ОДЕСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ І.І. МЕЧНИКОВА
БІОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Реферат на тему:
«Спектрофотометрія»
Виконала
студентка V курсу
кафедри ботаніки
Рудка Юлія
Одеса-2020
Зміст
Вступ………………………………………………………………………3
Спектрофотометрія……………………………………………………….4
Спектрофотометри………………………………………………………..7
Методика спектрофотометричних вимірювань……………………..…13
Список використаної літератури………………………………………..16
Вступ
Серед сучасних методів дослідження важливу роль відіграє спектральний аналіз. Він належить до фізико-хімічних методів якісного й кількісного визначення атомного та молекулярного складу речовин, ґрунтується на дослідженні спектрів, що поглинаються або випромінюються речовинами, які аналізують. В основу цих методів покладено принцип вимірювання зміни інтенсивності світлового потоку. Спектрофотометрія, або, у ширшому розумінні, колориметрія, — вимірювання інтенсивності забарвлення розчину досліджуваної речовини відносно інтенсивності забарвлення еталонного розчину з достовірно відомою концентрацією.
Власне спектрофотометрія — це вимірювання поглинання (і пропускання) прозорих розчинів в ультрафіолетовій, видимій та інфрачервоній ділянках спектра (220—1100 нм). Прилади, принцип роботи яких ґрунтується на вимірюванні світлопоглинання речовин, називають абсорбціометрами. До них належать фотоелектроколориметри (ФЕК) і спектрофотометри (СФ).' Фотоелектроколориметри дають змогу проводити вимірювання у видимій частині спектра, тоді як спектрофотометри (СФ) — у широкому діапазоні хвиль, від ультрафіолетового до інфрачервоного (210 —1100 нм), і досліджувати забарвлені та безбарвні розчини у вузькій частині спектра, у зоні максимального поглинання монохроматичного потоку світла.
Спектрофотометрія у видимій області і УФ-областях дозволяє оцінювати ступінь чистоти речовини, ідентифікувати по спектру різні сполуки, визначити константи дисоціації кислот і основ, досліджувати процеси комплексоноутворення. Інфрачервоні (ІЧ) спектри дають характеристику речовин. Наявність в ІЧспектрах тих чи інших полос поглинання дозволяє розшифровувати структуру речовини. УФ-спектрофотометричне вимірювання проводять в розчинах. Як розчинники використовують очищену воду, кислоти, луги, спирти (метанол, етанол), деякі інші органічні розчинники. Розчинник не повинен поглинати в тій чи іншій області спектра, що і аналізуємо речовина. Характер спектра (структура і положення полос поглинання) може змінюватися в різних розчинниках, а також при зміні рН середовища. Методом УФ-спектрофотометрії використовують для визначення ідентичності, чистоти і кількісного вмісту лікарських препаратів.
Спектрофотометрія широко застосовується при вивченні будови і складу різних сполук (комплексів, фарбників, аналітичних реагентів тощо), для якісного і кількісного аналізу речовин (визначення слідів елементів в металах, сплавах, технічних об'єктах).
Спектрофотометрія
Спектрофотометрія - метод дослідження і аналізу речовин, заснований на вимірі спектрів поглинання в оптичної області електромагнітного випромінювання. Інколи під спектрофотометрією розуміють розділ фізики, об'єднуючий спектроскопію (як науку про спектри електромагнітного випромінювання), фотометрію і спектрометрію (як теорію і практику виміру відповідної інтенсивності і довжини хвилі (або частоти) електромагнітного випромінювання); на практиці спектрофотометрію часто ототожнюють з оптичною спектроскопією. По типах систем, що вивчаються, спектрофотометрію зазвичай ділять на : молекулярну і атомну. Розрізняють спектрофотометрію в ІЧ, видимою і УФ областях спектру. Вживання спектрофотометрії в УФ і видимою областях спектру засновано на поглинанні електромагнітного випромінювання з'єднаннями, що містять хромофорні (наприклад, З = З, С=С, С=О) і ауксохромні (ОСН3, ОН, NН2 та інші) групи. Поглинання випромінювання в цих областях пов'язане із збудженням електронів s-, p-і n-орбіталей основного стану і переходами молекул в збуджені стани: s : s*, n : s*, p : p* і n : p* (переходи перераховані в порядку зменшення енергії, необхідної для їх здійснення). Переходи s : s* знаходяться в далекій УФ області, наприклад в парафінів при
