Контрольна робота
з біології
2009
Зміст
1. Методи визначення афінності антитіл
2. Способи розрахунку констант комплексоутворення реакції антиген-антитіло
3. Кінетичні закономірності реакції взаємодії антиген-антитіло
1. Методи визначення афінності антитіл
Визначення афінності антитіл в сироватці або виділених в очищеному вигляді являє собою складну експериментальну і теоретичну задачу. Труднощі обумовлені наступними обставинами.
По-перше, гетерогенністю антитіл за фізико-хімічними властивостями, у тому числі по спорідненості до антигенів. По-друге, складністю визначення загальної кількості антитіл, а також окремих фракцій. По-третє, у разі полівалентних антигенів можливістю утворення комплексів складного складу, в тому числі циклічної структури, в яких проявляється кооперативность взаємодії активних центрів антитіл. Все це не дозволяє застосувати традиційні методи для розрахунку справжніх значень констант зв'язування. -фрагментов, так как в этом случае могут быть выделены индивидуальные антитела в гомогенном виде.
Більш надійні дані можуть бути отримані для моноклональних антитіл і їх Fab-фрагментів, так як в цьому випадку можуть бути виділені індивідуальні антитіла в гомогенному вигляді.Справжні значення констант зв'язування важливі для визначення термодинамічних характеристик процесу взаємодії · антиген - антитіло. Для практичних цілей, зокрема для розробки методів імуноферментного аналізу, достатньо знати ефективні значення, що характеризують властивості використовуваних антитіл.
Розглянемо принципові підходи до визначення констант рівноваги. З рівняння випливає, що для розрахунків необхідно знати концентрації вільного та зв'язаного з антитілами антигену в умовах рівноваги. Зазвичай для цього використовують антигени, мічені маркером, який з високою чутливістю може бути визначений одним з доступних фізико-хімічних методів.
Всі методи, що дозволяють визначати концентрації вільного та зв'язаного антигену, можна умовно розбити на дві великі групи. До першої відносяться методи, в яких стадія поділу вільного та зв'язаного антигену здійснюється шляхом виборчого осадження, аффинного зв'язування або гельфільтраціі. Якщо реагенти досить сильно різняться своїми молекулярними масами і розмірами, то процедура поділу істотно спрощується. У разі корпускулярних антигенів залишилися незв'язані антитіла можуть бути відділені або центрифугуванням, або пропусканням суміші через фільтр, що затримує антиген. Для низькомолекулярних антигенів використовується рівноважний діаліз.
Друга група включає методи, що базуються на зміні фізико-хімічних властивостей антигенів при комплексоутворенні з антитілами: гасінні або посиленні флуоресценції, зміні ступеня поляризації флуоресценції, інгібуванні ферментативної активності.
Рівноважний діаліз - найбільш поширений метод вивчення реакції антиген - антитіло. Метод заснований на різній здатності антитіл і гаптену проходити через напівпроникні мембрани. Розчин кожного реагенту відомої концентрації в одному і тому ж розчиннику з однаковою іонною силою і значенням рН поміщають по різні сторони мембрани. Молекули гаптену дифундують у розчин антитіл і зв'язуються з ними. При досягненні рівноваги концентрація вільного гаптену вирівнюється по обидва боки мембрани. Вимірявши рівноважну концентрацію гаптену, можна розрахувати кількість гаптену, пов'язаного з антитілами, та визначити за рівнянням константу зв'язування.
Это обстоятельство существенно ограничивает область использования метода.
Як правило, метод рівноважного діалізу застосовується для низькомолекулярних сполук з Af r <3000. Ця обставина істотно обмежує область використання методу. До недоліків методу треба також віднести відносно великий час досягнення рівноваги і необхідність врахування ефектів, що викликаються присутністю мембрани, в результаті чого необхідно працювати з досить високими концентраціями реагентів, що значно знижує чутливість визначення константи зв'язування.Методи фракційного осадження використовуються для розділення комплексів антиген - антитіло і незв'язаного антигену. Вони засновані на здатності високомолекулярних комплексів антиген-антитіло вибірково осідати різними реагентами. При встановленні в системі рівноваги облягати реагент додають в такій концентрації ^ коли комплекс антиген-антитіло і незв'язані антитіла стають нерозчинними і випадають в осад, який легко може бути видалений центрифугуванням.
