Гемоглобін еритроцитарних мембран людини

1. ВСТУП

2. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

3. МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

3.1. Матеріал дослідження

3.2. Методи дослідження

4. РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

4.1. Кількісний вміст гемоглобіну та основних білків мембран еритроцитів людини.

4.2. Взаємне варіювання кількісної показності окремих білків еритроцитів людини.

4.3. Обговорення

5. ВИСНОВОК

6. ВИСНОВКИ

7. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

Введення

Мембрана еритроцита протягом довгого часу представлялася дослідникам лише оболонкою, яка відділяє гемоглобін від плазми. Роль мембрани в функціонуванні цієї високо спеціалізованої клітини, здавалося, обмежується лише здатністю бути проникною для газів крові. Проте успіхи, досягнуті в мембранології за останні роки і, зокрема, вивченні мембрани еритроцита ссавців за допомогою біохімічних та біофізичних методів, змушують в даний час по-іншому поглянути на роль мембрани в роботі клітини. Сукупність наявних у літературі даних дозволяє зробити висновок про те, що плазматична мембрана еритроцита - найважливіший елемент клітини, вона одночасно є і механічної оболонкою з регульованими фізичними властивостями, і "диспетчерської" клітини, що здійснює координацію роботи клітини в залежності від фізичних і хімічних сигналів, що надходять до неї в організмі. [9]

Найважливіші компоненти біологічних мембран - білки, які здійснюють їх специфічні функції. Одні з них забезпечують транспорт певних молекул всередину клітини або з неї, інші є ферментами і каталізують асоційовані з мембраною реакції, треті здійснюють структурну зв'язок цитоскелета з позаклітинним матриксом або служать в якості рецепторів для отримання та перетворення хімічних сигналів з навколишнього середовища. Мембранні білки, що утворюють цитоскелет, з'єднуються один з одним специфічним для кожного типу клітин чином і формують складні динамічно взаємодіють між собою структури. Ці структури і відповідають безпосередньо за узгоджена поведінка частин клітин. [4] Гемоглобін можна вважати свого роду модельним білком, структура, властивості і функції якого найбільш повно вивчені в порівнянні з іншими білками протягом останніх 50 років. Десятки років досліджень гемоглобіну в багатьох лабораторіях світу призвели до значного прогресу в описі і розумінні фізичних, хімічних і біологічних аспектів його функціонування. [2] Проте, незважаючи на це, у науковій літературі недостатньо докладно висвітлено питання про зв'язок гемоглобіну зі структурними білками еритроцитарних мембран.

Вивчення структури мембрани еритроцита людини і перш за все входять до їх складу білків є актуальним, оскільки ряд спадкових патологій (сфероцітарние анемії, міодистрофії, деякі захворювання центральної нервової системи) характеризуються різними порушеннями в білкової компоненті еритроцитарної мембрани і як наслідок порушенням її структурно-функціональної організації. [7] Певні чинники середовища можуть змінювати експресію генів, що відбивається на життєдіяльності як окремих органів і систем, так і організму в цілому. Деякі автори розглядають рівень гемоглобіну в крові як універсальний неспецифічний показник адаптаційних процесів, процесів напруженості організму у відповідь на різні зовнішні впливи. [1] Так, наслідком дії таких чинників може з'явитися зменшення кількості гемоглобіну в крові або порушення структурно-функціональної організації білкової компоненти мембран еритроцитів. Результатом таких змін служить ряд патологій, і, як наслідок, - значне зниження адаптаційних можливостей людини. Тому на сьогоднішній день актуально вивчення структури мембрансвязанного гемоглобіну, оцінка його кількісного вмісту і взаємозв'язок зі структурними білками еритроцитарних мембран. У зв'язку з початком систематичним вивченням продуктів експресії генів людини в рамках молекулярно-анатомічного напрямку представляється вкрай важливим встановлення кількості та основних властивостей поліпептидів, що входять до складу мембрани еритроцита, і складання каталогу білків. Можливості цих досліджень, а також пошуку первинного біохімічного дефекту при спадкових аномаліях істотно зросли після широкого поширення методу двомірного електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ). [7]

Метою цього дослідження було вивчення кількісного вмісту мембранозв'язаних гемоглобіну еритроцитів людини та її зв'язку із структурними білками.

літературний огляд

В силу своєї спеціалізації (перенесення кисню від легень до тканин) еритроцит за механічними властивостями є унікальною клітиною, так як на відміну від інших клітин постійно піддається вираженим деформуючим впливів у кровотоці. [9]

Для нормального функціонування еритроцит повинен протягом відносно тривалого періоду часу зберігати свою цілісність і бути добре деформується; остання властивість важливо перш за все для нормальної мікроциркуляції. У свою чергу деформованість визначається рядом факторів, основні з яких - форма клітини і еластичність мембрани. Зараз можна вважати доведеним, що ці властивості мембрани еритроцита і клітини в цілому обумовлені наявністю білкової мембранної структури, що називається мембранним скелетом клітини і розташованої на внутрішній стороні мембрани. [9] плазматичну мембрану еритроцитів слід розглядати як відкриту динамічну структуру, здатну специфічно і неспецифічно пов'язувати білки плазми крові та цитозолю еритроцитів. [6] Дослідники намагаються з'ясувати механізми метаболічного регулювання білкових взаємодій компонентів мембранного скелету між собою, а також з інтегральними білками мембрани, що має підвести до розуміння природи таких процесів, як зміна форми і деформованості, робота транспортних систем, зміна іонної проникності мембрани. У даному огляді зроблено спробу узагальнити і осмислити наявні дані з цього питання.

Сучасні уявлення про структуру та функції мембранного скелету еритроцитів людини та інших ссавців склалися в основному за останні 25 - 30 років. За цей період опубліковано ряд детальних оглядів. Наявність сітчастої структури, що вистилає внутрішню поверхню мембрани еритроцита, було виявлено безпосередньо за допомогою електронної мікроскопії після обробки клітин неіонних детергентом тритоном Х-100. Мембранний скелет видно у вигляді двомірної мережі філаментів, довжина яких залежить від особливостей приготування препарату для мікроскопії. Білкові компоненти мембранного скелета були ідентифіковані за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) у присутності додецилсульфату натрію (ДДС).

Класичною роботою по електрофоретичного розділення білків мембрани еритроцитів людини є робота Фейрбанкса і співавторів, в якій автори запропонували номенклатуру поліпептидних смуг, викритих у солюбілізірованних за допомогою ДДС мембрані; цієї номенклатурою користуються в даний час більшість дослідників. При одночасному електрофорезі солюбілізірованних білків еритроцитарної мембрани в ПААГ у присутності ДДС виявляється 20 смуг, однак Фейрбанкс з співавторами виділили 7 основних смуг, які були пронумеровані від катода до аноду. У наступні роки були внесені лише незначні уточнення в цю номенклатуру. [9]

У зв'язку зі способом розташування макромолекул в мембрані еритроцита білки ділять на периферичні (внутрішні) та інтегральні. Інтегральні утримуються в мембрані. До їх складу входять глікопротеїни і протеоліпіди. Функції інтегральних білків різноманітні: вони можуть виступати в ролі гідролітичних ферментів, рецепторів клітинної поверхні, окисно-відновних компонентів транспортної системи електронів і в якості специфічних білків входить до складу цитоскелету, який представляє собою двовимірну мережу, з'єднану безпосередньо з мембраною еритроцита через взаємодію з інтегральними білками . Також до периферичних білків відноситься ряд еритроцитарних ферментів.

Метод фракціонування мембранних білків одномірним електрофорезом в ПААГ у присутності ДДС дозволили розділити білки мембрани щодо їх електрофоретичної рухливості, і отриманим фракціям білків були дані номери в міру зменшення їх молекулярної маси.

Смуги 1 і 2 Включають окремі a-і b-субодиниці спектрина.

