Вільна субодиниця хоріонічного гонадотропіну людини як маркер синдрому Дауна

Вільна β-субодиниця хоріонічного гонадотропіну людини як маркер синдрому Дауна

Семенова Д. В. (dianna@yandex.ru), магістр техніки і технології, випускниця 2003 СПбГПУ, факультет медичної фізики та біоінженерії, кафедра фізико-хімічних основ медицини.

В останнє десятиліття широко обговорювалася можливість проведення пренатального скринінгу синдрому Дауна у першому триместрі вагітності. Було запропоновано кілька сироваткових маркерів цієї патології, проте найбільш інформативними з них виявилися вільна β-субодиниця хоріонічного гонадотропіну і асоційований з вагітністю білок плазми А. На даний момент в Росії оцінити ризик народження дитини з синдромом Дауна можна тільки в другому триместрі вагітності. Це пояснюється новизною і високою вартістю тесту.

Free β-subunit of human chorionic gonadotropin as Down's syndrome marker.

Semenova DV (dianna@yandex.ru), magister of technology (2003), Saint Petersburg State Polytechnical University.

Key words: free β-subunit of human chorionic gonadotropin, divnatal screening, Down's syndrome.

In the past decade the possibility of Down's syndrome divnatal screening in the first trimester of divgnancy was broadly discussed. Several markers were suggested, but the most informative of them were appeared free β-subunit of human chorionic gonadotropin and divgnancy-associated plasma protein A. To this moment in Russia to evaluate the risk for Down's syndrome affected divgnancy is possible only in the second trimester of divgnancy, because of cost and test newness.

Введення

Синдром Дауна - одна з найбільш часто зустрічаються вроджених захворювань, викликане трисомія по 21 хромосомі. За даними ВООЗ, з 1000 новонароджених генетичні патології мають 16 дітей [1], з яких 1-2 народжуються з хворобою Дауна [2]. Висока частота і тяжкість цього захворювання визначає необхідність широкого застосування пренатальної діагностики.

Пренатальна діагностика синдрому Дауна включає в себе два етапи:

Скринінгове дослідження за допомогою різних маркерів, призначене для оцінки ризику народження хворої дитини.

Діагностична процедура, спрямована на з'ясування каріотипу дитини для точного встановлення діагнозу [3].

Клітини плоду для картування хромосом отримують шляхом амніоцентезу (забору амніотичної рідини, що містить деяку кількість клітин плоду) або пункції хоріона. Обидві ці процедури підвищують ризик спонтанного аборту - на 0,2% у разі амніоцентезу і на 0,5-0,8% у випадку біопсії хоріона [4]. Тому такі процедури вимагають високої кваліфікації персоналу і, перш за все, повною обгрунтованості її проведення. Направлення на діагностичну процедуру визначається ризиком наявності патології плоду, який оцінюється за допомогою маркерів.

У 80-х роках минулого століття була встановлена ​​доцільність вимірювання концентрацій α-фетопротеїну і хоріонічного гонадотропіну в сироватці крові вагітних жінок у другому триместрі [5, 6]. Це дослідження дозволяло виявляти 70% випадків синдрому Дауна у дитини, що розвивається на цьому терміні вагітності [7]. Пізніше намагалися застосовувати їх для пренатального скринінгу в першому триместрі, але інформативність аналізу різко знижувалася [8].

Були знайдені інші маркери синдрому Дауна першого триместру: вільна субодиниця β-ХГЛ (хоріонічного гонадотропіну людини) і білок РАРР-А, а також ультразвуковий маркер - товщина комірцевої зони (nuchal translucency), які при спільному використанні дозволяють виявляти до 80% випадків при 5 % помилково-позитивних результатів [8, 9].

У кровотік матері вільна β-ХГЛ надходить внаслідок секреції клітинами трофобласта, а також як один з продуктів розпаду ХГЛ. Вимірювання концентрації вільної β-ХГЛ разом з асоційованим з вагітністю білком плазми А (РАРР-А) та ультразвукове вимірювання товщини комірцевого простору дозволяють виявити до 90% випадків синдрому Дауна в першому триместрі вагітності. Крім того, вільна β-ХГЛ також продукується пухлинними клітинами різного походження.

У зв'язку з цим молекула вільної β-субодиниці ХГЛ широко вивчалася. Картіровани її гени, вивчена амінокислотна послідовність і зміст вуглеводів, а також методом рентгеноструктурного аналізу отримано подання про її тривимірної структурі. Є велика кількість даних про метаболізм ХГЛ, в ході якого утворюється вільна β-субодиниця.