Методи, що не включають фазове розділення вступив і не вступив в реакцію антигену, відносяться до групи гомогенних методів.
Флуоресцентні методи засновані на здатності залишків триптофану в молекулах білків флуоресцировать при порушенні УФ світлом. Взаємодія ряду антигенів з антитілами призводить до зміни інтенсивності флуоресценції, що може бути використано для оцінки кількості антигену, що вступив у реакцію з антитілами. Залежно від хімічної структури антигену може спостерігатися як посилення, так і гасіння флуоресценції. Ступінь гасіння інтенсивності світіння залежить від концентрації активних центрів антитіл, константи їх асоціації з антигеном і пропорційна концентрації утворилися специфічних комплексів. Методи флуоресценції прості, не займають багато часу і мають високу чутливість, що скорочує витрати реагентів.
Таблиця 1. Методи визначення афінності антитіл
Методи | Використовувані антигени |
Рівноважний діаліз Осадження глобулінової фракції сульфатом амонію Осадження вугіллям, модифікованим декстраном Осадження антіглобулінамі Гельфільтрація, поділ за молекулярною масою Гасіння флуоресценції Посилення флуоресценції Поляризація флуоресценції Спектральні методи Гасіння біолюмінесценції | Гаптени, діалізуемие антигени гаптени, антигени, розчинні при 50%-ном насиченні сульфатом амонію гаптени Гаптеіи, білки, полісахариди гаптени, білкові полісахариди Гаптени і антигени зі специфічними флуоресцентними властивостями Гаптеіи, білки гаптени, білки Гаптени, пов'язані з барвником гаптени, білки |
Метод деполяризації флуоресценції заснований на вимірюванні поляризації флуоресценції антигену, міченого барвником, до взаємодії з антитілами і після комплексоутворення. Поляризація флуоресценції визначається молекулярним об'ємом частинки і ступенем її асиметрії. Комплексоутворення антигену з антитілом супроводжується різкою зміною поляризації флуоресценції барвника, який іграти роль мітки антигену чи антитіла. Межа виявлення антигену цими методами досить малий. Недоліками методів, заснованих на вимірі флуоресценції, є необхідність роботи з препаратами очищених антитіл і суворі вимоги до структури досліджуваних антигенів. Внаслідок цього флуоресцентні методи не є універсальними і можуть бути застосовані для обмеженої групи антигенів.
Методи гасіння біолюмінесценції засновані на використанні в якості маркера АТР, пришитою до 'молекулі антигена. У складі такого комплексу молекула АТР зберігає активність у реакції біолюмінесценції, що каталізується светлячковой люциферази. При додаванні антитіл утворюється комплекс з антигеном, в якому молекула АТР стає недоступною ферменту, в результаті чого інгібується реакція біолюмінесценції. Зазначений метод має високу чутливість, що дозволяє вимірювати константи асоціації до 10 -12 М.
Перелік експериментальних методів визначення афінності взаємодії антиген - антитіло наведено в табл. 1.
2. Способи розрахунку констант комплексоутворення реакції антиген - антитіло
Взаємодія однієї субпопуляції антитіл з моновалентний антигеном. -фрагмента-ми моноклональных антител и описывается простейшей схемой.
