МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ
Пензенська ДЕРЖАВНИЙ ПЕДАГОГІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім В.Г. БЕЛІНСЬКА
КАФЕДРА БІОХІМІЇ
Курсова робота:
ВИДІЛЕННЯ І ОЧИЩЕННЯ БІЛКІВ Сухожилля, ВИЗНАЧЕННЯ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ
Виконав: студент групи БХ - 31
Біжать М.М.
Перевірив: проф. Генгін М.Т.
Пенза
2009
Зміст
Введення
1. Сухожилля, сполучна тканина і колагенові волокна
1.1 Молекулярна структура і типи колагену
1.2 Розчинні фракції і агрегація колагену в фібрили
1.3 Дані ЯМР про структуру зв'язаної води в колагені за допомогою скануючої калориметрії
2. Способи іммобілізації колагену з різних органів і тканин. Можливість застосування в іммобілізації колагенів сухожиль.
Висновок
Список літератури
Введення
Медична хірургія завжди вимагає нові матеріали. У п'ятдесятих роках минулого сторіччя такі матеріали з'явилися завдяки інтенсивному розвитку хімії полімерів. Деякі синтетичні матеріали, наприклад, нейлон, капрон, лавсан, дакрон, тефлон і інші, почали впроваджувати в медичну практику з причини їх здаються на перший погляд позитивних якостей, насамперед доступності, легкості виготовлення, міцності, простоти стерилізації, відносної біологічної інертності.
Класичне поняття «біологічне краще штучного» піддали сумніву через надмірне захоплення полімерними матеріалами.
З накопиченням досвіду застосування синтетичних матеріалів з'явився обгрунтований скептицизм. Більш того, складні проблеми відновлювальної хірургії не вирішувалися остаточно.
Інертні полімери в живому організмі залишалися, на превеликий жаль, стороннім тілом, вони змінювали свої фізичні властивості, підтримували хронічну запальну реакцію; тривалість функціонування протезів з полімерів приносила шкоду живому організму, в науковій медичній літературі з'явилися відомості про канцерогенну небезпеку полімерів. Тому стали приділяти більше уваги розсмоктується матеріалами, які в процесі регенерації поступово заміщалися власними тканинами живого організму.
1. Сухожилля, сполучна тканина і колагенові волокна
Сухожилля - утворення з сполучної тканини, кінцева структура поперечносмугастих м'язів, за допомогою якої вони прикріпляються до кісток скелету.
Сухожилля складається з компактних паралельних пучків колагенових волокон, між якими розташовані ряди фиброцитах (тендоцітов). Найчастіше у формуванні сухожиль бере участь колаген типу I, також зустрічаються волокна колагену типів III і V. Пучки колагену утримуються разом протеогликанами. Паралельно ходу колагенових волокон розташовані кровоносні судини, що мають поперечні анастомози. Завдяки своїй структурі сухожилля мають високу міцність і низьку розтяжність.
Форма сухожиль різна - від циліндричної (частіше у довгих м'язів) до плоскої, пластинчастої (апоневрози широких м'язів).
У сполучної тканини розрізняють: Межклеточное (ОСНОВНИЙ) РЕЧОВИНА, клітинні елементи, волокнисті структури (колагенові волокна). Особливість: міжклітинної речовини набагато більше, ніж клітинних елементів.
Фібрилярний білок колаген складає приблизно третину всіх поліпептидів в організмі тварин і людини [ME Nimni., 1988]. У сухожиллях вміст колагену досягає 94, у шкірі - до 75, в кістковій тканині - близько 50%. Колаген характеризується високим ступенем молекулярної впорядкованості і кристалічності.
У тканинах переважна частина колагену знаходиться у складі колагенових волокон. В освіті їх з фібрил беруть участь протеоглікани і структурні глікопротеїни, які відіграють роль інтерфібріллярного цементуючого речовини, тому необхідно диференціювати колаген як біохімічне поняття (молекули, полімерізірующіеся в фібрили) і гетерогенне з хімічної точки зору колагенові волокна як морфологічне поняття. У біохімічній та морфологічної літературі про колагені в одні і ті ж терміни нерідко вкладають різний зміст.
1.1 Молекулярна структура і типи колагену
Основною структурною одиницею колагену є стрижнеподібні молекули тропоколагену, що складаються з трьох спіраль поліпептиди ланцюгів, званих α-ланцюгами, які скручені між собою в одну загальну спіраль і стабілізовані водневими зв'язками. Молекула колагену має відносну молекулярну масу 300 000 дальтон, довжину 280 нм і товщину 1,4 нм. Кожна α-ланцюг містить в середньому близько 1040 амінокислотних залишків. Відмінною особливістю колагену є присутність оксипроліну і оксілізін (хімічних маркерів колагену), відсутність триптофану, низький вміст тирозину і метіоніну, високий вміст гліцину (близько третини амінокислот), а також проліну та оксипроліну (чверть). Кінцеві ділянки а-ланцюгів на N-і С-кінцях молекули (телопептіди) мають відмінний від основної частини амінокислотний склад. Вони не містять проліну та оксипроліну і не мають гліцину в кожній третій позиції і тому не утворюють потрійної спіралі. Було показано [Wess TJ, Hammersley AP, Wess L., Miller A., 1995], що структура колагену формується шляхом паралельної укладання тріпептідних молекул тропоколагену з поздовжнім зрушенням на ~ 1 / 4 їх довжини. У поздовжньому напрямку (вісь c структури колагену) кінцеві С-і N-угрупування сусідніх трехспіральних молекул не стикаються, а величина проміжків, або "щілин", складає близько 340 Å в довжину. Розподіл подібних "вакансій" поперечним перерізом близько 15 Å в супрамолекулярної структурі колагену є строго впорядкованим, що проявляється у формі характерною поперечної смугастості колагену з періодом з 0 = 640 Å, видимої на електронно-мікроскопічних знімках [2-4]. При фарбуванні "щільні" ділянки залишаються світлими, тоді як вакансійних, або "пухкі", ділянки забарвлюються в темний колір. Таким чином, в напрямку осі с в колагені спостерігається регулярне чергування світлих, або впорядкованих, ділянок розміром 300 Å і темних, або разупорядкований, (пухких) ділянок розміром 340 Å, що включають зазначені вище молекулярні вакансії, або "щілини".
Імунологічні дослідження показали наявність в молекулі колагену трьох різних груп антигенних детермінант: 1) термінальних, що знаходяться в телопептідах, 2) спіральних, що локалізуються на поверхні молекул, і 3) центральних, що знаходяться в а-ланцюгах і звільняються при часткової або повної денатурації колагену, т . е. при розпаді трехспіральной спіралі на окремі ланцюга [Timpl R., 1976].
Найважливішим досягненням останніх років є відкриття гетерогенності колагену. З різних тканин виділені чотири генетично різних типу колагену. Вони розрізняються комбінацією в триланцюжкове молекулі п'яти α-ланцюгів [«1 (1); α2; αl (II), αl (III) і αl (IV)], які кодуються різними генами і мають деякі особливості первинної структури [Trelstad RL, 1974 ; 1977; Epstein EH et al., 1975; Gay S., Miller EJ, 1978]. Розподіл типів колагену в тканинах наведено в табл. 5, складеної за даними біохімічного аналізу. Імунологічні відмінності колагену різних типів дозволили в останні роки завдяки іммуноморфологічних методам з використанням типоспецифічних антитіл вивчити локалізацію різних типів колагену в сполучнотканинних структурах (табл. 6).