Спектрин - основний білок цитоскелету еритроцитів. Спектрин утворює двовимірну мережу, до якої кріпляться актинові олігомери. Молекула спектрина представляє собою ab-гетеродімер. За даними електронної мікроскопії, гетеродімери мають форму зігнутих фібрил довжиною близько 100 нм. Вони можуть приймати різні конфігурації. Кожен ланцюг молекули спектрина містить понад 2000 амінокислотних залишків і складається з лінійно розташованих структурних доменів. Доменна структура була встановлена ​​за допомогою аналізу пептидних фрагментів субодиниць. Вторинна структура a-і b-субодиниць подібна і являє собою a-спіральні ділянки, розділені чутливими до протеолізу b-структурами. Димери спектрина асоціюються з b-ланцюгом іншої димеру "голова до голови". Ніколи не зустрічаються aa-або bb-зв'язку. Між димерами і тетрамерами існують оборотні переходи, які залежать від умов середовища. При 37 ° С спектрин екстрагується з мембран еритроцитів у формі димеру, при 4 ° С - у формі тетрамера. При 30 і 40 ° С у розчині між димерами і тетрамерами встановлюється рівновага. Так як в звичайних умовах отримання спектрин екстрагується у вигляді тетрамера, вважали, що in vivo спектрин знаходиться в тій же формі. Електронно-мікроскопічний аналіз свідчить про те, що такі олігомери утворюються в результаті асоціації 3-7 димерів спектрина. Вважають, що в еритроцитах присутні як олігомери, так і тетрамери, які утворюють двовимірну мережа цитоскелету. Молекула спектрина піддається множинного фосфорилюванню, ступінь якого не впливає на форму еритроцитів. [5]

Смуги 2.1, 2.2, 2.3 Представлено різними формами периферичного білка анкирина. Дані електронної мікроскопії свідчать про те, що мережа спектрина розташована на певній відстані від мембрани і, мабуть, взаємодіє інтегральними білками мембрани. Латеральна рухливість інтегральних білків залежить від присутності спектрина: це підтверджує наявність такої взаємодії. При обробці мембран химотрипсином був виділений білковий фрагмент з мовляв. масою 72 kD, який ингибировал взаємодія спектрина з еритроцитарної мембраною, збідненої спектрином. Білок був названий анкирином, від грецького ankyra, що значить заякориваются. Інша група дослідників назвала його сіндеіном, від грецького syndeo, що значить зв'язуватися разом. Молекула анкирина (мол. маса 200 kD) має сферичну форму і складається з двох доменів: нейтрального і фосфорилированного. Фосфорілірованним доменом анкирин взаємодіє з b-субодиницею спектрина на відстані 20 нм від С-кінця молекули. Нейтральний домен анкирина здійснює зв'язок з білком смуги 3. [5,6]

Білок смуги 3 Білок 3 (анионтранспортного білок) - один з основних інтегральних білків еритроцитарної мембрани - є гликопротеидом з мовляв. масою 90 kD. Показано, що цей білок бере участь у забезпеченні аніонного транспорту, у зв'язуванні цитоскелетного каркаса з мембраною, цитоплазматичних білків гемоглобіну і гліцеральдегид-3-фосфатдегідрогенази. Не всі молекули білка 3 взаємодіють з анкирином. Якщо б всі молекули білка 3 були пов'язані з анкирином і, отже, з усією спектріновой мережею, це виключило б можливість латеральних переміщень самого білка, утворення кластерів і транспортних функцій. Зв'язок спектрина з мембраною здійснюється, мабуть, не тільки через анкирин, але також за допомогою додаткових взаємодій. Наявні на сьогоднішній день дані свідчать про те, що білок 4.1 забезпечує зв'язок спектрина з інтегральним білком мембрани. [5] Всі перераховані додаткові взаємодії мають слабкий характер і, мабуть, грають другорядну роль в порівнянні з взаємодією спектрин-анкирин-білок 3.

Білок смуги 4.1 Необхідний для нормальної стабілізації мембрани, закріплює зв'язок спектрина з актином. На електрофореграмме даний білок розділяється на дві смуги: 4.1а (Mr = 80 kD) і 4.1b (Mr = 78 kD). Перехід 4.1а в 4.1b здійснюється за допомогою деамідірованія. Це глобулярний білок з мовляв. масою 80 kD, що близько 5% від білкової маси цитоскелету еритроцитів. Його ізоформи подібні за амінокислотним складом. Обидві ізоформи здатні взаємодіяти зі спектрином. Кожна з них міститься в кількості приблизно 100 000 молекул на 1 клітину. [5]

Білок смуги 4.2 Паллідін - це олігомер (Mr = 72 kD), в клітині є у димерной і тримерной формах з Mr = 185 kD. З'єднується з цитоплазматическим доменом білка смуги 3, анкирином, спектрином і білком смуги 4.1. [14]

Білок смуги 4.5 До його складу входять інтегральні білки - переносники нуклеозидів і глюкози через еритроцитарну мембрану. Основна частина білків смуги 4.5 представлена ​​транспортерами глюкози (Mr = 55 kD). [14]

Білок смуги 4.9 Центральний компонент цитоскелету з Mr = 48 kD. Цей білок виділено як тримера з Mr = 145 kD. Стабілізує взаємодії спектрина з актином впливає на ступінь його полімеризації. Це фосфопротеинов. Білок є у еритроцитах в кількостях, приблизно рівних кількості спектрина. Про функції цього білка практично нічого не відомо. Можливо, він бере участь у зміцненні цитоскелетного каркаса (мережі цитоскелета). Показано, що очищений поліпептид смуги 4.9 може взаємодіяти з Актинові нитками, знижуючи швидкість полімеризації актину і, можливо, стабілізуючи короткі актинові нитки в еритроцитах. [5]

Смуга 5 Актин - представлений в еритроцитах b-изоформой і за фізико-хімічними властивостями схожий з актином поперечносмугастих м'язів. Так як функціональною формою актину є його полімер, спочатку намагалися з'ясувати, чи є в еритроцитах філаментне актин. Електронно-мікроскопічні дослідження показали, що актин присутній в еритроцитах у вигляді філаментів, які містять від 12 до 17 мономерів актину. [5] Виділені мембрани еритроцитів, а також комплекс спектрина, актину і білка 4.1 здатні індукувати полімеризацію мономерного актину, подібно олігомеру актину. Обробка цітохалазіном У пригнічує полімеризацію. Так як типовий фібрилярний актин не виявляється в нативних еритроцитах, а в дослідах in virto можна індукувати утворення довгих філаментів, пов'язаних з мембраною, слід, мабуть, припустити, що в еритроцитах існують якісь механізми, що обмежують зростання філаментів, подібно до того, як це робить цітохалазін В. Актинові олігомери зв'язуються з N-кінцем молекули спектрина латерально. Кожен тетрамер спектрина має два сайти зв'язування для Актинові олігомерів. Спектрин може зв'язуватися з Ф-актином по всій довжині актиновой нитки, і ці зв'язки, мабуть, істотні для освіти цитоскелетного мережі. Важлива роль у взаємодії актину і спектрина належить білку смуги 4.1, який пов'язується зі спектрином в тих же ділянках, що і актин. Зв'язок спектрина з актином у відсутність білка 4.1 слабка і значно посилюється в його присутності, тому взаємодія спектрина і актину називають 4.1-залежним. Комплекси білка 4.1, спектрина і актину володіють набагато більшою стійкістю до дисоціації при седиментації в сахарозі, ніж комплекси актину і спектрина.