Цей найбільш простий випадок реалізується, наприклад, при зв'язуванні гаптену з Fab-фрагмента-ми моноклональних антитіл і описується найпростішої схемою.Із системи рівнянь матеріального балансу
з урахуванням для константи рівноваги комплексоутворення можна легко отримати вираження рівноважної концентрацій утворився комплексу
1. Один з часто використовуваних способів розрахунку константи полягає в дослідженні залежності комплексу, що утворюється від загальної концентрації антигену о. Якщо при досить великих концентраціях антигену в системі виконується умова, то приймає вигляд
Ця залежність є аналогом ізотерми адсорбції Ленгмюра в теорії адсорбції або рівняння Міхаеліса-Менти в ферментативної кінетики. З виразу випливає, що при граничних значеннях концентрації 0 концентрація комплексу прагне до загальної концентрації центрів зв'язування 0. Для обчислення К визначають концентрацію антигену 'о, при якій половина антитіл знаходиться у вигляді комплексу з антигеном. З урахуванням виразів і можна отримати
З виразу випливає, що '0 = 1 / К за умови 1 / К "> о. При зворотному співвідношенні даний метод визначення До неприйнятний.
Залежність концентрації комплексу, що утворюється від загальної концентрації антигену у розчині
Графічне визначення константи зв'язування в подвійних зворотних координатах
2. Іноді для обчислення константи зв'язування До використовують уявлення експериментальних даних залежності концентрації комплексу від концентрації вільного антигену в системі подвійних зворотних координат:
При постійній концентрації антитіл в системі варіюють початкову концентрацію антигену і в умовах рівноваги визначають концентрацію вільного та зв'язаного в комплекс антигену. Графік в подвійних зворотних координатах представляє собою пряму лінію з тангенсом кута нахилу, що відсікає на осі ординат відрізок
В умовах надлишку антигену аналіз проводять в координатах 1 / 0.
3. Найбільш часто для аналізу комплексоутворення використовують метод Скетчарда, заснований на дослідженні залежності відносини рівноважної концентрації комплексу до концентрації вільного антигену від концентрації комплексу.
Аналітичний вигляд рівняння Скетчарда легко отримати з вирази для константи комплексоутворення та рівняння матеріального балансу:
.
У літературі часто ці координати позначають у символах. B / FiB. Залежність Скетчарда має вигляд прямої з тангенсом кута нахилу - К, відтинає на осі ординат відрізок К о, а на осі абсцис 0. Графічна обробка експериментальних даних у координатах Скетчарда дозволяє обчислити не лише рівноважну константу зв'язування, а й концентрацію активних центрів антитіл 0 в системі.На практиці при знаходженні константи даними способом проводять серію дослідів з визначення рівноважної концентрації вільного антигену при різних початкових концентраціях антигену і постійної концентрації антитіл в системі.
4. В якості ще одного перетворення рівнянь і використовують наступне:
Розділивши чисельник і знаменник частини рівності на концентрацію антитіл 0 і Логаріфміруя вираз, отримуємо
У координатах .
Взаємодія однієї субпопуляції антитіл з полівалентним антигеном. -фрагментов моноклональных антител с клетками, вирусными частицами и т. д., имеющими на своей поверхности большое число одинаковых центров связывания.
Розглянутий нижче випадок може реалізуватися, наприклад, при зв'язуванні Fab-фрагментів моноклональних антитіл з клітинами, вірусними частками і т. д., що мають на своїй поверхні велика кількість однакових центрів зв'язування. Вираз для константи рівноваги взаємодії антитіла, що має за з епітопів, записується таким чином:
Рівняння Скетчарда в цьому випадку приймає вигляд
Варіюючи концентрацію антитіл в системі при постійній концентрації о, можна визначити константу комплексоутворення К і число місць зв'язування 6 антигене п.
Так як молекули антитіл мають, принаймні, двома центрами зв'язування, то при взаємодії з полівалентним антигеном можливе утворення так званих комплексних зв'язків, коли після взаємодії одного активного центру молекули антитіла з одним з епітопів другий активний центр взаємодіє з розташованим поблизу другий епітопів тієї ж молекули антигену. может в 10 3 раз и более превышать Ко одиночных связей.