120 нм. Переходи n : s* спостерігаються в УФ області; наприклад, органічні сполуки, що містять n-електроні, локалізовані на орбіталях атомів О, N, S, мають смуги поглинання при довжині хвилі близько 200 нм. Лінії, відповідні переходам p : p*, наприклад, в спектрах гетероциклічних з'єднань виявляються в області близько 250-300 нм і мають велику інтенсивність. Смуги поглинання, відповідні переходам n : p*, знаходяться в ближній УФ і видимою областях спектру; вони характерні для з'єднань, в молекулах яких є такі хромофорні групи, як З = Про, C = S, N = N. Переходи типа n : p* часто виявляються забороненими, і відповідні смуги поглинання володіють дуже малою інтенсивністю. Переходи типа p : p* можуть супроводитися переходом електрона з орбіталі, локалізованою головним чином на одній групі (наприклад, С=С), на орбіталь локалізовану на іншій групі (наприклад, С=О). Такі переходи супроводжуються перенесенням електрона з одного атома на іншій і відповідні спектри називаються спектрами з перенесенням заряду. Останні характерні для різних комплексів (наприклад, ароматичних з'єднань з галогенами), що інтенсивно поглинають у видимій і УФ областях. Для іонів перехідних металів і їх комплексних з'єднань характерні переходи за участю d-електронів, а для РЗЕ і актиноїдів - переходи за участю f-електронів. Відповідні з'єднання в розчині бувають інтенсивно забарвленими, причому забарвлення (спектр поглинання) залежить від міри окислення катіона і стійкості комплексного з'єднання. Ізольовані, не взаємодіючі між собою хромофори в молекулі поглинають незалежно. В разі якої-небудь взаємодії між ними аддитивність спектрів порушується. По відхиленнях від аддитивності можна судити про характер і величину взаємодії. Оскільки положення смуг в спектрі визначається як різниця енергій основного і збудженого станів молекул, можна визначати структуру енергетичних рівнів молекул або за відомою схемою енергетичних рівнів визначати положення смуг поглинання. Будь-якому електронному стану молекул відповідає набір різних коливальних рівнів енергії. Дослідження спектрофотометрії спектрів молекул у видимій і УФ областях дозволяє встановити вигляд електронних переходів і структуру молекул. При цьому часто досліджують вплив різних типів заміщення в молекулах, зміни розчинників, температури і інших фізико-хімічних чинників. У ІЧ області виявляються переходи між коливальними і обертальними рівнями. Серед частот коливань молекул виділяють так звані характеристичні, які практично постійні по величині і завжди виявляються в спектрах хімічних сполук, що містять певні функціональні групи. Теорія коливань складних молекул дозволяє розрахунковим дорогою передбачити коливальний спектр з'єднань, тобто визначити частоти і інтенсивності смуг поглинання. Коливальні спектри молекул чутливі не лише до зміни складу і структури (тобто симетрії) молекул, але і до зміни різних фізичних і хімічних чинників, наприклад зміні агрегатного стану речовини, температури, природи розчинника, концентрації досліджуваної речовини в розчині, різною взаємодією між молекулами речовини (асоціація, полімеризація, утворення водневого зв'язку, комплексних з'єднань, адсорбція і т. п.). Тому ІЧ спектри широко використовують для дослідження, якісного і кількісного аналізу всіляких речовин. У ближній ІЧ області (10000-4000 см-1, або 1-2,5 мм), де розташовані обертони і складені частоти основних коливань молекул, смуги поглинання мають інтенсивність в 102-103 раз менше, ніж в середній ІЧ області (4000-200 см-1). Це спрощує підготовку зразків, оскільки товщина поглинаючого шару м. би. чималий (до декількох мм і більш). Експериментально техніка для роботи в цій області відносно проста. Проте чутливість і селективність визначення окремих з'єднань невеликі. Проте високе відношення сигнал : шум (до 105) створює хороші умови для кількісного аналізу при вмісті визначуваного з'єднання близько 1% і вище. Подібні аналізи виконуються за 1 мін. У далекій ІЧ області (200-5 см-1) можуть спостерігатися чисто обертальні переходи. Інтенсивність смуги поглинання молекули визначається вірогідністю відповідного електронного (або що коливає) переходу. Для виміру спектрів використовують спектральні