Виникає питання про те, які чинники впливають на полімеризацію еритроцитарного актину. Відносно низька концентрація актину в еритроцитах не може, ймовірно, мати вирішального впливу на довжину філаментів. Припустимо, що на полімеризацію актину можуть впливати такі актінсвязивающіе білки, як спектрин і білок 4.1. Виявилося, що ці білки здатні регулювати швидкість полімеризації актину, скорочуючи лаг-фазу, зменшуючи швидкість елонгації і не викликаючи при цьому ніяких змін в послідовності етапів полімеризації. Спектрин і білок 4.1 викликають нуклеації глобулярного актину в умовах, коли концентрація актину нижче критичної і спонтанна полімеризація не відбувається. Таким чином, можна припустити, що спектрин і білок 4.1 представляють собою комплекс білків, блокуючих повільний кінець актиновой нитки на відміну від більшості "замикаючих" білків, взаємодіючих з швидким кінцем. Проте пізніше були отримані дані, що суперечать цьому припущенню. Шен зі співавторами виділили фрагменти цитоскелету еритроцитів при обробці розчинами з низькою іонною силою при 37 ° С. [5] Електронно-мікроскопічні дослідження отриманих фрагментів показали, що частина з них містить філаменти актину, уздовж яких кластерами розташовуються спектріновие молекули. При інкубації цих препаратів з глобулярним актином (при концентрації актину в розчині вище критичної) відбувалося зростання Актинові ниток на обох кінцях. Тсукіта з співавторами вивчали полімеризацію актину на мембранах еритроцитів, закріплених на електронно-мікроскопічних сектах. При інкубації цих препаратів з глобулярним актином на внутрішній поверхні мембран, що містять цитоскелетного білки спостерігалося зростання Актинові філаментів. [5] При концентраціях глобулярного актину, близьких до критичних, зростання лише на повільному кінці, а при подальшому збільшенні концентрації - на обох кінцях нитки. При обробці мембран "кепірующім" білком з мовляв. масою 45 kD, зв'язується з швидким кінцем Актинові мікрофіламентів, зростання лише на повільному кінці. Дані Шена і Тсукіти приводять до висновку про те, що в еритроцитах актин існує у вигляді філаментів з вільними кінцями. Отже, спектрин і білок 4.1 не є кепірующімі білками, однак безсумнівно впливають на стан актину в еритроцитах, стабілізуючи актинові філаменти.

Білок смуги 6 гліцеральдегид-3-фосфатдегідрогеназа (ГАФД), молекулярна маса становить 35 kD. Розташовується на цитоплазматичної домені анионтранспортного білка, у складі мультиферментного комплексу. Даний білок є ферментом гліколізу і бере участь у регуляції окислення гемоглобіну. [14]

Смуга 7 Основною складовою поліпептид - тропомиозин. Довгий час залишалася невідомою природа білка зони 7. Було показано, що цей білок зв'язується з антитілами до тропомиозина, виділеного з мускульного шлунку курчати. Молекулярна маса білка збігалася з молекулярною масою тропомиозина, виділених з мозкових тканин, з макрофагів і кров'яних платівок. Тропомиозин еритроцитів - димер з мовляв. масою 60 kD, що складається з двох субодиниць з мовляв. масою 29 і 27 kD і зв'язується з м'язовим актином (Ф-актином) при співвідношенні: 1 молекула тропомиозина на 6-7 мономерів актину. Так як в еритроцитах філаменти актину містять до 15-17 мономерів, вони можуть пов'язувати дві молекули тропомиозина. [5]

Смуга 8 Представлено пептидного частиною ферменту глутатіон-S-трансферази (Mr = 23 kD). Взаємозв'язок білка смуги 8 з мембраною є кальцій - залежною.

У 1985 р. було показано, що ще одним компонентом цитоскелету еритроцитів є міозин. За допомогою моноклональних антитіл до важкого ланцюга міозину Фаулер виявив в еритроцитах поліпептид, який був виділений і охарактеризований. Білок складається з важкого ланцюга з мовляв. масою 200 kD і з двох легких ланцюгів з мовляв. масами 26 і 19,5 kD. У розчинах з низькою іонною силою він утворює біполярні філаменти і володіє АТФазной активністю. В еритроцитах міозин присутні приблизно в кількості 6000 молекул на 1 клітину, тобто на 1 молекулу міозину, як і в інших клітинах, припадає близько 80 мономерів актину. [5]

Білки, що утворюють цитоскелет еритроцитів, неунікальний. Вони або їм подібні білки є в багатьох інших клітинах. Переважна їх локалізація - поблизу мембран. Ймовірно також, що розглянуті білки можуть бути поліфункціональні і використовуватися в структурних комплексах різного функціонального призначення. [5]

Смугу 9 на електрофореграмме становить білок глобін, який є частиною мембрансвязанного гемоглобіну. Як вже говорилося вище, цитоплазматичний домен білка смуги 3, що включає близько 380 амінокислотних залишків, локалізована в цитоплазмі і грає важливу роль у підтримці форми еритроцита і його метаболізмі. N-кінцева послідовність цитоплазматичного домену багата амінокислотними залишками кислого характеру. На цій ділянці знаходяться центри зв'язування гідролітичних ферментів - гліцеральдегид-3-фосфатдегідрогенази, альдолази, каталази, гемоглобіну і геміхрома. Таким чином, цитоплазматичний домен анионтранспортного білка і є місцем локалізації мембрансвязанного гемоглобіну, про структуру, властивості і деяких аспектах функціонування якого буде сказано нижче.

Гемоглобін Гемоглобін - білок еритроцитів, червоних кров'яних клітин, що переносить молекулярний кисень від легень до тканин в організмах хребетних тварин. Гемоглобін можна вважати свого роду модельним білком, структура, властивості і функції якого найбільш повно вивчені в порівнянні з іншими білками протягом останніх 50 років. Американський фізик Хопфілд назвав його атомом водню сучасної біохімії, маючи на увазі, що вивчення гемоглобіну зіграло в біохімії ту ж роль, що й вивчення атома водню у фізиці. Гемоглобін називають також почесним ферментом, оскільки дослідження його структури в статиці і динаміці дозволили значно просунутися у розумінні механізмів функціонування ферментів. Структура цього глобулярного білка відома в деталях головним чином завдяки роботам англійського біофізика Макса Перутца, який отримав перші рентгеноструктурні дані ще в кінці 40-х років нашого століття. За ці дослідження він був удостоєний Нобелівської премії.

Структура гемоглобіну Молекула гемоглобіну складається з чотирьох субодиниць: двох a і b двох - і відповідно містить чотири поліпептидні ланцюжки двох сортів. Кожна a-ланцюжок містить 141, а b-ланцюжок - 146 амінокислотних залишків. Таким чином, вся молекула гемоглобіну включає 574 амінокислоти. Хоча амінокислотні послідовності a-і b-ланцюжків різні, вони мають практично однакові третинні просторові структури. Власне кажучи, наведені вище деталі структури відносяться не до гемоглобіну, а до його білкової компоненті - глобіну. Кожна субодиниця гемоглобіну містить одну небілкової (так названу простетичної) групу - гем. Гем є комплексом Fe (II) з протопорфирином. Структура гема представлена ​​на рис.1, а. [2]

Атом заліза може утворити шість координаційних зв'язків. Чотири зв'язку спрямовані до атомів азоту піррольних кілець, що залишилися дві зв'язку -

Рис.1. Структура гема (а), структура активного центру дезоксигемоглобина (б), структура активного центру оксигемоглобіну (в).

перпендикулярно до площини порфіринового кільця по обидві його сторони. Геми розташовані поблизу поверхні білкової глобули в спеціальних кишенях, утворених складками поліпептидних ланцюжків глобіну. Гемоглобін при нормальному функціонуванні може перебувати в одній з трьох форм: феррогемоглобін (зазвичай званий дезоксигемоглобином або просто гемоглобіном), оксигемоглобін і ферригемоглобин (званий також метгемоглобіну). У феррогемоглобіне залізо знаходиться в закисной формі Fe (II), одна з двох зв'язків, перпендикулярних до площини порфіринового кільця, спрямована до атома азоту гистидинового залишку, а друга зв'язок вільна (рис.1, б). Крім цього гистидинового залишку, званого проксимальним (сусіднім), по інший бік порфіринового кільця і ​​на більшій відстані від нього знаходиться інший гистидинового залишок - дистальний гістидин, не пов'язаний безпосередньо з атомом заліза. Взаємодія молекулярного кисню з вільним гемом призводить до необоротного окислення атома заліза гему [Fe (II) Ю Fе (III); гем Ю гемін]. У дезоксигемоглобина глобін охороняє залізо гема від окислення.

