ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ
Введення
Генну інженерію становить сукупність різних експериментальних прийомів (методик), що забезпечують конструкцію (реконструкцію) і клонування молекул ДНК (генів) з заданими цілями.
Методи генної інженерії використовують у певній послідовності, причому розрізняють кілька стадій у виконанні типового генно-інженерного експерименту, спрямованого на клонування будь-якого гена, а саме:
1. Виділення ДНК з клітин цікавить організму (вихідного) і виділення ДНК-вектора.
2. Розрізання (рестрикція) ДНК вихідного організму на фрагменти, що містять питання, що цікавлять гени, за допомогою одного з ферментів-рестриктаз і виділення цих генів з освіченої рестрикційної суміші. Одночасно розрізають (рестрікцііруют) векторну ДНК, перетворюючи її з кільцевої структури в лінійну.
3. Змикання цікавить сегмента ДНК (гена) з ДНК вектора з метою отримання гібридних молекул ДНК.
4. Введення гібридних молекул ДНК шляхом трансформації в будь-який інший організм, наприклад, в Є. coli або в соматичні клітини.
5. Висів бактерій, в які вводили гібридні молекули ДНК, на живильні середовища, що дозволяють зростання тільки клітин, що містять гібридні молекули ДНК.
6. Ідентифікація колоній, що складаються з бактерій, що містять гібридні молекули ДНК.
7. Виділення клонованої ДНК (клонованих генів) та її характеристика, включаючи секвенування азотистих основ у клонованій фрагменті ДНК.
ДНК (вихідна і векторна), ферменти, клітини, в яких клонують ДНК - все це називають «інструментами» генної інженерії.
Введення
Генну інженерію становить сукупність різних експериментальних прийомів (методик), що забезпечують конструкцію (реконструкцію) і клонування молекул ДНК (генів) з заданими цілями.
Методи генної інженерії використовують у певній послідовності, причому розрізняють кілька стадій у виконанні типового генно-інженерного експерименту, спрямованого на клонування будь-якого гена, а саме:
1. Виділення ДНК з клітин цікавить організму (вихідного) і виділення ДНК-вектора.
2. Розрізання (рестрикція) ДНК вихідного організму на фрагменти, що містять питання, що цікавлять гени, за допомогою одного з ферментів-рестриктаз і виділення цих генів з освіченої рестрикційної суміші. Одночасно розрізають (рестрікцііруют) векторну ДНК, перетворюючи її з кільцевої структури в лінійну.
3. Змикання цікавить сегмента ДНК (гена) з ДНК вектора з метою отримання гібридних молекул ДНК.
4. Введення гібридних молекул ДНК шляхом трансформації в будь-який інший організм, наприклад, в Є. coli або в соматичні клітини.
5. Висів бактерій, в які вводили гібридні молекули ДНК, на живильні середовища, що дозволяють зростання тільки клітин, що містять гібридні молекули ДНК.
6. Ідентифікація колоній, що складаються з бактерій, що містять гібридні молекули ДНК.
7. Виділення клонованої ДНК (клонованих генів) та її характеристика, включаючи секвенування азотистих основ у клонованій фрагменті ДНК.
ДНК (вихідна і векторна), ферменти, клітини, в яких клонують ДНК - все це називають «інструментами» генної інженерії.
Виділення ДНК
Розглянемо методику виділення ДНК на прикладі ДНК плазмід. ДНК з плазмідосодержащіх бактеріальних клітин виділяють за допомогою традиційної техніки, що полягає в отриманні клітинних екстрактів у присутності детергентів і наступному видаленні з екстрактів білків фенольної екстракцією Повне очищення плазмідної ДНК від білків, РНК та інших сполук проводиться в кілька стадій. Після того як клітини зруйновані, наприклад, за допомогою лізоциму (розчинені їх стінки), до екстракту додають детергент, щоб розчинити мембрани і інактивувати деякі білки. Більшість хромосомної ДНК видаляють з одержуваних препаратів звичайним центрифугуванням.
Часто для повного очищення використовують хроматографію. Якщо потрібно дуже ретельне очищення, використовують високошвидкісне центрифугування в градієнті щільності CsCI з використанням етидію броміду. Залишилася, хромосомна ДНК буде фрагментована в лінійну, тоді як плазмідна ДНК залишиться ковалентно закритою. Оскільки етидій бромід менш щільний, ніж ДНК, то при ультрацентрифугирование в центріфужний пробірці буде «викручуватися» два кільця - плазмідна ДНК і хромосомна ДНК плазмідну ДНК відбирають для подальшої роботи, хромосомну ДНК викидають.