прилади-спектрофотометри, основні частини якого: джерело випромінювання, диспергуюче елемент, кювета з досліджуваною речовиною, реєструюче пристрій. Як джерела випромінювання застосовують дейтерієву (або водневу) лампу (у УФ області) і вольфрамову лампу розжарювання або галогенну лампу (у видимій і ближній ІЧ областях). Приймачами випромінювання служать фотоелектронні помножувачі (ФЕУ) і фотоелементи (фоторезистори на основі PBS). Диспергуючими елементами приладу є призматичні монохроматор або монохроматор з дифракційними решітками. Спектр отримують в графічній формі, а в приладах з вбудованою міні-еом-в графічній і цифровій формах. Графічно спектр реєструють в координатах: довжина хвилі (нм) і (або) хвилеве число (см-1) - пропускання (%) і (або) оптична щільність. Основні характеристики спектрофотометрів: точність визначення довжини хвилі випромінювання і величини пропускання, що вирішує здатність і світлосила, час сканування спектру. МІНІ-ЕОМ (або мікропроцесори) здійснюють автоматизоване управління приладом і різну математичну обробку отримуваних експериментальних даних: статистичну обробку результатів вимірів, логарифмування величини пропускання, багатократне диференціювання спектру, інтеграцію спектру по різних програмам, розділення смуг, що перекриваються, розрахунок концентрацій окремих компонентів і тому подібне. Спектрофотометри зазвичай забезпечуються набором приставок для здобуття спектрів віддзеркалення, роботи із зразками при низьких і високих температурах, для виміру характеристик джерел і приймачів випромінювання і тому подібнеСпектрофотометри
Рис 1. Спектрофотометр
Вимірювання поглинання в ультрафіолетовій і видимій областях проводиться на фотоелектричних спектрофотометрах. У Радянському Союзі випускалися однопроменеві, призмові , не регіструючі прилади СФ-4 і СФ-4А для вимірів в ультрафіолетовій, видимій та ближній інфрачервоній областях спектру (від 220 до 1100 нм), не регіструючий прилад з дифракційними решітками СФД-2 для вимірювань від 220 до 1100 нм, однопроменевий, призменний спектрофотометр СФ-5М для вимірювань від 380 до 1100 нм, і двопроменеві, призмові, реєструючі прилади СФ-2М і СФ-10 для вимірів у видимій частині спектру від 400 до 750 нм.
За кордоном і в сучасній Україні використовуються реєструючі спектрофотометри типу Бекман (США), Перкін-Елмер (США), Уніка (Англія), Хілгер-Увіспек (Англія), Цейс (НДР) та інші серійні прилади.
Основними частинами будь-якого спектрофотометра є :
1.джерело безперервного випромінювання;
2.монохроматор;
3.кювета для аналізованого розчину;
4. детектор ;
5. реєструючий пристрій.
Оптична схема найпростішого спектрофотометра наведена на рис. 2.:
Рис.2 Оптична схема простого спектрофотометра.
1.джерело випромінювання;
2.дзеркало;3.вхіднаі вихіднащілини,
4.дзеркало;
5.призма;
6.поворотнедзеркало,
7.кювета,
8.фотоелемент.
Як джерело випромінювання в приладах найбільш широко використовуються газорозрядна воднева лампа і вольфрамова лампа розжарювання.
Газорозрядна воднева лампа забезпечує суцільний спектр в ультрафіолетовій області і особливо зручна для вимірів від 200 до 350 нм.
Вольфрамова лампа розжарювання використовується для роботи в ближній ультрафіолетовій області, видимої та ближньої інфрачервоної області, тобто в межах від 320 до 3000 нм. Ртутні лампи забезпечують дуже високу інтенсивність в ультрафіолетовій і видимій областях, даючи інтенсивну лінію спектру ртуті і суцільне випромінювання. Ртутні лампи необхідно нагрівати протягом 15 хвилин, перш ніж вони почнуть давати постійне випромінювання. Недоліком є висока температура, яку ртутна лампа набуває при роботі.
Ксенонові розрядні лампи застосовуються в ряді приладів для вимірювань в області від 200 до 900 нм.
Монохроматор пристосування для ізолювання дуже вузької смуги випромінювання; з джерела світла. Змішане випромінювання проходить через щілину в монохроматор, в якому промінь розкладається на спектр за допомогою призми або дифракційної решітки. Цей спектр фокусується на вихід щілини. Шляхом обертання призми або дифракційної решітки можна виділити певну частину спектру, яка через щілину направляється в кюветне відділення, де знаходиться розчин досліджуваної речовини.