Для визначення вмісту вільної β-ХГЛ були отримані і досліджені моноклональні антитіла до неї. На поверхні β-ХГЛ є кілька епітопів, що утворюють чотири антигенних домену, тільки два з яких виявляються на вільній формі β-субодиниці ХГЛ. Це створює труднощі при розробці систем імунохімічної діагностики, тому що в крові міститься кілька дериватів ХГЛ, що виступають у ролі крос-реактантов, причому їх співвідношення з вільною β-ХГЛ становить 97:3.

У Росії пренатальний скринінг синдрому Дауна в першому триместрі знаходиться на стадії апробації та оцінки його діагностичної значимості і до цих пір не запроваджено в широку лабораторну практику. Це пояснюється новизною аналізу і високими цінами на набори регентів для іммунометріческого визначення сироваткових маркерів, які виробляють закордонні компанії. У нашій країні вперше розпочата розробка імуноферментної тест-системи для визначення концентрації вільної β-ХГЛ у сироватці крові вагітних у першому триместрі.

Структура β-субодиниці ХГЛ і кодують її гени.

ХГЛ, що синтезується плацентою, відноситься до того ж сімейства глікопротеїнових гормонів, що і лютеїнізуючий (ЛГ), фолікулостимулюючий (ФСГ) та тиреотропний (ТТГ) гормони, які продукують передньою часткою гіпофіза. Всі вони є димерной білками, що складаються з двох неоднакових Глікопротеїдний субодиниць, пов'язаних нековалентно. Загальна у всіх чотирьох гормонів α-субодиниця, кодована одним геном, складається з 92 амінокислот і містить два N-зв'язаних вуглеводних комплексу; β-субодиниця у всіх гормонів різна і містить від 114 до 145 амінокислотних залишків і 1-6 N-і O- пов'язаних вуглеводних радикалів [10]. Амінокислотна послідовність перших 114 амінокислот β-субодиниці ХГЛ гомологічна ЛГ на 85%, ФСГ на 36% і ТТГ на 46%. Висока гомологія між ЛГ і ХГЛ визначає спільність їх біологічної функції, так як вони взаємодіють з одним рецептором.

β-субодиниця ХГЛ складається з 145 амінокислот, у тому числі 12 цистеїном, що утворюють 6 дисульфідних зв'язків у положеннях 9-57, 38-90, 34-88, 23-72, 26-110 і 93-100, причому перші три утворюють « цистинових вузол »(cystine knot). Просторова конформація і стабільність молекули β-субодиниці в значній мірі визначається дисульфідними зв'язками (рис. 1), що характерно і для α-субодиниці, яка має дуже схожу просторову конформацію [11]. «Цистинових вузол» був також знайдений у трьох ростових факторів: nerve growth factor (NGF) [12], transforming growth factor β2 (TGF-β2) [13] і platelet-derived growth factor-β (PDGF-β) [14] .

Зображення просторової конформації β-субодиниці ХГЛ, отримане методом рентгеноструктурного аналізу. У молекулярній структурі виділяють дві «петлі-шпильки», пов'язані дисульфідній зв'язком 23-72, одну довгу петлю, гідрофобну корову область, що включає в себе «цистинових вузол», і С-термінальний пептид, званий «seat-belt» (ременем безпеки) , який охоплює α-субодиницю, і його положення фіксується дисульфідній зв'язком 26-110. Дисульфідні зв'язки показані червоним кольором.

У нативної молекулі ХГЛ β-субодиниця містить два N-зв'язаних олігосахариду, приєднаних до залишків аспарагіну в положеннях 13 і 138, а також чотири O-пов'язаних із залишками серину олігосахариду в положеннях 121, 127, 132 і 138. Вуглеводи складають 34% від всієї маси молекули ХГЛ і виділяють його зі всього сімейства як найбільш важко глікозильований гормон [15].

Кластер генів, що кодують β-субодиниці ХГЛ і ЛГ, локалізований на 19-й хромосомі в області 13.3 довгого плеча [16, 17]. У ньому міститься шість копій гена β-ХГЛ, розташованих один за одним в прямий і зворотній послідовності [16] і один ген β-ЛГ на правому кінці кластера. Присутність декількох активних генів β-ХГЛ визначає високий рівень продукції ХГЛ на початку вагітності.

