утворюючого вірусу, що також відноситься до ретровірусів.

1.3 Виділення вірусу

У зв'язку з незвичайною лабільністю РСВ і низьким титром в секретах і заражених тканинах при виділенні цього вірусу потрібна особлива ретельність. Спроби виділення вірусу з зберігалися зразків рідко бувають успішними. Має сенс доставляти чутливу культуру клітин безпосередньо до місця знаходження пацієнта або зараженої тварини, а не транспортувати містять вірус матеріали в лабораторію для зараження культури.

, однако описано использование культуры почек макак-резусов, линий BS - C - I , MRC -5, WI -38 и некоторых других. Частіше за все для виділення РСВ використовують лінії клітин Нер-2 і HeLa, однак описано використання культури нирок макак-резусів, ліній BS - C - I, MRC -5, WI -38 і деяких інших. Кращим матеріалом для виділення РСВ служать змиви слизової носа або носоглотки хворих дітей. Змиви можна перенести в пробірку з невеликою кількістю буферного розчину або бульйону. Вміст пробірок перемішують енергійним струшуванням. Зразки слід тримати в крижаній бані і як можна скоріше використовувати для зараження чутливої ​​культури клітин. У всякому разі, проміжок між збором матеріалу і зараженням культури не повинен перевищувати декількох годин. З антибіотиків найбільш часто використовують пеніцилін ', стрептоміцин, неоміцин і мікостатін.

Для успішного виділення РСВ важливо уникати заморожування і відтавання зразків, при їх зберіганні підтримувати досить низьку температуру, як можна швидше використати матеріал для зараження чутливої ​​культури і включати до складу культурального середовища ЕТС або БСА. Сироватка дорослих домашніх тварин, зазвичай використовується для культивування клітин, як правило, містить досить високий титр нейтралізуючих РСВ антитіл, тому її не можна використовувати при виділенні цього вірусу. Заражену культуру інкубують при 36-37 ° С і спостерігають за нею не менше 3 тижнів, регулярно змінюючи середовище. Для виявлення ЦПД можуть знадобитися додаткові сліпі пасажі. Для РСВ характерно ЦПД у вигляді утворення синцитію, але цей ефект спостерігається не завжди, і його прояв залежить від штаму вірусу і типу зараженої культури.

1.4 Зберігання вірусу

Пневмовіруси слід зберігати в інтервалі температур від -70 ° С до - 198 ° С. При - 20 ° С настає досить швидка втрата інфекційне ™, і в таких умовах вірус не можна зберігати більше 3 міс. Ліофілізація або додавання гліцерину дозволяють збільшити термін зберігання вірусу при - 20 ° С. Швидкість падіння інфекційності залежить від природи містить вірус матеріалу; так, вірус, пов'язаний з мембранами, більш стабільний, ніж вільний.

2. Основні методи

2.1 Культивування респіраторно-синцитиального вірусу

2.1.1 Чутливі культури клітин

Є великий набір клітинних ліній, чутливих до РСВ. У діагностичних лабораторіях найчастіше використовують лінію гетероплоідних клітин людини Нер-2, оскільки її легко підтримувати.

-38, HeL -1, L -4, L -49, HLDC -1, - 4, - 6 и эмбриональных клеток мозга НВС-1 и НВС-4. Тим не менше для виділення РСВ більше підходять диплоїдні лінії клітин людини, наприклад ембріональних клітин легенів WI -38, HeL -1, L -4, L -49, HLDC -1, - 4, - 6 і ембріональних клітин мозку НВС-1 і НВС-4.

РСВ розмножується і в різноманітних культурах клітин тварин, зокрема в клітинах нирок кішок, норок і кенгурові щури. Ступінь чутливості різних ліній клітин, мабуть, залежить від схеми пасирування використовуваного штаму вірусу. -38 полученный изолят вируса давал на этих клетках в 50 раз более высокий титр, чем вирус, пассируемый на клетках BS - C -1. Наприклад, після трьох пасажів через, індивідуальні бляшки на культурі клітин WI -38 отриманий ізолят вірусу давав на цих клітинах в 50 разів вищий титр, ніж вірус, пассіруемий на клітинах BS - C -1.

, но он не размножается в клетках земноводных и беспозвоночных, в частности комаров. РСВ може бути адаптований і до зростання в деяких первинних культурах клітин холоднокровних тварин, наприклад черепахи Testudo graced, але він не розмножується в клітинах земноводних і безхребетних, зокрема комарів. На відміну від багатьох інших параміксовірусів РСВ не розмножується в курячих ембріонах і культурі клітин курячого ембріона. Крім того, на відміну від вірусу пневмонії мишей він не розмножується в клітинах ВНК-21.

При серійному пасирування РСВ з високою частотою утворюються дефектні інтерферуючі частинки. Розроблено простий колориметричний метод виявлення та кількісного визначення діч,

Для розмноження РСВ в культурі клітин можна використовувати основну мінімальну середу Голка, бажано з додатковими амінокислотами. Кращий вихід вірусу, як правило, дають активно діляться клітини. Можна використовувати й інші середовища, наприклад середу Лейбовича, для підтримки рН якої не потрібно газоподібна СОГ. Температура розмноження РСВ становить 25-39 ° С; максимальний вихід отримують при температурі близько 37 ° С.

2.1.2 цитопатогенну дію

Характерне для РСВ цитопатогенну дія - це утворення синцитію. У синцитію ядра клітин часто утворюють агрегати, що оточують центральну порожнину. Однак формування синцитію спостерігається далеко не завжди; характер ЦПД визначається багатьма факторами, в тому числі штамом вірусу, умовами культивування та типом клітин. Наприклад, при зараженні клітин нирок африканської зеленої мавпи утворюються фокуси агрегованих клітин. Під Агаровим покриттям вони виглядають як інтенсивно забарвлені згустки клітин, що нагадують фокуси трансформації, індуковані онкогенними вірусами. Проте індуковані РСВ фокуси оточені слабо забарвленої областю (рис.2). Її утворення зумовлене міграцією клітин до формування скупчення. Фокуси складаються з збільшилися в розмірах набряклий клітин, які потім дають початок синцитій. Незважаючи на зовнішню схожість фокусів, індукованих онкогенними вірусами і РСВ, клітини останніх не зберігають здатність до поділу.

2.1.3 Методи підвищення інфекційне ™

Обробка вірусу або клітин ДЕАЕ-декстраном підвищує чутливість клітин до РСВ. При оптимальній концентрації, що дорівнює 40 мкг / мл, ДЕАЕ-декстран в 2 рази підвищує вихід вірусу; є дані і про те, що кількість клітин, заражених РСВ великої рогатої худоби, зростає в цих умовах у 11 разів. Нісевич та ін повідомили про 100-кратному збільшенні числа клітин, заражених РСВ людини, у присутності 15 мкг / мл ДЕАЕ-декстрану.

