МІНІСТЕРСТВО АГЕНСТВО ДО ОСВІТИ
Пензенський державний педагогічний університет
ім. В. Г. Бєлінського
Факультет Природничо-географічний
Кафедра біохімії
Дипломна робота
Активність карбоксипептидази N і ангіотензинперетворюючого ферменту в сироватці крові у онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливі
Студент
_____________________ Лобзина Є. С.
Керівник
______________________ Сметанін В. А.
До захисту допустити.
Протокол № від «_» 200 г
Зав. кафедрою
____________________________ Генгін М.Т.
Пенза, 2009 р.
Зміст
Список скорочень
Введення
Глава 1. Огляд літератури
1.1. Протипухлинна хіміотерапія
1.1.1. Механізм дії протипухлинних препаратів
1.1.2. Ускладнення хіміотерапії
1.2. Пептідергіческая система
1.2.1. Механізм утворення активних форм регуляторних пептидів
1.2.2. Роль біологічно активних пептидів
1.2.3. Ферменти обміну регуляторних пептидів
1.2.3.1. Ангиотензинпревращающий фермент
1.2.3.2.
Карбоксипептидаза N1.3. Функціонування пептідергіческой системи при онкологічних захворюваннях
1.4. ) в онкогенезе
Роль оксиду азоту (II) в онкогенезіГлава 2. Матеріали і методи
2.1. Матеріал дослідження
2.2. Методи дослідження
2.2.1.
Метод визначення активності карбоксипептидази N2.2.2. Метод визначення активності ангіотензинперетворюючого ферменту
2.2.3. Метод визначення вмісту білка
2.2.4. ) в сыворотке крови
Метод кількісного визначення оксиду азоту (II) у сироватці крові2.3. Статистична обробка результатів дослідження
Глава 3. Результати та обговорення
3.1. в сыворотке крови онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии
Дослідження активності карбоксипептидази N в сироватці крові онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливі3.2. Дослідження ангіотензинперетворюючого ферменту в сироватці крові онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливі
3.3. Дослідження вмісту нітрит-іона в сироватці крові у онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливі
Висновки
Список літератури
Список скорочень
АПФ - ангиотензинпревращающий фермент
ККС - калікреїн-кінінова система
КПN - карбоксипептидаза N
Лап - лейцин-амінопептідазу
ММП - матриксних металопротеаз
РААС - ренін-ангіотензин-альдостеронова система
РЩЗ - рак щитовидної залози
– индуцибельная NO -синтаза
iNOS - індуцибельних NO-синтаза– оксид азота II
NO - оксид азоту II– фактор некроза опухолей
TNFa - фактор некрозу пухлинВведення
У структурі захворюваності і смертності онкологічна патологія займає одне з провідних місць. ].
З кожним роком число людей, страждаючих цим захворюванням, зростає [2,34, 49].Розвиток пухлини в організмі призводить допомогою різних механізмів до глибоких фізико-хімічними, нейрогуморальним і ферментативним зрушень. Пухлини паразитують в організмі, витягуючи необхідні для росту речовини зі здорових клітин і секретіруя токсини локально або в системний кровотік [5,18,30,38,49].
Існує три напрямки лікування ракових захворювань: хірургічне, радіологічне та хіміотерапевтичне. Хіміотерапія злоякісних пухлин - це використання лікарських речовин, що гальмують проліферацію чи необоротно пошкоджуючих пухлинні клітини [10,30,43]. Головною причиною, що послужила стимулом до розвитку лікарської терапії злоякісних пухлин, стала незадоволеність результатами хірургічного і променевого лікування [7].
Особливість застосування хіміопрепаратів полягає у близькій спряженості лікувального та токсичного ефекту. До побічних дій відносять прояви нейро-, гепато-, кардіотоксичності, порушення системи згортання крові та ендокринних органів [15,25,32,37]. [52].
Підсумком побічних дій є, в тому числі, порушення у функціонуванні калікреїн-кінінової і ренін-ангіотензинової систем, важливими компонентами яких є ангиотензинпревращающий фермент і карбоксипептидаза N [52]. Крім того, е ти ферменти впливають на рівень брадикініну, що стимулює продукцію оксиду азоту (II), який, у свою чергу, будучи мультифункціональної молекулою, може регулювати проліферативну активність та апоптоз пухлинних клітин [28].и ангиотензинпревращающего фермента в период химиотерапии у онкологических больных.
Метою цієї роботи було вивчення ролі карбоксипептидази N і ангіотензинперетворюючого ферменту в період хіміотерапії в онкологічних хворих.При виконанні роботи були поставлені наступні завдання:
1. и концентрацию оксида азота ( II ) у здоровых людей.
Вивчити активність ангіотензинперетворюючого ферменту, карбоксипептидази N і концентрацію оксиду азоту (II) у здорових людей.2. и концентрацию оксида азота ( II ) у онкологических больных до химиотерапии.
Вивчити активність ангіотензинперетворюючого ферменту, карбоксипептидази N і концентрацію оксиду азоту (II) в онкологічних хворих до хіміотерапії.3. и концентрацию оксида азота ( II ) у онкологических больных после химиотерапии.
Вивчити активність ангіотензинперетворюючого ферменту, карбоксипептидази N і концентрацію оксиду азоту (II) у онкологічних хворих після хіміотерапії.4. ) в сыворотке крови у онкологических больных до и после химиотерапии.
Встановити кореляційні взаємозв'язки між активністю ферментів та концентрацією оксиду азоту (II) у сироватці крові у онкологічних хворих до і після хіміотерапії., ангиотензинпревращающего фермента и концентрация оксида азота ( II ) в сыворотке крови у онкологических больных в период химиотерапии.
Установлены корреляционные взаимосвязи между активностью исследуемых ферментов и уровнем оксида азота ( II ) при химиотерапевтическом воздействии. Наукова новизна і практична цінність роботи. Вивчено активність карбоксипептидази N, ангіотензинперетворюючого ферменту і концентрація оксиду азоту (II) у сироватці крові у онкологічних хворих в період хіміотерапії. Встановлені кореляційні взаємозв'язки між активністю досліджуваних ферментів і рівнем оксиду азоту (II) при хіміотерапевтичне впливі.и ангиотензинпревращающего фермента , а также получить более полную картину о влиянии химиопрепаратов на организм при онкологических заболеваниях и могут быть использованы для коррекции терапии, оценки его эффективности и контроля больных после окончания курса лечения.
Отримані результати дозволяють розширити наші уявлення про біологічну роль карбоксипептидази N і ангіотензинперетворюючого ферменту, а також одержати більш повну картину про вплив хіміопрепаратів на організм при онкологічних захворюваннях і можуть бути використані для корекції терапії, оцінки його ефективності та контролю хворих після закінчення курсу лікування.Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (24-25 апреля 2009 г.).
Апробація роботи Матеріали даної роботи представлені на 58 науковій конференції студентів ПДПУ, на XVI Міжнародній науково-практичній конференції «Екологія і життя» (24-25 квітня 2009 р.).Глава 1. Огляд літератури
Протипухлинна хіміотерапія
Хіміотерапія злоякісних пухлин передбачає застосування лікарських речовин вибірково діють на зростання пухлини і пухлинну тканину. Протипухлинний ефект визначається співвідношенням дії речовини або продуктів його перетворення в організмі безпосередньо на пухлинні клітини та організм в цілому [9,10,40,43].
Основні принципи хіміотерапії пухлин:
1. Підбір препарату відповідно спектру його протипухлинної дії.
2. Вибір оптимальної дози і режиму введення препарату, забезпечують лікувальний ефект без побічних явищ.
3. Врахування факторів, які потребують корекції доз і режимів щоб уникнути важких ускладнень хіміотерапії [17,25].
Існує пряма залежність між разової та сумарною дозою та терапевтичним ефектом. Доза препаратів повинна бути максимально стерпної і викликати максимальний протипухлинний ефект [9,37,43,44].
Хіміопрепарати володіють певною специфічністю на різні види злоякісних новоутворень. Швидко зростаючі пухлини більш чутливі до хіміотерапії, ніж повільно зростаючі. Метастази пухлин більш чутливі до хіміопрепаратів, ніж первинні новоутворення. Ефективність хіміотерапії обернено пропорційна масі пухлини, при якій починають лікування. .
Чим більше пухлина, тим менший ефект, і навпаки [25,46,55].Сучасна хіміотерапія - це комбінована хіміотерапія, коли використовуються одночасно від 2 до 6 цитостатиків з різним механізмом дії. При цьому виходять з уявлення про те, що порушення різних біохімічних реакцій у пухлинній клітині зменшують шанси на те, що вціліють резистентні клони пухлини. Зазвичай в ці комбінації включають препарати з різною токсичністю, що може збільшити протипухлинний ефект без збільшення загальної токсичності [10,37].