Ферменти-рестриктаз і рестрикція ДНК
У ході еволюції бактерії розвинули здатність синтезувати так звані рестріцірующіе ферменти (ендонуклеази), які стали частиною клітинної (бактеріальної) системи рестрикції-модифікації. У бактерій системи рестрикції-модифікації є внутрішньоклітинної імунною системою захисту від чужорідної ДНК. На відміну від вищих організмів, у яких розпізнання і руйнування вірусів, бактерій та інших патогенів відбувається внеклеточно, у бактерій захист від чужорідної ДНК (ДНК рослин і тварин, в організмі яких вони мешкають) відбувається внутрішньоклітинно, тобто тоді, коли чужорідна ДНК проникає в цитоплазму бактерій. З метою захисту бактерії в ході еволюції розвинули також здатність «мітити» власну ДНК метіліруют підставами на певних послідовностях. З цієї причини чужорідна ДНК через відсутність в ній метальних груп на тих же послідовностях плавиться (розрізається) на фрагменти різними бактеріальними рестріктазами, а потім деградує бактеріальними екзонуклеазами до нуклео-тідов. Можна сказати, що таким чином бактерії захищають себе від ДНК рослин і тварин, в організмі яких вони мешкають тимчасово (як патогени) або постійно (як сапрофіти).
Рестріктази вперше були виділені з Є. coli у 1968 р-Виявилося, що вони здатні розрізати (плавити) молекули ДНК на різних сайтах (місцях) рестрикції. Ці ферменти отримали назву ендонуклеаз класу I. Потім у бактерій були виявлені ендонуклеази класу II, які розпізнають у чужорідної ДНК сайти рестрикції специфічно і на цих сайтах теж здійснюють рестрикцій. Саме ферменти цього класу стали використовувати в генній інженерії. Тоді ж були відкриті ферменти класу III, які плавлять ДНК поруч з сайтами розпізнання, але ці ферменти не мають значення в генній інженерії.
Дія системи рестрикції-модифікації «раціоналізуется» так званими паліндромний (розпізнають послідовностями) азотистих основ, які є сайтами рестрикції ДНК. Паліндромний послідовності - це послідовності підстав, які однаково читаються вперед і назад, як, наприклад, послідовність літер радар. Оскільки ланцюга ДНК володіють антипаралельних напрямком, то вважають, що послідовність є паліндромний, якщо вона ідентична, коли читається в напрямку від 5'-до 3'-кінця на верхній і 3'-к о'-кінця на нижній ланцюга, а саме:
Паліндроми можуть бути будь-яких розмірів, але більшість тих паліндромів, які використовують в якості сайтів впізнавання рестріктазами, складаються з 4, 5, 6 і рідше 8 підстав.
Рестріктази - це абсолютно необхідний інструмент в генній інженерії для вирізування цікавлять фрагментів (генів) з великих молекул ДНК. Оскільки відомо більше 100 ферментів рестрикції, то це дозволяє вибір рестриктаз і селективне вирізання фрагментів з початкової ДНК.
Чудовою особливістю рестріктаа є те, що вони продукують розрізи молекул на декілька фрагментів (рестрік-тов) ДНК уступами, в результаті чого в утворюються кінцях один ланцюг довше іншої, утворюючи своєрідний хвіст. Такі кінці (хвости) отримали назву «липких» кінців тому що вони здатні до самокомплементарна.
Розглянемо результати рестрикції на прикладі однієї з найбільш відомих рестриктаз Eco RI з системи рестрикція-модифікація Є. coli. Замість того, щоб плавити ДНК в центрі па-ліндромной послідовності впізнавання, цей фермент плавить ДНК за межами центру та продукує 4 самокомплементарна («липких») кінця, що складаються з різної кількості нуклео-тідов, а саме:
Ці «липкі» кінці у генно-інженерних дослідах корисні з тієї причини, що вони можуть бути возз'єднані комплементарно при низьких температурах, що дозволяє ефективне змикання ДНК-фрагментів.
Сайти розпізнання та сайти плавлення у випадку інших рестриктаз мають інший зміст, а саме:
Слідом за рестрикцій ДНК з рестрикційної суміші виділяють рестрикційний ДНК-фрагменти (ДНК-рестрікти), які необхідні потім для об'єднання з вектором. Для виділення ДНК-рестріктов вдаються до електрофорез, оскільки за допомогою цього методу рестрікцірованную ДНК дуже легко фракціонований завдяки розмірам фрагментів-рестріктов і завдяки константним відносинам електричний заряд-маса. Фрагменти в електричному полі мігрують в ході електрофорезу при частоті, залежною від їх розмірів (маси). Чим більше (довше) фрагмент, тим повільніше він мігрує в електричному полі. Матеріалом, в якому проводять електрофорез, є незаряжающіеся агар-за і поліакриламід. Для впізнання фрагментів використовують ці-дій бромід, який фарбує фрагменти, що веде до їх більш легкому виявленню
Результативність електрофорезу дуже висока, оскільки з його допомогою можуть бути розділені фрагменти, розміри яких становлять від 2 до 50 000 підстав.
Після електрофорезу фрагменти з агарози виділяють з допомогою різних методів. На підставі результатів порівняння розмірів рестріктов однієї і тієї ж ДНК, отриманих за допомогою різних рестриктаз, будують рестрикційний карти, на яких показують сайти рестрикції кожної з використаних рестриктаз У практичному плані рестрикційний карти дозволяють визначати не тільки розміри рестріктов, а й з'ясовувати розташування в молекулах ДНК локусів тих чи інших генів.
