Біфункціональність алкілуючі сполуки (сірчаний і азотний іприт, мітоміцін C) своїми двома алкільними групами можуть алкилироваться відразу два гуаніну з двох комплементарних ниток ДНК, утворюючи при цьому внутрішньомолекулярних зшивання.
Такі зшивання - типовий результат впливу на ДНК також азотистої кислоти та її солей.
Як видно, більшість первинних змін в ДНК, що викликаються мутагенами, самі по собі ще не мутації, тобто не є змінами в послідовності нуклеотидів. Ця послідовність може бути змінена тільки після проходження пошкодженої молекули через етап реплікації. Так, при реплікації молекули, в одну з ниток якої вбудована молекула акридинового барвника, проти цієї пошкодженої нитки будуватися комплементарна їй ланцюжок, що містить зайвий нуклеотид, вставлений проти місця, де в пошкодженій ланцюга інтеркальований молекула акридину. Така вставка нуклеотиду, закріплюються в обох нитках молекули після ще однієї реплікації - це вже мутація, що позначається як "зсув рамки зчитування" (frame shift). Зшивання в молекулі ДНК зазвичай летальні, тому що не дозволяють здійснювати нормальну реплікацію через неможливість розплітання ниток у місці зшивання. (Смирнов В.Г. 1991).
Проте в роботах Р. Кімбол (R. Kimball, 1966) вказувалося, що клітина здатна до репарації пошкоджень у ДНК, викликаних дією мутагенів.
У більшості випадків первинних ушкоджень після першої ж реплікації (якщо вони не були репарірованни до реплікації) навпроти них у знову синтезованої нитки ДНК з'являється пролом. Ю.А. Митрофанов і Г.С. Олімпіенко (1980) саме стан такого розриву в одній з комплементарних ниток ДНК і вважають потенційним пошкодженням, яке за одних умов може бути репарирувати, а при інших - перетворюється на двунітевих розрив у молекулі ДНК (хроматидного розрив).
A. Bender з співавторами (Bender et al., 1973) вважають, що при розриві в одній з ниток двунітевой молекули ДНК неушкоджена нитка може розрізатися навпаки розриву ДНК-Азою, специфічною для однониткових ДНК.
Вважається, що такий механізм матеріалізує ідею резонансного мутагенезу - переносячи пошкодження з пошкодженої нитки на неушкоджену.
На думку Смирнова В.Г. (1991) обмінні перебудови при впливі самими різними мутагенами виникають завдяки одному і тому ж механізму, що характеризується возз'єднанням решт з'являються розривів. Умовою цього є тісна просторова асоціація між ділянками хроматид однієї хромосоми або різних хромосом. При наявності такої асоціації виникають у хроматида розриви возз'єднуються подібно до того, як це відбувається при кросинговері (Бєляєв І.Я., Акиф А.П., 1988).
Різні дослідники неодноразово звертали увагу на схожість між процесом кросинговеру і утворенням обмінних перебудов при контакті хроматид. Вперше таку думку висловили А.С. Серебровський і Н.П. Дубінін (1929), а потім "Обмінну гіпотезу" про механізм виникнення перебудов запропонував С. Рівеллі (S. Revell, 1955, 1974). Результати, отримані І.Я. Бєляєвим і А.П. Акіфьевим (1988), свідчать про плідність зіставлення цих двох процесів.
Асоціації, між ділянками хроматид однієї хромосоми або різних хромосом, можуть встановлюватися між районами хромосом, що містять високоповторяющіеся послідовності ДНК. Такі послідовності зосереджені в гетерохроматинових районах хромосом - у прицентромерного і інтерколярном структурному гетерохроматин. Саме для гетерохромотінових районів неодноразово описані цитологічно спостережувані асоціації не гомологічних хромосом.
Освіта хромосомних аберацій можливо не тільки на основі рекомбінації в районах локалізації високоповторяющіхся не кодують послідовностей ДНК, але і на основі рекомбінації між повторюваними генами, при наявності дублікація в геномі.
Так само основою для виникнення хромосомних перебудов по рекомбінаційну механізму може бути присутність в геномі значного числа копій різних мобільних елементів (Смирнов В.Г. 1991).