Основною проблемою хіміотерапії є нездатність цитостатиків повністю знищити пухлину в більшості випадків. Клітинна популяція пухлини дуже гетерогенна, що робить вірогідним існування клітинних ліній, резистентних до хіміотерапії. Принаймні загибелі чутливих до цитостатиків клітин хіміорезистентний штами отримують виборче перевагу в зрості [7,25,45].
1.1.1 Механізм дії протипухлинних препаратів
За своїм походженням і механізмом дії існуючі протипухлинні препарати поділяються на такі групи:
Алкілуючі агенти: хлорбутин, аміном, допа, ломустін.
Антіметаболіти: метотрексат, меркаптопурин, фторурацил, фторафур.
Антибіотики: дактіноміцін, блеомицин, рубоміцін, адріаміцін.
Алкалоїди рослинного походження: вінбластин, вінкристин, таксол [10,25,30].
За походженням хіміопрепарати можна розділити на синтетичні та природні. До синтетичних препаратів належать алкілуючі агенти і антиметаболіти. До продуктів природного походження відносять антибіотики та алкалоїди. Протипухлинні засоби здатні знищувати пухлинну клітину (цитотоксичний ефект) чи пригнічувати їх проліферативну активність (цитостатичний ефект) [43,51]. Механізм дії цитостатичних речовин заснований на їх реагуванні з молекулами життєво важливих хімічних сполук, що складають субстрат клітин (білками, нуклеїновими кислотами, ферментами), внаслідок чого настає зміна структури і фізико-хімічних властивостей внутрішньоклітинних компонентів, придушення биокаталитических процесів, що лежать в основі обміну речовин, порушення мітотичного процесу і загибель клітин [51].
Речовини алкілуючі дії взаємодіють з нуклеїновими підставами подвійної спіралі ДНК. Вони приєднуються до ДНК шляхом реакції алкілування - заміщення атома водню нуклеїнового підстави на метильную групу цитостатика. У результаті утворюються аномальні пари основ. Це призводить до прямого придушення транскрипції або до утворення дефектної РНК і синтезу аномальних білків.
Антіметаболіти. Структурна або функціональна схожість з молекулами-метаболітами дозволяє їм блокувати синтез нуклеотидів і тим самим пригнічувати синтез ДНК або РНК або безпосередньо вбудовуватися в структури ДНК і РНК, блокуючи процеси реплікації і синтезу білків.
Антибіотики. Безпосередньо впливають на ДНК шляхом інтеркаляції, запускають механізм вільно-радикального окислення з ушкодженням мембран клітин і внутрішньоклітинних структур, а також ДНК. Порушення структури ДНК веде до порушення процесів реплікації і транскрипції.
Алкалоїди рослинного походження. Цитостатичний ефект вінка-алколоїди обумовлений деполимеризацией тубуліну. Процес клітинного ділення зупиняється у фазі мітозу. Інші препарати сприяють полімеризацію тубуліну, викликаючи утворення дефектних мікротрубочок і необоротну зупинку клітинного ділення. Мабуть, протипухлинний ефект проявляється деякими алкалоїдами залежить також від придушення ними деяких інших біохімічних процесів [10,22,25,30,40,43].
1.1.2 Ускладнення хіміотерапії
Одна з проблем хіміотерапії - токсичність цитостатичних препаратів [25]. Застосовувані навіть у терапевтичних дозах хіміопрепарати викликають цілий ряд побічних явищ, що пов'язане з їх ушкоджує, на ряд органів і систем організму. Невисока вибірковість дії протипухлинних препаратів пояснюється відсутністю якісних відмінностей у біохімії, темпі зростання, здатність до репарації після пошкодження між пухлинними і нормальними клітинами. Поряд з придушенням ними різних етапів обміну нуклеїнових кислот в пухлинних клітинах, вони впливають і на обмін нуклеїнових кислот швидко розмножуються популяцій нормальних клітин - імунокомпетентних, кісткового мозку, шлунково-кишкового тракту, репродуктивних органів [15,17,25,29,41] .
Ряд побічних ефектів порівняно специфічний для окремих цитостатиків. До таких побічних дій відносять прояви нейро-, гепато-, кардіотоксичності, порушення системи згортання крові, ендокринних органів. Подібні специфічні ускладнення хіміотерапії пухлинних захворювань залежать від особливостей фармакологічних властивостей цитостатиків та їх метаболізму [15,37].
Нейротоксичність виявляється лише у деяких протипухлинних препаратів незалежно від їх здатності проникати через гематоенцефалічний бар'єр. Виявляється в слабкості скелетної мускулатури, судомних м'язових скорочень, розвитку глаукоми. Є дані про порушення обміну аланіну, лейцину і серину в синапсах [15,17].
Гепатотоксична дія цитостатиків виражається в різному ступені. Найбільшу частину ускладнень становлять гепатопатіі, що не виходять за межі відхилень в показниках лабораторних тестів. При тривалій цитостатичної терапії спостерігаються гіпербілірубінемія і гіперхолестеринемія, зниження рівня протромбіну і коагуляційних факторів крові. При лікуванні похідними платини гепатотоксичність проявляється в оборотне підвищення амінотрансфераз. Антіметаболіти викликають зміну окремих функцій печінки аж до жовтяниці [15,44].
Кардиотоксическое побічна дія в основному властиво протипухлинною антибіотиків. Відзначають болі в області серця і порушення ритму [15,44,49].
Нефротоксичність (характерно для похідних платини) залежить від дози введеного препарату і проявляється підвищенням вмісту сечовини, сечової кислоти і креатиніну в плазмі, зниженням креатінового кліренсу [44].
Алкалоїди поряд з загальнийтоксичними дією впливають на утилізацію глутамінової кислоти і аргініну, певним чином діють на обмін проліну, глутаміну, триптофану. Підсилюють віддачу гіпоксантину, але не гальмують утилізацію клітинами аденіну. Не викликають істотних порушень з боку печінки за винятком зменшення вмісту альбумінів крові. .
З боку нирок відзначають зменшення натрію [44].Антіметаболіти пригнічують гемопоез, мають антикоагулянтними властивостями, що проявляється в порушенні згортання крові.
Прояв токсичності лімітує використання протипухлинних агентів. Розвиток ускладнень призводить до необхідності зниження дози цитостатиків або збільшення інтервалів між курсами [25,40,43].
1.2 Пептідергіческая система організму
1.2.1 Механізм утворення активних форм регуляторних пептидів
Активні форми пептидів представляють собою поліфункціональну групу речовин, яким належить важлива роль природних біорегуляторів. Це природні або синтетичні сполуки, молекули яких побудовані із залишків -амінокислот, з'єднаних між собою пептидними (амідних) зв'язками C (O)-NH. Більшість регуляторних пептидів утворюється з фізіологічно неактивних білків-попередників, шляхом посттрансляційної процесингу [32]. Секретуються білково-пептидні продукти синтезуються на мембранозв'язаних рибосомах ЕПР. Завдяки наявності на N-кінці сигнальної послідовності, що складається із залишків гідрофобних амінокислот, забезпечується транслокація пептиду через мембрани ЕПР. У порожнині ЕПР відщеплення цієї послідовності здійснюється за участю сигнальної пептидази. Далі процесинг здійснюється в ході пересування молекул пропептид по гранулярному ЕПР, комплексу Гольджі і в секреторних везикулах [14,61].
- и аминопептидазо- B -подобной активностью [4].
Спочатку під дією ендопептидаз утворюються неактивні пептиди, що містять з боку С-або N-кінця "зайві" залишки амінокислот, які потім видаляються екзопептидаза з карбоксипептидази-B - і амінопептідазу-B-подібної активністю [4].[13,27,32].
Рівень біологічно активних пептидів в організмі в значній мірі визначається активністю ферментів їх обміну, до яких зокрема належать АПФ і КП N [13,27,32].У зв'язку з цим, великий інтерес представляє вивчення активності даних ферментів у онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливі, що прямо або побічно впливає на будь-яку систему організму.
1.2.2 Роль біологічно активних пептидів
Область біологічної активності пептидів надзвичайно широка. Вони впливають на стан серцево-судинної, імунної, статевої, ендокринної, травної та інших систем, змінюють енергетичний обмін в організмі, беруть участь у регуляції роботи центральної нервової системи. и АПФ играют важную роль в обмене ангиотензина и брадикинина [31,54].
КП N і АПФ грають важливу роль в обміні ангіотензину і брадикініну [31,54].Ангіотензин - пептиди, які утворюються в організмі з білка плазми ангиотензиногена. .