Реакція оксигенації Оборотне приєднання кисню (оксигенація), що дозволяє гемоглобіну виконувати свою основну функцію переносника, забезпечується можливістю утворити міцні п'яту та шосту координаційні зв'язки і перенести електрон на кисень не від заліза (тобто окислити Fe ^{2 +),} а від імідазольного кільця проксимального гістидину. Це схематично зображено на мал.1, б. Замість молекулярного кисню залізо гема може приєднати окис вуглецю СО (чадний газ). Навіть невеликі концентрації СО призводять до порушення кіслородпереносящей функції гемоглобіну і отруєння чадним газом.

Вище було сказано, що одна молекула гемоглобіну містить чотири субодиниці і, отже чотири гема, кожен з яких може оборотно приєднати одну молекулу кисню. Тому реакцію оксигенації можна розділити на чотири стадії:

Hb + O ₂ И HbO ₂ (1a)

НbO ₂ + O ₂ И Hb (O _{2) 2} (1б)

Hb (O _{2) 2} + O ₂ И Hb (O _{2) 3} (1в)

Hb (O _{2) 3} + O ₂ И Hb (O _{2) 4} (1г)

Перш ніж розглянути цю головну функціональну реакцію гемоглобіну більш детально, необхідно сказати кілька слів про м'язовий гемоглобіні - міоглобіні. Цей барвний білок поперечносмугастих м'язів є комплекс гема з "четвертинки" глобіну. Він містить одну молекулу гема і одну полипептидную ланцюжок, склад і структура якої подібні складу і структурі b-субодиниці гемоглобіну. Як і для гемоглобіну, найважливішою функцією міоглобіну є оборотне приєднання молекулярного кисню. Цю функцію характеризує так звана крива оксигенації, що зв'язує ступінь насичення гемоглобіну киснем (у відсотках) з парціальним тиском останнього, рО ₂ (мм Hg). Типові криві оксигенації гемоглобіну і міоглобіну (за умови досягнення хімічної рівноваги) наведені на рис.2, а, б. Для міоглобіну крива є гіперболою, як і повинно бути у випадку одностадійної хімічної реакції за умови досягнення хімічного рівноваги:

Mb + O ₂ ИMbO _{2 (2)}

де Mb - міоглобін.

Рис. 2 Криві оксигенації

міоглобіну (а) і гемоглобіну (б)

Зовсім інша ситуація виникає у разі гемоглобіну. Крива дисоціації має S-подібну форму. Без кисню молекули гемоглобіну мають низьку спорідненість до кисню і рівновагу реакції (1а) зрушено вліво. Потім крива стає крутіше і при високих значеннях рО ₂ практично зливається з кривою дисоціації міоглобіну. [2]

Рис. 3. Логарифмічні анаморфози кривих оксигенації міоглобіну (a) і гемоглобіну (б)

М. Перутца пише, що розподіл молекул кисню по молекулам гемоглобіну слід біблійної притчі: "Кожному, у кого є, дай ще, і у нього буде надлишок; у того ж, у кого немає, забери те небагато, що у нього залишилося ". Це змушує припустити, що між гемамі однієї молекули гемоглобіну існує певний зв'язок, завдяки якій приєднання кисню до одного гему впливає на приєднання кисню до іншого гему тієї ж молекули. Це явище було відомо задовго до робіт Перутца і встановлення структури гемоглобіну та механізму його реакції з киснем. Воно отримало назву гем-гем взаємодії. Фізіологічний сенс гем-гем взаємодії очевидний. Сігмоідная форма кривої дисоціації створює умови максимальної віддачі кисню при перенесенні гемоглобіну від легень з високим значенням pO ₂ до тканин з низьким значенням pO _2. Для людини значення pO ₂ артеріальної і венозної крові в нормальних умовах (Т 37 ° С, pH 7,4) рівні відповідно 100 і 40 ммHg. При цьому (рис .2, б) гемоглобін віддає тканинам 23% зв'язаного кисню (ступінь оксигенації змінюється від 98 до 75%). При відсутності гем-гем взаємодії для одногемового міоглобіну (рис.2, а) ця величина не перевищує 5%. Міоглобін тому служить не переносником, а депо кисню і віддає його м'язової тканини лише при різкій гіпоксії, коли насичення тканини киснем падає до неприпустимо низького значення. [2]

Логарифмічна анаморфозу кривої дисоціації гемоглобіну людини представлена ​​на рис.3, б. У цьому випадку початок кривої являє собою пряму під кутом 45 ° до координатних осях, як і для міоглобіну: перші молекули кисню з'єднуються в основному з молекулами гемоглобіну, ще не містять кисню, і геми таким чином оксигенеруюче незалежно. Це свідчать про те, що гем-гем взаємодія обумовлено не просто наявністю декількох гемов в молекулі, а тим, що після оксигенації одного гема змінюються умови оксигенації інших гемов тієї ж молекули. Потім нахил кривої збільшується. Тангенс кута максимального нахилу отримав назву коефіцієнта Хілла (n), який відображає ступінь кооперативності процесу. Для міоглобіну n = 1, а для гемоглобіну людини (в нормі) n ~ 3. Поблизу області повного насичення гемоглобіну киснем нахил кривої знову стає рівним 45 ° (більшість молекул гемоглобіну або не містять вільних гемов, або мають лише один гем, здатний приєднати кисень).

Механізм кооперативності У 1963 році Моно, Шанже і Джекоб виявили, що активність деяких ферментів змінюється стрибком між двома значеннями при впливі на білок деяких низькомолекулярних агентів, які не беруть участі безпосередньо в каталітичному акті. Такі ферменти отримали назву аллостеріческій, а саме явище - аллостеріі. Передбачається, що ці ферменти можуть перебувати в різних станах, перемикання між якими здійснюється за приєднання специфічного низькомолекулярного ліганду (необов'язково поблизу активного центру). У 1965 році Моно, Вайман і Шанже зрозуміли, що гемоглобін, не будучи ферментом, належить до того ж класу білків. До того часу вже було відомо, що структури глобул оксигемоглобіну і гемоглобіну різні, і автори припустили, що стану з різними значеннями констант оксигенації відповідають різним просторовим структурам білка. Для гемоглобіну постулюється наявність двох таких станів: R (від англ. Relaxed) і Т (від англ. Tense). Стан R характеризується високим, а Т - низькою спорідненістю до О ₂ (сильніше й слабше пов'язують молекулярний кисень відповідно). У рамках цієї концепції вважається, що як в R-, так і в Т-стані спорідненість до кисню субодиниць однієї глобули (тобто тобто всіх чотирьох гемов однієї глобули) однаково. Цей постулат дозволяє побудувати порівняно просту математичну модель кооперативних властивостей гемоглобіну: До _R, К _Т і L (константи рівноваги реакцій асоціації в станах R, Т і відношення числа молекул гемоглобіну в станах Т і R відповідно). На рис.2, б ясно, що К _Т <До _R. Очевидно, збільшення константи асоціації при переході зі стану Т в стан R відповідає в розрахунку на один гем зміни вільної енергії системи

DG = 2,3 RT lg (K _R / K _T) кДж / моль. (7)

Для гемоглобіну людини при 37 ° С ця "вільна енергія кооперативності" дорівнює 5,61 кДж / моль. У фізіологічних умовах при відсутності кисню лише ~ 3.10 ^{- 5%} молекул гемоглобіну знаходяться в R-формі, а в умовах повного насичення киснем лише ~ 7-10 ^{- 3%} - в Т-формі. [2]

Зміни електронної та просторової структури гемоглобіну в процесі оксигенації На рис.4 схематично показані електронна структура заліза гему, положення атома заліза щодо площині порфіринового кільця гема, спектральні та магнітні характеристики молекул у різних станах молекули гемоглобіну: дезоксигемоглобин, оксигемоглобін і ферригемоглобин. Слід підкреслити, що у всіх випадках мова йде про рівноважних станах молекул білка. Ми побачимо далі, що перехід з одного стану в інший потребує значного (у молекулярних масштабах) часу, протягом якого система проходить через кілька нерівноважних станів, помітно відрізняються за своїм фізичним та хімічним властивостям від рівноважних. [2]

