1   2   3
Ім'я файлу: АВТОРЕФЕРАТ-Совет.doc
Розширення: doc
Розмір: 263кб.
Дата: 10.11.2021
скачати




Загальна характеристика роботи
Актуальність проблеми. Рак молочної залози (РМЗ) на даний момент посідає провідне місце в структурі онкологічної захворюваності жінок (його поширеність серед пухлинних захворювань становить у середньому 26%), а частота його зростає та має тенденцію до омолодження. У зв'язку з цим сучасні уявлення про розвиток захворювання враховують як накопичений клінічний досвід, так і розробку клініко-експериментальних досліджень. При цьому, незважаючи на значні успіхи, досягнуті останнім часом у цій області, проблема обґрунтування адекватних підходів і схем терапевтичних втручань із оцінкою економічної ефективності, а також виділення декретованих прогностичних груп пацієнток є складним і актуальним питанням.

РМЗ являє собою поліетіологічне захворювання, у генезі розвитку якого мають значення різні фактори, що включають у себе генетичні механізми, особливості дієти й способу життя, гормональні фактори, які можуть бути або дискретно ендо-/екзогенними, або взаємозалежні між собою. Різноманітні етіопатогенетичні фактори з'явилися матрицями для створення відповідних теорій онкогенезу в молочній залозі.
В усіх країнах світу рак та передракові ушкодження шийки матки є однією з основних медичних, психологічних та соціальних проблем жінок. Починаючи з 1997 року в Україні спостерігається незначне, але постійне зростання рівня захворюваності на рак шийки матки, в той час як у розвинутих країнах відзначається зворотна тенденція (Гойда Н.Г., 2000). У більшості випадків виникненню раку шийки матки можна запобігти. Вважається, що канцерогенез в епітелії шийки матки є етапним процесом і може тривати від 2 до 10 років, однак відповідний лікувальний вплив на ранніх стадіях розвитку цервікальних інтраепітеліальних неоплазій дозволяє уникнути виникнення інвазивних форм раку (Бохман Я.В., 2002; Nicolas F.S., 2003). ЦІН є послідовними стадіями преінвазивних ушкоджень шийки матки (Вишневская Е.Е., 2002; Коханевич Е.В., 2004). Слід зазначити той дуже важливий факт, що на будь-якому етапі цей процес може перерватися завдяки активації імунітету, апоптозу чи спонтанній регресії. Незважаючи на існування численних гіпотез, біологічні властивості ЦІН, що безпосередньо визначають можливість неопластичних трансформацій на тлі диспластичних процесів, залишаються невідомими (Минкина Г.Н., 2001; Young T., 2005).

В даний час у практичній онкології великого значення набуває аналіз експресії імуногістохімічних маркерів, оскільки при цьому істотно підвищується якість інформації про пухлинну тканину і яку неможливо одержати при традиційному гістологічному дослідженні (Петров С.В., 2004., Dabbs D.J., 2006). Вивчення молекулярних біомаркерів для виявлення й інтерпретації диспластичних клітин дозволить значно зменшити вплив суб’єктивних обставин, які супроводжують стандартний морфологічний підхід. Завдяки використанню прогностич­них маркерів можна відбирати контингент хворих з підвищеним ризиком розвитку інвазивного раку, що значно знизить вартість подальших діагностичних та терапевтичних процедур (Фролова И.И., 2002; Козаченко А.В., 2006; Carrilho C., 2005).

Відомо, що в розвитку пухлинних процесів основними елементами є порушення клітинної проліферації й диференціювання, апоптозу та ангіогенезу (Загорулько А.К., 2002; Тsuda H., 2003; Branca M., 2006). Однак натепер серед науковців немає єдиної точки зору щодо співвідношення цих процесів при прогресії передпухлинних ушкоджень шийки матки та їх зв'язку з біологічною поведінкою інвазивних пухлин (Liu S.S., 2001; Gasinska A., 2002). Не менш важливим є вивчення маркерів – індикаторів злоякісного перетворення клітин епітелію шийки матки, таких як p16ІNK4a, зв'язків між експресією маркерів біологічних властивостей тканин і детекцією вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику (Волгарева Г.М., 2002; Klaes R., 2001; Agoff S.N., 2003). Існує припущення, що розвиток ВПЛ інфекції та можливе виникнення та прогресія ЦІН в інвазивний рак залежить від рівня статевих гормонів (Хмельницкий О.К.,1999; Fonseca-Moutinho J.A., 2004). У літературі є велика кількість розбіжностей щодо експресії естрогенових та прогестеронових рецепторів у нормі та при патологічних змінах шийки матки (Coelho F.R., 2004; Ikuo K., 2006).