Нирковий фермент ренін відщеплює від молекули ангиотензиногена неактивний декапептид ангіотензин I. дипептид с образованием ангиотензина II . Інший фермент крові - АПФ - переважно в тканини легенів відщеплює з карбоксильного кінця молекули ангіотензину I дипептид з утворенням ангіотензину II. является физиологическим фактором роста клеток, обладает митогенными (учащающими деление) свойствами и, тем самым, стимулирует гиперплазию и пролиферацию клеток. Ангіотезін II є фізіологічним фактором росту клітин, володіє мітогенних (частіших розподіл) властивостями і, тим самим, стимулює гіперплазію і проліферацію клітин. Пептид підвищує активність симпатоадреналової системи, збільшуючи синтез адреналіну і обумовлюючи вивільнення норадреналіну із закінчень симпатичних нервів, що стимулює гіпертрофію серця і судин. оказывает сильное сосудосуживающее действие, вызывает быстрое и длительное повышение артериального давления. Ангіотензин II робить сильний судинозвужувальну дію, викликає швидке і тривале підвищення артеріального тиску. Крім того, він збільшує синтез альдостерону, що супроводжується реабсорбцией натрію і води. образуется ангиотензин III , обладающий положительной инотропной активностью. У наднирниках з ангіотензину II утворюється ангіотензин III, що володіє позитивної інотропної активністю. образуется ангиотензин IV , предположительно, участвующий в регуляции гемостаза [31,36,41,54]. Далі за участю амінопептидази N утворюється ангіотензин IV, імовірно, бере участь у регуляції гемостазу [31,36,41,54].Брадикинин - поліпептид, що складається з 9 амінокислот. Брадикинин здатний розширювати просвіт периферичних і коронарних судин, знижувати артеріальний тиск, сприяє синтезу NО в ендотелії. Пептид підвищує проникність капілярів, скорочує гладку мускулатуру бронхів та інших органів, викликає больовий ефект. Він стимулює синтез та звільнення простагландинів і фактора некрозу пухлин (TNFa) у різних тканинах, звільнення ряду інтерлейкінів, сприяє процесам репарації і володіє інсуліноподібний дією, стимулюючи захоплення глюкози периферичними тканинами, модулює передачу нервових імпульсів у ЦНС і периферичної нервової системи, змінює стан гематоенцефалічного бар'єру [13,52,63]. Брадикинин бере участь в широкому спектрі фізіологічних та патофізіологічних ефектів, і особливо в розвитку запалення [52].
Руйнування брадикініну обумовлено наявністю в крові і тканинах високоактивних ферментів - кініназа, здійснюють фізіологічний контроль рівня кінінів. Найбільш важливу роль у метаболізмі брадикініну грають два ферменти - кініназа I (карбоксипептидази N), і кініназа II (ангиотензинпревращающий фермент).
1.2.3 Ферменти обміну вазоактивних пептидів
1.2.3.1 ангіотензинперетворюючого ферменту. ,) является ключевым ферментом, связывающим между собой ренин – ангиотензиновую и калликреин – кининовую системы.
Ангиотензинпревращающий фермент (КФ3.4.15.1, АПФ, ангіотензин - конвертує фермент, кініназа II, дипептидилкарбоксипептидаза I,) є ключовим ферментом, що зв'язує між собою ренін - ангіотензинову та калікреїн - кінінової системи. Фермент присутній у плазмі крові, нервових клітинах, клітинах ниркових канальців, серцевому м'язі, матці, слинних залозах. . Основна локалізація в організмі людини - ендотелій судинної стінки [3]. За структурою АПФ являє собою глікопротеїн, існуючий у вигляді мембрано-зв'язаної форми і є інтегральним білком. Молекула ферменту, що представляє собою одну поліпептидний ланцюг, локалізована позаклітинно, гідрофобний трансмембранний ділянку включає 17 амінокислотних залишків і знаходиться в положенні 1230-1247, а внутрішньоклітинний гідрофільний ділянка складається з 30 залишків. Є і розчинна форма АПФ відрізняється від мембранозв'язаних відсутністю трансмембранного і внутрішньоклітинного ділянок. Мембранозв'язаних форма має молекулярну масу 170кДа і включає С-і-N-гомологічні домени, які мають ензиматичною активністю. Передбачається, що домени АПФ можуть мати різні функції в організмі. Можливо, між N-і C-доменами є ділянка, доступний для ферментативного розщеплення. Таким чином, N-домен може звільнятися або з знаходиться в розчині повнорозмірного ферменту, або з мембранозв'язаних форми, складаючи С-домен на мембрані [21]. У принципі такий процес може відбуватися будь-де в організмі. Питання про функціональну роль доменів до цих пір залишається неясним. Однак отримані до цього часу дані про виявлення ендогенних субстратів, специфічних для N-домену, і про різне взаємодії інгібіторів АПФ з доменами, а також присутність в організмі однодоменних форм ферменту свідчать на користь фізіологічної значимості доменів. Кожен з доменів містить активний центр, які відрізняються за швидкістю гідролізу пептидів, за ступенем гальмування специфічними інгібіторами АПФ [54,56]. АПФ - металлопротеиназ, яка містить в активному центрі іон цинку і активується іонами Сl -, NO 3 -, SO 4 2 -, інгібується сполуками, що містять SH-групу, хелатор (ЕДТА, о-фенантролін), брадікінінпотенціірующім фактором (K i = 40 нм), 2-меркаптоетанолом. Крім того, існують специфічні інгібітори АПФ - каптоприл (До = 20 нм), лізиноприл (До
= 3-10 нм), і еналаприл (До
= 25-35 нм) [4,20].
рН-Оптимум дії АПФ становить 7,2-7,6. Препарати АПФ, виділені з різних органів людини (легень, серця, печінки, мозку, плазми крові) істотно не розрізнялися за такими фізико-хімічними параметрами: молекулярній масі, ізоелектричної точці, рН-оптимуму, константі інгібування відомими інгібіторами АПФ. При цьому їх імунологічні та каталітичні властивості можуть бути різними [21].
При дії на фізіологічні субстрати АПФ може викликати або перетворення неактивної форми в активну, інактивацію біологічно активного пептиду, або трансформацію його активності. , он превращает его в физиологически активный ангиотензин II , инактивирует брадикинин путем последовательного удаления двух С-концевых дипептидов, расщепляет такие функционально активные пептиды, как мет-энкефалин, нейротензин, эндорфин, вещество Р, (действуя в этих превращениях как эндопептидаза), играя роль одного из регулирующих факторов в обмене этих биологически активных веществ [20,36,41].
Так, беручи участь у відщепленні З-кінцевого гістіділлейціна від ангіотензину I, він перетворює його у фізіологічно активний ангіотензин II, інактивує брадикінін шляхом послідовного видалення двох С-кінцевих дипептиду, розщеплює такі функціонально активні пептиди, як мет-енкефалінів, нейротензин, ендорфін, речовина Р , (діючи в цих перетвореннях як ендопептидаз), граючи роль одного з регулюючих факторів в обміні цих біологічно активних речовин [20,36,41]. -энкефалин- Arg 6 - Phe 7 в мет-энкефалин и Met -энкефалин- Arg 6 - Glu 7 - Leu 8 в Met -энкефалин- Arg 6 [4]. АПФ бере участь у процессингу енкефалінів, гидролизуя енкефалінсодержащіе пептиди - Met-енкефалінів-Arg 6 - Phe 7 у мет-енкефалінів і Met-енкефалінів-Arg 6 - Glu 7 - Leu 8 в Met-енкефалінів-Arg 6 [4].( N - AcSer - Asp - Lys - Pro ), влияющего на пролиферацию гемопоэтических и других клеток.
АПФ є фізіологічним регулятором концентрації в плазмі пептиду AcSDKP (N - AcSer - Asp - Lys - Pro), що впливає на проліферацію гемопоетичних та інших клітин.Фермент бере участь у регуляції артеріального тиску. Крім того, він втягнутий у реалізацію таких функцій як репродуктивні процеси, захисні та імунні реакції організму. Участь ферменту в тому чи іншому процесі визначається як його локалізацією, так і особливістю дії на регуляторні пептиди [20,56]. Будучи чинником, що зв'язує ККС і РААС - систем, залучених в регуляцію більшості функцій організму, реагує на зміни, що виникають при патологічних процесах . У зв'язку з цим становить інтерес вивчення активності ферменту у онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливі.
.
1.2.3.2 карбоксипептидази N. (КФ 3.4.12.7. КП N , аргинин-карбоксипептидаза, кининаза I ) обнаружена Erdos и соавт. Карбоксипептидаза N (КФ 3.4.12.7. КП N, аргінін-карбоксипептидаза, кініназа I) виявлена Erdos і співавт. в плазмі крові людини в 1962 році. , но отличается от нее тем, что не имеет неактивного предшественника. Названа так тому, що за властивостями і специфічності він близький до панкреатичної карбоксипептидази B, але відрізняється від неї тим, що не має неактивного попередника. Відноситься до ферментів вневізікулярной локалізації - позаклітинної рідини і зовнішньої поверхні цитоплазматичних мембран. Фермент локалізована в плазмі крові, виявлений в стінках кровоносних судин, слизовій оболонці носа, сечі [13].Фермент має Mr 280 кДа і складається з чотирьох субодиниць трьох типів: двох з Mr 88 кДа і по одній з Mr 55 кДа і 48 кДа. Субодиниці з Mr 88 кДа глікозовані (на частку вуглеводів припадає 29% маси), не мають ферментативною активністю і, мабуть, стабілізують фермент у плазмі крові [61]. Субодиниці з Mr 48 кДа і 55 кДа мають ферментативною активністю і не містять в своєму складі вуглеводних залишків [13,58].