Як видно з даних табл. 6, найбільш поширеною изоформой є колаген I типу, що складається з двох <х1 (I) ланцюгів і однієї а2 ланцюга. Колаген II типу [три αl (II) ланцюга] виділено спочатку з хрящової тканини, але потім виявлений в склоподібному тілі та інших тканинах. P. Smith і співавт. (1976) показали, що він синтезується епітелієм сітківки. Тип III [три> al (III) ланцюга] спочатку був виявлений в шкірі ембріонів і аорті, але потім з'ясувалося, що він міститься в тих же тканинах, що і тип I в різних пропорціях з останнім. Найбільше його в аорті і кишечнику, мабуть, у зв'язку з наявністю там гладких м'язів, якими він синтезується поряд з колагеном типу I [Layman DL et al., 1977], а також у стромі внутрішніх органів, що пояснюється наявністю ретикулінові волокон , що складаються з колагену III типу [Wick G. et al., 1978]. Колаген IV типу, що складається з трьох al (IV) - ланцюгів, виділений з базальних мембран і капсули кришталика [Kefalides N. А., 1975].
В даний час виявлені певні особливості колагенів різного типу [Miller A., 1976; Trelstad RL, 1977; Fessler JH, Fessler LJ, 1978]. Колагени III і IV типів відрізняються більш високим ступенем гідроксилювання проліну, а також містять цистин, завдяки чому здатні утворювати додаткові дисульфідні зв'язки. Тип II і особливо IV тип містять значно більше оксілізін і вуглеводних залишків, що, можливо, стабілізує комплекс колагенів з протогліканамі. У колагені IV типу молекулярна маса а-ланцюгів вище, ніж в інших типах (120 000-180 000 дальтон), що розцінюється як відсутність відщеплення кінцевих пептидів проколагену, перешкоджає утворенню в базальних мембранах фібрил з типовою періодичністю [Minor RR et al., 1975 ].
Слід зазначити також, що, крім макрогетерогенності, існує і мікрогетерогенності колагену, тобто менш істотні відмінності всередині типів в ступені гідроксилювання проліну та лізину, змісті різних амінокислот і вуглеводних залишків [Prockop D. et al., 1976]. Це пов'язано з тканинною специфічністю колагену. Наприклад, існують підвиди II типу для гіалінового і фіброзного хряща, I типу для шкіри, сухожилля, рогівки, два різновиди IV типу [Bailey А. et al., 1979].
Мабуть, макро-і мікрогетерогенності первинної структури колагену грає важливу біологічну роль, визначаючи особливості колагенових волокон на більш високих структурних рівнях і характер взаємодії їх з іншими компонентами сполучної тканини і з клітинними 'елементами, що в сукупності визначає функціональні особливості різновидів сполучної тканини.
1.2 Розчинні фракції і агрегація колагену в фібрили
Після секреції у міжклітинний простір і відщеплення, пропептид молекули колагену агрегує в фібрили, які є первинною формою надмолекулярної структури колагену. Оскільки молекулярний механізм фібріллообразованія в Організмі мало доступний для вивчення, основні гіпотези отримані на підставі дослідження агрегації молекул при осадженні їх з розчинів колагену.
Типи розчинної колагену можна розділити на дві основні категорії. До першої категорії (нативні розчини) відносяться розчинні фракції, одержувані прямий екстракцією із сполучної тканини молодих тварин, у яких колаген ще недостатньо скріплений міжмолекулярними зв'язками. Розрізняються кіслоторастворімий і нейтральносолерастворімий колаген, екстрагуються відповідно кислими буферами і нейтральними сольовими розчинами. До другої категорії відносяться розчини зрілого, нерозчинного колагену, отримані після попередньої ферментативної, хімічної або механічної обробки тканини (солюбілізірованний колаген). Ця категорія розчинів була використана нами для створення лікарських препаратів з колагену.
У залежності від умов осадження (рН, іонна сила, температура та ін) з розчину колагену можна отримати різні типи фібрилярних структур:
1) фібрили з неврегульованою структурою без періодичності;
2) кристали довжиною 280 нм (SLS-сегменти), що представляють собою паралельну агрегацію молекул бік в бік. У SLS визначили 117 поперечних асиметричних смуг, які, подібно до «відбитку пальців», характеризують розподіл полярних і неполярних амінокислотних залишків;
3) фібрили FLS з періодом 280 нм, в яких молекули також агрегує паралельно, але орієнтовані в сусідніх шарах в різні сторони (опозиційної), так що N-кінці з'єднані з С-кінцями; Рис. 27. Можливі шляхи внутрішньоклітинного транспорту і секреції колагену.
4) фібрили нативного типу (тобто відповідні тканинним) з періодичністю 64-67 нм. Основний період в цих фібрила складається з світлої А-зони і темної По-зони, особливо чітко видимими при негативній забарвленні фосфорно-вольфрамової кислотою. Після позитивного контрастування в періоді виявляється 12 темних і 12 світлих додаткових смуг, що відображають первинну структуру молекули [Kuhn К., 1974].
Для вивчення фібрилогенезу в організмі найбільше значення має механізм агрегації молекул у фібрили нативного типу, що пояснює наявність періодичності. Починаючи з 50-х років був висунутий ряд різних гіпотез, з яких найбільше значення мала модель зсуву сусідніх молекул на чверть своєї довжини [Schmitt F. О., Gross J., 1955], і модель RA Grant і співавт. (1967), за якою періодичність пояснюється існуванням на молекулах «смуг зв'язування» довжиною 26,5 нм, що містять полярні групи, і смуг, що містять неполярні групи 37,5 нм.
Пізніше було встановлено, що довжина молекули кратна не 4, а 4,4 D (D - довжина періоду 64 нм). Молекули, упаковані в фибриллу, в лінійній проекції розділені проміжком 0,6 D (зона «порожнечі»), а сусідні паралельні ряди молекул зрушені щодо один одного на величину періоду D, причому вони перекривають кінці паралельних їм молекул на 0,4 D (зона «перекриттів»).
Таким чином, уздовж фібрили чергуються зони «порожнеч» і «перекриттів», які на негативно забарвлених електронограмма відображаються відповідно в темних і світлих смугах періоду [Ktihn К., 1969; BrunsR. R., Gross J., 1974; Miller A., 1976]. Вся структура стабілізувати за рахунок поперечних зв'язків між молекулами.
Описана картина укладається в двомірну модель упаковки молекул колагену, вивчення ж тривимірної структури пов'язане зі значними труднощами. Однією з найбільш визнаних є модель JW Smith (1968), по якій п'ять молекул, зсунутих між собою на ID, стикаючись бічними поверхнями, покладені в циліндричний філамент, причому п'ята молекула зрушена по відношенню до першої на 4D. Такий філамент росте в довжину за рахунок приєднання нових молекул, а в ширину фібрила росте тільки шляхом з'єднання філаментів між собою. Усередині філамента молекули згорнуті в спіраль [Piez К.А., 1975]. Близька до цього і модель A. Veis н співавт. (1967), в якій передбачається, що філаменти складаються з чотирьох молекул колагену. Слід зазначити, що діаметр філаментів за цими моделями (3,5 нм в сухому та 5 нм у вологому стані) збігається з розмірами мінімальних філаментів (прото-або мікрофібрил), виявлених усередині тканинних колагенових фібрил [Olsen В. R., 1963; Doyle В.В. et al., 1974; Brims RR, 1976], а також у поперечно-смугастих філдментарних агрегатах (див. розділ 2.2.6).
За даними М. Bouteille, D. С. Pease (1971), JH Lillie і співавт. (1977), при «інертної» дегідратації, впливі сечовини або гуанідінхлоріда відбувається дисоціація фібрил на філаменти товщиною 3,5-4 нм, причому виявляється спіралевідное скручування цих філаментів. Спіральна структура колагенових фібрил виявляється також при застосуванні методу заморожування - розколювання [Rayns R. et al., 1974; Belton J. С. et al., 1975], ймовірно, в результаті використання агентів, що руйнують водневі зв'язки. У деяких випадках спіралеподібна структура фібрил відзначається і при звичайній заливці, наприклад в пухлинах [Manabe Т., Kajikkawa V., 1976]. Подібні зміни були виявлені в склері при різко вираженою короткозорості.