Оскільки у вищих організмів у ході транскрипції синтезується гетерогенна ДНК, коректовані процесингом, то в генній інженерії зазвичай використовують комплементарную ДНК (кДНК), яку отримують при використанні в якості матриці мРНК, на якій зворотна транскриптаза синтезує одноланцюжкову ДНК (кДНК), що є копією мРНК. У подальшому ці одноланцюгові ДНК перетворюють на дволанцюжкові ДНК. Вважають, що кДНК містить безперервні нуклеотидні послідовності (транскрибуються і трансльовані). Саме кДНК використовують для рестрикції.
Виділені після електрофорезу з агарозного гелів фрагменти ДНК (рестрікти) можна заздалегідь піддати секвені-вання, тобто визначити в них нуклеотидну послідовність. Для цього використовують хімічний та ферментативний методи сек-Веніровані.
Хімічний метод грунтується на отриманні мічених радіоактивним фосфором (32Р) фрагментів і видаленні з цих фрагментів однієї з підстав з наступним урахуванням результатів радіоавтографіі гелів, що містять ці фрагменти. Ферментативний метод заснований на тому, що в кінець аналізованого фрагмента вводять нуклеотид, який використовується потім у синтезі різних фрагментів in vitro, аналізованих на нуклеотидну послідовність електрофоретичної. Для вивчення специфічних послідовностей нуклеотидів в молекулі ДНК використовують також гібридизацію ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК, Нозерн-та Саузерн-блот.
Генетичні вектори
Сегмент ДНК (ген), який призначений для молекулярного клонування, повинен мати здатність до реплікації при перенесенні його в бактеріальну клітину, тобто бути реплікону. Однак він такою здатністю не володіє. Тому, щоб забезпечити перенесення і виявлення клонованої генів у клітинах, їх об'єднують з так званими генетичними векторами. Останні повинні мати, як мінімум, двома властивостями. По-перше, вектори повинні бути здатні до реплікації в клітинах, причому в кількох копіях. По-друге, вони повинні забезпечувати можливість селекції клітин, що містять вектор, тобто володіти маркером, на який можна вести контрселекцію клітин, що містять вектор разом з клонованої геном (рекомбінантні молекули ДНК). Таким вимогам відповідають плазміди і фаги. Плазміди є хорошими векторами з тієї причини, що вони є реплікону і можуть містити гени резистентності до якого-небудь антибіотика, що дозволяє вести селекцію бактерій на стійкість до цього антибіотика і, отже, легке виявлення рекомбінантних молекул ДНК.
Оскільки природні плазмідні вектори невідомі, то всі відомі до теперішнього часу плазмідні вектори були сконструйовані штучно. Вихідним матеріалом для створення ряду генетичних векторів послужили R-плазміди, в яких за допомогою рестриктаз видаляли зайві послідовності ДНК, у тому числі ті, на яких розташовувалися множинні сайти рестрикції. Це видалення визначалося тим, що плазмідний вектор повинен володіти тільки одним сайтом впізнавання для однієї рестриктаз, причому цей сайт повинен лежати у функціонально несуттєвому районі плазмідної геному. Наприклад, плазмідний вектор pBR 322, який містить гени резистентності до ампіциліну і тетрацикліну, що робить його дуже зручним для селекції бактерій, що містять клонованої сегмент ДНК, має одиночними сайтами рестрикції для понад 20 ферментів-рестриктаз, включаючи такі відомі рестриктаз, як Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II і Sal I
Фагових вектори теж мають ряд переваг. Вони можуть включати в себе більші (довші) клонованої фрагменти ДНК порівняно з плазмідними векторами. Далі, перенесення фагами клонованого фрагмента в клітини в результаті ін-фіцірованія ними останніх є більш ефективним, ніж трансформація ДНК. Нарешті, фагових вектори дозволяють більш ефективний скринінг (розпізнання) на поверхні агару колоній, що містять клітини, які несуть клонованої ген. Багато фагових вектори сконструйовані на базі фага лямбда.
Крім фагових використовують і інші вірусні вектори, сконструйовані на базі вірусу герпесу, а також вектори, сконструйовані на базі дріжджовий ДНК.
Якщо клонування генів проводять, використовуючи клітини ссавців або рослин, то вимоги до векторів ті ж, що й у випадку клонування в бактеріальних клітинах.
Конструювання рекомбінантних молекул ДНК
Безпосереднє конструювання рекомбінантних молекул ДНК слід після того, як отримані рестрікти досліджуваної ДНК і векторної ДНК. Воно полягає в змиканні сегментів-рест-рікти досліджуваної ДНК з рестріктом векторної ДНК, яка в результаті рестрикції перетворюється з кільцевої в лінійну ДНК.