Питання про механізм виникнення хромосомних перебудов почало активно обговорюватися відразу ж після встановлення можливості індукувати, посилити мутаційний процес при впливі такого можливого чинника, як різні види іонізуючих випромінювань (Г. А. Карсон, Г. С. Філіппов, 1925; Н. Міллер, 1927 ; L. Stadler, 1928).
А. Стадлер (L. Stadler, 1928) і М.С. Навашин (1931) вважали, що первинний ефект в дії Х-променів на хромосоми - виникнення розривів. Це положення легко в основу широко відомої гіпотези про механізм виникнення індукованих хромосомних перебудов, створеної в роботі К. Сакса (K. Sax, 1938-1942) і Д. Лі (D. Lea 1963, D. Catcheside 1942). У залежності від стадії клітинного циклу виникають або хромосомні (при опроміненні в період G1 до фази S), або хроматидного (при опроміненні у фазах S і на початку G2) розриви. Велика їх частина потім знову возз'єднується з відновленням початкової структури (реституція). Однак якщо розриви в різних місцях однієї хромосоми (або хроматиди) або в різних хромосомах (або хроматида) в один і той же момент локалізується близько один до одного, вони можуть возз'єднається таким чином, що виникають хромосомні або хроматидного делеції (брак), транслокації, інверсії, вставки, утворюються Центромерна або бесцентромерние кільцеві хромосоми, бесцентромерние фрагменти. Окремі фрагменти, що з'явилися відразу в результаті виникнення розривів, можуть зберігатися як такі і без возз'єднання з будь-якими іншими.
Досить скоро були отримані переконливі дані про можливої ​​модифікації мутагенного ефекту випромінювань завдяки дії додаткових факторів (температура, інфрачервоне світло, зниження концентрації кисню), з яких кожен сам по собі не чинив вплив на спонтанний рівень мутаційного процесу. Так у дослідах К. Свенсона і А. Холлендера (C. Swenson, A. Hollaender, 1946) було показано, що обробка мікроспор традесканції інфрачервоним світлом до або після опромінення Х-променями приводить до значного збільшення частоти як хроматидного делецій, так і міжхромосомними перебудов , причому в максимальній мірі цей ефект інфрактасних променів був виражений при температурі 12 градусів С і зменшувався при більш низькій температурі.
Досліди такого роду змусили припустити, що іонізуюче опромінення викликає не тільки розриви хромосом, а й деякі предмутаціонние, потенційні зміни в них, які при додатковому впливі слабкіше діючих факторів можуть реалізуватися в додаткові розриви і перебудови (Смирнов А.Г. 1991).
1.1.4. Принципи обліку хромосомних аберацій на стадії метафази і загальні рекомендації до нього.
Пофарбований препарати починають аналізувати під невеликим збільшенням мікроскопа, чим досягається загальна оцінка препарату, а саме мітотичну активність і наявність метафазних пластинок. Для аналізу хромосом потрібно Імерсійний об'єктив.
При проведенні метафазної аналізу можливі два підходи до обліку хромосомних аберацій: з каріотипуванням метафазної пластинки і без каріотипування. Перший підхід найбільш точний, але він трудомісткий і може бути застосований у спеціальних дослідженнях (наприклад, при вивченні розподілу ушкоджень за групами хромосом, по довжині окремих хромосом). Другий підхід найбільш уживаний і дешевий при швидкому вирішенні питання (Priest, 1969). Так, наприклад, при оцінці мутагенності факторів зовнішнього середовища досить враховувати хромосомні аберації без каріотипування.
При аналізі обміну найбільш повна інформація включає відповіді на наступні питання:
1) кількість задіяних в обмін хромосом і хроматид;
2) симетричність транслокацій (еу - або анеуцентрічность);
3) реціпроктность (повнота);
4) гомологічного залучених в обмін хромосом та їх ідентифікація;
5) порівняльна величина учасників при транслокації між гомологічними хромосомами.
При аналізі кожної аберації необхідно пам'ятати про один факт: гомологічні ділянки сестринських хроматид взаємно притягуються незалежно від їх переміщення.