На закінчення слід відзначити, що поки не існує загальновизнаної моделі тривимірної структури фібрили, яка повністю відповідала б рентгеноструктуровим та електронно-мікроскопічним даними. Обговорюються можливості тетрагона і гексогональной решітки, циліндричної (у формі вставлених один в одного циліндрів з шарів молекул) і спіральної (закрученої в рулон) упаковки молекул в фибриллу [Miller A., 1976].
1.3 Дані ЯМР про структуру зв'язаної води в колагені за допомогою скануючої калориметрії
До складу нативного (неушкодженого) колагену входить зв'язана вода, яка становить близько 2 / 3 (або ~ 66%) від повної маси сухожилля. Встановлено, що вода відіграє істотну роль у механізмі самозбірки молекул колагену і освіти фібрил в цитоплазмі коллагеноцітов, а також у механізмах біохімічної активності та функціонуванні колагену у позаклітинному просторі живого організму [1]. Однак до теперішнього часу принциповий характер гідратної структури колагену залишається нез'ясованим. За даними 2 Н ЯМР спектроскопії сухожиль хвоста щура, збагаченої тяжеловодородной водою 2 H 2 O, було встановлено, що в "щільних" ділянках структури колагену молекули зв'язаної води (2 Н 2 О) характеризуються константами квадрупольного взаємодії (ККВ) ядер 2 Н ~ 3 кГц (в інтервалі від +20 ° до ~ +5 ° C).
При негативних температурах ККВ зростають, досягаючи значень ~ 8 кГц при -10 ° C, і тенденція до збільшення ККВ зберігається при подальшому зниженні температури. Відносно мала величина ККВ та її плавні зміни типові для процесів дифузійної рухливості молекул води в нанопористих системах цеолітового типу. Фазові переходи в подібних системах, як правило, є переходами типу порядок-безлад (близькими до фазових переходів другого роду) і не супроводжуються різкими тепловими ефектами.
У той же час за даними 2 Н ЯМР водна підсистема колагену в областях "щілин" характеризується дуже малими значеннями ККВ (близькими до нульових), що вказує на сильну раз-впорядкованість підсистеми зв'язаної води в "пухких" ділянках структури колагену. Виявлено також, що в околиці температури замерзання води (~ 273 K) стрибкоподібним чином змінюється спектр 2 Н ЯМР сухожилля. Інтенсивна центральна лінія, яка відноситься нами до рихлим ділянкам структури колагену, стає неспостережний, що може вказувати на фазовий перехід першого роду. Даний факт побічно свідчить на користь моделі, відповідно до якої "пухкі" ділянки структури колагену представляють собою тектогідрат, або структуру, що включає безперервний тривимірний каркас з молекул води з тетраедричних координацією, характерною для льоду і клатратное гідратів. У цьому випадку значення ККВ і ширина спектру 2 Н ЯМР повинні зростати на два порядки порівняно з кімнатною температурою, відповідно амплітуда сигналу повинна впасти на два порядки, що узгоджується з експериментом. Проте для прямого підтвердження подібної моделі розташування молекул води необхідно отримати термодинамічні характеристики даного фазового переходу.
У даній роботі був проведений аналіз величини прихованої теплоти фазового переходу в сухожиллях хвоста щури з використанням методу скануючої калориметрії. Для досліджень були взяті зразки сухожилля RTT експериментальних тварин лінії "Вістар", що містилися на стандартному харчуванні. Вік щурів становив 6 місяців, чисельність у групі - 3 тварин. Зразки волокон сухожиль вагою 100-150 мг вилучали безпосередньо перед дослідженням. Вимірювання проводили в інтервалі від кімнатної температури (+20 ° С) до -30 ° С, швидкість зміни температури 3 град. / хв. при використанні автоматичного калориметра ДСК-204 фірми Netzsch (Німеччина). Результати вимірювань представлені в таблиці.
Отримані дані можна порівняти з довідковими параметрами для прихованої теплоти плавлення чистого льоду: Q пл (лід) = 333,5 Дж / г [6]. При порівнянні треба враховувати, що в сухожиллях вміст колагену досягає 94%, а вміст води в нативному колагені складає ~ 66%. Розподіл зв'язаної води між щільними та пухкими ділянками достовірно не встановлено, але за даними ЯМР 2 Н [5] в "пухких" ділянках колагену міститься приблизно половина загального вмісту води в сухожиллі. Таким чином, якщо структура підсистеми молекул води в вакансійних ділянках нативного колагену при негативних температурах відповідає структурі тектогідрата (клатратоподобного або льодоподібною типу), то очікувана прихована теплота фазового переходу в даній підсистемі повинна скласти
Q пер = ~ (0,66 ⋅ 0,5 ⋅ 0,94) ⋅ Q пл (лід) = ~ 94 Дж / г,
що знаходиться в хорошому злагоді з виміряними значеннями для трьох зразків.
На кривих охолодження спостерігаються знижені значення Q пер, що є наслідком значного переохолодження зразків при зниженні температури. Даний ефект дозволяє отримати оцінне значення теплоємності c p високотемпературної фази підсистеми молекул води, що відчуває фазовий перехід. У рамках обговорюваної моделі середнє значення величини зміни теплоти фазового переходу ΔQ пep = 16,55 ± 3,9 Дж / г повинно бути пов'язано з середньою величиною температури переохолодження Т = (11,5 ± 0,7) ° співвідношенням
ΔQ пep = ~ (0,6 ⋅ 0,5 ⋅ 0,94) ⋅ Δс р ΔT,
де Δс р - різниця між теплоємністю води і льоду. Якщо властивості водної підсистеми, що відчуває фазовий перехід у колагені, відповідають властивостям вільної води і льоду, то Δс р = 2,062 Дж / г (поблизу 0 ° С [6]). Звідси розрахована величина ΔQ пер = ~ 6,69 Дж / моль; знижений в порівнянні з експериментом значення розрахункової величини ΔQ пер може вказувати на існування вкладу в Δс р, пов'язаного із взаємодією молекул води і функціональних угруповань в білковій структурі. Таким чином, на якісному рівні величина прихованої теплоти фазового переходу знаходиться у згоді з моделлю, згідно з якою властивості приблизно половини зв'язаної води у структурі колагену близькі до властивостей вільної (або об'ємної) води. Підвищена температура плавлення льоду зв'язаної води в колагені і різниця значень теплоємності Δс р можуть вказувати на деяку взаємоузгодження структур води і фібрилярні білка, можливо, клатратное типу.
2. Способи іммобілізації колагену з різних органів і тканин. Можливість застосування в іммобілізації колагенів сухожиль
Для розчинення колагену використовуються різні методики, але більшість з них базується на розчиненні в оцтовій кислоті.
Енуклеірованние заморожені очні яблука свині (-20 °) розморожують при кімнатній температурі, склера відділяється від залишків м'язів, зв'язок і пігменту і промита холодною водою. Отримана тканина може зберігатися в замороженому вигляді протягом 3-4 тижнів. Виділення колагену. 100 р. очищеної склери заливається 5 л лужного розчину (1966 NaOH + 100 р. Na 2 SO 4 на 1 л розчину) і при періодичному перемішуванні витримується при 20 ° протягом 36 ч. При цьому полісахариди і протеоглікани, що становлять значну частину склери, переходять в розчин. Потім склеру відокремлюють від розчину на воронці Бюхнера і промивали 10 л дистильованої води. Для нейтралізації лугу тканину обробляють 2%-м H 3 BO 3 протягом 40 хв при перемішуванні на магнітній мішалці. Обробку склери розчином борної кислоти повторюють 4 рази до встановлення pH розчину 6.0. Після нейтралізації лугу склеру 4 рази відмивають від H 3 BO 3 і Na 2 SO 4 дистильованою водою (5 л), кожен раз протягом 40 хв при 20 ° при постійному перемішуванні на магнітній мішалці. Ступінь відмивання визначають по повному видаленню (SO 4) - (реакція з BaCl 2). Отримання розчину колагену. До вимитій склері додають рівну за обсягом кількість 0.3 M CH 3 COOH і витримують отриману гелеобразную напівпрозору масу протягом 7-8 діб при 4 ° і слабкому перемішуванні. У цих умовах колаген переходить в розчин, і склера розчиняється практично без залишку. Отриманий розчин гомогенізують і фільтрують через скляний фільтр з розміром пор 160 мкм, використовуючи водоструминні насос. Концентрація колагену в отриманому розчині (по сухому залишку) складає 2% за масою. Частина отриманого розчину розбавляли 0.2 М Na-ацетатний буфер з pH 3.44 до концентрації 8.6 ⋅ 10-6 і 8.6 ⋅ 10-7 М.