относится к металлокарбоксипептидазам.
КП N відноситься до металлокарбоксіпептідазам. 2+ . Активний центр ферменту має форму кишені, в порожнині якого знаходиться іон Z n 2 +. 2+ и в меньшей степени Ni 2+ , инактивируется ионами тяжелых металлов, бензоилом– L -аргинином, и хелатными соединениями. У цільної сироватці крові людини фермент активується іонами Co 2 + і в меншій мірі Ni 2 +, інактивується іонами важких металів, Бензоїлу-L-аргініном, і хелатними сполуками. проявляется не только в опытах in vitro , но и in vivo . Гальмує дію інгібіторів КП N проявляється не тільки в дослідах in vitro, але і in vivo. При внутрішньовенному введенні інгібітора (2-меркаптоетанол, ЕДТА) посилювалося гіпотензивну дію брадикініну. 7,0 – 7,8, и зависит от природы буферной смеси. Каталітична активність ферменту оптимальна при pH 7,0 - 7,8, і залежить від природи буферної суміші. 7,5; в зоне pH 7,0 – 6,0 наблюдается резкое падение активности; в трис-буфере pH – оптимум составляет 7,0. У фосфатному буфері максимум активності знаходиться при pH 7,5; в зоні pH 7,0 - 6,0 спостерігається різке падіння активності; у трис-буфері pH - оптимум становить 7,0. Фермент чутливий до кислого середовища. среды 2,0 – 3,0 он инактивируется необратимо, а при pH 6,5 – 5,0 – обратимо. При pH середовища 2,0 - 3,0 він інактивується необоротно, а при pH 6,5 - 5,0 - оборотно. Трапезникова С.С. і Пасхіна Т.С. из сыворотки крови человека, очищенного в 273 раза. провели роботу з вивчення властивостей карбоксипептидази N з сироватки крові людини, очищеного в 273 рази. . Отримані препарати, за даними ультрацентрифугування, складалися з двох компонентів з константою седиментації 5,3 S і 6,5 S. Відзначено чітко виражена залежність ферменту від температури: максимальна активність проявляється при 37 ° С, при 30 ° С вона знижується наполовину. Ліофілізовані препарати зберігають свою активність протягом 6 місяців [4,13].гидролизует более простые синтетические субстраты: гиппурил- L -аргинин, гиппурил–орнитин (пептидазная активность), а также расщепляет эфиры гиппурил- L -аргининовой кислоты [27].
Крім здатності відщеплювати С-кінцевий аргінін в брадикініну (істинна кініназная активність) і Met 5-енкефалінів-Arg 6, лізин в Met 5-енкефаліну-Lys 6, карбоксипептидаза N гідролізує більш прості синтетичні субстрати: гіппуріл-L-аргінін, гіппуріл-орнітин (пептідазная активність), а також розщеплює ефіри гіппуріл-L-аргінінових кислоти [27]. При цьому швидкість розщеплення субстратів, що містять C-кінцеві залишки лізину в 5-6 разів вище, ніж відповідних пептидів з C-кінцевим аргініном. Швидкість розщеплення гіппуріл-аргінінових кислоти в кілька разів вище, ніж гіппуріл-аргініну. 2+ , а также аргининовой кислотой и ЭДТА [13]. Естеразная активність ферменту пригнічується іонами важких металів, особливо Cd 2 +, а також аргінінових кислотою і ЕДТА [13].во многом остаётся неясной.
Біологічна роль КП N багато в чому залишається неясною. Інактівіруя брадикінін, вона здатна залучатися в регуляцію артеріального тиску і тонусу кровоносних судин. Однак реальний внесок ферменту в інактивацію брадикініну in vivo не перевищує 10-12%. Деякі автори припускають, що КПN може грати роль модулятора дії брадикініну [57,62].Активність КПN змінюється при запальних та алергічних реакціях, так як підкислення реакції середовища в тканинах буде сприяти накопиченню кінінів через гальмування кініназной активності ферменту. Оскільки фермент розщеплює пептиди, що у розвитку запальних реакцій (брадикінін та анафілотоксинів), і його активність у крові знижується при введенні рекомбінантного інтерлейкіну-1 b, ймовірно, що КПN залучається до розвитку запальних реакцій [52,63].
Фермент бере участь не тільки в процессингу енкефалінів, але і в їх інактивації. Будучи основним ферментом ККС, він бере участь у морфогенезі клітин, збільшення проникності судинної стінки, регуляції активності каскадних протеолітичних систем плазми крові: гемокоагуляції, фібринолізу, комплементу, розвитку злоякісних новоутворень [13,52].
вносит вклад в регуляцию многих физиологических процессов и развитие патологических состояний.
Таким чином, КП N вносить внесок у регуляцію багатьох фізіологічних процесів і розвиток патологічних станів. Тому, представляє інтерес дослідження активності ферменту при онкологічних захворюваннях в період хіміотерапії.1.3 Функціонування пептідергіческой системи при онкологічних захворюваннях
Злоякісний ріст характеризується зміною активності та спектру ферментів. Ферментний спектр обумовлений локалізацією, гістоцітогенезом і ступенем диференціювання пухлини. Якщо в диференційованої пухлини ферменти відповідають таким даного органу або тканини, то при низькому ступені диференціювання активність і спектр ферментів значно змінені. Велике значення надається ферментам в інвазії пухлинних клітин. У трансформованих клітинах протеїназ синтезується помітно більше, ніж у нормальних клітинах. При ряді злоякісних новоутворень спостерігається вихід пептидаз у міжклітинний простір і збільшення їх активності. У сироватці хворих із злоякісними пухлинами можна часто виявити збільшення активності одних ферментів і зменшення інших. Джерелом збільшення активності ферментів у сироватці може бути посилене виділення його пухлиною в кров'яне русло. При вивченні локалізації пептідазной активності в пухлинах людини висока пептідазная активність була виявлена в периферичних відділах інвазивної зростаючих пухлин [19,26,27,41,59].
У процесі онкогенезу беруть участь матриксних металопротеаз (ММП). Транскрипція цих ферментів залежить від цілого ряду чинників: цитокінів, факторів росту і некрозу пухлин, хімічних агентів. Участь ММП у пухлинної трансформації, а також у процесах інвазії та метастазування добре доведено in vitro і in vivo. Встановлено, що експресія ММП корелює з деструктивними змінами в матриксі і з туморогенну фенотипом клітин, а також залежить від виду пухлини і тканини. ММП можуть брати участь у процесі канцерогенезу, впливаючи на різні шляхи передачі сигналу в клітині, основні компоненти сполучнотканинного матриксу, на міжклітинні взаємодії, а також продукуючи різні біологічно активні молекули [35]. У пухлинних клітинах може утворюватися велика кількість колагенази (представник сімейства ММП), мішенню дії якої є колаген, що представляє собою бар'єр для поширення пухлинного процесу. Інгібітор її активності здатний обмежувати інвазивність пухлинних клітин. Таким чином, колагенази асоційовані з виникненням метастазуючого фенотипу клітин і грають ключову роль в процесах інвазії та метастазування. У процес неопластичної трансформації залучені лізосомні цистеїнових протеїнази. Ферменти деградують багато білків і компоненти позаклітинного матриксу, здійснюють деструкцію тканини. Ці протеїнази здійснюють протеоліз короткоживучих білків, які регулюють злоякісний ріст [29,33,35,55,60].
При раку молочної залози, раку легені і раку товстої кишки збільшений рівень колагенази типу IV (матриксних металлопротеиназ типу 2, желатінази A) - одна з ознак високого ризику метастазів.
При раку сечового міхура підвищення рівня колагенази типу IV у крові відповідає збільшенню маси пухлини [33].
Багато пухлини характеризуються підвищеною продукцією колагенази I типу, гидролизующее основні компоненти екстрацелюлярного матриксу і сполучної тканини [35].
Відзначено зміну ізоферментного спектру амінопептидази. растворимой аминопептидазы.