Щоб зімкнути фрагменти досліджуваної ДНК з ДНК-вектора, використовують ДНК-лігази Лігированіє буде успішним, якщо стуляються структури мають 3'-гідроксил і 5-фосфатної групами і якщо ці групи розташовані відповідним чином одна відносно іншої. Фрагменти об'єднуються через їх «липкі» кінці у результаті са-мокомплементарності. При високих концентраціях фрагментів останні час від часу стають у правильне положення (навпроти один одного). Багато ре-стріктази, такі як Eco RI, продукують «липкі» кінці, що складаються з 4-х підстав. Процес лігування «липких» кінців, що складаються з чотирьох основ, відбувається при зниженій температурі (до 12 ° С).
Якщо при рестрикції утворюються фрагменти без «липких» кінців, то їх «насильно» конвертують в молекули з «липкими» кінцями, використовуючи фермент трансферазу. Цей фермент додає нуклеотиди до 3'-кінця ДНК. На одному фрагменті може бути доданий полі-А-хвіст, на іншому - полі-Т-хвіст. Для генерації будь-яких бажаних решт ДНК використовують також так звану полімеразну ланцюгову реакцію (ПНР). Принцип ПЛР заснований на денатурації виділеної з клітин ДНК і «відпалі» її з додаванням до ренатурірующімся ланцюгах ДНК-олігонуклеотидів, що складаються з 15-20 нуклеотидів кожен. Ці олігонуклеотиди повинні бути комплементарні послідовностей в цілях, розділених відстанями в 50-2000 нуклеотидів. Будучи «запалом» для синтезу ДНК in vitro, вони дозволяють ДНК-полімеразі копіювати ті ділянки, які знаходяться на межі "затравки». Це копіювання дає велику кількість копій досліджуваного фрагмента ДНК.
Введення рекомбінантного молекул ДНК у клітини
Після змикання цікавить фрагмента ДНК (гена) з генетичним вектором з допомогою ДНК-лігази освічені реком-бінантние молекули вводять в клітки з метою домогтися їх реплікації (за рахунок генетичного вектора) і збільшення кількості копій. Найбільш популярним способом введення в клітини рекомбінантних молекул ДНК, в яких вектором служить плазміда, є трансформація Є. coli. З цією метою бактеріальні клітини попередньо обробляють кальцієм або рубідій (іонами) для того, щоб вони стали «компетентними» у сприйнятті рекомбінантної ДНК.
Щоб підвищити частоту проникнення ДНК в клітини, використовують метод електропорації, що полягає в короткому експонуванні клітин в інтенсивному електричному полі. Ця обробка створює порожнини в мембранах клітин, що сприяє кращому сприйняттю клітинами ДНК-Після введення рекомбінантних молекул ДНК в бактерії останні висівають на МПА, збагачений антибіотиками для селекції бажаних клітин, тобто клітин, які містять рекомбінантні молекули ДНК. Частота трансформації є невисокою. Зазвичай один трансформант виникає на 106 висіяних клітин. Якщо ж вектор є фагів, то вдаються до трансфекції клітин (бактерій або дріжджів) фагом. Що стосується соматичних клітин тварин, то їх трансфекції здійснюють ДНК в присутності хімічних речовин, що полегшують проходження ДНК через плазматичні мембрани. Можливі також прямі мікроін'єкції ДНК в овоцити жаб, в культивовані соматичні клітини і в ембріони ссавців.
Найважливішим моментом, пов'язаним з молекулярним клоніро-ристанням, є пошук способу, що дозволяє встановити, чи дійсно клонованої фрагмент включився у вектор і разом з вектором, утворивши рекомбіновану молекулу ДНК, увійшов до клітки. Якщо мова йде про бактеріальних клітинах, то один із способів заснований на обліку інсерційного інактивації плазмідної (векторного) гена резистентності. Наприклад, в плазмідної векторі pBR322, що детермінує резистентність до ампіциліну і тетрацикліну, єдиний сайт для рестриктаз Pst I знаходиться в локусі, займаному геном резистентності до ампіциліну. Pst I-плавлення на цьому сайті генерує липкі кінці, що дозволяють лігування клонованого фрагмента з векторною ДНК. Однак при цьому плазмідний (векторний) ген ампіціллінрезіс-тентності інактивується, тоді як ген тетраціклінрезістентнос-ти на векторі залишається інтактним. Саме, ген тетраціклінрезіс-тентності і використовується для селекції клітин, що трансформують рекомбінантними молекулами ДНК. Щоб переконатися, що клітини колоній, що виросли на середовищі з тетрацикліном дійсно містять рекомбінантні молекули ДНК, їх перевіряють за допомогою так званого «спот-тесту» на парі чашок з щільною середовищем, одна з яких містить ам-піціллін, тоді як інша позбавлена цього антибіотика. Клонованої ДНК містяться лише в трансформанта, резистентних до тетрацикліну Що стосується трансформантів, резистентних одночасно до ампіциліну і тетрацикліну (Артс), то вони містять плазмідні (векторні) молекули, що спонтанно придбали кільцеву форму без включення до них чужорідної (клонованої) ДНК. Інший спосіб виявлення інсерцій чужорідних (клонованої) фрагментів в плазмідний вектор заснований на використанні вектора, що містить ген (3-га-лактозідази. Інсерцій чужорідної ДНК в цей ген неминуче інактивує синтез р-галактозидаза, що може бути виявлено посівом трансформованих клітин на середовище, яке містить субстрати р-галактозидази. Це середовище дозволяє селекцію забарвлених колоній клітин.