Визначення концентрації. Зміст колагену в пробах визначають модифікованим методом Лоурі [18] за допомогою реактиву Фоліна-Чіокалто. В якості стандарту використовують розчин желатини відомої концентрації. Реєстрацію проводять спектрофотометрично при λ = 750 нм. Реакційна суміш складається з 0.04 М CuSO 4, 0.11 М Na 2 C 4 H 4 O 6, 0.05м Na 2 CO 3, 0.4 М NaOH, реактиву Фоліна-Чіокалто і коллагенового розчину. Метод заснований на реєстрації забарвленого з'єднання, що утворюється при взаємодії білка з реактивом Фоліна [19].
Відомий спосіб отримання колагену за патентом США 5106949, МПК A 61 K 35/32, опубл. 21.04.1992 р. Відповідно до патенту колаген отримують із сухожиль (переважно сухожиль згиначів копита телят). Далі проводять такі операції:
- Видаляють оболонки сухожиль;
- Подрібнюють матеріал;
- Промивають подрібнений матеріал фізіологічним фосфатним буфером (PBS) (2 г хлористого калію КС1, 2 г однозамещенного фосфорнокислого калію KH 2 РО 4, 80 м. хлористого натрію і 79,3 г двузамещенного фосфату натрію на 1 л розчину), рН 6,5 -8,5, розбавленим 1:3-1:1; найбільш ефективний розбавлений 1: 3 PBS з іонною силою 0,05 М (0,05 молярного) NaCl і 0,0022 М Na 2 HPO 4 (6-кратна промивка по 2 год);
- Екстрагують колаген слабкою кислотою (0,5-2 М оцтова кислота); переважно 0,5 М оцтова кислота з добавкою 4 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА);
- Беруть в облогу колаген з допомогою NaCl (0,6-1,8 М);
- Виділяють осад і розчиняють його в оцтовій кислоті;
- Переводять розчин діалізом в 0,01 М оцтову кислоту.
Дані методики не суперечать цілям дослідження з огляду на те, що і склера і сухожилля побудови одним і тим же типом колагену, тобто всі зазначені типи взаємодії білка з реактивами застосовні в обох випадках іммобілізації.
Висновок
Важливою особливістю колагену та інших біологічних полімерів є їх здатність утворювати комплекси з різними лікарськими речовинами для спрямованої дії: підсилюють згортання крові, що стимулюють відновлення сполучної тканини, протибактеріальних та ін Таким чином, відкриваються широкі перспективи для лікувальних препаратів пролонгованої впливу, причому колаген або інші біополімери грають для лікарського засобу роль депо. Так, введення колагенових препаратів, що містять лінкоміцин, показало, що антибіотик зберігається в навколишніх тканинах 23-25 діб. На цьому принципі зараз засновані ліки зі збільшеними термінами бактеріального впливу на мікробну флору, що застосовуються при лікуванні остеомієліту, лейшманіозних виразок, бронхіальних свищів, при пластиці кровоносних судин в умовах інфекції.
Здатність колагену утворювати комплекси з гепарином - речовиною, що перешкоджає згортанню крові і виникнення тромбів, що закупорюють просвіт судини, послужила підставою для створення судинного протеза з антикоагулянтними - протизсідні - властивостями. Такий комбінований судинний протез являє собою ткану або в'язану синтетичну трубку, пори якої заповнені коллагенгепаріновой плівкою. Подібні імплантати можна використовувати для заміщення не тільки уражених артерій, але і уражених вен, оскільки коллагенгепаріновий комплекс тривало забезпечує антизсідальної ефект і перешкоджає утворенню пристінкових тромбів.
Явним гідністю колагену та отриманих на його основі колагенових матеріалів для медицини є відсутність токсичних та канцерогенних властивостей, слабка антигенність, висока механічна міцність і стійкість до тканинних ферментів, регульована швидкість лізису в організмі, здатність утворювати комплекси з біологічно активними речовинами, стимуляція регенерації власних тканин організму .
Список літератури
1. В.В. Сєров, А.Б. Шехтер - Сполучна тканина (функціональна морфологія і загальна патологія) - М, 1981
2. Журнал структурної хімії - С.П. Габуда, АА Гайдаш, В.А. Дребущак, С.Г. Козлова - Дані ЯМР про структуру зв'язаної води в колагені за допомогою скануючої калориметрії - том 46, № 6, 2005
3. Опис винаходу до патенту РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ - Л.В. Кухарева, Б.А. Парамонов, І.І. Шамоліна, Є.Г. Семенова - Спосіб отримання колагену для лікування патологій тканин організму - СПб, 2003
4. Патент США 5106949, МПК A 61 K 35/32 - 1992 р.
5. Єлісєєв В.Г. Сполучна тканина. - М.: Медгиз, 1961.
6. Мазуров В.І. Біохімія колагенових білків. - М.: Медицина, 1974.
7. Нікітін В.М., Перський Є. Е »Утєвська Л.А. Вікова і еволюційна біохімія колагенових структур. - Київ.: Наукова думка, 1977.
8. Хількін А.М., Шехтер А.Б., Істранов Л.П. Колаген і його застосування в медіціне.-М.: Медицина, 1976.
9. Bazin S., Lelous M., Delannay A. Collagen in granulation tissue. - Agent and Act., 1976, v. 6, p. 272-275
10. Bruns R. Supramolekular structure of polymorphic collagen fibrills. - J. Cell Biol., 1976, v. 68, p. 521-538
11. Gay S., Muller P., Meigel W., Kuhn K. Polymorphic des Kollagens: Neue Aspekte fur die Structur und Funktion des Bindegewebe.-Hautarzt, 1976, v. 27, p. 196-205
12. Gross J. Collagen biology: structure, degradation, and disease. - Harvey Lectures, 1974, v. 68, p. 351-432
13. Gross J. Aspects of the animal collagenases. - In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 275-317
14. Kefalldes N. Basement membranes: structural and biosynthetic considerations. - J. invest. Derm., 1975, v. 65, p. 85-92
15. Miller A. Molecular packing in collagen fibrils. - In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 85-136
16. Minor R., Clark C, Kefalides N. Synthesis and deposition of basement membrane procollagen. - J. Cell. Biol., 1975, p. 67, part 2, p. 287-899.
17. Piez K - The regulation of collagen fibril formation. - In: Extracellular matrix influences on gene exdivssion. New York, 1975, v. 231-237.
18. Ratnachandran G., Ratnakrishnan C. Molecular structure of collagen. - In: Biochemistry of Collagen. New York, 1976, p. 45-84.
19. Reddi A. Collagen and cell differentiation. - In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 449-478
20. Trelstad R. Basement membrane collagens: isolation by heat gelation fractionation. - Upsala J. Med. Sci., 1977, v. 82, p. 157-162.