У молекулі дезоксигемоглобина залізо відстоїть від площини порфіринового кільця приблизно на 0,5-0,6 А ° (є невеликі відмінності між a-і b-субодиницями). З шести 3d електронів заліза Fe (II) два електрони спарені на одній з нижчих d-орбіталей (d _xy, d _yz, d _xs), а чотири електрона займають залишилися d-орбіталі, їх спінові моменти, згідно з правилом Хунда, паралельні і сумарний спін ​​S -2. Магнітний момент гему в цьому стані дорівнює ~ 5,5 Борівського магнетону (БМ), а спектр поглинання в зеленій області має характерну смугу з l _max ~ 556 нм. Приєднання кисню веде до значних змін. Атом заліза в оксигемоглобін лежить практично в площині порфіринового кільця (відстань до площини становить 0,16 А ° в α-і 0,00 А ° в β-субодиниць). Всі шість d-електронів спарені на трьох нижчих d-орбіталях, S = 0, оксигемоглобін диамагнитен. У зеленій області спектру є дві характерні смуги поглинання: а (l _max 576 А °) і b (542 А °).

Рис.4. Основні характеристики молекули гемоглобіну в різних станах.

У ферригемоглобине (метгемоглобін) при нейтральних значеннях рН місце кисню займає молекула води (при лужних значеннях рН-ОН), залізо знаходиться значно ближче до площини гема, ніж у дезоксигемоглобина, всі п'ять d-електронів неспарени і займають п'ять d - ​​орбіталей. S = 5 / 2 та магнітний момент дорівнює 5,91 БМ.

Структурні зміни в активному центрі (поблизу гема) призводять і до значних змін просторової структури всього білка. При оксигенації (перехід від Т-к R-формі) зміщення окремих амінокислотних залишків сягає 7 А °. Як вже було сказано вище, четвертинна структура гемоглобіну характеризується наявністю чотирьох поліпептидних ланцюгів, що утворюють дві (a-і дві b-субодиниці). Більш детальні дослідження показали, що субодиниці утворюють ab-димери. ТЮR - перехід супроводжується поворотом одного димера щодо іншого на 12-15 ° і в кінцевому підсумку призводить до збільшення кишень, в яких знаходяться геми. Ці структурні зміни ініціюються приєднанням перший молекули О ₂ до одного з вільних гемов і поширюються на всю глобулу. Саме тому в рівноважної суміші завжди присутні тільки Т-і R-форми. Ці димери в Т-формі стягуються 14 додатковими (в порівнянні з R-формою) сольовими містками (водневі зв'язки між іонними чи нейтральними групами аминоксилот, ван-дер-ваальсові контакти). Крім того, між b-субодиницями в Т-формі приєднується молекула дифосфоглицерата, що також призводить до звуження кишень. Ці зміни схематично представлені на рис.5.

Тригером для всіх описаних вище структурних перебудов при переходах між Т-і R-формами і назад служить приєднання або відщеплення кисню. Після локального елементарного хімічного акта: приєднання або відщеплення низькомолекулярного ліганду, окислювання заліза при утворенні ферригемоглобине (інакше кажучи, після появі зайвої позитивного заряду на залозі) - виникає істотно нерівноважний конформационное стан - зміни поблизу активного центру вже відбулися, а вся величезна молекула білка залишилася в колишньому, ще не отрелаксіровавшем стані. Подальша релаксація може займати мікросекунди і навіть секунди. У ході цієї релаксації змінюються не тільки фізичні, а й хімічні властивості білка, зокрема швидкості наступних хімічних актів, якщо вони встигають відбутися до повного завершення релаксації. Таким чином, описана вище картина процесів, що супроводжують оборотне зв'язування кисню гемоглобіном, є лише першим, хоча і дуже важливим наближенням до істини. Так, наприклад, швидке відновлення заліза в ферригемоглобине коротким (мікро-або наносекунди) імпульсом електронів призводить до виникнення нерівноважного стану, в якому залізо вже відновлено, але не відійшло від площини порфіринового кільця. За спектральним і магнітним характеристикам цей стан відповідає рівноважному оксигемоглобін. Релаксація гема і його найближчого оточення з видаленням заліза від площини порфіринового кільця займає при кімнатній температурі десятки мікросекунд, а повна релаксація всієї білкової глобули до рівноважної Т-формі дезоксигемоглобина - сотні мілісекунд.

Рис. 5. Структурна схема переходу гемоглобіну від Т-к R-формі

Інші реакції і функції гемоглобіну При взаємодії молекулярного кисню з гемоглобіном існує невелика, але кінцева ймовірність окислення останнього: молекула О ₂ не приєднається, але окислить залізо: Fe ^{2 + +} O ₂ Ю Fe ^{3 +} O ₂ ^-. Тому при диханні в еритроцитах безперервно утворюється метгемоглобін. Для його відновлення в еритроциті існує спеціальна ферментативна система, відновлює метгемоглобін і перетворює його в нормальний дезоксигемоглобин. При порушенні цієї системи виникає важке захворювання - метгемоглобінемія, при якому гемоглобін перестає бути переносником кисню.

Гени, відповідальні за синтез гемоглобіну, можуть піддаватися мутацій, що змінює структуру і функції білка. Найбільш вивчена мутація, що призводить до заміни тільки однієї амінокислоти в полпептідних ланцюжках b-субодиниць гемоглобіну. Заміна глутаміну на валін призводить до важкої хвороби - серповидноклеточной анемії: еритроцити приймають форму серпа і втрачають здатність переносити кисень.

Приєднання кисню змінює кислотно-основні властивості гемоглобіну. Оксигемоглобіну є сильнішою кислотою, ніж дезоксигемоглобин. Тому в тканинах, де значна частина гемоглобіну втрачає кисень і стає більш сильною основою, гемоглобін пов'язує утворюється в ході метаболічних внутрішньоклітинних процесів вуглекислоту. В альвеолах легень дезоксигемоглобин знову перетворюється на оксигемоглобін, стає більш сильною кислотою і сприяє отщеплению СО _2. Це злегка спрощений опис важливого процесу транспорту вуглекислоти еритроцитами. Вуглекислота, що звільняється тканинами, недостатньо добре розчинна для ефективного переносу. За допомогою ферменту карбоангідрази, прискорюючого пряму і зворотну реакцію

СО ₂ + Н ₂ ОИНСО ₃ ^- + Н ⁺ (8)

двоокис вуглецю перетворюється в добре розчинний бікарбонат-аніон. У капілярах тканин відщеплення кисню підвищує вміст дезоксигемоглобина, що зв'язує протони і зміщуються, таким чином, рівновага реакції (8) вправо. Легко розчинний іон бікарбонату переноситься кров'ю. В альвеолах легень гемоглобін оксигенеруюче, протони звільняються і рівновагу (8) зміщується вліво. Утворюється погано розчинна двоокис вуглецю СО _2, яка видаляється з водної фази і видихається. Таким чином, гемоглобін працює як буфер зі змінним значенням pK. Функція гемоглобіну як переносника вуглекислоти не менш важлива, ніж його функція переносника кисню.