При раку легенів зникає ізофермент I розчинної амінопептидази. При злоякісних пухлинах печінки і шлунка з'являється новий пік активності ферменту [18]. У лейкозних клітинах, отриманих від хворих різними формами лімфопроліферативних захворювань, виявлені амінопептидази принаймні двох видів: метало-і SH-залежні ферменти. У кровотворних клітинах була виявлена амінопептідазу N, головним чином, в популяціях мієлоїдної-моноцитарного ряду, що знаходяться на різних стадіях диференціювання, і розглядалася як маркер цих клітин. Активність Лейца-амінопептидази (лап) посилюється в ранні терміни після настання холестазу (механічна жовтяниця, викликана злоякісними новоутвореннями). Найбільше посилення активності ферменту при закупорці загальної жовчної протоки пухлиною, раку підшлункової залози [1,8,12]. При новоутвореннях печінки, спостерігається збільшення активності Лейца-амінопептидази сироватки. У меншій мірі активність лап збільшується при метастатичних ураженнях печінки. У 46% хворих з пухлинами описано збільшення активності ферменту в сечі. Але його дослідження не має діагностичного значення при новоутвореннях ротової порожнини і області шиї [1,26].На пізніх стадіях раку легенів може бути виявлено зниження активності АПФ [47,48].
При раку щитовидної залози (РЩЗ) у тканині (операційний матеріал) спостерігалося значне зростання активності серинових і цистеїнових протеолітичних ферментів. Активність серинових протеїназ при РЩЗ у 6 разів перевищувала таку в контрольній тканини. Активність цистеїнових протеїназ при РЩЗ в 6 разів була вищою, ніж у контрольній тканини. Це послужило підставою для використання даних показників як додаткових критеріїв РЩЗ [35,39].
У жінок з II стадією злоякісного ураження ендометрія досліджувалася пептідгідролазная активність сироватки крові. Дослідження, проведені в різновікових групах донорів, не виявили достовірних змін в активності досліджуваних протеїназ. Активність тріпсіноподобних протеїназ в сироватці крові достовірно збільшувалася в онкохворих жінок і мала тенденцію до збільшення з віком. Активність лізосомних катепсіноподобних протеїназ в сироватці крові онкологічних хворих в 2,5-2,7 рази вище в порівнянні з аналогічними показниками здорових жінок, що може свідчити про інвазивної стадії даного процесу, який характеризується порушенням цілісності здорової тканини і стабільності клітинних мембран. З іншого боку цей процес може супроводжуватися посиленням біосинтезу досліджуваних протеїназ або зниженням біосинтезу їх ендогенних інгібіторів [19,35].
У опроміненої пухлинної тканини при раку нирки було виявлено, підвищення активності інгібіторів серинових і цистеїнових протеїназ в 4 і 5,5 разів, і зниження ферментативної активності на 74% і 45% для серинових і цистеїнових протеїназ, відповідно. При зіставленні активності протеолізу в пухлинної тканини після променевої терапії і в неопроміненої пухлинної тканини виявлено зниження ферментативної активності серинових і цистеїнових протеїназ. Їх активність під впливом променевої терапії зменшувалася, складаючи всього 7% і 20% від активності до опромінення, і після опромінення не змінювалася, а активність інгібітора цистеїнових протеїназ - збільшувалася в 2 рази [35,59,60].
При злоякісних утвореннях товстої кишки активність нейтральних і кислих протеїназ в пухлинної тканини в 1,76 - 2 рази вище, ніж в незміненій тканини кишки. .
Після передопераційного опромінення прямої кишки активність протеїназ в опроміненої пухлини виявляється в 2,8 - 3,58 рази нижче, ніж у пухлини не підданої опроміненню [1,11].У сироватці крові онкологічних хворих (рак легені, рак молочної залози) досліджували деякі компоненти калікреїн-кінінової системи, а також активність "нейтральних" і "кислих" протеаз та їх інгібіторів до і після терапевтичного нейтронного опромінення. Дослідження показали, що передопераційне опромінення швидкими нейтронами на область первинного вогнища гальмує процеси кінінообразованія в крові онкологічних хворих: на 20% знижується рівень калікреїну на фоні збільшення вмісту неактивного проферменту. Загальна активність серинових протеїназ залишається незмінною, однак відзначається зменшення концентрації основного інгібітора калікреїну - a 2-макроглобуліну. На цьому тлі підвищується активність кініноразрушающего ферменту карбоксипептидази N. Разом з тим, активність "нейтральних" і "кислих" протеаз після опромінення має чітко виражену тенденцію до зменшення, а рівень загальної антіпротеолітіческой активності залишається практично незмінним. При цьому наголошується стабілізація стану клітинних мембран. Між ступенем гальмування утворення протеолітичних ферментів і клінічно визначається регресією розмірів пухлини існує достовірна кореляційна залежність [35,62].
) в онкогенезе
1.4 Роль оксиду азоту (II) в онкогенезіобладает мультипотентными свойствами, определяемые как цитотоксичностью радикала, так и его коммуникативной активностью.
Оксид азоту II має мультипотентних властивостями, які визначаються як цитотоксичність радикала, так і його комунікативної активністю. необходим для обеспечения цитотоксического действия макрофагов на опухолевые клетки [23,42]. При онкологічних захворюваннях ця молекула може виявляти і протипухлинні властивості, і брати участь у патогенезі неоплазій. NO необхідний для забезпечення цитотоксичної дії макрофагів на пухлинні клітини [23,42]. подавляет опухолевые клетки либо блокируя их железосодержащие ферменты, либо повреждая их клеточные структуры. Виділяється макрофагами, NO пригнічує пухлинні клітини або блокуючи їх залізовмісні ферменти, або пошкоджуючи їх клітинні структури. включается в модуляцию апоптоза: активирует экспрессию p 53, который вызывает задержку деления клеток в фазе G 1. Викликаючи пошкодження ДНК, NO включається до модуляцію апоптозу: активує експресію p 53, який викликає затримку поділу клітин у фазі G 1. 53 по принципу обратной отрицательной связи подавляет синтез iNOS и таким образом предохраняет трансформированные клетки от гибели. У той же час p 53 по принципом зворотного негативного зв'язку пригнічує синтез iNOS і таким чином охороняє трансформовані клітини від загибелі. индуцируется TNFa . Встановлено, що синтез iNOS індукується TNFa. достигает уровня, при котором начинает сказываться его влияние на опухолевые клетки [24,28]. NO участвует в образовании новых сосудов, что необходимо для удовлетворения потребностей раковых клеток в питании. Вже через 6 - 12 год після дії індуктора NO досягає рівня, при якому починає позначатися його вплив на пухлинні клітини [24,28]. NO бере участь в утворенні нових судин, що необхідно для задоволення потреб ракових клітин у харчуванні. , выделяемая эндотелиальными или опухолевыми клетками, может стимулировать процесс инвазии в стенку сосуда, поскольку прикрепление к эндотелию сосудов необходимое звено метастазирования. З іншого боку, внаслідок цього поліпшується доставка оксиду азоту в пухлинні клітини. NO, що виділяється ендотеліальними або пухлинними клітинами, може стимулювати процес інвазії в стінку посудини, оскільки прикріплення до ендотелію судин необхідна ланка метастазування. Радикал володіє дезагрергірующім дією. подавляет межклеточное сцепление клеток в опухоли и облегчает их распространение по организму. Тому слід очікувати, що посилений синтез NO пригнічує міжклітинний зчеплення клітин у пухлині і полегшує їх поширення по організму. будет труднее отделяться от первичной опухоли и образовывать метастазы. Кліткам з мінімальної продукцією NO буде важче відділятися від первинної пухлини і утворювати метастази. [42].как в прометастатических, так и в антиопухолевых реакциях [42].
Таким чином, існують механізми підтримують баланс між участю NO як в прометастатіческіх, так і в антипухлинних реакціях [42].РОЗДІЛ 2. Матеріали та методи дослідження
2.1 Матеріал дослідження
Активність ферментів визначали у сироватці крові онкологічних хворих. Кров брали з ліктьової вени, далі її инкубировали 30 хвилин при кімнатній температурі, центрифугували 20 хвилин при 4000 g та отримували сироватку, в якій визначали активність карбоксипептидази N і ангіотензинперетворюючого ферменту.
Вивчення активності ферментів було проведено у 24 чоловіків у віці від 49 до 70 років з пухлинами легень, шлунково-кишкового тракту, сечостатевої системи. Хворі піддавалися хіміотерапевтичних впливу. Вони склали дві експериментальні групи. Перша група - хворі до початку проведення ним хіміотерапії (12 осіб), друга - ті ж хворі, але після закінчення курсу лікування (12 осіб). В якості контролю виступала група з 13 здорових чоловіків такого ж віку.
2.2 Методи дослідження
2.2.1 Метод визначення активності карбоксипептидази N
Активність КПN визначали в сироватці крові Нінгідринова методом [61].
Досвідчені проби містили 20 мкл 3,5 мМ розчину CoSO 4, приготованого на 100 мМ Тріс-HCl буфері, pH 7,6 і 40 мкл препарату ферменту. , pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента.