Таким чином, визначення експресії маркерів біологічних властивостей тканин при диспластичних та неопластичних процесах шийки матки для удосконалення діагностики, прогнозу перебігу, передбачення відповіді на терапію й формування груп ризику пацієнток, що вимагають більш ретельного спостереження в зв'язку з можливістю подальшої прогресії ушкоджень шийки матки з розвитком інвазивного раку, є актуальним і перспективним науковим дослідженням.

Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Представлена робота є фрагментом науково-дослідної роботи кафедр патологічної анатомії і судової медицини та онкології і медичної радіології Дніпропетровської державної медичної академії „Індивідуалізація лікування злоякісних пухлин з урахуванням біологічних показників активності пухлинного процесу та маркерів хіміогормонорезистентності” (№ держреєстрації 0101U001002).

Мета і завдання дослідження. Удосконалити діагностичні та прогностичні критерії перебігу диспластичних та неопластичних процесів епітелію шийки матки на підставі вивчення показників експресії маркерів біологічних властивостей тканин.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі завдання:

  1. Визначити частоту виявлення вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику в епітелії шийки матки та дослідити кореляцію з типом передпухлинних та пухлинних ушкоджень.

  2. Вивчити рівень експресії онкопротеїну р16INK4A як показника онкогенної трансформації при передпухлинних та пухлинних процесах епітелію шийки матки.

  3. Вивчити імуноморфологічні показники проліферації, апоптозу, диференціювання та неоваскулогенезу при передракових та ракових процесах шийки матки.

  4. Визначити зв'язок рівня експресії естрогенових та прогестеронових рецепторів зі ступенем диспластичних та неопластичних ушкоджень.

  5. Визначити чутливість, специфічність, негативне передбачувальне число та позитивне передбачувальне число для використання рівня експресії кожного маркера для встановлення ступеня диспластичних ушкоджень, рівня диференціювання інвазивних пухлин шийки матки та наявності генетичного матеріалу вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику.

Об’єкт дослідження: операційний та біопсійний матеріал шийки матки пацієнтів після гістеректомії, конізації шийки матки та кольпоскопії з приводу цервікальних інтраепітеліальних неоплазій, інвазивних раків шийки матки.

Предмет дослідження: експресія імуногістохімічних маркерів при диспластичних та неопластичних процесах епітелію шийки матки, гістологічний ступінь диференціювання, критерії його оцінки.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети та вирішення завдань використано гістологічні, імуногістохімічні, морфометричні методи для встановлення морфологічних змін при диспластичних та неопластичних процесах епітелію шийки матки; статистична обробка отриманих результатів дослідження уможливила деталізацію та об’єктивізацію базисної інформації.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вивчено частоту виявлення вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику в епітеліальній тканині шийки матки методом ПЛР та проведено кореляцію цих даних з варіантом дисплазій та неоплазій та рівнем експресії імуногістохімічних маркерів. Вперше визначено взаємозв’язок між характером та ступенем виразності патологічного процесу в епітелії шийки матки та рівнем експресії імуногістохімічних маркерів біологічних властивостей тканин. Досліджено корелятивний зв’язок між процесами апоптозу, проліферації, неоваскулогенезу та диференціювання клітин епітелію шийки матки в нормі та при диспластичних і неопластичних процесах.

У результаті комплексного дослідження розроблені категорії оцінки експресії імуногістохімічних маркерів. Визначені такі параметри як чутливість, специфічність, негативне передбачувальне число та позитивне передбачувальне число для використання рівня експресії кожного маркера для встановлення ступеня диспластичних ушкоджень, рівня диференціювання інвазивних пухлин шийки матки та наявності генетичного матеріалу вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику, описані можливості використання імуногістохімічного дослідження маркерів у клініці як скринінгових та підтверджуючих методів. Вперше на підставі вивчення варіантів експресії маркерів біологічних властивостей тканин та їх статистичної обробки обґрунтована концепція, яка визначає підходи до використання імуногістохімічного методу для поліпшення гістологічної діагностики диспластичних процесів та виділення груп ризику пацієнток з цервікальними неоплазіями.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлені в роботі показники експресії маркерів апоптозу, проліферації, неоваскулогенезу та диференціювання при диспластичних та неопластичних процесах епітелію шийки матки доповнюють та уточнюють уявлення про онкотрансформацію і фактори, від яких залежить біологічна поведінка передпухлинних процесів та злоякісних новоутворень. На основі визначення чутливості, специфічності, НПЧ і ППЧ для використання рівня експресії імуногістохімічних маркерів при передпухлинних та пухлинних процесах шийки матки розроблено концепцію можливого використання імуногістохімічного дослідження цих маркерів у клініці як скринінгових і підтверджуючих методів, що дозволяє підвищити якість ранньої діагностики цих процесів, прогнозувати подальший перебіг захворювання, а також рекомендувати виділення різних груп ризику в залежності від рівня та варіанту експресії цих маркерів. Одержані результати дозволяють обґрунтувати необхідність корекції подальшого ведення таких пацієнток з можливим призначенням необхідних діагностичних заходів та вибір адекватного методу терапії, що є безперечною передумовою успішного лікування хворих на передпухлинні та пухлинні процеси епітелію шийки матки.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведені патентний та інформаційний пошук, збір, аналіз і обробка біопсійного та операційного матеріалу, виконано імуногістохімічне та загальноморфологічне дослідження біопсійного й операційного матеріалу 134 пацієнток, особисто розроблені критерії оцінки експресії імуногістохі­міч­них маркерів, проведено аналіз і статистичну обробку результатів дослідження, підібраний й оформлений ілюстративний матеріал. Дисертантом самостійно написані всі розділи дисертації, здійснена публікація результатів дослідження в журналах, представлені результати досліджень на наукових з’їздах та конференціях.