Вільна β-субодиниця та інші метаболічні форми ХГЛ в крові

Молекула ХГЛ і її вільні α-і β-субодиниці секретуються клітинами трофобласта в ході його нормального розвитку і при трофобластичних захворюваннях, клітинами пухлин різного походження, а також у невеликих кількостях гіпофізом [17]. Секреція вільних субодиниць відбувається або внаслідок незалежної регуляції синтезу субодиниць, або із-за їх не відбулася асоціації. Існують дані, що підтверджують обидві ці причини. На користь першої говорить те, що співвідношення кількостей α-і β-субодиниць ХГЛ змінюється в процесі розвитку плаценти, що дозволяє припускати існування різних шляхів фізіологічної регуляції синтезу двох субодиниць ХГЛ. Є дані про те, що в плаценті у першому триместрі вагітності рівень мРНК α-субодиниці був у 2 рази вище, ніж мРНК β-субодиниці ХГЛ. Це корелювало з рівнем α-і β-субодиниць, доводячи те, що продукція ХГЛ контролюється на претрансляціонном рівні. У плаценті кінця вагітності спостерігалося помітне зниження рівнів мРНК обох субодиниць, але співвідношення субодиниць α: β зростала до 12: 1 [18]. Таким чином, регуляція продукції субодиниць ХГЛ відбувається незалежно, але в цілому вони продукуються в кількості, достатній для забезпечення можливості утворення біологічно активного гетеродімер. Однак є дані, що вказують на існування механізмів, що перешкоджають утворенню димеру ХГЛ. Одним із шляхів порушення взаємодії субодиниць є гіперглікозілірованіе α-субодиниці, що заважає її здатності залучатися в освіту повної молекули ХГЛ [19].

Катаболізм молекули хоріонічного гонадотропіну - це інший шлях надходження вільної β-субодиниці в кровотік. Деградація ХГЛ починається з одиночного розщеплення між 47 і 48 амінокислотами β-субодиниці [20]. Це призводить до різкої втрати функціональної активності ХГЛ та її стабільності у крові (з 1300 годин до 22) [21]. ХГЛ з розщепленої β-субодиницею не здатний взаємодіяти з рецепторами ЛГ / ХГ клітин жовтого тіла і стимулювати продукцію прогестерону, і, можливо, виступає в ролі антагоніста нативного гормону [22]. Розщеплення ХГЛ пов'язують з плацентарною макрофагами, лейкоцитарна еластаза яких чутлива до певного будовою довгою петлі β-ХГЛ: послідовність гідрофільних амінокислот змінюється послідовністю гідрофобних амінокислот (рис.2). У зв'язку з цим поява вільної β-ХГЛ в крові може залежати від кількості чи активності плацентарних макрофагів [12].

Після розпаду субодиниць, розщеплена молекула β-ХГЛ втрачає С-термінальний пептид (область 93-145 амінокислот) і деградує до кінцевого продукту розпаду ХГЛ - β-кор-фрагмента (дві ділянки β-субодиниці, 6-40 і 55-92, з'єднані чотирма дисульфідними зв'язками) (рис.3). Катаболізм ХГЛ призводить до появи в крові тільки розщепленої β-ХГЛ.

Всі ці процеси призводять до того, що в плазмі та сечі вагітних жінок виявляється велика кількість дериватів (метаболічних форм і попередників) хоріонічного гонадотропіну. Ця група включає в себе нативний ХГЛ, ХГЛ з розщепленої β-субодиницею, ХГЛ без С-термінального виступу, вільну-субодиницю, вільну гіперглікозілірованную α-субодиницю, вільну β-субодиницю, розщеплену вільну β-субодиницю і β-кор-фрагмент [23 ].

Зміст вільної β-субодиниці ХГЛ у біологічних рідинах в нормі і при патології

Концентрації ХГЛ - нативного і з розщепленої β-субодиницею - у плазмі крові та сечі зростають у першому триместрі вагітності, подвоюючись кожні 48 годин, і досягають піку близько десятого тижня вагітності [24]. Концентрація нативного ХГЛ знижується з десятою по шістнадцяту тижня вагітності, досягаючи приблизно 20% від пікової концентрації, і залишається близько цього рівня до кінця вагітності [25]. У середньому ХГЛ з розщепленої β-субодиницею становить близько 9% від усіх дериватів ХГЛ в плазмі на другому нормальної місяці вагітності і зростає в середньому до 21% на дев'ятому місяці. Незважаючи на в середньому низький вміст розщепленого ХГЛ, індивідуально воно може дуже сильно змінюватися [26]. Зміни концентрації гормону протягом вагітності відображають його основну функцію - підтримання продукції прогестерону жовтим тілом до того як плацента не візьме цю функцію на себе [27].