21. Weiss J. Enzymic degradation of collagen. - Intern. Rev. Connect. Tissue Res., 1976, v. 7, p. 101-157.
Пензенська ДЕРЖАВНИЙ ПЕДАГОГІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім В.Г. БЕЛІНСЬКА
КАФЕДРА БІОХІМІЇ
Курсова робота:
ВИДІЛЕННЯ І ОЧИЩЕННЯ БІЛКІВ Сухожилля, ВИЗНАЧЕННЯ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ
Виконав: студент групи БХ - 31
Біжать М.М.
Перевірив: проф. Генгін М.Т.
Пенза
2009
Зміст
Введення
1. Сухожилля, сполучна тканина і колагенові волокна
1.1 Молекулярна структура і типи колагену
1.2 Розчинні фракції і агрегація колагену в фібрили
1.3 Дані ЯМР про структуру зв'язаної води в колагені за допомогою скануючої калориметрії
2. Способи іммобілізації колагену з різних органів і тканин. Можливість застосування в іммобілізації колагенів сухожиль.
Висновок
Список літератури
Введення
Медична хірургія завжди вимагає нові матеріали. У п'ятдесятих роках минулого сторіччя такі матеріали з'явилися завдяки інтенсивному розвитку хімії полімерів. Деякі синтетичні матеріали, наприклад, нейлон, капрон, лавсан, дакрон, тефлон і інші, почали впроваджувати в медичну практику з причини їх здаються на перший погляд позитивних якостей, насамперед доступності, легкості виготовлення, міцності, простоти стерилізації, відносної біологічної інертності.
Класичне поняття «біологічне краще штучного» піддали сумніву через надмірне захоплення полімерними матеріалами.
З накопиченням досвіду застосування синтетичних матеріалів з'явився обгрунтований скептицизм. Більш того, складні проблеми відновлювальної хірургії не вирішувалися остаточно.
Інертні полімери в живому організмі залишалися, на превеликий жаль, стороннім тілом, вони змінювали свої фізичні властивості, підтримували хронічну запальну реакцію; тривалість функціонування протезів з полімерів приносила шкоду живому організму, в науковій медичній літературі з'явилися відомості про канцерогенну небезпеку полімерів. Тому стали приділяти більше уваги розсмоктується матеріалами, які в процесі регенерації поступово заміщалися власними тканинами живого організму.
1. Сухожилля, сполучна тканина і колагенові волокна
Сухожилля - утворення з сполучної тканини, кінцева структура поперечносмугастих м'язів, за допомогою якої вони прикріпляються до кісток скелету.
Сухожилля складається з компактних паралельних пучків колагенових волокон, між якими розташовані ряди фиброцитах (тендоцітов). Найчастіше у формуванні сухожиль бере участь колаген типу I, також зустрічаються волокна колагену типів III і V. Пучки колагену утримуються разом протеогликанами. Паралельно ходу колагенових волокон розташовані кровоносні судини, що мають поперечні анастомози. Завдяки своїй структурі сухожилля мають високу міцність і низьку розтяжність.
Форма сухожиль різна - від циліндричної (частіше у довгих м'язів) до плоскої, пластинчастої (апоневрози широких м'язів).
У сполучної тканини розрізняють: Межклеточное (ОСНОВНИЙ) РЕЧОВИНА, клітинні елементи, волокнисті структури (колагенові волокна). Особливість: міжклітинної речовини набагато більше, ніж клітинних елементів.
Фібрилярний білок колаген складає приблизно третину всіх поліпептидів в організмі тварин і людини [ME Nimni., 1988]. У сухожиллях вміст колагену досягає 94, у шкірі - до 75, в кістковій тканині - близько 50%. Колаген характеризується високим ступенем молекулярної впорядкованості і кристалічності.
У тканинах переважна частина колагену знаходиться у складі колагенових волокон. В освіті їх з фібрил беруть участь протеоглікани і структурні глікопротеїни, які відіграють роль інтерфібріллярного цементуючого речовини, тому необхідно диференціювати колаген як біохімічне поняття (молекули, полімерізірующіеся в фібрили) і гетерогенне з хімічної точки зору колагенові волокна як морфологічне поняття. У біохімічній та морфологічної літературі про колагені в одні і ті ж терміни нерідко вкладають різний зміст.
1.1 Молекулярна структура і типи колагену
Основною структурною одиницею колагену є стрижнеподібні молекули тропоколагену, що складаються з трьох спіраль поліпептиди ланцюгів, званих α-ланцюгами, які скручені між собою в одну загальну спіраль і стабілізовані водневими зв'язками. Молекула колагену має відносну молекулярну масу 300 000 дальтон, довжину 280 нм і товщину 1,4 нм. Кожна α-ланцюг містить в середньому близько 1040 амінокислотних залишків. Відмінною особливістю колагену є присутність оксипроліну і оксілізін (хімічних маркерів колагену), відсутність триптофану, низький вміст тирозину і метіоніну, високий вміст гліцину (близько третини амінокислот), а також проліну та оксипроліну (чверть). Кінцеві ділянки а-ланцюгів на N-і С-кінцях молекули (телопептіди) мають відмінний від основної частини амінокислотний склад. Вони не містять проліну та оксипроліну і не мають гліцину в кожній третій позиції і тому не утворюють потрійної спіралі. Було показано [Wess TJ, Hammersley AP, Wess L., Miller A., 1995], що структура колагену формується шляхом паралельної укладання тріпептідних молекул тропоколагену з поздовжнім зрушенням на ~ 1 / 4 їх довжини. У поздовжньому напрямку (вісь c структури колагену) кінцеві С-і N-угрупування сусідніх трехспіральних молекул не стикаються, а величина проміжків, або "щілин", складає близько 340 Å в довжину. Розподіл подібних "вакансій" поперечним перерізом близько 15 Å в супрамолекулярної структурі колагену є строго впорядкованим, що проявляється у формі характерною поперечної смугастості колагену з періодом з 0 = 640 Å, видимої на електронно-мікроскопічних знімках [2-4]. При фарбуванні "щільні" ділянки залишаються світлими, тоді як вакансійних, або "пухкі", ділянки забарвлюються в темний колір. Таким чином, в напрямку осі с в колагені спостерігається регулярне чергування світлих, або впорядкованих, ділянок розміром 300 Å і темних, або разупорядкований, (пухких) ділянок розміром 340 Å, що включають зазначені вище молекулярні вакансії, або "щілини".
Імунологічні дослідження показали наявність в молекулі колагену трьох різних груп антигенних детермінант: 1) термінальних, що знаходяться в телопептідах, 2) спіральних, що локалізуються на поверхні молекул, і 3) центральних, що знаходяться в а-ланцюгах і звільняються при часткової або повної денатурації колагену, т . е. при розпаді трехспіральной спіралі на окремі ланцюга [Timpl R., 1976].
Найважливішим досягненням останніх років є відкриття гетерогенності колагену. З різних тканин виділені чотири генетично різних типу колагену. Вони розрізняються комбінацією в триланцюжкове молекулі п'яти α-ланцюгів [«1 (1); α2; αl (II), αl (III) і αl (IV)], які кодуються різними генами і мають деякі особливості первинної структури [Trelstad RL, 1974 ; 1977; Epstein EH et al., 1975; Gay S., Miller EJ, 1978]. Розподіл типів колагену в тканинах наведено в табл. 5, складеної за даними біохімічного аналізу. Імунологічні відмінності колагену різних типів дозволили в останні роки завдяки іммуноморфологічних методам з використанням типоспецифічних антитіл вивчити локалізацію різних типів колагену в сполучнотканинних структурах (табл. 6).