У роботах, виконаних у співавторстві, реалізовані наукові ідеї здобувача. Співавторами здійснювалась допомога в зборі матеріалу, надана консультація при проведені імуногістохімічних досліджень. Дисертантом не були використані результати й ідеї співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації та її фрагменти були представлені й обговорені на II і III Всеукраїнських наукових морфологічних конференціях “Карповські читання” (Дніпропетровськ, 2005; 2006), Українській школі-семінарі молодих вчених та фахівців патологоанатомів (Одеса, 2006), науково-практичній конференції асоціації акушерів-гінекологів (Дніпропетровськ, 2006), Російській науково-практичній конференції „Патология шейки матки и генитальные инфекции – от теории к практике” (Москва, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 наукових праць, які повністю відображають зміст проведеного дослідження. Із них 3 статті видані у рекомендованих ВАК України наукових фахових журналах (у тому числі 1 самостійно), 1 стаття – оглядова, 2 деклараційні патенти, 3 тез матеріалів наукових конференцій.

Обсяг та структура дисертації. Дисертацію викладено державною мовою на 175 сторінках, з яких 140 сторінок залікового принтерного тексту. Робота складається із вступу, огляду літератури, загальної методики і основних методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку літературних джерел. Роботу ілюстровано 82 рисунками та 27 таблицями. Список цитованої літератури налічує 180 джерел.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал і методи дослідження. У відповідності до мети та завдань у дослідженні було використано клініко-анатомічний матеріал хворих, який отримано під час операцій і діагностичних біопсій з приводу ЦІН, РШМ та інших гінекологічних захворювань.

Весь клініко-анатомічний матеріал був розподілений на 3 групи: 1 група – 91 пацієнтка з ЦІН І (дисплазія легкого ступеня, Н-ПІУ); ЦІН ІІ (дисплазія помірного ступеня), ЦІН ІІІ (дисплазія тяжкого ступеня та рак in situ) (ЦІН ІІ та ЦІН ІІІ об’єднувались в В-ПІУ) у віці від 18 до 65 років. Розподіл матеріалу в залежності від ступеня диспластичних трансформацій був наступним: ЦІН І – 30 випадків, ЦІН ІІ – 29, ЦІН ІІІ – 32 спостереження. 2 група – 36 пацієнток з інвазивними раками шийки матки у віці від 30 до 70 років. Розподіл матеріалу в залежності від форми захворювання був таким: плоскоклітинні раки – 27 випадків (із них зроговілі – 18, незроговілі – 9), аденокарциноми – 9 спостережень (із них високодиференційовані – 6, низькодиференційовані – 3). 3 група – 7 пацієнток з патологією шийки матки, яка не була пов'язана з ЦІН або новоутвореннями шийки матки у віці від 25 до 60 років – як контроль.

Комісією з біоетики Дніпропетровської державної медичної академії (протокол №3 від 13.02.06) встановлено, що проведені наукові дослідження тканин людини відповідають етичним вимогам згідно наказу МОЗ України № 281 від 01.11.2000 року.

Для проведення морфологічного дослідження операційний і біопсійний матеріал хворих фіксувався в 10% розчині нейтрального забуференого формаліну на протязі 12 годин. Після фіксації і проводки по стандартній методиці матеріал заливався у парафін. Парафінові зрізи після забарвлення гематоксиліном і еозином піддавалися загальноморфологічному дослідженню.