Як уже зазначено, рестрикційний лінійні фрагменти векторної ДНК здатні до відновлення кільцевої структури без включення до них клонованої сегментів. Щоб зменшити частоту спонтанного утворення таких кільцевих молекул векторної ДНК, рестрікти векторної ДНК обробляють фосфатазою. У результаті цього утворення кільцевих молекул ДНК стає неможливим, оскільки будуть відсутні кінці 5'-РО ^, необхідні для дії лігази.
Сукупність Колоцей-трансформантів, які виросли на селективної середовищі, являє собою сукупність клітин, що містять клони різних фрагментів (генів) клонованої геномної або кДНК. Колекції цих клонів формують так звані бібліотеки ДНК, широко використовуються в генно-інженерних роботах.
Заключною стадією клонування генів є виділення і дослідження клонованої ДНК, включаючи секвенування.
Перспективні штами бактерій або соматичних клітин, що містять рекомбінантні молекули ДНК, які контролюють синтез цікавлять білків, що мають комерційну цінність, передають у промисловість.
Список літератури
1. Біологія. У 2 кн. (Підручник) Під ред. В.Н. Яригіна (2003, 5-е вид., 432с., 3
2. Мікробіологія. (Підручник) Гусєв М.В., Мінєєва Л.А. (2003, 464с.)
3. Біологія з основами екології. (Підручник) Пехов А.П. (2000,
Розглянемо методику виділення ДНК на прикладі ДНК плазмід. ДНК з плазмідосодержащіх бактеріальних клітин виділяють за допомогою традиційної техніки, що полягає в отриманні клітинних екстрактів у присутності детергентів і наступному видаленні з екстрактів білків фенольної екстракцією Повне очищення плазмідної ДНК від білків, РНК та інших сполук проводиться в кілька стадій. Після того як клітини зруйновані, наприклад, за допомогою лізоциму (розчинені їх стінки), до екстракту додають детергент, щоб розчинити мембрани і інактивувати деякі білки. Більшість хромосомної ДНК видаляють з одержуваних препаратів звичайним центрифугуванням.
Часто для повного очищення використовують хроматографію. Якщо потрібно дуже ретельне очищення, використовують високошвидкісне центрифугування в градієнті щільності CsCI з використанням етидію броміду. Залишилася, хромосомна ДНК буде фрагментована в лінійну, тоді як плазмідна ДНК залишиться ковалентно закритою. Оскільки етидій бромід менш щільний, ніж ДНК, то при ультрацентрифугирование в центріфужний пробірці буде «викручуватися» два кільця - плазмідна ДНК і хромосомна ДНК плазмідну ДНК відбирають для подальшої роботи, хромосомну ДНК викидають.
Ферменти-рестриктаз і рестрикція ДНК
У ході еволюції бактерії розвинули здатність синтезувати так звані рестріцірующіе ферменти (ендонуклеази), які стали частиною клітинної (бактеріальної) системи рестрикції-модифікації. У бактерій системи рестрикції-модифікації є внутрішньоклітинної імунною системою захисту від чужорідної ДНК. На відміну від вищих організмів, у яких розпізнання і руйнування вірусів, бактерій та інших патогенів відбувається внеклеточно, у бактерій захист від чужорідної ДНК (ДНК рослин і тварин, в організмі яких вони мешкають) відбувається внутрішньоклітинно, тобто тоді, коли чужорідна ДНК проникає в цитоплазму бактерій. З метою захисту бактерії в ході еволюції розвинули також здатність «мітити» власну ДНК метіліруют підставами на певних послідовностях. З цієї причини чужорідна ДНК через відсутність в ній метальних груп на тих же послідовностях плавиться (розрізається) на фрагменти різними бактеріальними рестріктазами, а потім деградує бактеріальними екзонуклеазами до нуклео-тідов. Можна сказати, що таким чином бактерії захищають себе від ДНК рослин і тварин, в організмі яких вони мешкають тимчасово (як патогени) або постійно (як сапрофіти).
Рестріктази вперше були виділені з Є. coli у 1968 р-Виявилося, що вони здатні розрізати (плавити) молекули ДНК на різних сайтах (місцях) рестрикції. Ці ферменти отримали назву ендонуклеаз класу I. Потім у бактерій були виявлені ендонуклеази класу II, які розпізнають у чужорідної ДНК сайти рестрикції специфічно і на цих сайтах теж здійснюють рестрикцій. Саме ферменти цього класу стали використовувати в генній інженерії. Тоді ж були відкриті ферменти класу III, які плавлять ДНК поруч з сайтами розпізнання, але ці ферменти не мають значення в генній інженерії.