Гемоглобін - одне з найбільш добре вивчених білків. Десятки років досліджень гемоглобіну в описі і розумінні фізичних, хімічних і біологічних аспектів його функціонування. Величезний внесок внесли роботи Макса Перутца і його співробітників у Кавендішської лабораторії (Кембрідж, Великобританія). Проте важливість цих робіт стосується не тільки гемоглобіну. Вони послужили основою розвитку сучасних уявлень про механізми ферментативного каталізу, зв'язавши безпосередньо кінетику і термодинаміку біохімічних реакцій з динамікою конформаційних змін макромолекул білка. Якщо відволіктися від безпосередньої практичної користі отриманих результатів для медицини, фармакології, то фундаментальне значення робіт з вивчення механізму функціонування гемоглобіну полягає в стимулюванні прогресу у встановленні законів перебігу найважливіших процесів: ферментативного каталізу і внутрішньоклітинної трансформації енергії в біологічних системах. [2]

Про участь гемоглобіну в мембранної організації еритроцитів свідчить феномен освіти серповидної та інших форм еритроцитів при різних гемоглобинопатиях, першооснову якого і складає аномальне взаємодія еритроцитарної мембрани з мутантними гемоглобінами. Не виключено, що зміна пружно-механічних властивостей еритроцитарних мемран при підвищенні негативного заряду їх зовнішньої поверхні відбувається внаслідок поліпшення умов для створення та структурування білкового шару, що формується за участю гемоглобіну на внутрішній поверхні еритроцитарних мембран. [13]

Показано, що при отриманні безгемоглобінових тіней еритроцитів в препаратах електронно-мікроскопічно виявляється велика кількість везикул діаметром приблизно 100 нм, що свідчить про часткову фрагментації плазматичної мембрани еритроцитів. У той же час якщо в мембранах міститься багато гемоглобіну та інших білків, які виявляються в примембранних шарах, то фрагментації мембрани визначається таким чином, не спостерігається. Є й інші докази стабілізуючого дії гемоглобіну на еритроцитарні мембрани. Наприклад, S. Knutton і співавторам вдалося отримати дві фракції еритроцитарних мембран, різняться змістом пов'язаного з ними гемоглобіну. Ними було показано, що у фракції еритроцитарних мембран з великим вмістом гемоглобіну руйнування липопротеиновой структури мембран при їх дегідротаціі відбувається набагато слабкіше, ніж у випадку з фракцією еритроцитарних мембран з малим вмістом гемоглобіну. В основі зміни умов для структурування білково-утворюючого примембранного шару всередині еритроцитів може лежати зміна електричних поверхневих властивостей на зовнішній стороні. Це можливо внаслідок того, що для мембран в ліпідної зоні дебаевский радіус екранування зарядів набагато більше її товщини, в результаті поверхневі заряди з обох сторін еритроцитарних мембран взаємно впливають один на одного, утворюючи самоузгоджену систему. Крім того, умови для утворення білкового шару, стабілізуючого мембрани еритроцитів, можуть змінюватися й у результаті защелачивания їх внутрішнього середовища, що має місце при суспендированием еритроцитів у лужному або неелектролітной середовищі, наприклад, сахарозний. Це може сприяти гемоглобіну та іншим примембранном білкам за рахунок зміни їх властивостей утворювати міцний прімембранной білковий шар (щодо гемоглобіну, наприклад, відомо, що його властивості, в тому числі кіслородосвязивающіе, сильно змінюються при варіюванні рН). Разом з тим защелачивание внутрішнього середовища еритроцитів не завжди може служити фактором, що стабілізує їх структуру. У літературі, наприклад, стверджують, що для еритроцитів новонародженого теляти, для яких характерна наявність фетального гемоглобіну, будь-які експериментальні маніпуляції, результатом яких є внутрішньоклітинний защелачивание середовища, викликають їх самовільний гемоліз. У міру розвитку організму теляти (2-3 місяці життя) еритроцити з нормальним гемоглобіном, що з'являються замість усували з кровоносного русла клітин, що містять фетальний гемоглобін, стають стійкими до внутрішньоклітинного защелачиванию їхнього середовища. При цьому важливо відзначити, що, за даними літератури, в гемолізі фетальних еритроцитів при защелачивании їх внутрішнього середовища, крім фетального гемоглобіну, певна роль належить і мембранному білку band III. [13]

Наведені літературні дані дають підставу зробити висновок про тісний взаємозв'язок процесів метаболізму, трансмембранного транспорту, змін форми і механічних властивостей еритроцита, що, мабуть, дозволяє організму здійснювати координовану регуляцію функціонування клітини через відповідні рецепторні структури, наявні на зовнішній поверхні мембрани. [9]

Таким чином, у підтримці структурної цілісності еритроцитів важливе значення мають внутрішні примембранних білкові шари, структура і взаємодія яких з еритроцитарними мембранами взаємно обумовлені і в цілому являють собою єдину структурну організацію. Тому будь-яка модифікація як самої мембрани, так і що міститься в них гемоглобіну в кінцевому рахунку супроводжується і модифікацією цієї особливої ​​організації, приватним прикладом прояву якої може бути зміна її механічних властивостей. [13] Наведені дані спонукали нас провести дослідження з оцінки кількісного вмісту мембрансвязанного гемоглобіну еритроцитів людини та її зв'язку із структурними білками.

матеріал і методи дослідження

Матеріал дослідження

Матеріалом цього дослідження послужили еритроцити 124 практично здорових осіб, що проживають в місті Курську, у віці від 18 до 47 років. Набір добровольців проводився при виключенні будь соматопатологіі.

У обстежуваних проводився забір крові з ліктьової вени в суху стерильну посуд у кількості 5-7 мл з метою отримання образів еритроцитарних мембран.

Методи дослідження

Для досягнення поставленої мети і вирішення завдань цієї роботи використовувався комплекс методів.

Біохімічні методи.

Реактиви та біоматеріали. У роботі використовувалися: декстран Т-500 фірми "SIGMA" (США), HBS - целюлоза фірми "SIGMA" (США), гідрофосфат натрію, хлористий натрій, сечовина фірми "Bio-Rad" (США), трис, 2 - меркаптоетанол, персульфат амонію "Reanal" (Угорщина), додецилсульфат натрію (ДДС) фірми "Діа-Фарм" (Росія), акриламід "SIGMA" (США), N, Nў - метилен бісакріламід "FLUKA" (Швейцарія), Кумассі G - 250 фірми "Serva" (ФРН), бромфеноловий синій, ТЕМЕД, гліцин, набір білків для визначення молекулярної ваги MS-2 (Росія).

Реактиви вітчизняного виробництва були марки "хч" і "ОСЧ".

Отримання еритроцитів. Еритроцити отримували з 5 мл гепаринизированной крові за методом Бейтлера з незначною модифікацією. [14] Спочатку гепаринизированную кров відстоювали двічі в розчині PBS, що містить 3% декстран Т -500, протягом 30 хвилин. Потім еритроцитарну масу піддавали додатковому очищенню, пропускаючи її через колонку з HBS-целюлозою, після чого еритроцити ценріфугіровалі при 3000 оборотах на хвилину. Далі з отриманої очищеної маси еритроцитів проводили виділення мембран.

Виділення мембран. Для отримання препаратів мембран еритроцити руйнували осмотичним шоком за методом Dodge з невеликою модифікацією, яка полягала в тому, що гемоліз еритроцитів і відмивання "тіней" проводили дворазово в 10 мМ Na - фосфатному буфері з додаванням інгібітору протеназ PMSF. Після цього мембрани еритроцитів ліофілізована і зберігали при -20 ° С.

Одновимірний електрофорез по Леммлі. Електрофорез у присутності ДДС проводили модифікованим методом методом Леммлі. [14] Для цієї мети використовували такі розчини:

1. 60% акриламід -0,8% метилен бісакріламід.

2. Буфер для розділяє гелю: 1 М трис - HCI (pH 8,8).

3. Буфер для концентруючого гелю: 0,5 М трис - HCI (pH 6,8).

4. 10% додецилсульфат натрію.

5. 10% персульфат амонію.

6. ТЕМЕД.

7. Електродний буфер для ЕФ: 0,025 М трис, 0,193 М гліцин, 0,1% додецилсульфат натрію.

Розчини зберігалися при +4 ° С дві-три тижні. Розчин 5 готувався перед використанням.

Електрофорез проводили в пластинах ПААГ розміром 180х180х1мм, приготованих з лінійним градієнтом концентрації акриламіду 5 - 25%.