2.1.4 Методи стабілізації інфекційне

Інфекційність РСВ стабілізується в присутності високих концентрацій цукрози чи іонів магнію. 04 стабильность РСВ возросла в 30 раз и период полужизни инфекционного вируса при 4°С увеличился до 12 нед. Ферні і Герін повідомили, що в присутності 1 М MgS 04 стабільність РСВ зросла в 30 разів і період напівжиття інфекційного вірусу при 4 ° С збільшився до 12 тижнів. 04 до концентрации 1 М облегчает очистку РСВ для физико-химических исследований, однако при выделении вируса и определении его инфекционной активности добавление MgS 04 нежелательно, поскольку высокая ионная сила оказывает отрицательное воздействие на культуры клеток. Додавання MgS 04 до концентрації 1 М полегшує очищення РСВ для фізико-хімічних досліджень, однак при виділенні вірусу та визначенні його інфекційної активності додавання MgS 04 небажано, оскільки висока іонна сила чинить негативний вплив на культури клітин.

2.2 Методи визначення інфекційності

Інфекційність препаратів РСВ можна визначити методом бляшок. - C -1, пригоден и для работы с большинством других клеточных культур. Метод, описуваний тут для клітин BS - C -1, придатний і для роботи з більшістю інших клітинних культур.

1. Висівають по 10 ⁶ клітин в чашки Петрі діаметром 60 мм. Чашки інкубують протягом ночі при 37 ° С і використовують клітини відразу ж після утворення щільного моношару.

2. Культуральне середовище видаляють і вносять в чашки по 0,2 мл послідовних 10-кратних розведень вірусного препарату. , или, предпочтительно, среду MEM . Для приготування розведень можна використовувати буферний розчин, наприклад PBS, або, переважно, середу MEM.

В обох випадках використовується для розведення вірусу розчин повинен містити 0,5% ЕТС і антибіотики.

3. Культуру інкубують 1 год при 31 ° С для адсорбції вірусу.

4. У кожну чашку вносять по 5 мл покриття. Видалення інокуляту необов'язково. , содержащую 1-2% ЭТС, антибиотики и 0,9% агара. В якості покриття можна використовувати середу MEM, що містить 1-2% ЕТС, антибіотики і 0,9% агару. в двойной концентрации и расплавленного 1,8% -ного агара Нобль. Це середовище готують, змішуючи рівні об'єми нагрітої до 37 ° С середовища MEM в подвійній концентрації і розплавленого 1,8%-ного агару Нобль. При температурі 43-46 ° С агар не застигає, і покриття можна наносити на шар клітин без їх пошкодження.

5. Клітини інкубують 3-5 діб. при 31-39 ° С; час інкубації залежить від температури: чим вища температура, тим коротше час інкубації.

и оставляют при комнатной температуре по крайней мере на 4 ч для фиксации. Для приготування стабільних препаратів, в яких можна підраховувати бляшки через тривалий час після досвіду, в кожну чашку додають 2 мл 1%-ного розчину глутарового альдегіду в PBS і залишають при кімнатній температурі принаймні на 4 год для фіксації. Фіксуючий розчин і агаровому покриття видаляють і додають в чашки розчин відповідного барвника, забарвлюють протягом 5 хв, потім ретельно промивають водою і сушать. Для максимально точного підрахунку бляшок необхідний бінокулярний мікроскоп з невеликим збільшенням. или в среде, содержащей 0,9% агара. Для фарбування можна використовувати і 0,01%-ний розчин нейтрального червоного в PBS або в середовищі, що містить 0,9% агару.

Зазвичай для посилення контрасту зі складу агарового покриття виключають феноловий червоний, але це не має принципового значення. Фарбування розчином нейтрального червоного проходить швидше, однак такі препарати нестабільні і схильні фотохимическому пошкодження під дією світла.

Фарбування за допомогою твердого нейтрального червоного, що входить до складу агарового покриття, відбувається повільніше, проте в тих випадках, коли необхідно виділити інфекційний вірус з індивідуальних бляшок, даний метод явно кращими.

2.3 гемаглютинація

У культуральної рідини інфікованих РСВ клітин гемаглютинін не виявляється. Гемаглютинація з еритроцитами людини, африканської зеленої мавпи, макаки-резусу, морської свинки, щури, хом'ячка, миші, гусака, вівці, свині, курки і курчати не відзначена.

З іншого боку, ВПМ аглютинативна еритроцити миші і хом'ячка. Методичні аспекти постановки реакції гемаглютинації описані в роботі Компанса та ін

2.4 гемадсорбції

Адсорбція еритроцитів на клітинах, заражених РСВ, не описана. Негативні результати отримані з еритроцитами африканської зеленої мавпи, шимпанзе, мавпи гелади, морської свинки, щури, хом'ячка, миші, качки, гуски, голуба, курки і курчати. Однак клітини, заражені ВПМ, пов'язують еритроцити миші; технічні деталі описані Ком-Панса і ін.

2.5 Імунофлуоресцентний методи

Імунофлуоресцентній фарбування за допомогою поликлональной антисироватки представляє собою зручний і точний метод підрахунку заражених клітин і виявлення місця розмноження вірусу при аналізі фіксованих зрізів заражених тканин. Використовуючи моноклональні антитіла проти індивідуальних вірусних поліпептидів, імунофлуоресцентний методом можна вивчати і внутрішньоклітинну локалізацію вірусних антигенів.

Імунофлуоресцентній фарбування застосовується також для швидкої діагностики вірусних інфекцій. Цей напрямок нещодавно розглянуто в вичерпних оглядах, а конкретні методи виявлення РСВ в клінічному матеріалі описані в роботі Гарднера та ін імунофлуоресценція - більш точний метод виявлення РСВ в організмі хворого, ніж безпосереднє виділення вірусу, оскільки в період реконвалесценції після викликаного РСВ захворювання заражені клітини бувають покриті противірусними антитілами.

Непряма імунофлуоресценція більш чутлива, ніж пряма, однак при її використанні виникає проблема неспецифічної флуоресценції. Її можна усунути попередніми виснаженням антисироватки і антііммуноглобулінового кон'югату обробленої ацетоном культурою клітин або гомогенату печінки тварин. Обробка клітин ацетоном проводиться наступним чином:

1. -10 ⁹ клеток снимают со стекла и получают суспензию. 10 ^s -10 ⁹ клітин знімають зі скла і отримують суспензію.

2. ; эту процедуру повторяют трижды. Клітини концентрують центрифугуванням і ресуспендіруют в 0,01 М PBS; цю процедуру повторюють тричі.

3. Осад клітин _{ресуспендіруют:} 5 хв в 10-кратному обсязі ацетону і знову осаджують клітини.

4. и проводят 6 циклов осаждения для полного удаления ацетона. Клітини ресуспендіруют в 0,01 М PBS і проводять 6 циклів осадження для повного видалення ацетону. при - 20 °С. Після цього клітини можна зберігати до вживання в 0,01 М PBS при - 20 ° С.

Нижче наведена стандартна методика для виявлення антигенів РСВ в заражених клітинах методом непрямої імунофлуоресценції.