Як видно з даних табл. 6, найбільш поширеною изоформой є колаген I типу, що складається з двох <х1 (I) ланцюгів і однієї а2 ланцюга. Колаген II типу [три αl (II) ланцюга] виділено спочатку з хрящової тканини, але потім виявлений в склоподібному тілі та інших тканинах. P. Smith і співавт. (1976) показали, що він синтезується епітелієм сітківки. Тип III [три> al (III) ланцюга] спочатку був виявлений в шкірі ембріонів і аорті, але потім з'ясувалося, що він міститься в тих же тканинах, що і тип I в різних пропорціях з останнім. Найбільше його в аорті і кишечнику, мабуть, у зв'язку з наявністю там гладких м'язів, якими він синтезується поряд з колагеном типу I [Layman DL et al., 1977], а також у стромі внутрішніх органів, що пояснюється наявністю ретикулінові волокон , що складаються з колагену III типу [Wick G. et al., 1978]. Колаген IV типу, що складається з трьох al (IV) - ланцюгів, виділений з базальних мембран і капсули кришталика [Kefalides N. А., 1975].
В даний час виявлені певні особливості колагенів різного типу [Miller A., 1976; Trelstad RL, 1977; Fessler JH, Fessler LJ, 1978]. Колагени III і IV типів відрізняються більш високим ступенем гідроксилювання проліну, а також містять цистин, завдяки чому здатні утворювати додаткові дисульфідні зв'язки. Тип II і особливо IV тип містять значно більше оксілізін і вуглеводних залишків, що, можливо, стабілізує комплекс колагенів з протогліканамі. У колагені IV типу молекулярна маса а-ланцюгів вище, ніж в інших типах (120 000-180 000 дальтон), що розцінюється як відсутність відщеплення кінцевих пептидів проколагену, перешкоджає утворенню в базальних мембранах фібрил з типовою періодичністю [Minor RR et al., 1975 ].
Слід зазначити також, що, крім макрогетерогенності, існує і мікрогетерогенності колагену, тобто менш істотні відмінності всередині типів в ступені гідроксилювання проліну та лізину, змісті різних амінокислот і вуглеводних залишків [Prockop D. et al., 1976]. Це пов'язано з тканинною специфічністю колагену. Наприклад, існують підвиди II типу для гіалінового і фіброзного хряща, I типу для шкіри, сухожилля, рогівки, два різновиди IV типу [Bailey А. et al., 1979].
Мабуть, макро-і мікрогетерогенності первинної структури колагену грає важливу біологічну роль, визначаючи особливості колагенових волокон на більш високих структурних рівнях і характер взаємодії їх з іншими компонентами сполучної тканини і з клітинними 'елементами, що в сукупності визначає функціональні особливості різновидів сполучної тканини.
1.2 Розчинні фракції і агрегація колагену в фібрили
Після секреції у міжклітинний простір і відщеплення, пропептид молекули колагену агрегує в фібрили, які є первинною формою надмолекулярної структури колагену. Оскільки молекулярний механізм фібріллообразованія в Організмі мало доступний для вивчення, основні гіпотези отримані на підставі дослідження агрегації молекул при осадженні їх з розчинів колагену.
Типи розчинної колагену можна розділити на дві основні категорії. До першої категорії (нативні розчини) відносяться розчинні фракції, одержувані прямий екстракцією із сполучної тканини молодих тварин, у яких колаген ще недостатньо скріплений міжмолекулярними зв'язками. Розрізняються кіслоторастворімий і нейтральносолерастворімий колаген, екстрагуються відповідно кислими буферами і нейтральними сольовими розчинами. До другої категорії відносяться розчини зрілого, нерозчинного колагену, отримані після попередньої ферментативної, хімічної або механічної обробки тканини (солюбілізірованний колаген). Ця категорія розчинів була використана нами для створення лікарських препаратів з колагену.
У залежності від умов осадження (рН, іонна сила, температура та ін) з розчину колагену можна отримати різні типи фібрилярних структур:
1) фібрили з неврегульованою структурою без періодичності;
2) кристали довжиною 280 нм (SLS-сегменти), що представляють собою паралельну агрегацію молекул бік в бік. У SLS визначили 117 поперечних асиметричних смуг, які, подібно до «відбитку пальців», характеризують розподіл полярних і неполярних амінокислотних залишків;
3) фібрили FLS з періодом 280 нм, в яких молекули також агрегує паралельно, але орієнтовані в сусідніх шарах в різні сторони (опозиційної), так що N-кінці з'єднані з С-кінцями; Рис. 27. Можливі шляхи внутрішньоклітинного транспорту і секреції колагену.
4) фібрили нативного типу (тобто відповідні тканинним) з періодичністю 64-67 нм. Основний період в цих фібрила складається з світлої А-зони і темної По-зони, особливо чітко видимими при негативній забарвленні фосфорно-вольфрамової кислотою. Після позитивного контрастування в періоді виявляється 12 темних і 12 світлих додаткових смуг, що відображають первинну структуру молекули [Kuhn К., 1974].
Для вивчення фібрилогенезу в організмі найбільше значення має механізм агрегації молекул у фібрили нативного типу, що пояснює наявність періодичності. Починаючи з 50-х років був висунутий ряд різних гіпотез, з яких найбільше значення мала модель зсуву сусідніх молекул на чверть своєї довжини [Schmitt F. О., Gross J., 1955], і модель RA Grant і співавт. (1967), за якою періодичність пояснюється існуванням на молекулах «смуг зв'язування» довжиною 26,5 нм, що містять полярні групи, і смуг, що містять неполярні групи 37,5 нм.
Пізніше було встановлено, що довжина молекули кратна не 4, а 4,4 D (D - довжина періоду 64 нм). Молекули, упаковані в фибриллу, в лінійній проекції розділені проміжком 0,6 D (зона «порожнечі»), а сусідні паралельні ряди молекул зрушені щодо один одного на величину періоду D, причому вони перекривають кінці паралельних їм молекул на 0,4 D (зона «перекриттів»).
Таким чином, уздовж фібрили чергуються зони «порожнеч» і «перекриттів», які на негативно забарвлених електронограмма відображаються відповідно в темних і світлих смугах періоду [Ktihn К., 1969; BrunsR. R., Gross J., 1974; Miller A., 1976]. Вся структура стабілізувати за рахунок поперечних зв'язків між молекулами.
Описана картина укладається в двомірну модель упаковки молекул колагену, вивчення ж тривимірної структури пов'язане зі значними труднощами. Однією з найбільш визнаних є модель JW Smith (1968), по якій п'ять молекул, зсунутих між собою на ID, стикаючись бічними поверхнями, покладені в циліндричний філамент, причому п'ята молекула зрушена по відношенню до першої на 4D. Такий філамент росте в довжину за рахунок приєднання нових молекул, а в ширину фібрила росте тільки шляхом з'єднання філаментів між собою. Усередині філамента молекули згорнуті в спіраль [Piez К.А., 1975]. Близька до цього і модель A. Veis н співавт. (1967), в якій передбачається, що філаменти складаються з чотирьох молекул колагену. Слід зазначити, що діаметр філаментів за цими моделями (3,5 нм в сухому та 5 нм у вологому стані) збігається з розмірами мінімальних філаментів (прото-або мікрофібрил), виявлених усередині тканинних колагенових фібрил [Olsen В. R., 1963; Doyle В.В. et al., 1974; Brims RR, 1976], а також у поперечно-смугастих філдментарних агрегатах (див. розділ 2.2.6).
За даними М. Bouteille, D. С. Pease (1971), JH Lillie і співавт. (1977), при «інертної» дегідратації, впливі сечовини або гуанідінхлоріда відбувається дисоціація фібрил на філаменти товщиною 3,5-4 нм, причому виявляється спіралевідное скручування цих філаментів. Спіральна структура колагенових фібрил виявляється також при застосуванні методу заморожування - розколювання [Rayns R. et al., 1974; Belton J. С. et al., 1975], ймовірно, в результаті використання агентів, що руйнують водневі зв'язки. У деяких випадках спіралеподібна структура фібрил відзначається і при звичайній заливці, наприклад в пухлинах [Manabe Т., Kajikkawa V., 1976]. Подібні зміни були виявлені в склері при різко вираженою короткозорості.