Дія системи рестрикції-модифікації «раціоналізуется» так званими паліндромний (розпізнають послідовностями) азотистих основ, які є сайтами рестрикції ДНК. Паліндромний послідовності - це послідовності підстав, які однаково читаються вперед і назад, як, наприклад, послідовність літер радар. Оскільки ланцюга ДНК володіють антипаралельних напрямком, то вважають, що послідовність є паліндромний, якщо вона ідентична, коли читається в напрямку від 5'-до 3'-кінця на верхній і 3'-к о'-кінця на нижній ланцюга, а саме:
Паліндроми можуть бути будь-яких розмірів, але більшість тих паліндромів, які використовують в якості сайтів впізнавання рестріктазами, складаються з 4, 5, 6 і рідше 8 підстав.
Рестріктази - це абсолютно необхідний інструмент в генній інженерії для вирізування цікавлять фрагментів (генів) з великих молекул ДНК. Оскільки відомо більше 100 ферментів рестрикції, то це дозволяє вибір рестриктаз і селективне вирізання фрагментів з початкової ДНК.
Чудовою особливістю рестріктаа є те, що вони продукують розрізи молекул на декілька фрагментів (рестрік-тов) ДНК уступами, в результаті чого в утворюються кінцях один ланцюг довше іншої, утворюючи своєрідний хвіст. Такі кінці (хвости) отримали назву «липких» кінців тому що вони здатні до самокомплементарна.
Розглянемо результати рестрикції на прикладі однієї з найбільш відомих рестриктаз Eco RI з системи рестрикція-модифікація Є. coli. Замість того, щоб плавити ДНК в центрі па-ліндромной послідовності впізнавання, цей фермент плавить ДНК за межами центру та продукує 4 самокомплементарна («липких») кінця, що складаються з різної кількості нуклео-тідов, а саме:
Ці «липкі» кінці у генно-інженерних дослідах корисні з тієї причини, що вони можуть бути возз'єднані комплементарно при низьких температурах, що дозволяє ефективне змикання ДНК-фрагментів.
Сайти розпізнання та сайти плавлення у випадку інших рестриктаз мають інший зміст, а саме:
Слідом за рестрикцій ДНК з рестрикційної суміші виділяють рестрикційний ДНК-фрагменти (ДНК-рестрікти), які необхідні потім для об'єднання з вектором. Для виділення ДНК-рестріктов вдаються до електрофорез, оскільки за допомогою цього методу рестрікцірованную ДНК дуже легко фракціонований завдяки розмірам фрагментів-рестріктов і завдяки константним відносинам електричний заряд-маса. Фрагменти в електричному полі мігрують в ході електрофорезу при частоті, залежною від їх розмірів (маси). Чим більше (довше) фрагмент, тим повільніше він мігрує в електричному полі. Матеріалом, в якому проводять електрофорез, є незаряжающіеся агар-за і поліакриламід. Для впізнання фрагментів використовують ці-дій бромід, який фарбує фрагменти, що веде до їх більш легкому виявленню
Результативність електрофорезу дуже висока, оскільки з його допомогою можуть бути розділені фрагменти, розміри яких становлять від 2 до 50 000 підстав.
Після електрофорезу фрагменти з агарози виділяють з допомогою різних методів. На підставі результатів порівняння розмірів рестріктов однієї і тієї ж ДНК, отриманих за допомогою різних рестриктаз, будують рестрикційний карти, на яких показують сайти рестрикції кожної з використаних рестриктаз У практичному плані рестрикційний карти дозволяють визначати не тільки розміри рестріктов, а й з'ясовувати розташування в молекулах ДНК локусів тих чи інших генів.
Оскільки у вищих організмів у ході транскрипції синтезується гетерогенна ДНК, коректовані процесингом, то в генній інженерії зазвичай використовують комплементарную ДНК (кДНК), яку отримують при використанні в якості матриці мРНК, на якій зворотна транскриптаза синтезує одноланцюжкову ДНК (кДНК), що є копією мРНК. У подальшому ці одноланцюгові ДНК перетворюють на дволанцюжкові ДНК. Вважають, що кДНК містить безперервні нуклеотидні послідовності (транскрибуються і трансльовані). Саме кДНК використовують для рестрикції.
Виділені після електрофорезу з агарозного гелів фрагменти ДНК (рестрікти) можна заздалегідь піддати секвені-вання, тобто визначити в них нуклеотидну послідовність. Для цього використовують хімічний та ферментативний методи сек-Веніровані.
Хімічний метод грунтується на отриманні мічених радіоактивним фосфором (32Р) фрагментів і видаленні з цих фрагментів однієї з підстав з наступним урахуванням результатів радіоавтографіі гелів, що містять ці фрагменти. Ферментативний метод заснований на тому, що в кінець аналізованого фрагмента вводять нуклеотид, який використовується потім у синтезі різних фрагментів in vitro, аналізованих на нуклеотидну послідовність електрофоретичної. Для вивчення специфічних послідовностей нуклеотидів в молекулі ДНК використовують також гібридизацію ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК, Нозерн-та Саузерн-блот.