Контрольні проби містили 20 мкл 100 мМ Тріс-HCl, pH 7,6 і 40 мкл препарату ферменту. Проби преінкубіровалі 8 хв при 37 o C, реакцію починали додатком в дослідні проби 10 мкл гіппуріл-арг, приготованого на 100 мМ Тріс-HCl буфері, pH 7,6 (кінцева концентрація в пробі 5 мкМ). Реакцію проводили 120 хв при 37 o C і зупиняли додаванням 30 мкл 10% трихлороцтової кислоти.Проби центрифугували 20 хв при 4000 об / хв, відбирали 50 мкл надосадової рідини, доливали 1 мл Нінгідринова реактиву. Далі проби струшували, витримували 12 хв на киплячій водяній бані і вимірювали оптичну щільність на КФК-2 при 595 нм проти H 2 O.
Активність КПN визначали як різниця оптичної щільності дослідних і контрольних проб і виражали в нмоль аргініну, що утворився за 1 хв інкубації в перерахунку на 1 мг білка.
Концентрацію білка в пробах визначали біуретовим методом.
2.2.2 Метод визначення активності ангіотензинперетворюючого ферменту
Активність АПФ визначали в сироватці крові Нінгідринова методом за освітою гли-арг з КБЗ-гли-гли-арг при рН 8,2 як активність, інгібіруемую каптоприлом. Препарат ферменту (40 мкл) змішували з 20 мкл 35 мкМ каптоприлу в 100 мМ Трис-НСl буфері, рН 8,2, або 20 мкл буфера і преінкубіровалі 8 хв при 37 ˚ С. Реакцію починали додатком 10 мкл розчину КБЗ-гли-гли-арг у вищевказаному буфері (кінцева концентрація в пробі 5 мкМ). Через 120 хв реакцію зупиняли додаванням 30 мкл 10% розчину трихлороцтової кислоти [59]. Проби центрифугували 30 хв при 4000 об / хв. Відбирали 50 мкл надосадової рідини і визначали кількість утвореного гли-арг Нінгідринова методом [61]. Проби колоріметріровалі на КФК-2 при l = 590 нм. Активність АПФ визначали як різниця в оптичній щільності проб не містять і містять каптоприл. Активність ферменту виражали в нмоль гли-арг, що утворився за 1 хв інкубації в перерахунку на 1 мг білка. Концентрацію білка визначали біуретовим методом.
2.2.3 Метод визначення вмісту білка
Вміст загального білка визначали біуретовим методом. Принцип методу заснований на тому, що іони міді в лужному середовищі взаємодіють з пептидними зв'язками білків сироватки крові з утворенням комплексу червоного кольору, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації загального білка.
Досвідчені проби містили 50 мкл сироватки крові і 2,5 мл робочого розчину біуретового реагенту (концентрат біуретового реагенту розвести дистильованою водою у співвідношенні 1:19). Контрольні проби містили 50 мкл дистильованої води і 2,5 мл робочого розчину біуретового реагенту. У калібрувальну пробу додавали 50 мкл калібрувального розчину загального білка (розчин бичачого сироваткового альбуміну з концентрацією 60 г / л з додаванням хлористого натрію 9 г / л і азиду натрію 1 г / л).
Вміст пробірок ретельно перемішували, уникаючи утворення піни, инкубировали при кімнатній температурі (+ 18 - 25 С) протягом 30 хвилин, після чого вимірювали величину оптичної щільності калібрувальної і досвідчених проб проти контрольної проби при довжині хвилі 540 нм.
Концентрацію загального білка розраховували, як відношення оптичної щільності дослідної проби до оптичної щільності калібрувальної проби помножена на концентрацію загального білка в калібрувальному розчині (60 г / л).
в сыворотке крови
2.2.4 Метод кількісного визначення NO в сироватці крові0,5 мл сыворотки депротеинизировали добавлением 1 мл 0,5 н.
Для визначення концентрації NO 0,5 мл сироватки депротеінізований додаванням 1 мл 0,5 н. и 10 % раствора ZnSO 4 для осаждения белковых компонентов. розчину NaOH і 10% розчину ZnSO 4 для осадження білкових компонентів. Проби центрифугували при 5000 об / хв. 30 хв. До 1мл надосадової рідини додавали рівну кількість 1% розчину реактиву Грісса і инкубировали протягом 10 хв. при 252.3 Статистична обробка результатів дослідження
Достовірність відмінностей між середніми визначали з використанням t-критерію Стьюдента [16]. Кореляційний аналіз проводили за допомогою програми «Статистика» (версія 6.0).
РОЗДІЛ 3. Результати та обговорення
в сыворотке крови онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии
3.1 Дослідження активності карбоксипептидази N в сироватці крові онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливіу онкологических больных в период до проведения химиотерапии по сравнению с контрольной группой в 2 раза, и уменьшение активности фермента после проведения химиотерапии, по отношению к периоду до начала лечения в 2,6 раза
Результати дослідження показали збільшення активності КП N у онкологічних хворих в період до проведення хіміотерапії в порівнянні з контрольною групою в 2 рази, і зменшення активності ферменту після проведення хіміотерапії, по відношенню до періоду до початку лікування в 2,6 рази (Рис.1).у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, M ± m , n=12 ¸ 18; достоверность отличий: * - p < 0,05 относительно контроля, + - p <0,05 относительно до химиотерапии).
Рис.1. Активність КП N у онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливі (нмоль продукту, що утворився за 1 хв інкубації на 1 мг білка, M ± m, n = 12 ¸ 18; достовірність відмінностей: * - p <0,05 відносно контролю, + - p <0,05 відносно до хіміотерапії).играет не только центральную роль в процессах гемокоагуляции и фибринолиза, но и контролирует различные стадии развития злокачественных новообразований [52,63].
Калікреїн-кінінова система, до якої належить і КП N грає не тільки центральну роль у процесах гемокоагуляції і фібринолізу, а й контролює різні стадії розвитку злоякісних новоутворень [52,63]. у онкологических больных, вероятно, опосредованно через уменьшение уровня брадикинина может препятствовать высвобождению фактора некроза опухолей ( TNFa ), способного лизировать большой набор опухолевых клеток in vivo и in vitro . Зростання активності КП N у онкологічних хворих, ймовірно, опосередковано через зменшення рівня брадикініну може перешкоджати вивільненню фактора некрозу пухлин (TNFa), здатного лизировать великий набір пухлинних клітин in vivo та in vitro. на опухолевую клетку связано с деградацией ДНК и нарушением функционирования митохондрий. Цитотоксичну дію TNFa на пухлинну клітину пов'язано з деградацією ДНК і порушенням функціонування мітохондрій. может способствовать прогрессии опухоли. Таким чином, збільшення активності КП N може сприяти прогресії пухлини. после химиотерапии до уровня контрольных значений может указывать на существенный противоопухолевый эффект данного терапевтического воздействия. Зниження активності КП N після хіміотерапії до рівня контрольних значень може вказувати на істотний протипухлинний ефект даного терапевтичного впливу. Таким чином, динамічне дослідження активності ферменту в сироватці крові хворих до і після хіміотерапії може бути використано в якості додаткових біохімічних критеріїв при спостереженні за ефективністю проведеного лікування [6,33].3.2 Дослідження активності ангіотензинперетворювального ферменту в сироватці крові онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливі
Результати дослідження показали, що активність АПФ у онкологічних хворих до хіміотерапії відповідала контрольним значенням, однак після проведення лікування активність ферменту зростала у порівнянні з двома іншими групами в 1,8 і 1,7 рази відповідно (рис.2).
Рис. 2. , n=12 ¸ 18; достоверность отличий: * - p < 0,05 относительно контроля; ++ - p < 0,01 относительно до химиотерапии).
Активність АПФ у онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливі (нмоль продукту, що утворився за 1 хв інкубації на 1 мг білка, M ± m, n = 12 ¸ 18; достовірність відмінностей: * - p <0,05 відносно контролю; + + - p < 0,01 щодо до хіміотерапії).Відомо, що наявність пухлини в організмі призводить до порушень гемостазу. Також відомо про негативний вплив хіміопрепаратів на систему згортання крові та гемостаз [30,37]. Таким чином, хіміотерапія лише посилює вже наявні в організмі порушення системи згортання крові. Можливо, саме з цим пов'язано підвищення активності АПФ після проведення лікування. и через деградацию брадикинина.