Концентрація вільної β-ХГЛ у сироватці крові вагітних дуже низька: близько десятого тижня вагітності воно максимально (1-3% від усіх дериватів ХГЛ), а до дев'ятого місяця знижується до 0,5%. Більш високий вміст вільної β-субодиниці спостерігається в сечі, де досягає 9% від загальної кількості дериватів [20].

Вміст у крові та сечі ХГЛ з розщепленої β-субодиницею, вільної β-субодиниці та β-кор-фрагмента значно змінюється при синдромі Дауна у плоду, вагітності, ускладненої преекламсії (пізнім токсикозом) і при трофобластичних захворюваннях (пузирном заметі, трофобластичних пухлинах і хориокарциноме ) [28-31, 34].

У пренатальної діагностики кореляція концентрації будь-яких маркера, в тому числі вільної β-субодиниці ХГЛ, з патологією оцінюється статистично - за вкладом в імовірність народження хворої дитини, що розраховується на підставі декількох чинників. Всі фактори ризику, біохімічні та ультразвукові, оцінюють в одиницях МОМ (multiplies of median, кратності медіані). Потім за допомогою спеціальних статистичних програм розраховується імовірність народження дитини з синдромом Дауна з урахуванням вікового ризику [32, 33].

З 1993 року були проведені скринінгові дослідження, в яких була встановлена ​​доцільність використання вільної β-ХГЛ для скринінгу синдрому Дауна в першому триместрі [8]. Дані цих досліджень представлені в табл. 1.

Таблиця 1

Зміст вільної β-субодиниці ХГЛ у крові жінок у першому триместрі вагітності за наявності синдрому Дауна у плода.

Таким чином, при синдромі Дауна концентрація вільної β-ХГЛ в 2 з гаком рази вище, ніж значення для вибірки в цілому.

Характеристика епітопів β-субодиниці ХГЛ

Розвиток високоспецифічних і чутливих імунохімічних методів для визначення вільної β-ХГЛ в крові засноване на відборі моноклональних антитіл, здатних відрізняти вільну β-ХГЛ від інших метаболітів гормону. Антитіла, специфічно зв'язують вільну β-субодиницю, вперше були отримані в 1981 р. [37]. Після цього було описано велику кількість антитіл, однак чітке уявлення про розташування антигенних областей β-ХГЛ з'явилося тільки після вивчення її кристалічної структури. Численні дослідження методами біохімічної, в т.ч. ензиматичною модифікації, вивчення крос-реактивності в конкурентних імуноаналізу, за допомогою штучних синтетичних пептидів і рентгеноструктурного аналізу призвели до з'ясування епітопной карти β-ХГЛ, вільної β-субодиниці та продуктів її деградації.

Встановлено, що вільна β-ХГЛ має чотири просторово розділених антигенних домену [38]. Два з них локалізовані в С-термінальної області β-ХГЛ і є невеликими слабо імуногенними областями, що складаються кожна з одного епітопів (113-116 і 137-144 амінокислотні залишки) [39]. Третій домен також представлений одним епітопів, локалізованим поблизу від «цистинових вузла» з аргініном в положенні 60 в якості головної детермінанти, і є також слабо імуногенність. Четвертий домен демонструє високу імуногенну активність і представлений чотирма епітопи в області β-кор-фрагмента. Крім того, до цього домену також відноситься один з двох епітопів, специфічних тільки для вільної β-ХГЛ (табл. 2) [40].

Таблиця 2

Розподіл епітопів на дериватів ХГЛ.

«+» - Присутність епітопів на молекулі, «-» - відсутність.

З цих даних видно, що на вільній β-ХГЛ виявляються тільки два епітопів (β6 і β7), антитіла до яких не взаємодіють з молекулою ХГЛ.

Комерційні тест-системи для визначення вмісту вільної β-субодиниці ХГЛ у сироватці крові

З вищесказаного ясно, що складність створення іммунометріческой тест-системи для визначення концентрації вільної β-ХГЛ пов'язана з великою кількістю метаболічних форм ХГЛ, що містяться в крові, і перехресної реакцією антитіл з ними. У зв'язку з тим, що β-ХГЛ становить не більше 3% від усіх дериватів ХГЛ, для конструювання одностадійної системи необхідні високочутливі і специфічні лише до вільної β-субодиниці антитіла [23]. За останніми даними, охарактеризовано всього два антитіла, специфічно зв'язуються з вільною β-ХГЛ (табл. 2).