Генетичні вектори
Сегмент ДНК (ген), який призначений для молекулярного клонування, повинен мати здатність до реплікації при перенесенні його в бактеріальну клітину, тобто бути реплікону. Однак він такою здатністю не володіє. Тому, щоб забезпечити перенесення і виявлення клонованої генів у клітинах, їх об'єднують з так званими генетичними векторами. Останні повинні мати, як мінімум, двома властивостями. По-перше, вектори повинні бути здатні до реплікації в клітинах, причому в кількох копіях. По-друге, вони повинні забезпечувати можливість селекції клітин, що містять вектор, тобто володіти маркером, на який можна вести контрселекцію клітин, що містять вектор разом з клонованої геном (рекомбінантні молекули ДНК). Таким вимогам відповідають плазміди і фаги. Плазміди є хорошими векторами з тієї причини, що вони є реплікону і можуть містити гени резистентності до якого-небудь антибіотика, що дозволяє вести селекцію бактерій на стійкість до цього антибіотика і, отже, легке виявлення рекомбінантних молекул ДНК.
Оскільки природні плазмідні вектори невідомі, то всі відомі до теперішнього часу плазмідні вектори були сконструйовані штучно. Вихідним матеріалом для створення ряду генетичних векторів послужили R-плазміди, в яких за допомогою рестриктаз видаляли зайві послідовності ДНК, у тому числі ті, на яких розташовувалися множинні сайти рестрикції. Це видалення визначалося тим, що плазмідний вектор повинен володіти тільки одним сайтом впізнавання для однієї рестриктаз, причому цей сайт повинен лежати у функціонально несуттєвому районі плазмідної геному. Наприклад, плазмідний вектор pBR 322, який містить гени резистентності до ампіциліну і тетрацикліну, що робить його дуже зручним для селекції бактерій, що містять клонованої сегмент ДНК, має одиночними сайтами рестрикції для понад 20 ферментів-рестриктаз, включаючи такі відомі рестриктаз, як Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II і Sal I
Фагових вектори теж мають ряд переваг. Вони можуть включати в себе більші (довші) клонованої фрагменти ДНК порівняно з плазмідними векторами. Далі, перенесення фагами клонованого фрагмента в клітини в результаті ін-фіцірованія ними останніх є більш ефективним, ніж трансформація ДНК. Нарешті, фагових вектори дозволяють більш ефективний скринінг (розпізнання) на поверхні агару колоній, що містять клітини, які несуть клонованої ген. Багато фагових вектори сконструйовані на базі фага лямбда.
Крім фагових використовують і інші вірусні вектори, сконструйовані на базі вірусу герпесу, а також вектори, сконструйовані на базі дріжджовий ДНК.
Якщо клонування генів проводять, використовуючи клітини ссавців або рослин, то вимоги до векторів ті ж, що й у випадку клонування в бактеріальних клітинах.
Конструювання рекомбінантних молекул ДНК
Безпосереднє конструювання рекомбінантних молекул ДНК слід після того, як отримані рестрікти досліджуваної ДНК і векторної ДНК. Воно полягає в змиканні сегментів-рест-рікти досліджуваної ДНК з рестріктом векторної ДНК, яка в результаті рестрикції перетворюється з кільцевої в лінійну ДНК.
Щоб зімкнути фрагменти досліджуваної ДНК з ДНК-вектора, використовують ДНК-лігази Лігированіє буде успішним, якщо стуляються структури мають 3'-гідроксил і 5-фосфатної групами і якщо ці групи розташовані відповідним чином одна відносно іншої. Фрагменти об'єднуються через їх «липкі» кінці у результаті са-мокомплементарності. При високих концентраціях фрагментів останні час від часу стають у правильне положення (навпроти один одного). Багато ре-стріктази, такі як Eco RI, продукують «липкі» кінці, що складаються з 4-х підстав. Процес лігування «липких» кінців, що складаються з чотирьох основ, відбувається при зниженій температурі (до 12 ° С).
Якщо при рестрикції утворюються фрагменти без «липких» кінців, то їх «насильно» конвертують в молекули з «липкими» кінцями, використовуючи фермент трансферазу. Цей фермент додає нуклеотиди до 3'-кінця ДНК. На одному фрагменті може бути доданий полі-А-хвіст, на іншому - полі-Т-хвіст. Для генерації будь-яких бажаних решт ДНК використовують також так звану полімеразну ланцюгову реакцію (ПНР). Принцип ПЛР заснований на денатурації виділеної з клітин ДНК і «відпалі» її з додаванням до ренатурірующімся ланцюгах ДНК-олігонуклеотидів, що складаються з 15-20 нуклеотидів кожен. Ці олігонуклеотиди повинні бути комплементарні послідовностей в цілях, розділених відстанями в 50-2000 нуклеотидів. Будучи «запалом» для синтезу ДНК in vitro, вони дозволяють ДНК-полімеразі копіювати ті ділянки, які знаходяться на межі "затравки». Це копіювання дає велику кількість копій досліджуваного фрагмента ДНК.