1. - C -1. У пластикові чашки діаметром 50 мм поміщають ретельно вимиті і дегідратованих етанолом покривні скла і висівають по ИО ⁶ клітин BS - C -1. Інкубують клітини 24 год, промивають і заражають РСВ з множинністю інфекції близько 1 БОЮ / кл.

2. , содержащей 2,5% ЭТС, и инкубируют при 31 или 39 °С. Після адсорбції вірусу протягом 2 год покривні скла з зараженими клітинами ретельно промивають середовищем MEM, що містить 2,5% ЕТС, і інкубують при 31 або 39 ° С.

3. Через 40-48 год після зараження клітини фіксують на 5 хв в охолодженому до 4 ° С ацетоні, висушують на повітрі 30 хвилин і зберігають при - 20 ° С.

4. - C -1 при 4°С и используют в подобранном оптимальном разведении. Антивірусну сироватку виснажують обробленими ацетоном клітинами BS - C -1 при 4 ° С і використовують в підібраному оптимальному розведенні. Кроляча сироватка проти глобулінів декількох видів тварин, кон'юговані з ізотіоцианатом флуоресцеїну, є у продажу. - C -1 при 4°С. Кон'югат виснажують обробленим ацетоном гомогенату печінки миші або клітинами BS - C -1 при 4 ° С.

5. Покривні скла інкубують з антивірусною сироваткою 1 год при 37 ° С, промивають і інкубують ще 45 хв при 37 ° С з відповідним кон'югатом.

6. Після промивання препарати містять в забуференной гліцерин і досліджують під флуоресцентним мікроскопом. Рис.3 ілюструє дозвіл, який може бути отримано при використанні даного методу.

Доказами специфічності імунофлуоресценції можуть служити:

- C -1; 1) відсутність флуоресценції незаражених клітин BS - C -1;

2) відсутність флуоресценції при використанні ЕТС замість специфічної із зараженими РСВ клітинами;

3) відсутність флуоресценції після виснаження противірусної сироватки зараженими клітинами.

Високою чутливістю володіє і іммунопероксідазний метод; його перевага полягає в тому, що він не вимагає використання мікроскопа з ультрафіолетовою оптикою.

2.6 Твердофазний імуноферментний аналіз

- еще один иммунологический метод быстрого обнаружения и количественного определения РСВ. ELISA - ще один імунологічний метод швидкого виявлення та кількісного визначення РСВ. Нижче наведена типова методика.

1. Лунки планшета для імунологічних реакцій покривають зараженими або незараженими клітинами, або РСВ, очищеним центрифугуванням в градієнті. Це робиться одним з таких методів:

а) клітини вирощують в лунках планшета і через ряд заражають РСВ. Коли в лунках з зараженими клітинами проявляється ЦПД, клітини промивають, фіксують розчином, що містить етанол і оцтову кислоту, і зберігають при - 20 ° С;

б) в лунки планшета вносять РСВ, очищений центрифугуванням в градієнті, і висушують протягом ночі при 37 ° С.

Якщо є клітини, персистентно інфіковані РСВ, їх можна використовувати як джерело антигену замість політично інфікованих клітин.

2. . Перед початком аналізу всі лунки планшета покривають 5%-ним розчином БСА в PBS. У кожен досвід слід включати негативний контроль і позитивний контроль. У лунки планшета вносять зразки вірусу і інкубують протягом ночі при 4 ° С. Планшет промивають і додають овечі антитіла проти імуноглобулінів миші, кон'юговані з пероксидазою хрону у рекомендованому розведенні. Планшет інкубують 1 год при 37 ° С, промивають, додають субстрат, о-фенілендіамін, і інкубують при 37 ° С ще 30 хв. 2 SO 4 и учитывают результаты с помощью ридера "Мультискан". Реакцію зупиняють додаванням 4,5 М H 2 SO 4 і враховують результати за допомогою рідера "Мультіскан".

количественно выявлять белковые полосы после электрофореза и переноса белков на нитроцеллюлозные мембраны, так называемый метод "вестерн-блотинга". Хіерхольцер та ін описали методику, що дозволяє за допомогою ELISA кількісно виявляти білкові смуги після електрофорезу і перенесення білків на нітроцелюлозні мембрани, так званий метод "вестерн-блотингу". Перевага цього методу полягає в тому, що він не вимагає використання радіоактивних ізотопів.

3. Аналітичні методи

3.1 Радіоактивне лікування, радіоіммуноаналіз і радіоіммунопреціпітація

3.1.1 Введення радіоактивної мітки у вірусні білки в заражених РСВ клітинах

1. в концентрации 2,5 мкг/мл. Оптимальні умови для мічення вірусних білків досягаються при додаванні до заражених клітин через 18 годин після зараження актиноміцину D в концентрації 2,5 мкг / мл.

тионина и - цистеина по следующей методике. Білки РСВ вдається ефективно позначити сумішшю - Me тіоніном і - цистеїну за наступною методикою.

2. культур ал ьную среду заменяют на среду, содержащую 50 мкКи/мл L -- Me тионина и 25 мкКи/мл Ь--цистеина. Через 2 години після внесення актиноміцину D культур ал ьную середу замінюють на середу, що містить 50 мкКі / мл L - Me тіоніном і 25 мкКі / мл Ь - цистеїну. у

3. Клітини інкубують 16 год при 37 ° С або до прояву вираженого ЦПД.

4. Моношар промивають, солюбілізіруют клітини і екстрагують білки лизирующие буфером.

5. Після інкубації протягом 2 год при кімнатній температурі лізат використовують для електрофорезу або зберігають при - 20 ° С.

Рис.4 ілюструє результати поділу мічених - метіоніном білків РСВ в пластині 10%-ного поліакриламідного гелю. Вірусні глікопротеїни можна помітити аналогічним методом, використовуючи як мітки 50 мкКі / мл - глюкозаміну або - манози. Альтернативний метод введення мітки в глікопротеїни оболонки РСВ полягає в йодування поверхні заражених вірусом клітин лактопероксідазним методом. Білки очищеного нуклеокапсида РСВ можна йодувати за допомогою хлораміну Т.

3.1.2 Радіоіммуноаналіз

с использованием в качестве вторых антител меченных ¹²⁵ 1 гамма-глобулинов сыворотки козы против глобулинов мыши, а в качестве субстрата - фиксированных метанолом персистентно инфицированных РСВ клеток описан Коутом и др. . Метод прямого RIA з використанням в якості другого антитіл мічених ¹²⁵ 1 гамма-глобулінів сироватки кози проти глобулінів миші, а в якості субстрату - фіксованих метанолом персистентно інфікованих РСВ клітин описаний Коут та ін.

3.1.3 Радіоіммунопреціпітація

Радіоіммунопреціпітація проводиться стандартним методом, описаним, наприклад, Ферні і Герін і Уордом і ін Для РСВ застосовують таку методику.