При огляді комерційних тест-систем (табл. 3), виявилося, що тільки в одній з них використовуються два антитіла, специфічні до вільної β-ХГЛ, що дозволило виробникові (Wallac OY, Фінляндія) [41] створити одностадійний варіант аналізу. Всі інші компанії пропонують двустадійность аналіз. Можна припустити, що у всіх цих системах тільки нижня антитіло має специфічність до вільної β-субодиниці, а верхнє - до повної молекулі ХГЛ.

Таблиця 3

Аналітичні характеристики комерційних тест-систем для визначення концентрації вільної β-субодиниці ХГЛ у сироватці крові («-» означає, що дані не знайдені)

Список літератури

Айламазян Е. К. Антенатальна діагностика та корекція порушень розвитку плода / / Російський вісник перінаталогіі та педіатрії. 1999. № 3. с. 6-11.

Гінзбург Б. Г. Динаміка частоти синдрому Дауна у різних регіонах. / / Російський вісник перінаталогіі та педіатрії. 2000; № 3: с.58.

Wald N. J, Cuckle H. S, Densem JW et al. Maternal serum screening for Downs syndrome in early divgnancy / / BMJ. 1988; 297: 883-7.

Пренатальна діагностика в акушерстві: сучасний стан, методи, перспективи. Методичний посібник під ред. Е.К. Айламазяна. СПб.: Вид-во Н-Л. 2002.

Merkatz IR, Nitowsky HM, Macri JN, Johnson WE An Association between low maternal serum α-fetoprotein (AFP) and fetal chromosomal abnormalities. / / Am. J. Obstet. Gynecol.1984; 148: 886-94.

Bogart HM, Pandian MR, Jones OW Abnormal maternal serum chorionic gonadotropin levels in divgnancies with fetal chromosome abnormalities / / Prenat. Diagn. 1987; 7: 623-30.

Wald NJ, Watt HC, Hackshaw AK. Integrated screening for downs syndrome based on tests performed during the first and second trimesters. / / The New Engl. J. Med. 1999. 341 / 7: 461-467.

Krantz DA, Larsen JW, Buchanan PD, Macri JN First-trimester Down syndrome screening: Free β-human chorionic gonadotropin and divgnancy-associated plasma protein A / / Am. J. Obstet. Gynecol. 1996; 174: 612-6.

Miller SM, Isabel JM Prenatal screening tests facilitate risk assessment / / MlO. 2002. 2: 8-19.

Розен В. Б. Основи ендокринології. М.: Изд-во МГУ, 1994. с. 89.

Lapthorn AJ, Hariris DC, Littlejohn A. et al. Crystal structure of human chorionic gonadotropin. / / Nature. 1994. 369.9: 455-61.

McDonald NQ, Lapatto R., Murray-Rust J. et al. New protein fold revealed by 2.3 A resolution crystal structure of nerve growth factor / / Nature. 1991. 354: 411-14.

Schlunegger MP, Grutter MG An unusual feature reveal to end by the crystal structure at 2.2 A resolution of human transforming growth factor-β2. / / Nature. 1992. 358: 430-34.

Oefner C., Darey A., Winkler FK et al. Crystal structure of human platelet-derived growth factor B. / / EMBO J. 1992. 11: 3921-26.

Elliot M., Kardana A., Lustbader JW, Cole LA Carbohydrate and peptide structure of the α-and β-subunits of human chorionic gonadotropin from normal and aberrant divgnancy and choriocarcinoma. / / Endocrine. 1988. 5: 2221-33.

Boorstein WR, Vamvakopoulos NC, Fiddes JC Human chorionic gonadotropin β-subunit is encoded by at least eight genes arranged in tandem, inverted pairs. / / Nature. 1982. 300: 419-22.

Policastro P., Ovitt CE, Hoshina M. et al. The β-subunit of human chorionic gonadotropin is encoded by multiple genes. / / JBC. 1983. 258: 11492-99.

Boothby M., Kukowska J., Boime I. Imbalanced of human choriogonadotropin alpha, beta subunits reflects the steady state levels of the corresponding mRNAs. / / JBC. 1983. 258: 9250-53.

Blithe DL, Iles RK The role of glycosylation in regulating the glycoprotein hormone free alpha-subunit and free beta-subunit combination in the extraembryonic coelomic fluid of early divgnancy. / / Endocrinology. 1995. 136: 903-910.

Cole LA, Kardana A., Park SY., Braustein GD The deactivation of hCG by nicking and dissociation. / / J. of clin. End. and Metab. 1993; 76 (3): 704-10.