Введення рекомбінантного молекул ДНК у клітини
Після змикання цікавить фрагмента ДНК (гена) з генетичним вектором з допомогою ДНК-лігази освічені реком-бінантние молекули вводять в клітки з метою домогтися їх реплікації (за рахунок генетичного вектора) і збільшення кількості копій. Найбільш популярним способом введення в клітини рекомбінантних молекул ДНК, в яких вектором служить плазміда, є трансформація Є. coli. З цією метою бактеріальні клітини попередньо обробляють кальцієм або рубідій (іонами) для того, щоб вони стали «компетентними» у сприйнятті рекомбінантної ДНК.
Щоб підвищити частоту проникнення ДНК в клітини, використовують метод електропорації, що полягає в короткому експонуванні клітин в інтенсивному електричному полі. Ця обробка створює порожнини в мембранах клітин, що сприяє кращому сприйняттю клітинами ДНК-Після введення рекомбінантних молекул ДНК в бактерії останні висівають на МПА, збагачений антибіотиками для селекції бажаних клітин, тобто клітин, які містять рекомбінантні молекули ДНК. Частота трансформації є невисокою. Зазвичай один трансформант виникає на 106 висіяних клітин. Якщо ж вектор є фагів, то вдаються до трансфекції клітин (бактерій або дріжджів) фагом. Що стосується соматичних клітин тварин, то їх трансфекції здійснюють ДНК в присутності хімічних речовин, що полегшують проходження ДНК через плазматичні мембрани. Можливі також прямі мікроін'єкції ДНК в овоцити жаб, в культивовані соматичні клітини і в ембріони ссавців.
Найважливішим моментом, пов'язаним з молекулярним клоніро-ристанням, є пошук способу, що дозволяє встановити, чи дійсно клонованої фрагмент включився у вектор і разом з вектором, утворивши рекомбіновану молекулу ДНК, увійшов до клітки. Якщо мова йде про бактеріальних клітинах, то один із способів заснований на обліку інсерційного інактивації плазмідної (векторного) гена резистентності. Наприклад, в плазмідної векторі pBR322, що детермінує резистентність до ампіциліну і тетрацикліну, єдиний сайт для рестриктаз Pst I знаходиться в локусі, займаному геном резистентності до ампіциліну. Pst I-плавлення на цьому сайті генерує липкі кінці, що дозволяють лігування клонованого фрагмента з векторною ДНК. Однак при цьому плазмідний (векторний) ген ампіціллінрезіс-тентності інактивується, тоді як ген тетраціклінрезістентнос-ти на векторі залишається інтактним. Саме, ген тетраціклінрезіс-тентності і використовується для селекції клітин, що трансформують рекомбінантними молекулами ДНК. Щоб переконатися, що клітини колоній, що виросли на середовищі з тетрацикліном дійсно містять рекомбінантні молекули ДНК, їх перевіряють за допомогою так званого «спот-тесту» на парі чашок з щільною середовищем, одна з яких містить ам-піціллін, тоді як інша позбавлена цього антибіотика. Клонованої ДНК містяться лише в трансформанта, резистентних до тетрацикліну Що стосується трансформантів, резистентних одночасно до ампіциліну і тетрацикліну (Артс), то вони містять плазмідні (векторні) молекули, що спонтанно придбали кільцеву форму без включення до них чужорідної (клонованої) ДНК. Інший спосіб виявлення інсерцій чужорідних (клонованої) фрагментів в плазмідний вектор заснований на використанні вектора, що містить ген (3-га-лактозідази. Інсерцій чужорідної ДНК в цей ген неминуче інактивує синтез р-галактозидаза, що може бути виявлено посівом трансформованих клітин на середовище, яке містить субстрати р-галактозидази. Це середовище дозволяє селекцію забарвлених колоній клітин.
Як уже зазначено, рестрикційний лінійні фрагменти векторної ДНК здатні до відновлення кільцевої структури без включення до них клонованої сегментів. Щоб зменшити частоту спонтанного утворення таких кільцевих молекул векторної ДНК, рестрікти векторної ДНК обробляють фосфатазою. У результаті цього утворення кільцевих молекул ДНК стає неможливим, оскільки будуть відсутні кінці 5'-РО ^, необхідні для дії лігази.
Сукупність Колоцей-трансформантів, які виросли на селективної середовищі, являє собою сукупність клітин, що містять клони різних фрагментів (генів) клонованої геномної або кДНК. Колекції цих клонів формують так звані бібліотеки ДНК, широко використовуються в генно-інженерних роботах.
Заключною стадією клонування генів є виділення і дослідження клонованої ДНК, включаючи секвенування.
Перспективні штами бактерій або соматичних клітин, що містять рекомбінантні молекули ДНК, які контролюють синтез цікавлять білків, що мають комерційну цінність, передають у промисловість.
Список літератури
1. Біологія. У 2 кн. (Підручник) Під ред. В.Н. Яригіна (2003, 5-е вид., 432с., 3
2. Мікробіологія. (Підручник) Гусєв М.В., Мінєєва Л.А. (2003, 464с.)
3. Біологія з основами екології. (Підручник) Пехов А.П. (2000,