1. , содержащего 30 мкКи - метионина и 25 мкКи - цистеина, и инкубируют чашки при 31 °С 1 ч. "Моношарова культури клітин в чашках Петрі діаметром 50 мм заражають РСВ з множинністю інфекції більше 1 БОЮ / кл. Через певні проміжки часу після зараження проводять імпульсне мічення. Для цього культуральне середовище в чашках замінюють на 1 мл PBS, що містить 30 мкКі - метіоніну і 25 мкКі - цистеїну, і інкубують чашки при 31 ° С 1 год

2. . Радіоактивний розчин зливають і моношар промивають охолодженим PBS.

3. Клітини знімають зі скла за допомогою стерильної гумової палички і осаджують центрифугуванням.

4. Клітини ресуспендіруют в 200 мкл лізуючої буфера, інкубують суспензію 30 хв у крижаній бані, потім інтенсивно перемішують.

5. . Ядра і клітинний дебрис видаляють центрифугуванням 5 хв при 10 000 g.

6. Лізат освітлюють інкубацією з 50 мкл 10%-ної суспензії фіксованих формаліном стафілококів або з 50 мкл суспензії покритих білком-А гранул 30 хв при 0 ° С.

7. Стафілококи видаляють центрифугуванням. До 50 мкл лізата додають 10 мкл гіперімунної сироватки, перемішують і інкубують 3 год в льоду.

8. Додають 100 мкл суспензії стафілококів, перемішують і інкубують суміш 30 хв при кімнатній температурі.

9. . Імунні комплекси осаджують центрифугуванням 20 з при 10 000 g.

10. , 100 мМ трис- HCl , рН 8,5. Осад 3 рази промивають розчином, що містить 500 мМ LiCl, 100 мМ трис-HCl, рН 8,5.

11. Осад після промивки ресуспендіруют в 50 мкл смеиг для дисоціації, кип'ятять 2 хв і або негайно наносять на гель для електрофорезу, або зберігають при - 20 ° С.

3.2 Метод виявлення дефектних интерферирующих частинок

Дефектні інтерферуючі частинки і стандартні віріони РСВ не вдається розділити фізичними методами, на прояв стійкою до ультрафіолетового опромінення і чутливою до нейтралізуючим антитіл інтерферує активності при пасирування вірусу з високою множинністю інфекції свідчить про накопичення діч. Розробка приладів та Зотзн колориметричний метод кількісного визначення діч в препаратах РСВ. Він заснований на вимірюванні інтенсивності фарбування, обумовленого поглинанням нейтрального червоного клітинами, які виживають при зараженні стандартним вірусом у результаті захисту діч. Наводяться дані про те, що колориметричний чутливіші, ніж метод, заснований на визначенні зниження виходу вірусу. Колориметричний аналіз проводять таким чином.

1. Моношарова культури клітин Нер-2, вирощені в лунках планшета діаметром 16 мм, інкубують з містить діч матеріалом 2 год при 37 ° С.

2. Містить діч іннокулят видаляють і заражають клітини стандартним вірусом, отриманими в результаті пасирування з низькою множинністю, і продовжують адсорбцію 2 год при 37 ° С.

3. У кожну лунку вносять по 1 мл культурального середовища та інкубують клітини 72 год при 37 ° С.

4. Середу видаляють і вносять в кожну лунку по 0,5 мл нейтрального червоного в розчині Ерла; інкубацію клітин продовжують ще 2 год при 37 ° С.

5. . Барвник видаляють і клітини двічі промивають PBS.

6. 2 P 0 ₄ , и определяют его количество спектрофотометрически при 540 нм. Барвник екстрагують з клітин 1 мл 50%-ного етанолу, що містить 0,1 М NaH 2 P 0 _4, і визначають його кількість спектрофотометрично при 540 нм. Отримані дані порівнюють з кількістю барвника, екстрагованого з незаражених клітин і з клітин, заражених стандартним вірусом.

Концентрацію діч можна розрахувати таким чином, припускаючи, що їх розподіл по клітках підкоряється закону Пуассона:

число діч / мл = 1/разведеніе, що забезпечує виживання 63% клітин Х загальне число клітин X 1/об'ем іннокулята.

3.3 Електронна мікроскопія

Пневмовіруси виключно різноманітні за формою; крім того, їх віріони і нуклеокапсиди нестабільні і легко ушкоджуються при звичайних процедурах концентрування вірусів. Тому точний підрахунок вірусних частинок практично неможливий.

Трансмісійна електронна мікроскопія зручна для ідентифікації вірусів і вивчення морфології і морфогенезу ві-Ріоні. Скануюча електронна мікроскопія використовується для вивчення морфології поверхні заражених клітин, а також для кількісного визначення поверхневих антигенів на основі специфічного зв'язування бактеріальних клітин.

3.3.1 Морфологія віріонів

Для негативного контрастування успішно застосовують такі речовини: фосфорно-вольфрамова кислота, фосфовольфрамат натрію, калію фосфовольфрамат, кремневольфрамат натрію і уранилацетатом. Концентрування вірусу необхідно проводити найм'якшим методом, наприклад осадженням поліетиленгліколем або ультрафильтрацией через фільтри "Амікон", уникаючи високошвидкісного центрифугування. Краплю концентрованого розчину вірусу наносять на покриту графітом формваровую сіточку. , перемешивают и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Для фіксації додають рівний об'єм 3%-ного глутарового альдегіду в PBS, перемішують і інкубують 5 хв при кімнатній температурі. и проводят негативное контрастирование. Сіточки промивають PBS і проводять негативний контрастування. Для візуалізації нуклеокапсидов заражені клітини лизируют дистильованою водою або гіпотонічним буферним розчином. Клітинний дебрис можна осадити безпосередньо на сіточці перед негативним контрастуванням.

3.3.2 Морфогенез віріонів

1. Заражені клітини фіксують, додаючи до моношар, вирощеному в чашці Петрі діаметром 50 мм, глутаровий. альдегід до концентрації 2,5%.

2. и добавляют 10 капель 1% -ного раствора четы-рехокиси осмия. Після фіксації протягом 30 хв моношар двічі промивають PBS і додають 10 крапель 1%-ного розчину подружжя-рехокісі осмію.

3. , снимают клетки со стекла и суспендируют их в 2 мл PBS . Через 15 хв моношар ще 2 рази промивають PBS, знімають клітини зі скла і суспендують їх в 2 мл PBS.

4. Клітини осаджують центрифугуванням і дегидратируются, послідовно суспендіруя в розчинах із зростаючою концентрацією етанолу; в кожному розчині клітини інкубують 5 хв, при необхідності їх можна витримати протягом ночі у 70%-ном етанолі. Після інкубації в 90%-ном етанолі клітини двічі по 15 хв обробляють 100%-ним етанолом.

5. Етанол замінюють на суміш етанолу і окису пропілену.