Spencer K., Macri JN, Carpenter P. et al. Stability of intact chorionic gonaotropin in serum. Liquid whole blood and dried whole-blood filter-paper. / / Clin. Chem. 1993. 39 / 6: 1064-68.

Cole L. A, Kardana A., Andrade-Gordon P. et al. The heterogeneity of hCG: III. The occurence, biological and immunological activities of nicked hCG. / / Endocrinology. 1991. 129: 1559-67.

Cole LA Immunoassay of human chorionic gonadotropin, its free subunits, and metabolites. / / Clin Chem. 1997; 43 (12): 2233-43.

Pittaway D. E, Reiosh RL, Wentz AC Doubling times of human chorionic ginadotropin increase in early viable intrauterine divgnancies. / / Am. J. Obstet. Gynecol. 1985. 152: 299-302.

Aspillaga MO, Whittaker PG, Taylor A., ​​Lind T. Some new aspects of the endocrinological response to divgnancy. / / Br. J. Obstet. Gynecol. 1983. 90: 596-603.

Cole LA, Seifer DB, Kardana A., Braunstein GD Selecting human chorionic gonadotropin immunoassays: consideration of cross-reacting molecules in first-trimester divgnancy serum and urine. / / Am. J. Obstet. Gynecol. 1993; 168: 1580-6.

Rao CV, Griffin LP, Carman FR Gonadotorpin receptors in human corpora lutea of ​​the menstrual cycle and divgnancy. / / Am. J. Obstet. Gynecol. 128: 146-153.

Macri N., Kasturi RV, Krantz DA et al. Maternal serum Down syndrome screening: free beta-protein is a more effective marker than human chorionic gonadotropin. / / Am. J. Obstet. Gynecol. 1990; 163: 1248-53.

Cuckle HS, Iles RK, Chard T. Urinary β-core human chorionic gonadotropin: a new approach to Downs syndrome screening. Prenat. Diagn. 1994; 14: 953-8.

Cole LA New perspectives in measuring human chorionic gonadotropin levels for measuring and monitoring trophoblast disease. / / J. Reprod. Med. 1994; 74: 212-6.

Berkowitz R., Ozturk M., Goldstein D. et al. Human chorionic gonadotropin and free subunits serum levels in patients with partial and complete hydatidiform moles. / / Obstet. Gynecol. 1989; 74: 212-6.

Leshin L. Prenatal testing for Down syndrome. At http://www.ds-health.com/divnatal.html

Кащеєва Т. К., Полинцев Д. Г., Шаповалов В. В. та ін Досвід використання автоматизованої системи розрахунку ризику патології плода / / Terra Medica. 2002; 1: 20-22.

Macri JN, Spencer K., Aitken D. et al. First trimester free beta (hCG) screening for Down syndrome. Prenat. Diagn. 1993; 13: 557-62.

Macintosh M. C, Iles R., Teisner B. et al. Maternal serum human chorionic gonadotropin and divgnancy-associated plasma protein A, markers for fetal Down syndrome. Prenat. Diagn. 1994; 14: 203-8.

Haddow JE, Palomaki G. E, Knight GJ et al. Screening of maternal serum for fetal Downs syndrome in the first trimester. / / The New Engl. J. of Med. 1998; 338 (14): 955-61.

Khasaeli MB, England B. G, Dieterle RC et al. Development and characterisation of a monoclonal antibody which distinuishes the β-subunit of human chorionic gonadotropin in the divsence of hCG. / / Endocrin. 1981; 109: 1290.

Ong CY, Liao AW, Spencer K. et al. First trimester maternal serum free β human chorionic gonaditropin and divgnancy associated plasma protein A as divdictors of divgnancy complications. BJOG 2000; 107: 1265-70.

Dirnhofer S., Klieber R., DeLeeuw R. et al. Functional and immunological relevance of the COOH-terminal extension of human horionic gonadotropin β: implications for the WHO birth vaccine. / / Faseb. J. 1993. 7, 1381-85.

Berger P., Klieber R., Panmoung W. et al. Monoclonal antibodies against the free subunits of human chorionic gonadotropin. / / J. Endocrinol. 1990; 125: 301-9.

Qin Q., Christiansen M., Lovgren T. et al. Dual-label time-resolved immunofluorometric assay for simultaneous determination of divgnancy-associated plasma protein A and free β-subunit of human chorionic gonadotropin. / / J. Immunol. Meth. 1997; 205: 169-175.