Розпізнавання парних ацентріческіх фрагментів зазвичай не викликає труднощів. Вони можуть бути дуже маленькими, ледве помітними і дуже довгими палочнообразнимі структурами, що лежать, як правило, паралельно один одному за рахунок тяжіння сестринських хроматид. Вважають, що вони являють собою кінцеві делеції. Іноді можна спостерігати дуже довгі фрагменти, що утворилися за рахунок злиття ацентріческіх ділянок двох хромосом. Ці випадки повинні відзначатися особливо, якщо в клітинах не було діцентріков, оскільки мова йде про пошкодження двох хромосом з неповним обміном. Ацентріческіе фрагменти практично ніколи не лежать поруч і на тій же осі з фрагментованою хромосомою. Завдяки цьому їх легко відрізнити від ізохроматідних обмінів.
"Точкові" фрагменти - парні округлі утворення, без просвіту в середині, інтенсивно забарвлені, діаметр не менше, ніж поперечник хроматиди.
Обидві "точки" лежать поруч за рахунок тяжіння сестринських хроматид. Якщо фрагменти мають довжину або діаметр більше, ніж поперечник хроматиди, то вважають, що це інтерстиціальний невелику ділянку хромосоми, замкнувшийся в маленьке ацентріческіе кільце. Якщо фрагменти мають довжину або діаметр менше поперечника хроматиди, то такі постаті відносять до парних фрагментів. Слід, однак, відзначити, що строгих доказів такого розподілу немає.
Ацентріческіе кільця можуть бути легко розпізнані при їх хорошому распластиваніі на склі. Іноді вони розташовуються боком. У цих випадках для них характерні овальна форма і відсутність просвіту. Обидва сестринських кільця лежать поруч часто з накладенням одного на інше в силу тяжіння ідентичних ділянок сестринських хроматид.
Кільцеві хромосоми є замкнутими структурами, що включають ділянки більшою чи меншою величини обох плечей. Вони відносяться до групи внутріхромосомних обмінів між двома плечима. При великій кількості пошкоджень можуть утворюватися і діцентріческіе кільцеві хромосоми.
Точний аналіз хромосомних аберацій вимагає правильно відбирати клітини для дослідження і вони повинні відповідати наступним вимогам:
1) Всі хромосоми повинні бути добре фарбують і рівномірно розкидані.
2) Не допускається наявність кількох випадкових хромосом в полі зору.
3) Рівень конденсації хромосом повинен знаходиться в наступних межах:
max - малі акроцентричні хромосоми видно у вигляді чітко виражених структур, а не у вигляді точок, тому що в такому разі їх легко можна прийняти за точкові фрагменти;
min - хромосоми розділені на дві хроматиди лежать окремо один від одного.
4) Не допускається наявність у метафазних пластинках хромосом, що увійшли а анафазу, тому що їх важко отдіффіренціровать від парних фрагментів.
5) Не допускається аналіз метафазних пластинок з великою кількістю накладень хромосом, особливо поздовжніх, тому що в таких випадках можна визначити більшу кількість обмінних аберацій, ніж є в дійсності.
6) З-за технічних маніпуляцій можливі втрати хромосом в пластинці. Зазвичай при обліку хромосомних аберацій допускається аналіз клітин з числом хромосом від 44 до 47 (Бочков, 1971).
Дані цитогенетичних досліджень заносять в спеціальні бланки-протоколи, де відрізняють число хромосом, загальне
число проаналізованих клітин, число клітин з абераціями, загальне число аберацій, типи аберацій, а також замальовки аберацій і їхні координати.
 
1.2. Спонтанний хромосомний мутагенез.
 
Підрозділ хромосомних аберацій на спонтанні та індуковані є чисто умовними. Так як виникнення будь-якої аберації обумовлено певними мутагенними чинниками. Про спонтанних хромосомних абераціях говорять у тих випадках коли точна причина їх виникнення невідома.
Закономірності спонтанних хромосомних аберацій досить повно вивчені в лабораторії мутагенезу Інституту медичної генетики АМН на основі досліджень 531 культури лімфацітов переферической крові 437 здорових осіб різного віку та статі (Бочков та ін, 1972).