6. , а затем в среде EPON 1 ч. Через 15 хв суміш етанол-окис пропілену замінюють на свіжу, інкубують суспензію ще 30 хв, після цього ресуспендіруют клітини в суміші етанол-окис пропілену-середовище EPON, а потім у середовищі EPON 1 ч.

7. в капсуле ВЕЕМ и, заполнив капсулу средой EPON , инкубируют их 48 ч при 60 °С для полимеризации. Компактний осад клітин наносять на невеликий об'єм середовища EPON в капсулі ВЕЕМ і, заповнивши капсулу середовищем EPON, інкубують їх 48 год при 60 ° С для полімеризації. Після цього ув'язнені в капсулу клітини готові для приготування зрізів стандартним способом на ультрамікротоме.

8. Тонкі зрізи розташовують на необроблених сіточка для електронної мікроскопії і через 24 год забарвлюють 5 хв,, поміщаючи сіточки препаратами вниз в краплю насиченого розчину уранилацетатом в метанолі.

9. Сіточки промивають дистильованою водою і сушать на аркуші фільтрувального паперу.

10. и помещают сеточку срезом вниз на 5 мин в каплю раствора ацетата свинца. На зріз наносять краплю 0,1 М розчину NaOH і поміщають сіточку зрізом вниз на 5 хв у краплю розчину ацетату свинцю. Сіточки промивають і сушать на аркуші фільтрувального паперу, після цього вони готові до електронно-мікроскопічному дослідженню.

3.3.3 Скануюча електронна мікроскопія

Для підготовки клітин до скануючої електронної мікроскопії застосовують наступний метод.

1. Клітки, що утворять нещільний моношар на покривних скельцях, фіксують 1-2 год 2,5%-ним розчином глутарового альдегіду у фосфатному буфері.

2. Скло розміщують на 1 год в 1%-ний розчин четирехокісі осмію у фосфатному буфері.

3. Клітини дегидратируются, послідовно поміщаючи скла в 30, 50, 70, 90 і 100%-ний етанол, а потім на 15 хв в суміш етанолу з ацетоном.

4. ., Watford , Herts или другой аналогичный прибор. Скло двічі обробляють 100%-ним ацетоном і сушать С0 ₂ в критичній точці, використовуючи апарат для сушіння фірми Polaran Equipment Ltd., Watford, Herts або інший аналогічний пристрій.

5. 915" и покрывают золотом с помощью диодного напылителя Polaron Е5000 или другой аналогичной системы. Покривні скла фіксують на алюмінієвих підкладках за допомогою клею "Electrocday 915" і покривають золотом з допомогою діодного напилювачі Polaron Е5000 або іншої аналогічної системи. Підготовлені таким чином препарати можна досліджувати методом скануючої електронної мікроскопії.

На рис.5 представлена ​​фотографія заражених пневмо-вірусом клітин, виконана за допомогою скануючої електронної мікроскопії. Зверніть увагу на довгі вирости інфікованих клітин.

3.3.4 Локалізація та кількісне визначення вірусних антигенів щодо зв'язування стафілококів

с помощью поверхностного А-белка связываются с Fc -фрагментами иммуноглобулинов. Клітини Staphylococcus aureus за допомогою поверхневого А-білка зв'язуються з Fc-фрагментами імуноглобулінів. Цей ефект можна використовувати для дослідження просторової локалізації вірусного антигену на плазматичної мембрани заражених клітин після їх обробки противірусної сироваткою. Стафілококи більш зручні, ніж покриті А-білком кульки латексу, поліметилметакрилату-метакрилату або полістиролу, у зв'язку з легкістю отримання бактерій і однаковим діаметром всіх бактеріальних клітин (близько 1 мкм). На поверхні клітин, заражених багатьма вірусами, стафілококи розподіляються рівномірно, але в разі пневмовірусов вони специфічно зв'язуються з ниткоподібними виростами, утворення яких є унікальною особливістю заражених цими вірусами клітин. Зв'язування стафілококів високоспецифічний і підтверджує результати імунофлуоресцентного фарбування, які свідчать про те, що вірусні антигени на поверхні заражених клітин локалізовані переважно у складі ниткоподібних структур.

Зв'язування стафілококів з поверхнею заражених клітин проводять за наступною методикою.

1. Клітини вирощують на покривних скельцях до утворення моношару і заражають вірусом. Краще всього використовувати клітини нирки кенгурові щури, оскільки вони високочутливі до пневмовірусам і не мають поверхневих виростів.

2. для полного удаления входящей в состав среды сыворотки, затем фиксируют 10-15 мин 2,5% -ным раствором глутарового альдегида в PBS при комнатной температуре. Заражені клітини інкубують у підтримуючій середовищі, промивають PBS для повного видалення входить до складу середовища сироватки, потім фіксують 10-15 хв 2,5%-ним розчином глутарового альдегіду в PBS при кімнатній температурі.

3. Клітини обробляють противірусної сироваткою 1 год при 37 ° С.

4. . Антисироватка видаляють, ретельно промиваючи клітини PBS. , штамм Cowan , приготовленную по методу Прингла и Парри, или коммерческий препарат стафилококков и инкубируют 5 мин при 37 °С. До клітинам додають суспензію aureus, штам Cowan, приготовлену за методом Прінгл і Паррі, або комерційний препарат стафілококів і інкубують 5 хв при 37 ° С.

5. , и клетки фиксируют 60 мин при комнатной температуре 2% -ным раствором четырехокиси осмия в PBS . Незв'язана стафілококи видаляють, швидко промиваючи скла PBS, і клітини фіксують 60 хв при кімнатній температурі 2%-ним розчином четирехокісі осмію в PBS. Після цього скла можна підготувати до скануючої електронної мікроскопії та досліджувати.

Підрахунок числа зв'язалися з клітинами стафілококів дає можливість кількісно дослідити експресію вірусних антигенів на клітинній мембрані за умови постановки відповідних контролів.

3.4 Концентрування вірусу

Запропоновано простий метод концентрування РСВ преципітацією поліетиленгліколем.

1. Готують 36%-ний розчин ПЕГ 6000 в дистильованій воді.

2. Розчин охолоджують і додають до містить вірус рідини до кінцевої концентрації ПЕГ 6%.

3. Суспензію інкубують 2 год при 4 ° С.

4. Преципітат збирають центрифугуванням при 4 ° С.

5. Супернатант зливають, осад двічі промивають буферним розчином і ресуспендіруют в невеликому обсязі.

3.5 Очищення і радіоактивне мічення РСВ

Клінічні ізоляти РСВ в основному асоційовані з клітинами, проте при культивуванні деяких лабораторних штамів в середу виділяється достатня кількість вірусу для успішної очищення. Найбільш зручно використовувати для цього штами Лонг і А2.

3.5.1 Градієнтні центрифугування

У літературі можна зустріти не одну методику очищення РСВ градієнтним центрифугуванням. Представлена ​​нижче була успішно використана для очищення штаму А2.

1. Моношар клітин Нер-2 заражають РСВ. Адсорбцію проводять 2 год при 37 ° С, потім додають культуральне середовище.