Для приготування однієї пластини ПААГ брали: 0,85 мл розчину 1, 5,5 мл дистильованої води, 3,6 мл розчину 2, 101 мкл розчину 4, 5 мкл розчину 6 і 20 мкл розчину 5 (легкий розчин, 5%). У важкому (25%) розчині на відміну від легкого бралося 4,2 мл розчину 1 і 2,6 мл дистильованої води. Через змішувач ці розчини подавалися перистальтичним насосом у формувач пластини, протягом 10 хвилин заповнюючи пластину на 4 см нижче верхнього краю. Зверху на полімеризується суміш нашаровувалося 0,5 мл дистильованої води. Так формувався розділяє гель. Полімеризація тривала протягом 30-40 хвилин. Після полімеризації воду видаляли і заливали розчин, формуючий концентрує гель. Для приготування такого розчину брали 660 мкл розчину 1, 100 мкл розчину 4, 2,5 мл розчину 3, 4 мкл розчину 6, 70 мкл розчину 5 і 6 мл дистильованої води. Вставляли формувач лунок і нашаровуються 0,3 мл дистильованої води. Полімеризація тривала протягом 20 хвилин, після чого пластини ПААГ могли зберігатися при = 4 ° С протягом двох діб.

Підготовка проб Для приготування аналізованого зразка для ЕФ брали 1 мг ліофілізованих мембран еритроцитів і розчиняли в 40 мкл врівноважує буфера, до складу якого входили:

(На 10 мл врівноважує буфера)

1. 3 г сечовини;

2. 0,2 г ДДС;

3. 1,25 мл розчину 3;

4. 0,5 мл меркаптоетанол;

5. 5 мкл барвника бромфенолового синього.

Врівноважує буфер зберігали при температурі -20 ° С протягом місяця.

Підготовлені таким чином аналізовані зразки стояли протягом однієї години при кімнатній температурі, після чого їх вносили об'ємом 15 мкл у сформовані в концентрирующим гелі лунки.

Електрофорез проводили при силі струму 35 мА, поки напруга не зростала до 300 В, потім стабілізували джерело живлення з даного напрузі і проводили ЕФ цьому режимі, поки що лідирує барвник не доходив 1 см до краю пластини.

Після ЕФ фореграмми фарбували протягом однієї години барвником Кумассі G - 255 за модифікованою методикою Fairbanks в розчині, що містить 10% оцтової кислоти, 25% ізопропанолу, 0,05% Кумассі блакитного. Після цього незв'язану фарбу відмивали протягом 12 годин 10%-ний оцтової кислотою до повного зникнення фонового фарбування.

Відмиті фореграмми потім дегідратованих протягом 30 хвилин у розчині, що містить 280 мл ізопропанолу, 25 мл гліцерину і 195 мл дистильованої води. Далі пластини ПААГ щільно фіксували між двома шарами целюлозного паперу і в натягнутому вигляді висушували при кімнатній температурі.

На Електрофореграма ідентифікували 17 білкових фракцій.

Денсітометрірованіе. Денсітометрірованіе Електрофореграма проводили на лазерному денситометрі «Ultrascan XL». Молекулярну масу білків визначали за допомогою маркерних білків з відомою молекулярною масою: бичачий сироватковий альбумін (Mr = 68 kD), овальбумін (Mr = 43 kD), химотрипсиноген (Мr = 25 kD), міоглобін (Мr = 17,5 kD) і цитохром (Мr = 12,4 kD).

Визначення концентрації білка. Зміст білкових фракцій у досліджуваному зразку визначали за відомою масою маркерного білка бичачого сироваткового альбуміну, через отримані при десітометрірованіі площі альбуміну і кожної білкової фракції окремо за формулою:

m (x) = S (x) ґ4.5 / S (a),

де m (x) - маса білкової фракції,

S (x) - площа цієї фракції під піком на денситограмме

4.5 - маса маркерного білка альбуміну в мкг,

S (a) - площа маркерного білка альбуміну під піком на денситограмме.

Подальший перерахунок кількісного вмісту білкових фракцій проводили на 1 міліграм загального білка.

Методи статистичної обробки

Статистична обробка матеріалу проведена на ПВМ IBM PC / AT (486) з використанням програми "Gen 1", складеної д.б.н Трубникова В.І. та пакету прикладних програм "STATGRAPHICS v3.0".

При описі кількісних ознак використовувалися параметри нормального розподілу: середнє значення, стандартна похибка середнього значення, несмещенная дисперсія. Для перевірки статистичних гіпотез використовувалися параметричні критерії Ст'юдента і Фішера. Рівень значущості брали рівний 0,05.

Кластерний аналіз. При проведенні кластерного аналізу в якості об'єктів виступали індивіди і досліджувані ознаки, а мірою подібності служили коефіцієнти кореляції без урахування знака. Результати кластерного аналізу дозволили визначити відповідно некорельованих групи досліджуваних параметрів, що детермінують фенотипическую мінливість ознак. На кожному кроці кластеризації вибирався найбільший за значенням елемент матриці, що стоїть на перетині i-го рядка і j-го стовпця об'єднання i-го і j-го ознак у кластер, що розглядається як новий ознака. Для виділення кластеру перераховувалися значення коефіцієнтів кореляції в матриці з тим, щоб на наступному кроці кластеризації пошук максимального коефіцієнта кореляції проводився з урахуванням попередніх результатів. Наведений алгоритм кластерного аналізу служив лише для підрозділу кореляційної матриці на окремі підсистеми без перевірки статистичної значимості рівнів об'єднання кластерів. Перевірка гіпотези про некорельованість виділених підсистем здійснювалася з використанням спеціальних критеріїв.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Кількісний вміст гемоглобіну та основних білків мембран еритроцитів людини.

У ході даної роботи нами було проведено вивчення кількісного вмісту основних білків еритроцитарних мембран і мембрансвязанного гемоглобіну. Отримані результати представлені в таблиці 1.

У залежності від електрофоретичної рухливості білки були розділені на 15 фракцій, 16-ю склав гемоглобін. При електрофорезі білкові фракції розташувалися в міру зменшення молекулярних мас білків. З таблиці 1 видно, що найбільш представницькими білками в мембранах еритроцитів людини є анионтранспортного білок смуги 3, a-і b-спектрин і актин. Друге місце за кількісним вмістом зайняли білки смуги 4.5 (транспортер глюкози і нуклеозидів), білки смуги 7 (основним білком цієї смуги є тропомиозин) і білок смуги 4.2 (паллідін).

Менш представницькими виявилися анкирина 2.1, 2.2, і 2.3, білок смуги 4.1, гліцеральдегид-3-фосфатдегідрогеназа і глутатіон-S-трансфераза. Найменшим вмістом відрізнявся білок смуги 4.9 і зв'язана з мембраною гемоглобін. Кількісний вміст гемоглобіну склало 17,40 ± 0,74 мкг на 1 мг загального білка мембран. Крім того, гемоглобіну відповідало і найменше значення дисперсії (d ² = 66,91).

Проведене дослідження кількісного вмісту основних білків мембран еритроцитів дозволило оцінити їх показність. Отримані нами показники узгоджуються з літературними даними. [4, 5]

Взаємне варіювання кількісної показності окремих білків еритроцитів людини.

З метою встановлення особливостей взаємного варіювання змісту білкових фракцій в аналізованих зразках нами був проведений багатомірний кількісного вмісту білків еритроцитарних мембран людини. Була побудована матриця фенотипових кореляцій кількісного вмісту гемоглобіну і основних білків мембран еритроцитів. Дана матриця представлена ​​в таблиці 2. З неї видно, що отримані коефіцієнти кореляції мали як позитивну, так і негативну спрямованість.

Для встановлення пріоритетності у взаємозв'язках варіабельності кількісного вмісту гемоглобіну та основних мембранних білків еритроцитів нами був проведений кластерний аналіз. Отримані результати представлені на рисунку 6.