Загальна ефективність взаємодії в цьому випадку істотно зростає; зокрема, ефективна константа комплексоутворення для молекули IgG може в 10 3 разів і більше перевищувати Ко одиночних зв'язків. в Системе. Частота утворення таких зв'язків залежить від концентрації реагентів і може коливатися від нуля до максимальної, відповідної загальної кількості молекул IgG в Системі.Взаємодія двох субпопуляцій антитіл з моновалентний антигеном. Одним з простих наближень при описі реальних систем взаємодії моновалентною антигену з антитілами може бути модель, згідно з якою набір популяцій антитіл замінюється двома - високоафінними і нізкоаффінной, кожна з яких характеризується власною константою комплексоутворення - Кй і Кг. Задача визначення констант і концентрацій кожної з фракцій антитіл перед експериментаторами виникає часто. Знання чисельних значень цих параметрів досить важливо для розробки конкретних наборів для імуноферментного аналізу і вибору схеми проведення імуноаналізу з метою досягнення необхідної чутливості визначення антигену і специфічності аналізу.
В умовах рівноваги розглянута схема взаємодії
описується системою наступних алгебраїчних рівнянь:
Опускаючи алгебраїчні перетворення, дамо остаточний вираз залежності, яка описує зв'язок параметрів системи в координатах Скетчарда:
де ; F=. Графическая зависимость
В = Вй-\-В 2 = +; F =. Графічна залежність B / F від В має вигляд гіперболи. Таким чином, одержувана при аналізі залежності зв'язування невідомою популяції антитіл з антигеном в координатах Скетчарда увігнута крива може свідчити про існування двох фракцій антитіл - високоафінними і нізкоаффінной.Для визначення чотирьох невідомих параметрів - Кг,
0 и о можно воспользоваться одним из следующих методов. Кй, Кг, 0 і о можна скористатися одним з таких методів.1. Параметри можна оцінити по кутах нахилу асимптот гіперболи і відрізкам, що відсікаються ними на осі абсцис і ординат. Для побудови асимптот використовують наступний прийом.
За кінцевим ділянкам експериментальної кривої проводять прямі, які дають початкове наближення констант Кй і КЯ. Шляхом паралельного переміщення прямих підбирають таке їх становище, щоб сума відрізків, що відсікаються ними на осях координат ', дорівнювала відповідним відрізкам на тих же осях, що відсікаються самої кривої при екстраполяції її до осей координат:
дают оценочные значения для
Відрізки на осі абсцис ОМ і осі ординат CW дають оцінні значення для и о соответственно. 0 і про відповідно. Підставляючи оцінні значення Кз, 0 в выражения для Кй, Кз, 0 у вирази для Вй і В 2
знаходять наближені параметри У \ і В% і В = В 1 - \-В 2 при різних концентраціях Аг.
/ F
З використанням отриманих значень будують теоретичну залежність B / F від В, порівнюють її з експериментальної і підбирають нові оціночні параметри до найкращого збігу теоретичної та експериментальної кривої.2.