2. до концентрации 0,3 мкг/мл. Через 10 годин після зараження додають актиноміцин D до концентрації 0,3 мкг / мл. Для радіоактивного мічення РНК через 16-20 год після зараження замінюють культуральне середовище на свіжу, що містить 20 мкКі / мл - уридину. Для введення мітки в білки в середу додають 5 мкКі / мл - метіоніну.

3. При прояві ЦПД та освіті сінцітіем збирають культуральну рідину. и концентрируют вирус центрифугированием 90 мин при 65000 g на холоду. Клітинний дебрис видаляють центрифугуванням 20 хв при 11000 g і концентрують вірус центрифугуванням 90 хв при 65000 g на холоду.

4. при ультразвуковой обработке. Осад ресуспендіруют в буфері NTE при ультразвуковій обробці.

5. в 10-50% -ном градиенте концентрации сахарозы и собирают фракции, содержащие видимую зону вируса. Вірус центрифугують 1 год при 150 000 g у 10-50%-ном градієнті концентрації сахарози і збирають фракції, що містять видиму зону вірусу.

6. и обрабатывают ультразвуком. Містять вірус фракції об'єднують, розводять NTE і обробляють ультразвуком. в 20-60% -ном градиенте концентрации сахарозы. Вірус знову центрифугують 2 год при 150 000 g у 20-60%-ном градієнті концентрації сахарози.

7. . Вірус концентрують повторним центрифугуванням 90 хв при 65000 g.

Дана методика дозволяє отримати частково очищені препарати радіоактивно міченого РСВ. 0 ₄ до концентрации 1 М. Для подальшого очищення запропоновані більш складні методи; інфекційність, яка у звичайних умовах дуже чутлива до центрифугированию, можна стабілізувати додаванням MgS 0 ₄ до концентрації 1 М.

3.5.2 Очищення РСВ методом ізопікніческого центрифугування

Даний метод вимагає більш тривалого центрифугування в градієнті концентрації сахарози або метрізаміда. Розчини метрізаміда володіють більш низькою в'язкістю і осмотичним тиском, ніж розчини сахарози, і тому їх використання для ізопікніческого центрифугування переважно. , рН 7,8. Розчини метрізаміда завжди слід готувати безпосередньо перед використанням на 10 мМ HEPES, рН 7,8.

3.6 Радіоактивне мічення віріонів РНК

Інтактну віріону РНК РСВ отримати важко; рекомендується наступна методика.

Очищений радіоактивно мічений вірус отримують, РНК екстрагують фенолом і далі з водної фази осаджують етанолом.

в течение 15 ч при 19 000 об/мин. Виділену РНК очищають центрифугуванням в 15 - 30%-ном градієнті концентрації сахарози в присутності ДДС-Na протягом 15 год при 19 000 об / хв.

Альтернативний підхід полягає в тому, що РНК, екстрагованих з немічених віріонів, мітять по З'-кінця за допомогою РНК-лігази і - цітідін-3 ^/, 5'-бісфосфата, як описано Вертц і Девісом. и полинуклеотидкиназы из Е. coli , зараженной бактериофагом Т4. РНК можна помітити і по 5'-кінця після видалення 5'-кінцевого фосфату лужною фосфатазою з кишечника великої рогатої худоби, яку потім інактивують протеїназ К. Після цього РНК екстрагують фенолом, осаджують етанолом і мітять у присутності - ATP і полінуклеотідкінази з Є. coli , зараженої бактеріофагом Т4. 50. Мічену РНК потім відділяють від непрореагировавшего АТР хроматографією на колонці з сефадекса G 50. Методика, зручна для мічення РНК РСВ, описана Шубертом та ін.

3.7 Аналіз вірусних РНК і білків методом електрофорезу в поліакриламідному гелі

3.7.1 Аналіз білків

или in vitro меченые белки можно анализировать с помощью электрофореза в 10% -ном или б - 15% -ном градиентном полиакриламидном геле, как описано Марсденом и др. . Синтезовані in vivo або in vitro мічені білки можна аналізувати за допомогою електрофорезу в 10%-ном чи б - 15%-ном градієнтному поліакриламідному гелі, як описано Марсденом та ін.

Після електрофоретичного розділення в поліакриламідному гелі білки можна перенести на нітроцелюлозні фільтр для біохімічного або імунологічного аналізу. Застосування цього методу до білків РСВ описано Хіерхольцером та ін Перенесення білків з. поліакриламідного гелю на нітроцелюлозу здійснюється електрофоретичної за нижченаведеною методикою.

1. Після електрофоретичного розділення білків поліак-ріламідний гель поміщають в камеру приладу для електрофоретичного перенесення разом з листом нітроцелюлози. У камеру заливають буферний розчин, що містить 0,025 М трис, 0, 193 М гліцин і 20% метанолу, рН 8,35.

2. Для перенесення проводять електрофорез при 60 В принаймні 4 год при 4 ° С.

3. Лист нітроцелюлози розрізають на смужки і поміщають кожну в закриту пробірку.

4. Смужки інкубують з анти-РСВ сироваткою 2 год при кімнатній температурі.

5. , содержащим твин 80. Смужки 3 рази промивають PBS, що містить твін 80.

6. Смужки інкубують з кон'югатом, розведеним в 1000 раз, 3 год при кімнатній температурі.

7. Смужки 3 рази промивають тим же розчином.

8. , рН 7,2. Нітроцелюлозу виявляють розчином, що містить 50 мг 3,3 '-діамінобензідіна і 100 мкл 3%-ного перекису водню в 100 мл PBS, рН 7,2.

9. Нітроцелюлозу промивають водою і сушать на аркуші фільтрувального паперу.

10. Кількісний аналіз можна провести спектрофотометрично після обробки нітроцелюлози речовинами, розчинювальними пластмаси. У результаті подібної обробки нітроцелюлоза стає прозорою.

3.7.2 Аналіз РНК

Радіоактивно мічену РНК з очищених віріонів або з цитоплазми заражених РСВ клітин можна проаналізувати електрофорезом в 1,5%-ном гелі агарози, що містить 6 М сечовину, за наступною методикою.

1. Для приготування гелю розміром 50X17X0, 3 см готують окремо такі розчини: а) 120 мл 4,5%-ної агарози; для розчинення агарози суспензію обробляють в мікрохвильовій печі або автоклавують її; б) 1,5-кратний концентрат розчину сечовини в цитратно буфері ; для цього до 129,6 г сечовини додають 9 мл концентрованого 1 М цитратного буфера і розчиняють, доводячи об'єм водою до 240 мл.

2.1,5-кратний буфер нагрівають і змішують з 3-кратним концентратом агарози.

3. Гель заливають на холоду в горизонтальний апарат для електрофорезу в 3 стадії, перерви між стадіями становлять 45 хв.

4. У гель негайно вводять гребінець.

5. Гель використовують для електрофорезу через 2-3 години після заливки. Гребінку виймають, промивають осередку буфером з сечовиною і заповнюють їх тим же буфером. У комірки вносять зразки, змішані з буфером для нанесення.