На закінчення слід відзначити, що поки не існує загальновизнаної моделі тривимірної структури фібрили, яка повністю відповідала б рентгеноструктуровим та електронно-мікроскопічним даними. Обговорюються можливості тетрагона і гексогональной решітки, циліндричної (у формі вставлених один в одного циліндрів з шарів молекул) і спіральної (закрученої в рулон) упаковки молекул в фибриллу [Miller A., 1976].
1.3 Дані ЯМР про структуру зв'язаної води в колагені за допомогою скануючої калориметрії
До складу нативного (неушкодженого) колагену входить зв'язана вода, яка становить близько 2 / 3 (або ~ 66%) від повної маси сухожилля. Встановлено, що вода відіграє істотну роль у механізмі самозбірки молекул колагену і освіти фібрил в цитоплазмі коллагеноцітов, а також у механізмах біохімічної активності та функціонуванні колагену у позаклітинному просторі живого організму [1]. Однак до теперішнього часу принциповий характер гідратної структури колагену залишається нез'ясованим. За даними 2 Н ЯМР спектроскопії сухожиль хвоста щура, збагаченої тяжеловодородной водою 2 H 2 O, було встановлено, що в "щільних" ділянках структури колагену молекули зв'язаної води (2 Н 2 О) характеризуються константами квадрупольного взаємодії (ККВ) ядер 2 Н ~ 3 кГц (в інтервалі від +20 ° до ~ +5 ° C).
При негативних температурах ККВ зростають, досягаючи значень ~ 8 кГц при -10 ° C, і тенденція до збільшення ККВ зберігається при подальшому зниженні температури. Відносно мала величина ККВ та її плавні зміни типові для процесів дифузійної рухливості молекул води в нанопористих системах цеолітового типу. Фазові переходи в подібних системах, як правило, є переходами типу порядок-безлад (близькими до фазових переходів другого роду) і не супроводжуються різкими тепловими ефектами.
У той же час за даними 2 Н ЯМР водна підсистема колагену в областях "щілин" характеризується дуже малими значеннями ККВ (близькими до нульових), що вказує на сильну раз-впорядкованість підсистеми зв'язаної води в "пухких" ділянках структури колагену. Виявлено також, що в околиці температури замерзання води (~ 273 K) стрибкоподібним чином змінюється спектр 2 Н ЯМР сухожилля. Інтенсивна центральна лінія, яка відноситься нами до рихлим ділянкам структури колагену, стає неспостережний, що може вказувати на фазовий перехід першого роду. Даний факт побічно свідчить на користь моделі, відповідно до якої "пухкі" ділянки структури колагену представляють собою тектогідрат, або структуру, що включає безперервний тривимірний каркас з молекул води з тетраедричних координацією, характерною для льоду і клатратное гідратів. У цьому випадку значення ККВ і ширина спектру 2 Н ЯМР повинні зростати на два порядки порівняно з кімнатною температурою, відповідно амплітуда сигналу повинна впасти на два порядки, що узгоджується з експериментом. Проте для прямого підтвердження подібної моделі розташування молекул води необхідно отримати термодинамічні характеристики даного фазового переходу.
У даній роботі був проведений аналіз величини прихованої теплоти фазового переходу в сухожиллях хвоста щури з використанням методу скануючої калориметрії. Для досліджень були взяті зразки сухожилля RTT експериментальних тварин лінії "Вістар", що містилися на стандартному харчуванні. Вік щурів становив 6 місяців, чисельність у групі - 3 тварин. Зразки волокон сухожиль вагою 100-150 мг вилучали безпосередньо перед дослідженням. Вимірювання проводили в інтервалі від кімнатної температури (+20 ° С) до -30 ° С, швидкість зміни температури 3 град. / хв. при використанні автоматичного калориметра ДСК-204 фірми Netzsch (Німеччина). Результати вимірювань представлені в таблиці.
Отримані дані можна порівняти з довідковими параметрами для прихованої теплоти плавлення чистого льоду: Q пл (лід) = 333,5 Дж / г [6]. При порівнянні треба враховувати, що в сухожиллях вміст колагену досягає 94%, а вміст води в нативному колагені складає ~ 66%. Розподіл зв'язаної води між щільними та пухкими ділянками достовірно не встановлено, але за даними ЯМР 2 Н [5] в "пухких" ділянках колагену міститься приблизно половина загального вмісту води в сухожиллі. Таким чином, якщо структура підсистеми молекул води в вакансійних ділянках нативного колагену при негативних температурах відповідає структурі тектогідрата (клатратоподобного або льодоподібною типу), то очікувана прихована теплота фазового переходу в даній підсистемі повинна скласти
Q пер = ~ (0,66 ⋅ 0,5 ⋅ 0,94) ⋅ Q пл (лід) = ~ 94 Дж / г,
що знаходиться в хорошому злагоді з виміряними значеннями для трьох зразків.
На кривих охолодження спостерігаються знижені значення Q пер, що є наслідком значного переохолодження зразків при зниженні температури. Даний ефект дозволяє отримати оцінне значення теплоємності c p високотемпературної фази підсистеми молекул води, що відчуває фазовий перехід. У рамках обговорюваної моделі середнє значення величини зміни теплоти фазового переходу ΔQ пep = 16,55 ± 3,9 Дж / г повинно бути пов'язано з середньою величиною температури переохолодження Т = (11,5 ± 0,7) ° співвідношенням
ΔQ пep = ~ (0,6 ⋅ 0,5 ⋅ 0,94) ⋅ Δс р ΔT,
де Δс р - різниця між теплоємністю води і льоду. Якщо властивості водної підсистеми, що відчуває фазовий перехід у колагені, відповідають властивостям вільної води і льоду, то Δс р = 2,062 Дж / г (поблизу 0 ° С [6]). Звідси розрахована величина ΔQ пер = ~ 6,69 Дж / моль; знижений в порівнянні з експериментом значення розрахункової величини ΔQ пер може вказувати на існування вкладу в Δс р, пов'язаного із взаємодією молекул води і функціональних угруповань в білковій структурі. Таким чином, на якісному рівні величина прихованої теплоти фазового переходу знаходиться у згоді з моделлю, згідно з якою властивості приблизно половини зв'язаної води у структурі колагену близькі до властивостей вільної (або об'ємної) води. Підвищена температура плавлення льоду зв'язаної води в колагені і різниця значень теплоємності Δс р можуть вказувати на деяку взаємоузгодження структур води і фібрилярні білка, можливо, клатратное типу.
2. Способи іммобілізації колагену з різних органів і тканин. Можливість застосування в іммобілізації колагенів сухожиль
Для розчинення колагену використовуються різні методики, але більшість з них базується на розчиненні в оцтовій кислоті.
Енуклеірованние заморожені очні яблука свині (-20 °) розморожують при кімнатній температурі, склера відділяється від залишків м'язів, зв'язок і пігменту і промита холодною водою. Отримана тканина може зберігатися в замороженому вигляді протягом 3-4 тижнів. Виділення колагену. 100 р. очищеної склери заливається 5 л лужного розчину (1966 NaOH + 100 р. Na 2 SO 4 на 1 л розчину) і при періодичному перемішуванні витримується при 20 ° протягом 36 ч. При цьому полісахариди і протеоглікани, що становлять значну частину склери, переходять в розчин. Потім склеру відокремлюють від розчину на воронці Бюхнера і промивали 10 л дистильованої води. Для нейтралізації лугу тканину обробляють 2%-м H 3 BO 3 протягом 40 хв при перемішуванні на магнітній мішалці. Обробку склери розчином борної кислоти повторюють 4 рази до встановлення pH розчину 6.0. Після нейтралізації лугу склеру 4 рази відмивають від H 3 BO 3 і Na 2 SO 4 дистильованою водою (5 л), кожен раз протягом 40 хв при 20 ° при постійному перемішуванні на магнітній мішалці. Ступінь відмивання визначають по повному видаленню (SO 4) - (реакція з BaCl 2). Отримання розчину колагену. До вимитій склері додають рівну за обсягом кількість 0.3 M CH 3 COOH і витримують отриману гелеобразную напівпрозору масу протягом 7-8 діб при 4 ° і слабкому перемішуванні. У цих умовах колаген переходить в розчин, і склера розчиняється практично без залишку. Отриманий розчин гомогенізують і фільтрують через скляний фільтр з розміром пор 160 мкм, використовуючи водоструминні насос. Концентрація колагену в отриманому розчині (по сухому залишку) складає 2% за масою. Частина отриманого розчину розбавляли 0.2 М Na-ацетатний буфер з pH 3.44 до концентрації 8.6 ⋅ 10-6 і 8.6 ⋅ 10-7 М.