Для знаходження асимптот гіперболи можна скористатися чисто графічним методом, що полягає в побудові двох прямих PQ і , для которых выполняется соотношение НМ, для яких виконується співвідношення
, соединяющий начало координат с любой точкой R , находящейся на гиперболе, равен сумме отрезков ORi
тобто відрізок OR, з початку координат в будь-якою точкою R, що знаходиться на гіперболі, дорівнює сумі відрізків ORi 2, соединяющих начало координат с точками пересечения отрезка OR і OR 2, що з'єднують початок координат з точками перетину відрізка OR з асимптотами.3. Для оцінки параметрів Кі Кг, и о часто используют следующий метод, основанный на анализе графической зависимости B / F п і про часто використовують наступний метод, заснований на аналізі графічної залежності B / F від В. З експериментально отриманої кривої зв'язування шляхом екстраполяції знаходять точки перетину кривої з осями абсцис і ординат. Проводять дотичні в цих точках до кривої до перетину їх з осями абсцис і ординат в точках D і Е "
Можна показати, що чисельні значення шуканих параметрів визначаються за наступними алгебраїчним формулами:
3. Кінетичні закономірності реакції взаємодії антиген - антитіло
Освіта комплексу антиген-антитіло є оборотним процесом, тобто рівноважна константа зв'язування даного комплексу визначається відношенням константи швидкості асоціації ki до константи швидкості дисоціації. Дослідження кінетики процесу комплексоутворення антигенів з центрами зв'язування антитіл в широкому діапазоні концентрацій, включаючи надлишкові концентрації кожного з реагентів, дозволяє визначити значення кінетичних констант швидкостей асоціації і дисоціації, розрахувати час, необхідний для досягнення системою рівноваги. -
Реакція антиген-антитіло в діапазоні таких концентрацій реагентів, які реєструються звичайні »ми фізнко-хіміческімн методами, протікає дуже швидко, що ускладнює її вивчення за допомогою традиційних кінетіческіх.методов,
При високих концентраціях реагентів лімітуючим фактором є час змішування розчинів, так як рівновага встановлюється за час, який не дозволяє визначати зміни концентрацій реагентів.
Для знаходження кінетичних констант реакції антиген-антитіло можуть бути застосовані два експериментальних підходу. Перший з них полягає у використанні спеціальних прийомів для вивчення швидких реакцій - методу температурного стрибка і методу зупиненої струменя. Другий напрямок пов'язаний із застосуванням реагентів, що дозволяють стежити за реакцією комплексоутворення в області ультранизьких концентрацій реагентів. Перехід до низьких концентрацій реагентів дає можливість значно знизити швидкість реакції та будуть використані для розрахунків традиційні кінетичні методи.
Основна частина кінетичних експериментів, наведених в літературі, виконана, для взаємодії гаптенов, головним чином ДНФ-лігандів. Лише дуже невелика кількість робіт присвячена дослідженню кинетическому взаємодії антитіл з антигенами білкової природи. Це пов'язано з тим, що кінетичні дані, отримані в дослідах зі складними антигенами, важко інтерпретувати.
Як для білкових антигенів, так і для гаптенов встановлені досить високі значення констант швидкостей асоціації, що наближаються до дифузійно контрольованому межі. У разі білкових антигенів їх значення приблизно на 2 порядки менше і коливаються від 5-10 5 до 5-Ю 6 М -1-с -1, що пояснюється більш складною структурою антигенної детермінанти білкових антигенів.
Наявні дані свідчать про те, що спостерігаються відмінності в афінності антитіл обумовлені, в основному, значеннями константи швидкості дисоціації. Це було наочно продемонстровано в експериментах з серією гомологічних гідрофобних ДНФ-лігандів, в яких десятикратне збільшення константи афінності для двох перехресно реагуючих ли-ганда обумовлено розходженням у константах швидкостей дисоціації, а не асоціації. Ці та інші результати показують, що саме константа швидкості дисоціації визначає спорідненість антитіла до гаптеном. Цей висновок, однак, не можна вважати остаточним, оскільки кількість експериментальних даних, отриманих до теперішнього часу, обмежена.
Експериментальні методи визначення кінетичних констант. Метод температурного стрибка. Цей метод є одним з релаксаційних методів, заснованих на принципі залежності часу досягнення нового рівноважного стану системи, обумовленого швидким зовнішнім впливом, від констант швидкостей прямої і зворотної реакцій. Можна показати, що якщо в початковому стані система
знаходиться в рівновазі, то після швидкої зміни температури кінетика реакції досягнення нового положення рівноваги описується диференціальним рівнянням, рішення якого є експоненту, в якій показник експоненти пов'язаний з елементарними константами швидкостей реакції рівнянням
,
называется временем релаксации. Анализ зависимости в координатах 1 / ч -— -~ позволяет найти по тангенсу угла наклона прямой значение Величина ф називається часом релаксації. Аналіз залежності в координатах 1 / ч - - ~ дозволяє знайти за тангенсу кута нахилу прямої значення ki, а по відрізку, який відсікається на осі ординат, . ki.