6. Електрофорез проводять на холоду при градієнті напруги 5 В / см протягом 18 год Основні розчини готують наступним чином.

1 М цитратний буфер, рН 3,0: змішують 1 М розчини лимонної кислоти і цитрату натрію до досягнення рН 3,0. Буфер для електрофорезу: 1 М. цитратний буфер розводять в 40 разів, отримуючи 0,025 М цитратний буфер, рН 3,0 Буфер для нанесення зразків: 0,025 мл 1 М цитратного буфера, 3,6 г 6 М сечовини, 2 г 20%-ної сахарози, 0,1 мл 0,005%-ного бромфенолового синього, об'єм доводять водою до 10 мл. Буфер з 6 М сечовиною: 3,6 г сечовини, 0,25 мл 1 М цитрату, рН 3,0; об'єм доводять до 10 мл дистильованою водою.

3.8 Очищення матричної РНК для трансляції

получают следующим образом. Матричну РНК для трансляції in vitro одержують у такий спосіб.

1. 50-Ю ⁶ клітин заражають РСВ. Клітини інкубують 10-12 год при 37 ° С.

2. Моношар промивають, знімають клітини зі скла і суспендують у буферному розчині. Суспензію залишають на 10 хв при 4 ° С для набухання клітин.

3. Клітини руйнують в гомогенизаторе Даунса, потім осаджують клітинний і дебрис центрифугуванням при 4 ° С.;

4. Осад ресуспендіруют в 2 мл того ж буфера, знову гомогенізують і центрифугують. Супернатант, отримані після першого і другого центрифугування, об'єднують.

5. и N -лаурилсаркозин. До супернатанту додають CsCl та N-лаурілсаркозін. Розчин ретельно перемішують і прогрівають 1-2 хв при 51 ° С.

6. 40 и добавляют сверху буфер, чтобы заполнить пробирку. 7 мл отриманого розчину нашаровують на 2 мл розчину в пробірці для ротора SW 40 і додають зверху буфер, щоб заповнити пробірку. 40 16 ч при 25000 об/мин и 25 °С. Пробірки центрифугують роторі SW 40 16 год при 25000 об / хв і 25 ° С.

7. Осад ресуспендіруют в 0,5 мл стерильної дистильованої води. и 10 мкл 10% -ного ДДС- Na . РНК двічі переосаждают етанолом, додаючи 1,2 мл етанолу, 25 мкл 4 М розчину NaCl і 10 мкл 10%-ного ДДС-Na.

8. до концентрации 0,2% и проводят хроматографию на колонке с олиго - целлюлозой. Після другого осадження осад ресуспендіруют в буфері, додають ДДС-Na до концентрації 0,2% і проводять хроматографію на колонці з оліго - целюлозу. Зв'язавшись матеріал елюіруют і в облогу РНК етанолом, додаючи в ка * честве носія тРНК з печінки кролика. и переосаждают РНК двумя объемами этанола в присутствии 0,2 М ацетата калия. Осад ресуспендіруют в тому ж буфері без ДДС-Na і переосаждают РНК двома об'ємами етанолу в присутності 0,2 М ацетату калію. , рН 7,6. Кінцевий осад ресуспендіруют в 250-500 мкл 0,01 М HEPES, pH 7,6. Як безклітинних системи для синтезу білка можна використовувати залежний від мРНК лізат ретикулоцитів кроля, приготовлений, як описано Престоном, або комерційний препарат лізата. Для контролю слід паралельно отримати мРНК з незаражених клітин. Індивідуальні вірусні мРНК для трансляції в безклітинних системі можна виділити методом гібридізаційного селекції з використанням клонів кДНК з відомою структурою, як описано Коллінзом і Вертц.

3.9 Молекулярне клонування і олігонуклеотидно секвенування

с использованием плазмиды pBR 322. 10 генів РСВ були ідентифіковані в результаті клонування кДНК з наступним картуванням і трансляцією вірусних мРНК - кДНК отримували зворотною транскрипцією мРНК із заражених РСВ клітин Нер-2 і клонували їх в Є. coli з використанням плазміди pBR 322.

Нуклеотидна послідовність гена білка нуклеопротеі-на РСВ і кодована нею амінокислотна послідовність - опубліковані Венкатесаном і Еланго, а послідовності гена і білка М. - Сатаке і Венкатесаном. У цих роботах докладно описані методи олігонуклеотидно секвенування в застосуванні до РСВ.

3.10 Очищення вірусних білків

3.10.1 Вірусні поліпептиди

В даний час очищені вірусні білки можна отримувати методом афінної хроматографії з використанням специфічних моноклональних антитіл. Інший підхід полягає в експресії клонованих генів у прокаріотів або в еукаріотичних клітинах. Однак безпосередньо для РСВ такі методики поки не описані.

3.10.2 Очищення капсидного білка

Капсидний білок виділяють з очищених нуклеокапсидов, які в свою чергу можна отримати або з віріонів, або з екстракту заражених клітин. Нижче наведено методику виділення з клітинних екстрактів, що дає більш високий вихід.

50-Ю ⁶ клітин заражають РСВ. , 0,25 мМ ЭДТА и 0,1 мМ PMSF . Через 36-48 год після зараження клітини знімають з поверхні флакона розчином, що містить 10 мМ трис-НО, рН 7,4, 0,18 М NaCl, 0,25 мМ ЕДТА та 0,1 мМ PMSF. Клітини осаджують центрифугуванням і ресуспендіруют в 1мл лізуючої буфера 20 хв при 4 ° С. Клітини руйнують в гомогенизаторе Даунса. до концентрации 0,1 М и удаляют неразрушенные клетки, ядра и дебрис центрифугированием 2 мин при 600 g . До гомогенату додають NaCl до концентрації 0,1 М і видаляють незруйнована клітини, ядра і дебрис центрифугуванням 2 ​​хв при 600 g. . Нуклеокапсиди осаджують центрифугуванням 30 хв при 100000 g. , рН 7,4, и 0,1 мМ ЭДТА. Нуклеокапсиди промивають лизирующие буфером, а потім буфером, що містить 10 мМ трис-HCl, рН 7,4, і 0,1 мМ ЕДТА. Осад нуклеокапсидов ресуспендіруют і отримують очищені нуклеокапсиди ізопікніческім центрифугуванням в 15-55%-ном градієнті концентрації тартрату калію в буфері ТЕ.

3.10.3 Очищення віріони глікопротеїнів

Запропоновано метод очищення глікопротеїнів РСВ, заснований на солюбілізаціі віріонів неіонних детергентом в буферному розчині з низькою іонною силою.

1. при 50 000 g 60 мин. Очищені методом градієнтного центрифугування віріони осаджують центрифугуванням через шар 30%-ного розчину сахарози в буфері NTE при 50 000 g 60 хв. Осад ресуспендіруют в 0,01 М фосфатному буфері, що містить 10% тритона Х-100.