Визначення концентрації. Зміст колагену в пробах визначають модифікованим методом Лоурі [18] за допомогою реактиву Фоліна-Чіокалто. В якості стандарту використовують розчин желатини відомої концентрації. Реєстрацію проводять спектрофотометрично при λ = 750 нм. Реакційна суміш складається з 0.04 М CuSO 4, 0.11 М Na 2 C 4 H 4 O 6, 0.05м Na 2 CO 3, 0.4 М NaOH, реактиву Фоліна-Чіокалто і коллагенового розчину. Метод заснований на реєстрації забарвленого з'єднання, що утворюється при взаємодії білка з реактивом Фоліна [19].
Відомий спосіб отримання колагену за патентом США 5106949, МПК A 61 K 35/32, опубл. 21.04.1992 р. Відповідно до патенту колаген отримують із сухожиль (переважно сухожиль згиначів копита телят). Далі проводять такі операції:
- Видаляють оболонки сухожиль;
- Подрібнюють матеріал;
- Промивають подрібнений матеріал фізіологічним фосфатним буфером (PBS) (2 г хлористого калію КС1, 2 г однозамещенного фосфорнокислого калію KH 2 РО 4, 80 м. хлористого натрію і 79,3 г двузамещенного фосфату натрію на 1 л розчину), рН 6,5 -8,5, розбавленим 1:3-1:1; найбільш ефективний розбавлений 1: 3 PBS з іонною силою 0,05 М (0,05 молярного) NaCl і 0,0022 М Na 2 HPO 4 (6-кратна промивка по 2 год);
- Екстрагують колаген слабкою кислотою (0,5-2 М оцтова кислота); переважно 0,5 М оцтова кислота з добавкою 4 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА);
- Беруть в облогу колаген з допомогою NaCl (0,6-1,8 М);
- Виділяють осад і розчиняють його в оцтовій кислоті;
- Переводять розчин діалізом в 0,01 М оцтову кислоту.
Дані методики не суперечать цілям дослідження з огляду на те, що і склера і сухожилля побудови одним і тим же типом колагену, тобто всі зазначені типи взаємодії білка з реактивами застосовні в обох випадках іммобілізації.
Висновок
Важливою особливістю колагену та інших біологічних полімерів є їх здатність утворювати комплекси з різними лікарськими речовинами для спрямованої дії: підсилюють згортання крові, що стимулюють відновлення сполучної тканини, протибактеріальних та ін Таким чином, відкриваються широкі перспективи для лікувальних препаратів пролонгованої впливу, причому колаген або інші біополімери грають для лікарського засобу роль депо. Так, введення колагенових препаратів, що містять лінкоміцин, показало, що антибіотик зберігається в навколишніх тканинах 23-25 діб. На цьому принципі зараз засновані ліки зі збільшеними термінами бактеріального впливу на мікробну флору, що застосовуються при лікуванні остеомієліту, лейшманіозних виразок, бронхіальних свищів, при пластиці кровоносних судин в умовах інфекції.
Здатність колагену утворювати комплекси з гепарином - речовиною, що перешкоджає згортанню крові і виникнення тромбів, що закупорюють просвіт судини, послужила підставою для створення судинного протеза з антикоагулянтними - протизсідні - властивостями. Такий комбінований судинний протез являє собою ткану або в'язану синтетичну трубку, пори якої заповнені коллагенгепаріновой плівкою. Подібні імплантати можна використовувати для заміщення не тільки уражених артерій, але і уражених вен, оскільки коллагенгепаріновий комплекс тривало забезпечує антизсідальної ефект і перешкоджає утворенню пристінкових тромбів.
Явним гідністю колагену та отриманих на його основі колагенових матеріалів для медицини є відсутність токсичних та канцерогенних властивостей, слабка антигенність, висока механічна міцність і стійкість до тканинних ферментів, регульована швидкість лізису в організмі, здатність утворювати комплекси з біологічно активними речовинами, стимуляція регенерації власних тканин організму .
Список літератури
1. В.В. Сєров, А.Б. Шехтер - Сполучна тканина (функціональна морфологія і загальна патологія) - М, 1981
2. Журнал структурної хімії - С.П. Габуда, АА Гайдаш, В.А. Дребущак, С.Г. Козлова - Дані ЯМР про структуру зв'язаної води в колагені за допомогою скануючої калориметрії - том 46, № 6, 2005
3. Опис винаходу до патенту РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ - Л.В. Кухарева, Б.А. Парамонов, І.І. Шамоліна, Є.Г. Семенова - Спосіб отримання колагену для лікування патологій тканин організму - СПб, 2003
4. Патент США 5106949, МПК A 61 K 35/32 - 1992 р.
5. Єлісєєв В.Г. Сполучна тканина. - М.: Медгиз, 1961.
6. Мазуров В.І. Біохімія колагенових білків. - М.: Медицина, 1974.
7. Нікітін В.М., Перський Є. Е »Утєвська Л.А. Вікова і еволюційна біохімія колагенових структур. - Київ.: Наукова думка, 1977.
8. Хількін А.М., Шехтер А.Б., Істранов Л.П. Колаген і його застосування в медіціне.-М.: Медицина, 1976.
9. Bazin S., Lelous M., Delannay A. Collagen in granulation tissue. - Agent and Act., 1976, v. 6, p. 272-275
10. Bruns R. Supramolekular structure of polymorphic collagen fibrills. - J. Cell Biol., 1976, v. 68, p. 521-538
11. Gay S., Muller P., Meigel W., Kuhn K. Polymorphic des Kollagens: Neue Aspekte fur die Structur und Funktion des Bindegewebe.-Hautarzt, 1976, v. 27, p. 196-205
12. Gross J. Collagen biology: structure, degradation, and disease. - Harvey Lectures, 1974, v. 68, p. 351-432
13. Gross J. Aspects of the animal collagenases. - In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 275-317
14. Kefalldes N. Basement membranes: structural and biosynthetic considerations. - J. invest. Derm., 1975, v. 65, p. 85-92
15. Miller A. Molecular packing in collagen fibrils. - In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 85-136
16. Minor R., Clark C, Kefalides N. Synthesis and deposition of basement membrane procollagen. - J. Cell. Biol., 1975, p. 67, part 2, p. 287-899.
17. Piez K - The regulation of collagen fibril formation. - In: Extracellular matrix influences on gene exdivssion. New York, 1975, v. 231-237.
18. Ratnachandran G., Ratnakrishnan C. Molecular structure of collagen. - In: Biochemistry of Collagen. New York, 1976, p. 45-84.
19. Reddi A. Collagen and cell differentiation. - In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 449-478
20. Trelstad R. Basement membrane collagens: isolation by heat gelation fractionation. - Upsala J. Med. Sci., 1977, v. 82, p. 157-162.
21. Weiss J. Enzymic degradation of collagen. - Intern. Rev. Connect. Tissue Res., 1976, v. 7, p. 101-157.