Визначення констант швидкостей комплексоутворення з використанням мічених реагентів. Цей метод, знайшов велике застосування у зв'язку з розвитком високочутливих методів імуноаналізу, заснованих на використанні мічених реагентів: радіоімунологічного, іммунофер-цементних та інших-методів. Кінетичні закономірності найпростішої схеми взаємодії антиген - антитіло описує система диференціальних рівнянь:
Визначення кінетичних констант взаємодії моновалентною антигену з субпопуляцней антитіл за методом температурного стрибка
З урахуванням рівняння матеріального балансу
н початкових умов можна отримати розв'язок системи
де
Дуже істотним параметром в «ммуноферментном аналізі є час встановлення рівноваги в системі. Якщо вважати, що ^ равн визначається умовою
7
той час встановлення рівноваги можна знайти за формулою
Так як для обчислення часу необхідно точне значення констант швидкостей k \ і ki, які часто невідомі, то це рівняння зазвичай використовують лише для самої грубої оцінки часу встановлення рівноваги.
Визначення константи швидкості асоціації. 1. Найбільш простий метод заснований на реєстрації початкової швидкості образования комплекса V <> утворення комплексу тогда Бг · БФ, тоді
Однак метод недостатньо точним, так як визначення про н У про зазвичай проводиться з великою помилкою. Для підвищення точності при розрахунках використовують кілька начальних.концентрацій реагентів.
2. Для знаходження k \ і k-\ експеримент проводять в умовах надлишкової концентрації одного з реагентів. У разі застосування міченого антигену використовують великий надлишок відповідних антитіл. Вираз для концентрації Комплексу в цьому випадку приймає наступний вигляд:
Як видно з цього виразу, залежність рівноважної концентрації комплексу від часу описується моноекспоненціальной кривої з предекспоненціальним множником
*
відповідним ефективної константи швидкості асоціації.
Спрямляючи залежність одним з відомих способів, наприклад, в координатах
>
по тангенсу кута прямої обчислюють k ' при заданій концентрації 0.
Відкладаючи графічно k ' від концентрації 0, отримуємо пряму, тангенс кута нахилу якої дає ki, а відрізок, що відсікається на осі ординат, ki. Даний спосіб розрахунку придатний, коли k-\ В противном случае что позволяет определить по тангенсу угла наклона только бимолекулярную константу скорости Бй. порівнянна з & i 0. В іншому випадку що дозволяє визначити по тангенсу кута нахилу тільки бімолекулярний константу швидкості Бй.
Визначення константи швидкості дисоціації. Зазвичай константу швидкості дисоціації знаходять шляхом прямого вимірювання швидкості процесу дисоціації. комплексу в умовах його незворотності. Для цього використовують один з наступних підходів.
1. Після встановлення рівноваги в системі проводять розведення системи великим надлишком буфера. Так як швидкість утворення комплексу пропорційна добутку концентрацій кожного з реагентів, а швидкість дисоціації комплексу - його концентрації в первбй ступеня, то при сильному розведенні
У цьому випадку процес дисоціації комплексу Аг-Ат буде описуватися експоненційної кривої. Випрямленням її в логарифмічних координатах можна отримати константу швидкості ku
2. У систему вносять речовини, здатні швидко і повністю пов'язувати або видаляти вільний ліганд. Якщо швидкість видалення вільного ліганда буде істотно більше швидкості дисоціації комплексу, то спостерігається швидкість розпаду комплексу описується реакцією першого порядку з k-\.
3. Після встановлення рівноваги в системі антитіла - мічений антиген в неї вводять надлишок вільного немічених антигену. - i . У цих умовах процес зміни концентрації комплексу також описується кінетикою першого порядку константа швидкості якого відповідає k - i.