Для імуногістохімічного дослідження зрізи завтовшки 4-5 мкм наносилися на предметне скло, попередньо оброблене адгезивною рідиною, вслід за чим депарафінізувалися відповідно до прийнятих стандартів. Ми використовували нагрівання на водяній бані в цитратному буфері з рН=6,0 (протягом 30 хвилин після досягнення температури 980) і автоклавування (5 хвилин при температурі +1210 С). Як первинні використовувалися моноклональні антитіла до р53-онкопротеїну (клон DO-7, DakoCytomation), Ki-67 (клон MIB-1, DakoCytomation), p16INK4a (kit для гістологічних препаратів, №K5334, DakoCytomation), VEGF (клон VG1, DakoCytomation), естрогенових (клон 6F11, Novocastra) та прогестеронових рецепторів (клон 1A6, Novocastra), CD34 (клон QBEnd 10, DakoCytomation), p63 (клон 4А4, DakoCytomation). Для контролю специфічності імуногістохімічного забарвлення для кожного маркера виконували контрольні реакції. Подальшу обробку проводили з використанням системи візуалізації LSAB2 та EnVision (DakoCytomation) протягом 10 хвилин з кожним реагентом з проміжним промиванням у ТРИС-буферному розчині. Після цього проводили реакцію з хромогеном (DAB (DakoCytomation)), оцінюючи якість взаємодії під контролем мікроскопу протягом від 20 секунд до 3 хвилин. Для диференціювання структур тканин зрізи додатково забарвлювали гематоксиліном Майєра протягом 3 хвилин. Дегідратація і заключення у бальзам здійснювалися згідно розповсюдженим принципам (Петров С.В., 2004., Dabbs D.J., 2006).

Клітини, позитивні у відношенні експресії маркерів, вивчали на 4-6 випадково обраних полях зору мікроскопа. Після підрахунку 300 гістологічно ідентифікованих клітин обчислювали показники експресії за результатами всіх вивчених ділянок, враховуючи реакції у нормальних, а також диспластично і неопластично змінених клітинах епітеліального шару. Експресія рецепторів стероїдних гормонів, VEGF та CD34 оцінювалась також у стромальному компоненті.

При оцінці імуногістохімічного забарвлення позитивна імуногістохімічна реакція з антитілами до Кі-67, р53, р63, естрогенових та прогестеронових рецепторів виявлялася коричневим забарвленням ядер клітин різного ступеня інтенсивності. Найбільш розповсюдженою формою позитивної реакції на p16INK4A та VEGF було коричневе одночасне забарвлення ядер і цитоплазми – так звана змішана позитивна реакція (Dabbs D.J., 2006).
Для оцінки p16INK4A експресії використовували наступну шкалу: негативна реакція – до 5% позитивно забарвлених клітин; фокальна - до 80% клітин з позитивним забарвленням; дифузна – більше 80% клітин з імуногістохімічною міткою (Takaaki S., 1998). Для оцінки експресії стероїдних рецепторів використовували наступні діапазони: негативна реакція –0-10% позитивно забарвлених клітин; позитивна реакція - більше 10% клітин з імуногістохімічною міткою. Індекси проліферації (ІП), р53 та р63 експресії обчисляли як відсоток клітин з інтрануклеарною реакцією, незалежно від інтенсивності забарвлення, до загальної кількості клітин в середньому за результатами всіх вивчених ділянок. При оцінці імуногістохімічного забарвлення з VEGF використовувався напівкількісний метод з 4 категоріями: 0 - негативна реакція (еквівалентно нормальному епітелію), 1 - слабке забарвлення (позитивно забарвлені окремі розкидані клітини, чи розповсюджена на весь епітелій, але слабка реакція), 2 - помірно виражене забарвлення (більша кількість позитивно забарвлених клітин) і 3 - інтенсивне забарвлення (практично всі клітини епітелію були позитивними) (Branca M., 2006).
Матеріал пацієнток був підданий ПЛР дослідженню на предмет виявлення ВПЛ різних типів.

Дані морфометричного та імуногістохімічного досліджень піддавалися статистичній обробці, з використанням варіаційних статистичних методів. Визначення достовірності відмінностей ознак проводили за допомогою параметричних методів (t критерій Стьюдента). Зв’язок між ознаками визначали за допомогою коефіцієнта кореляції. У випадку, коли розподілення не відповідало нормальному закону, оцінку відмінностей між вибірками оцінювали за допомогою непараметричних критеріїв: Х-критерію Ван-дер-Вардена і U-критерію Уілкоксона (Манна-Уітні). В дослідженні були також підраховані чутливість, специфічність, НПЧ і ППЧ для р16ІNK4a; р53; Кі-67; VEGF; ER; PGR; р63 забарвлення, як маркерів ступеня диспластичних трансформацій, наявності ВПЛВКР та ступеня диференціювання інвазивних пухлин (Лакин Г.Ф., 1990).

Отже, представлені в даному розділі матеріал і методи дослідження є послідовними кроками на шляху вирішення поставлених задач, які дозволяють здійснити комплексний підхід до вивчення експресії маркерів біологічних властивостей тканин при диспластичних та неопластичних процесах епітелію шийки матки.

  1   2   3

скачати

© Усі права захищені
написати до нас