Нижче наведені основні параметри спонтанних хромосомних аберацій в лімфацітах крові людини. При дослідженні більше 60 тис. клітин виявлено, що середня частота клітин з хромосомними абераціями становить 1,2%, а число аберацій на клітку не перевищує 0,0124. Порівняння цих показників у осіб різного віку та статі не виявило істотних коливань, тобто частота спонтанних хромосомних аберацій знаходиться в одних і тих же межах у індивідів чоловічої і жіночої статі у віці від 0 до 70 років. Серед виявлених аберацій більше 90% склали ацентріческіе фрагменти (одиночні і парні). Обмінні аберації склали близько 6-8%. Розподіл досліджених культур за частотою клітин з хромосомними абераціями виявився таким: з 527 вивчених культур 30,4% були без аберацій, 38,1% мали по одній аберрантной метафазі і однієї хромосомної аберації, 19,9% - по дві, 8,3% - по три, 2,1% - по чотири, 0,4% - по п'ять, 0,6% - по шість, 0,2% - по сім. Таким чином, 96,7% досліджуваних культур лімфоцитів від здорових осіб мали частоту аберантних клітин та хромосомних аберацій у межах від 0 до 3. Цей розподіл культур відповідає теоретичному розподілу Пуассона, на підставі чого можна зробити висновок про те, що максимальний рівень клітин з хромосомними абераціями в культурі лімфоцитів людини в нормі не перевищує 3% (Захаров А.Ф., 1992).
Деякі автори спостерігали у окремих індивідів з контрольних вибірок клітини з незвичайно великою кількістю хромосомних аберацій. Інтерпретація таких знахідок не може бути однозначною, оскільки дія мутагенних факторів важко оцінювати ретроспективно. Це могло бути дію вірусу, хімічної речовини, опромінення чи це могло бути результат спонтанного мутагенного процесу (Бочков, 1989).
1.3. Специфічність та особливості хімічного мутагенезу.
Пріоритет відкриття більшості відомих в даний час мутагенів, в тому числі і найбільш ефективних, широко використовуваних у всьому світі, - формальдегіду, уретану, етиленіміну, окису етилену, діетілсульфата, діметілсульфата - належить радянському генетику І.А. Рапопорту.
Дослідження показали, що хімічні мутагени на кілька порядків перевищують активність радіації, часто володіють значно більш специфічними і більш тонким дією на клітину (Рапопорт І.А, 1966).
В даний час список хімічних мутагенів налічує десятки речовин за кількістю головних функціональних центрів і десятки в розрахунку на їх похідні, разом з тим накопичуються нові відомості про тонкощі дії мутагенів, тому систематика їх заснована на особливостях хімічної будови, взаємодії з генетичним матеріалом, своєрідності біологічного ефекту , представляє певні труднощі.
У класифікації, яка знайшла найбільш широке поширення, розрізняють п'ять основних груп мутагенів:
1. інгібітори синтезу попередників нуклеїнових кислот.
2. аналоги азотистих основ.
3. алкілуючі сполуки (зі всіх виявлених на сьогоднішній день мутагенів вони вважаються найбільш сильними).
4. окислювачі, відновники, вільні радикали.
5. акридинового барвники.
Шкідливе генетичне дію хімічних препаратів трудноуловимо-спроби оцінити генетичну небезпеку хімічних речовин, що знаходяться в навколишньому середовищі, наштовхуються на дуже серйозні труднощі.
Незліченна безліч хімічних мутагенів по різному взаємодіють з молекулою ДНК. Спектри їх біологічної дії різні. Хоча і виявляють часткове перекривання (Фогель, 1990).
Хімічні мутагени проходять через метаболістіческую систему організму і самими непередбачуваними шляхами перетворюються на інші сполуки. При цьому вони можуть втратити свою мутагенну активність, а можуть придбати такі мутагенні властивості, які були відсутні у вихідного з'єднання. Особливу небезпеку становлять не мутагенні хімічні речовини, які, включившись в метаболізм, перетворюються на мутагени. Інші труднощі пов'язані з поглинанням, розподілом по різних системах органів і виділенням, або якщо виділення не можливо, накопиченням цих речовин (Ауербах, 1978).
Хімічні мутагени можуть проявляти вузьку специфічність щодо організмів і навіть клітин одного і того ж організму (вперше ідея про специфічність дії мутагенів була сформульована І. А. Рапопорт).
Хімічні агенти, які мутагени для тест - об'єкту, не обов'язково виявляться мутагенними для людини. І навпаки, речовини, що не викликають мутації в контрольних дослідах, можуть викликати їх після метаболістіческіх перетворень (Ауербах, 1978).