Можна припустити, що свій ефект щодо посилення тромботичних ускладнень АПФ реалізує двома шляхами: через синтез ангіотензину II і через деградацію брадикініну. является вазопрессором, стимулятором образования свободных радикалов, в частности супероксидных анионов, которые инактивируют NO , промотируют образование пероксинитрита и снижают эффективность NO -опосредуемой сосудистой дилатации. Ангіотензин II є вазопресорів, стимулятором утворення вільних радикалів, зокрема супероксидних аніонів, які інактивують NO, промотують освіта пероксинітриту і знижують ефективність NO-опосередковуваного судинної дилатації. способствует развитию эндотелиальной дисфункции, в результате чего усиливается выработка вазоконстрикторов и прокоагулянтов, и как следствие активируется система свертывания. Таким чином, ангіотензин II сприяє розвитку ендотеліальної дисфункції, в результаті чого посилюється вироблення вазоконстрикторів і прокоагулянтов, і як наслідок активується система згортання. в эндотелии, участвуя в дилатации сосудов и усиливая скорость местного кровотока [52,54]. У той час як брадикінін стимулює синтез NO в ендотелії, беручи участь у дилатації судин і посилюючи швидкість місцевого кровотоку [52,54].Підвищення активності ферменту після лікування можливо також пов'язане з проявом нефротоксичності препаратів-похідних платини (саме ці препарати застосовувалися при хіміотерапії) [44]. Ймовірно, що ураження клітин нирок, які містять значну кількість АПФ, призводить до виділення ферменту в кров і збільшення його активності.
Одночасне відсутність достовірних відмінностей в активності АПФ у онкологічних хворих в періоді до хіміотерапії і здорових людей, і наявність порушень у згортання крові у перше, може вказувати на те, що у формуванні патологій гемостазу беруть участь і інші механізми.
3.3 Дослідження вмісту нітрит-іона в сироватці крові у онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливі
Результати дослідження показали, що вміст нітрит-іона в сироватці крові онкологічних хворих до проведення ним хіміотерапії зменшується в порівнянні з контрольною групою на 19,4%. Після проведення хіміотерапії концентрація нітрит підвищується по відношенню до періоду до лікування на 12%, але залишається нижче контрольних значень на 8,4% (Рис.3).
2 - в сыворотке крови онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии (мкг/мл, достоверность отличий: *- p <0,05 относительно контроля; *** - p <0,001 относительно контроля; ++ - p < 0,01 относительно до химиотерапии).
Рис.3 Вміст NO 2 - у сироватці крові онкологічних хворих при хіміотерапевтичне впливі (мкг / мл, достовірність відмінностей: *- p <0,05 відносно контролю; *** - p <0,001 щодо контролю; + + - p <0, 01 щодо до хіміотерапії).может выступать не только как индуктор неоплазий, но и как эффектор противоопухолевой защиты.
NO може виступати не тільки як індуктор неоплазій, але і як ефектор протипухлинної захисту. Секретується клітинами, інфільтрують пухлини (макрофаги, лімфоцити, нейтрофіли), радикал виконує роль протипухлинного агента, тобто здатний знищувати пухлинні клітини і зупинити їх зростання [23,42,53]. и соавт. Згідно Hibbs і співавт. . цитостатичний і цитотоксичний ефекти макрофаги здійснюють за допомогою NO. -лимфоцитами макрофаги активируют синтез iNOS , которая превращает аргинин в NO . При активації T-лімфоцитами макрофаги активують синтез iNOS, яка перетворює аргінін в NO. Оксид азоту II виділяється з макрофагів і проникає в пухлинні клітини. Там молекула інгібує три групи ферментів: мітохондріальної дихального ланцюга, циклу Кребса та синтезу ДНК. У цих умовах енергопродукцію і ділення клітин стає неможливим і клітина гине [24]. может быть вызвано ослаблением защиты (иммунной системы) организма и является одним из факторов, приводящих к развитию опухолей. Таким чином, зниження вмісту NO може бути викликане ослабленням захисту (імунної системи) організму і є одним з факторів, що призводять до розвитку пухлин.в сыворотке крови после химиотерапии объясняется усилением его продукции под влиянием ряда цитостатиков [28].
Ймовірно, більш високий рівень NO в сироватці крові після хіміотерапії пояснюється посиленням його продукції під впливом ряду цитостатиків [28]. Можливо, що частково, терапевтична активність цитостатиків залежить від цієї реакції, а в данной ситуации может расцениваться как благоприятный прогностический признак. збільшення концентрації оксиду азоту II в даній ситуації може розцінюватися як сприятливий прогностичний ознака. может иметь значение для повышения эффективности противоопухолевой терапии. Таким чином, управління синтезом NO може мати значення для підвищення ефективності протипухлинної терапії.на фоне снижения концентрации оксида азота II в сыворотке крови до химиотерапии (табл.), возможно вызвано тем, что повышение активности КП N приводит к подавлению высвобождения фактора некроза опухоли Т NFa , который индуцирует синтез iNOS , это приводит к такому снижению продукции NO , при котором он не оказывает противоопухолевого воздействия [24].
Достовірна негативний взаємозв'язок між збільшенням активності КП N на тлі зниження концентрації оксиду азоту II в сироватці крові до хіміотерапії (табл.), можливо викликано тим, що підвищення активності КП N призводить до пригнічення вивільнення фактора некрозу пухлини Т NFa, який індукує синтез iNOS, це призводить до такого зниження продукції NO, при якому він не надає протипухлинного впливу [24]. Отримані дані свідчать про генералізованому зниженні природних захисних сил організму.Таблиця.
и активности ферментов
Кореляційний взаємозв'язок змісту NO і активності ферментівАктивність ферментів | Зміст NO | Активність АПФ | Активність КП N | |||
До хіміо-терапії | Після хіміо- терапії | До хіміо-терапії | Після хіміо- терапії | До хіміо-терапії | Після хіміо- терапії | |
АПФ до хіміотерапії | - | - | - | - | ||
АПФ після хіміотерапії | - | -1,00 *** | - | - | ||
до химиотерапии КП N до хіміотерапії | -1,00 *** | - | - | |||
после химиотерапии КП N після хіміотерапії | - | - | - | |||
< 0,001.
Достовірність кореляційних взаємозв'язків: - достовірної кореляції не виявлено, *** - p <0,001., по всей видимости, связана с тем, что фермент, опосредованным образом вызывает деградацию оксида азота II [42].
Негативна кореляція між активністю АПФ і рівнем NO, по всій видимості, пов'язана з тим, що фермент, опосередкованим чином викликає деградацію оксиду азоту II [42]. у пациентов оказывается ниже, чем в контрольной группе. Ймовірно, з цієї причини після хіміотерапії на тлі високої активності АПФ концентрація NO у пацієнтів виявляється нижче, ніж у контрольній групі.Висновки
1. Виявлено збільшення активності ангіотензинперетворюючого ферменту у онкологічних хворих, які пройшли хіміотерапію порівняно з періодом до початку лікування та контрольною групою.
2. у онкологических больных до проведения химиотерапии по сравнению с контрольной группой и больными, прошедших химиотерапию.
Виявлено збільшення активності карбоксипептидази N в онкологічних хворих до проведення хіміотерапії в порівнянні з контрольною групою і хворими, які пройшли хіміотерапію.3. ) у онкологических больных по сравнению с контрольной группой и повышение уровня оксида азота ( II ) после проведения химиотерапии по сравнению с периодом до лечения.
Виявлено більш низький вміст оксиду азоту (II) у онкологічних хворих в порівнянні з контрольною групою і підвищення рівня оксиду азоту (II) після проведення хіміотерапії в порівнянні з періодом до лікування.4. при онкологических заболеваниях с различной локализацией опухоли и могут быть использованы для разработки методов профилактики и коррекции различных нарушений, возникающих до и после химиотерапии.
Отримані результати становлять інтерес для розуміння біологічної ролі ангіотензинперетворюючого ферменту і карбоксипептидази N при онкологічних захворюваннях з різною локалізацією пухлини і можуть бути використані для розробки методів профілактики та корекції різних порушень, що виникають до і після хіміотерапії.Список літератури
1. Абдурасулов Д.М. Множинні пухлинні поразки. - Т.: Медицина, 1980. - 326с.
2. Абелем Г.І. Що таке пухлина / / Соросівський освітній журнал. - 1997. - № 10. - С. 85 - 90
3.Альтшулер Б.Ю., Ройтман А.П., Долгов В.В. Методичні аспекти визначення ангіотензинперетворюючого ферменту / / Клінічна лабораторна діагностика. - 2000. - № 12. - С. 10 - 14.
4. Антонов В.К. Хімія протеолізу. - М.: Наука, 1991. - 503с.
5. Балаж А. Біологія пухлин. Сумніви і надії. Пер з угор.: - М.: Світ, 1987. - 206с.
6. Бессмельцев С.С., Рибакова Л.П., Грицкевич Н.Л. Діагностичне та прогностичне значення визначення церулоплазміну, ацетилхолінестерази та загальної протеолітичної активності в сироватці крові хворих на множинну мієлому / / Питання онкології. - 1999, тому 45. - № 6. - С.398 - 403.
7. Блохін Д.Ю. Фенотип множинної лікарської стійкості пухлинних клітин, обумовлений порушенням програми клітинної загибелі / / Вісник Російської академії медичних наук. - 2004. - № 12. - С.16 - 19.