Кластерний аналіз кореляційної матриці дозволив виділити 4 групи взаимнокоррелирующих білків за їх кількісним вмістом. Першу групу склали a-і b-спектрин, білки смуги 4.1, 4.2 (r = 0,255). До складу другої групи увійшли анкирина 2.1, 2.2 та 2.3 (r = 0,278). Третю групу утворили гемоглобін, тропомиозин, глютатіон-S-трансфераза і білок смуги 4.5.1 (r = 0,316). Четверту групу склали актин, білки смуги 4.5, гліцеральдегид-3-фосфатдегідрогеназа і анионтранспортного білок смуги 3 (r = 0,209). Виняток склала фракція 4.9, варіабельність кількісного змісту якої носила незалежний характер.

Низький рівень об'єднання спостерігався між кількісним вмістом анкирином 2.3 і анкирином 2.1 і 2.2 (r = 0,278), актином і білком смуги 4.5 (r = 0,327).

Малюнок 6

Дендрограмма фенотипових кореляцій кількісного вмісту гемоглобіну і основних білків мембран еритроцитів людини

N = 124 R (5%) = 0,176

Групу кластерів із середнім рівнем об'єднання склали анкирина 2.1 і 2.2 (r = 0,434), глутатіон-S-трансфераза і білок смуги 4.5.1 (r = 0,409), гліцеральдегид-3-фосфатдегідрогеназа і білок смуги 3 (r = 0,370).

Високий рівень об'єднання мав місце між кількісним вмістом a-і b-спектрином (r = 0,506)

Найвищий рівень об'єднання (r = 0,595) відповідав кількісним вмістом гемоглобіну і білків смуги 7, основним складовим білком якої є тропомиозин.

Обговорення

На основі отриманих даних встановлено, що найбільш представницькими білками в мембранах еритроцитів людини є анионтранспортного білок смуги 3, a-і b-спектрин, а також актин. Найменша кількісний вміст відповідає мембрансвязанного гемоглобіну. Незважаючи на те, що він міститься в мембрані еритроцитів людини в меншій кількості, гемоглобін грає важливу роль як в освіті та підтримці стабільності цитоскелету, так і в механізмах ферментативного каталізу і внутрішньоклітинної трансформації енергії.

Отримані дані дозволили припустити, що в еритроцитарних мембранах розглядаються білки у взаємному варіюванні їх кількісного вмісту утворюють 4 групи взаимнокоррелирующих систем. Причому кожна з цих груп по відношенню до решти характеризується відносною незалежністю.

Згідно з результатами нашого дослідження кількісний вміст гемоглобіну найбільш тісно пов'язаний зі змістом тропомиозина. Про причини цього поки судити важко внаслідок недостатньої кількості даних, що стосуються цього питання - у доступній нам літературі він не отримав належного освітлення. Але ми сподіваємося, що отримані дані слугуватимуть основою для подальшої деталізації у вивченні зв'язку гемоглобіну зі структурними білками.

Таким чином, отримані нами дані свідчать про складну структурної та функціональної взаємозв'язку білків в мембранах еритроцитів.

висновок

Цитоплазматичні мембрани ерітоцітов людини відіграють ключову роль у забезпеченні та регуляції фізіологічної активності цих клітин. Специфічні функції мембран забезпечує складна структурна організація, головним компонентом якої є білки.

Сучасні біохімічні та біофізичні методи дозволили виділити практично всі основні мембранні білки еритроцитів, вивчити їх біохімічну структуру та основні аспекти функціонування. Разом з тим у науковій літературі не отримав належного висвітлення питання про структуру мембрансвязанного гемоглобіну, про його зв'язок із структурними білками. Нами була проведена оцінка кількісного вмісту гемоглобіну і основних білків мембран еритроцитів людини, так як нормальне функціонування мембрани визначається не тільки присутністю білкових компонент, але і їх кількісним змістом.

Крім того був зроблений аналіз взаімоварьірованія кількісного вмісту гемоглобіну і структурних білків. У ході дослідження нами було встановлено факт взаємозалежності кількісного вмісту гемоглобіну і тропомиозина. Результати даного дослідження можуть служити основою для подальшої деталізації у вивченні зв'язку гемоглобіну зі структурними білками. Нами планується провести ряд досліджень з метою вивчення кількісного вмісту гемоглобіну та його взаємозв'язки із структурними білками мембран еритроцитів не тільки в нормі, але і при різних патологічних станах. З тим, щоб прогнозувати поряд з рівнем даних порушень їх зв'язок між собою і вплив на них змін навколишнього середовища.

висновки

1. Кількісний вміст гемоглобіну в мембранах еритроцитів становить 17,40 ± 0,74 мкг на 1 мг загального білка мембран і є найменшим, порівняно з кількісним вмістом інших мембранних білків.

2. Варіабельність кількісного вмісту гемоглобіну характеризується досить високою сопряженностью з коліче37ственним вмістом білка смуги 7 - тропомиозина.

Література

1. Балашов В.І., Реза А.А., Ярига В.В. Вміст гемоглобіну і його дериватів у крові дітей, які проживають у населених пунктах санітарно-захисної зони астраханського газового комплексу / / Педіатрія. - 1995. - № 2. - С.75-77.

2. Блюменфельд Л.А. Гемоглобін / / Соросівський освітній журнал. - 1998. - № 4. - С.33-38.

3. Гааль Е., Медьєші Г., Верецький Л. Електрофорез у поділі біохімічних макромолекул. - М. - 1982. - 446с.

4. Гончаренко М.С., Андрух Г.А., Рязанцев В.В. Білковий спектр еритроцитарних мембран у нормі і при псоріазі / / Вісник дерматології і венерології. - 1989. - № 3. - С.4-7.

5. Гончарова Є.І., Пінаєв Г.П. Білки цитоскелету еритроцитів / / Цитологія. - 1988. - Т.30, № 1. - С.5-18.

6. Громов П.С., Захаров С.Ф., Шишина С.С., Іллінський Р.В. Двовимірна карта мембранних білків еритроцитів людини / / Біохімія. - 1988. - Т.53, вип.8. - С.1316-1326.

7. Громов П.С., Шандала А.М., Ковальов Л.І., Шишкін С.С. Вивчення білків мембран еритроцитів людини методом двовимірного електрофорезу / / Бюлетень експериментальної біології і медицини. - 1986. - № 7. - С.28-30.

8. Казенне А.М., Маслова М.М. Вплив мембранного скелету без'ядерних еритроцитів на властивості транспортних АТФаз / / Цитологія. - 1991. - Т.33, № 11. - С.32-41.

9. Казенне А.М., Маслова М.М. Структурно-біохімічні властивості мембрани без'ядерних еритроцитів / / Фізіологічний журнал СРСР ім. І. М. Сєченова. - 1987. - Т.73, № 12. - С.1587-1594.

10. Казенне А.М., Маслова М.Н., Шагабодов А.Д. Роль білків мембранного скелету без'ядерних еритроцитів у функціонуванні мембранних ферментів / / Докл. АН СРСР - 1990. - Т.312. - № 1. - С.223-226.

11. Лакин Г.Ф. Біометрія: Навчальний посібник для біол. спец. Вузів - 4-е вид., Перераб. і доп. - М.: Висш.шк., 1990. - 352с.

12. Остерман Л.А. Методи дослідження білків і нуклеїнових кислот. Електрофорез і ультрацентрифугирование. - М.: Наука, 1981. - 288с.

13. Петренко Ю.М., Владимиров Ю.А. Роль поверхневих зарядів у підтримці осмотичної резистентності еритроцитів / / Гематологія і трансфузіологія. - 1987. - № 10. - С.15-18.

14. Солодилова М.А. Роль генетичних та середовищних факторів у детермінації кількісного вмісту основних білків мембран еритроцитів людини / Дис. на здобуття наукового ступеня к.б.н. - М., 1999. - 160с.

15. Шандала А.М., Захаров С.Ф., Громов П.С., Шишкін С.С. Білковий склад мембран еритроцитів людини, фракційних в ступінчастому градієнті декстрану / / Гематологія і трансфузіологія. - 1987. - № 10. - С.28-31.