2. . Суспензію перемішують 30 хв при кімнатній температурі і центрифугують 60 хв при 200 000 g.

3. Супернатант екстрагують п-бутанолом.

4. . Екстраговані білки суспендують в 0,01 М фосфатному буфері з 1% тритона Х-100 і фракционируют в 5-25%-ном лінійному градієнті концентрації сахарози, що містить 1% тритона Х-100, 18 годин при 100 000 g. Збирають фракції з верхньої частини градієнта та діалізу їх проти 0,01 М фосфатнога буфера.

5. Тритон Х-100 видаляють екстракцією п-бутанолом.

6. Фракції, що містять вірусні глікопротеїни, ідентифікують за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі.

4. Спеціальні біологічні методи

4.1 Отримання моноклональних антитіл

Моноклональні антитіла до кількох білків РСВ були отримані стандартними методами. Нижче наведено типовий протокол.

1. / c внутрибрюшинно вводят зараженные РСВ клетки. Мишам лінії Balb / c внутрішньочеревно вводять заражені РСВ клітини. Через 10 діб. інокуляцію повторюють.

2. 1 1640, забуференной бикарбонатом натрия и содержащей пенициллин, гентамицин, пируват натрия, L -глютамин и ЭТС. Селезінки імунізованих мишей суспендують у середовищі RPM січня 1640, забуференной бікарбонатом натрію і містить пеніцилін, гентаміцин, піруват натрію, L-глютамін і ЕТС.

3. / c NS 1/1, выращиваемой в той же среде. Клітини селезінки імунізованих мишей зливають з клітинами мишачої мієломи, наприклад Balb / c NS 1 / 1, вирощуваної в тому ж середовищі. При цьому змішують 3-10 ⁷ клітин селезінки з такою ж кількістю клітин мієломи. и 1 мин выдерживают при 37 °С. Клітини центрифугують 10 хв при 200 g і 1 хв витримують при 37 ° С. Для злиття клітин по краплях додають 1 мл 50%-ного ПЕГ 4000 з 5% ДМСО.

4. Суспензію інкубують 90 з при 37 ° С і зупиняють процес злиття, додаючи 20 мл середовища.

5. Клітини осаджують центрифугуванням і промивають середовищем. Осад ресуспендіруют в середовищі ГАТ і розподіляють по плоскодонним лунках планшета для імунологічних реакцій.

6. Клітини інкубують на поживному шарі з макрофагів, підготовленому за добу до злиття, кожна лунка повинна містити 10 "перитонеальних макрофагів здорової миші.

7. Через 6 діб після початку інкубації в кожну лунку вносять по 50 мкл середовища ДАТ.

8. с антигенами РСВ. Через 9-12 діб після злиття перевіряють активність і специфічність продукуються антитіл методом ELISA з антигенами РСВ.

9. Гібридоми, продукують специфічні антитіла, клонують методом граничного розведення в планшеті для імунологічних реакцій, використовуючи макрофаги або клітини селезінки як фідера. Клонування проводять двічі. Гібридоми вважають стабільними, якщо 95% клонів продукують специфічні антитіла.

4.2 Виділення температурно-чутливих мутантів

Для аналізу функцій генів і біохімічних досліджень корисно мати температурно-чутливі мутанти вірусу. Їх виділяють наступним чином.

- C -1, выращенных в чашке Петри диаметром 50 мм или во флаконе с завинчивающейся крышкой емкостью 30 мл, заражают РСВ дикого типа с множественностью инфекции 0,01 БОЕ/кл. 1.10 ⁶ клітин BS - C -1, вирощених у чашці Петрі діаметром 50 мм або у флаконі з кришкою, що загвинчується ємністю 30 мл, заражають РСВ дикого типу з множинністю інфекції 0,01 БОЮ / кл. Адсорбцію проводять 1 год при 31 ° С.

2. Вірус відмивають двома змінами середовища і додають 3 мл середовища Ігла, що містить 2,5% ЕТС і мутаген.

3. Культуру інкубують при 31 ° С до прояву ЦПД в контрольній зараженої культури, до якої мутаген не додавали.

4. Розведення культуральної рідини з оброблених мутагеном культур титрують методом бляшок після освітлення, але без заморожування і відтавання. Для цього на клітини наносять необхідні розведення і інкубують клітини, під 0,9%-ним Агаровим покриттям 5-7 діб при 31 ° С.

5. Вірус з отриманих індивідуальних бляшок нарощують, переносячи бляшки пастерівською піпеткою на свіжі моношарова культури.

6. Проводять скринінг отриманих ізолятів вірусу на здатність давати бляшки при 31 і 39 ° С. Для цього заражені чашки інкубують паралельно при кожній температурі. Альтернативний метод полягає в прямому скринінгу бляшок, утворених вірусом, обробленим мутагеном. Для цього 2 чашки з культурою, покритої шаром 0,9%-ного агару товщиною 2 мм, ділять на сектори і в кожний сектор поміщають 1 бляшку., Після адсорбції протягом 30 хв при 31 ° С заливають другий шар агарового покриття. Після цього одну чашку інкубують при 31 ° С, а іншу при 39 ° С. Із секторів, де бляшки утворюються при 31 ° С, але не при 39 ° С, їх вилучають для додаткової перевірки.

Температурно-чутливі мутанти можна підрозділити на функціональні групи за допомогою тесту комплементації, фактори, що впливають на комплементації, детально вивчені.

Як і для інших вірусів з негативною полярністю РНК і несегментірованное геномом, рекомбінація між температурно-чутливими мутантами РСВ, що належать до однієї або до різних груп комплементації, не описана.

4.3 Отримання персистентно інфікованих клітинних культур

Персистентной інфекції культур клітин при повній відсутності ЦПД або мінімальному його прояві можна домогтися декількома способами. Одним з них є пасивування вірусу з високою множинністю інфекції і пересівши виживають клітин. Інші методи включають зараження частково стійких клітин у присутності противірусних антитіл або інтерферону. Для отримання персистентно інфікованих культур можна інкубувати клітини, заражені температурно-чутливими мутантами РСВ при частково обмежує розмноження температурі для придушення ЦПД. Такі культури після встановлення персистенції підтримують при тій же температурі. Вихід досвіду залежить від конкретних властивостей використовуваного мутанта. Температурно-чутливі мутанти комплементаціонной групи В, які продукують при Неразрешающаяся температурі лише невелика кількість антигену, не підходять для даної мети, оскільки дають або абортивну, або літичну інфекцію. , синтезирующие при неразрешающей температуре значительное количество антигена, воспроизводимо дают персистентно инфицированные культуры, которые можно пассировать неограниченное число раз. З іншого боку, мутанти групи D, синтезують при Неразрешающаяся температурі значну кількість антигену, відтворено дають персистентно інфіковані культури, які можна пасерувати необмежену кількість разів. . Персистентно інфіковані культури служать хорошим джерелом вірусного антигену для проведення аналізу за методом ELISA.