8. Блохін М.М., Ітин А.Б., Клименков А.Г. Рак підшлункової залози і позапечінкових жовчних шляхів. - М.: Медицина, 1982. - 272с.
9. Блохін М.М., Переводчикове Н.І. Хіміотерапія пухлинних захворювань. - М.: Медицина, 1984.
10. Бичков М.Б. Хіміотерапія злоякісних пухлин / / Архів патологій. - 1996, том 58. - № 4. - С. 15 - 17.
11. Варбанець В. Ф. Активність протеолітичних ферментів та їх інгібіторів у пухлинах товстої кишки / / Питання медичної хімії. -1990, Тому 36. - № 2. - С. 33 - 35.
12. Василенко В.Х. Пухлини шлунка. Клініка і діагностика. - М.: Медицина, 1989. - 288с.
13. Верееменко К.Н. Кінінова система. - К.: Здоров'я, 1977.
14. Вернигора О.М., Генгін М.Т. Протеолітичні ферменти: субклітинних локалізація, властивості та участь в обміні нейропептидів / / Біохімія. - 1996, т.6, № 5. - С. 771 - 785.
15. Гершанович М.Л. Ускладнення при хіміо-та гормонотерапії злоякісних пухлин. - М.: Медицина, 1982. - 224с.
16. Гланц С. Медико-біологічна статистика: Пер. з англ. - М, Практика, 1998. - 459с.
17. Гнатишак А.І. Загальна клінічна онкологія. - Львів: Вища шк., 1988. - 238с.
18. Голубєв А.М. Ізоферменти новоутворень. - М.: Медицина, 1981. - 144с.
19. Діагностика та лікування злоякісних новоутворень. Збірник наукових праць. / Кавецький Р.Є. - К.: Наукова думка, 1979. - 180с.
20. Єлісєєва Ю.Є. Ангиотензинпревращающий фермент, його фізіологічна роль. / / Питання медичної хімії. - 2001. - № 1. - С. 53 - 60.
21. Єлісєєва Ю.Є. Структурно-функціональні особливості ангіотензинперетворюючого ферменту. / / Біоорганічна хімія. - 1998, том 24. - № 4. - С. 262 - 270.
22. Зеленін К.Н. Виникнення і розвиток хіміотерапії. / / Соросівський освітній журнал. - 2001, том 7. - № 5. - С. 23 - 28.
23. Зеленін К.Н. ): новые возможности давно известной молекулы.
Оксид азоту (II): нові можливості давно відомої молекули. / / Соросівський освітній журнал. - 1997. - № 10. - С. 109 - 110.24. Івашкін В.Т., Драпкіна О.М. Клінічне значення оксиду азоту і білків теплового шоку. - М.: Геотар-мед, 2001. - 87с.
25. Клінічна онкологія: довідковий посібник. / З.С. Фрадкін, І.В. Залуцький - Мн.: Білорусь, 2003. - 784с.
26. Клінічна ферментологія. / Е. Щеклік. - Варшава: Польське державне медичне вид-во, 1966. - 491с.
27. Колодзейському М.В., Пилявська О.С. Пептидази. - К.: Наукова думка, 1982. - 173с.
28. Кондакова І.В., Какуріна Г.В., Чойнозов Є.Л. Вплив донорів оксиду азоту на протипухлинний ефект доксорубіцину. / / Бюллютенях СО РАМН. - 2005. - № 2 (116). - С.92 - 95.
29. Крутяк В.М. Біотерапія раку та інгібітори протеаз. / / Питання онкології. - 2001, том 47. - № 1. - С. 106 - 107.
30. Кулієв Ш.Б. Проблеми згортання крові в онкології. - Б.: Азернешр, 1979. - 273С.
31. Лебедєв А.А. Система ренін-ангіотезін. / / Соросівський освітній журнал. - 1998. - № 3. - С. 35 - 40.
32. Ленінджер А., Основи біохімії, пров. з англ., т. 1 3, M., 1985.
33. Локшина Л.А. Протеолітичні ферменти в процесах онкогенезу. / / Питання медичної хімії. - 1991, том 37. - № 6. - С.15 - 21.
34. Маррі Р., Греннер Д., Мейес П., Родуелл В. Біохімія людини: У 2-х томах. Т.2. Пер. з англ.: - М.: Світ, 1993. - 384с.
35. Матеріали конференції "Структура і функція протеолітичних ферментів". / / Питання медичної хімії. - 2000. - № 5.
36. Машковский М.Д. Лікарські засоби: У 2-хтомах Т.1. - М.: ТОВ "Вид-во нова хвиля", 2002. - 540с.
37. Онкологія. / М.М. Трапезников. - М.: Медицина, 1981. - 255с.
38. Патологічна фізіологія і біохімія: Навчальний посібник для вузів / - М.: Видавництво «іспит», 205. - 480с.
39. ПАЧЕС А.І., Пропп Р.М. Рак щитовидної залози. - М.: Медицина, 1984. - 320с.
40. Переводчикове Н.І. Клінічна хіміотерапія пухлинних захворювань. - М.: Медицина, 1976. - 200с.
41. Поляк С.М., Рожанська Т.І., Яковлєва Є.П. Регулятори активності ферментів та їх застосування в медицині. - М.: Медицина, 1989. - 128с.
42. Проскуряков С.Я., Конопляник А.Г., Іванніков А.І. Оксид азоту в неопластичного процесу. / / Питання онкології, 2001, том 47. - № 3. - С. 257 - 266.
43. Протипухлинна хіміотерапія. Довідник. / Н.І. Переводчикове. - М.: Медицина, 1993. - 155с.
44. Протипухлинні препарати: довідник. / З.П. Булкіна. - К.: Наукова думка, 1991. - 304с.
45. Сиваський М.С., Салганін Р.І. Гетерогенність ракових клітин у відношенні їх реакції на цисплатину. / / Питання онкології, 2001, том 47. - № 1. - С. 66 - 68.
46. Слінчак С.М. Онкологія. - К.: Вища шк., 1989.
47. Трахтенберг А.Х. Рак легені. - М.: Медицина, 1987. - 304с.
48. Харченко В.Г., Кузьмін І.В. Рак легені. Керівництво для лікарів. - М.: Медицина, 1994. - 480с.
49. Циганенко А.Я., Жуков В.І., Мясоєдов В.В., Завгородній І.В. Клінічна біохімія (навчальний посібник для студентів медичних вузів). - М.: Тріада - Х, 2002. - 504с.
50. Черенков В.Г. Клінічна онкологія. - М. Медицина, 2005. - 447с.
51. Чернов В.А. Цитостатичні речовини в хіміотерапії злоякісних новоутворень. - М.: Медицина, 1964. - 319с.
52. Ярова Г. А. Калікреїн-кінінова система: нові факти і концепції (огляд) / / Питання медичної хімії. - 2001, том 47. - № 1. - С. 20-42.
53. Ahmad H., Srivastova RC, Agarwal R., Mukhtar H. Nitric oxide synthase and skin tumor promotion. / / BBRC. - 1997. - Vol.232. - P. 328 - 331.
54. Blume A., Herdegen T., Unger T. Angiotensin peptides and inducible transcription factors. J. Mol. Med.77. - P. 339 - 357.
55. Boyd D. Invasion and metastasis. / / Cancer Metastasis Rev. - 1996. - Vol.15. - P. 77 - 89.
6 .
5 6. Camdell DJ. Circulating and tissue angiotensin system. J. Clin. Invest., 1987. - Vol.79. - № 1-6.57. Erdos EG, Sloane EM, Wohler IM Carboxypeptidase in blood and other fluids / / Biochem. Pharmacol. - 1964. - № 13. - P. 893 - 905.
58. Fulong Tan., Deepthi K., Skidgel RA, Kaul RK, Erdos EG The deduced protein sequence of the human carboxypeptidase N high molecular weight subunit reveals the presence of leucine-rich tandem repeats. J. of biological chemistry, 1990. - Vol.265. - № 1. - P. 13 - 19.
59. Kennedy AR Cancer prevention by protease inhibitors. / / Prev. Med / - 1993. - Vol.22. - P. 796 - 811.
60. Kennedy AR Chemopreventive agents: protease inhibitor. / / Pharmacol. Ther. - 1998. - Vol.78. - P. 167 - 209.
61. Lee PV, Takahashi TN An improved colorimetric determination of amino acid with the use of ninhydrin / / Analyt. Biochem. - 1966. - 14, № 1. - P. 71 - 77.
62. Skidgel RA, Erdos EG Cellular carboxypeptidases / / Immunol. Rev. - 1998. - V. 161, № 2. - P. 129-141.
63. The kallikrein - kinin system in health and disease. - Munich: Limbach - verlag braunschweig. - 1989. - P. 374.