Кут відхилення між початковим напрямком променя і напрямом, в якому він проходить через призму, залежить від показника заломлення матеріалу, з якого зроблена призма. Показник заломлення будь-якого матеріалу змінюється в залежності від довжини хвилі, що визначається наступним рівнянням:
n = n0 + C / (λ — λ0),
де n — показник заломлення при визначеній довжині хвилі;
λ — довжина хвилі;
C; n0; — константи.
Отже, коли промінь немонохроматичним радіації входить у призму, які становлять його довжини хвиль відхиляються під різними кутами. Той же процес повторюється при виході променя з призми. Таким чином, виходить спектр, в якому короткі хвилі відхиляються від їх початкового напрямку більше, ніж довгі.
Кутова дисперсія - це зміна кута диспергованого променя зі зміною довжини хвилі. Дисперсія не змінюється лінійно залежно від довжини хвилі.
Роздільна сила призми визначається здатністю інструмента розділяти дві спектральні лінії, що відрізняються на довжину хвилі dλ.
R = λ / dλ = t * dn / dλ
де λ-середня довжина хвилі двох ліній, незначно відрізняються один від одного;
dλ - відмінність в довжинах хвиль двох ліній;
t - товщина основи призми;
n - показник заломлення призми.
Матеріал, з якого виготовляються призми, вибирається з розрахунком отримання максимальної дисперсії і хорошою пропускною здатністю в певній області спектра. Призми зі скла використовуються у видимій області, з кварцу - в ультрафіолетовій і ближній інфрачервоній області. Призми в порівнянні з дифракційними решітками забезпечують чистіший спектр.
Дифракційні гратки дешевші, ніж призми, і можуть бути використані для всіх областей спектра, так як пропускна здатність в даному випадку не має визначального значення. Дифракційна решітка складається з великої кількості паралельних ліній, нанесених на скло або на поверхню металу. Спектри, одержувані з дифракційними решітками, не так чисті, як призмові, тому, що утворюється спектр більш ніж одного «порядку».
Коли світло відбивається від дифракційної поверхні, спектри утворюються на обох сторонах перпендикуляра у відповідності з наступним рівнянням:
n * λ = d * (sin i + sin Θ),
де n - порядок спектра;
λ - довжина хвилі;
d - відстань між лініями дифракційної решітки;
i - кут падіння;
Θ - кут дифракції.
Дисперсія від дифракції залишається практично постійною при зміні довжини хвилі, а роздільна сила решітки визначається порядком спектра і числом ліній на освітленій частині дифракційної решітки.
R = n * N,
де R - роздільна сила решітки;
n - порядок спектра;
N - число ліній.
Роздільна сила також залежить від якості дифракційної решітки. Будь-які недоліки в точності нанесення ліній можуть привести до появи кілька зміщеного зображення ліній. Зазвичай отримують спектр дещо вищого порядку, ніж очікуваний.Для обох систем диспергування світла необхідні колімінуючі та фокусуючі лінзи або дзеркала, зазвичай комбіновані з диспергуючим пристроєм.У абсорбційній спектроскопії застосовуються кювети різних розмірів, виготовлені з кварцу або скла. Як і призми, кювети зроблені з матеріалу, що володіє високою пропускною здатністю в певної частини спектра. Кварцові кювети придатні для вимірювань як ультрафіолетової, так і у видимій області; скляні ж можуть бути використані тільки у видимій області.
Товщина шару в кюветах коливається від 0,1 до 10 см. Найчастіше вимірювання проводять в кюветах з товщиною шару 1 см. Важко робити кювети, абсолютно ідентичні за пропускною здатністю, тому одну і ту ж кювету зазвичай використовують тільки для розчинника. Поправка на різне поглинання кювет визначається шляхом порівняння поглинання обох кювет, наповнених чистим розчинником.Слід звертати увагу на чистоту кювет та стан їх оптичної поверхні, так як обидва ці чинники впливають на показання поглинання.Для вимірювання поглинання світла необхідно фотометричний пристрій. Застосовувані для цих цілей фотоелементи, фотоемісійні лампи і фотопомножувачі засновані на відомому ефекті переходу світлової енергії в електричну.Фотоелементи дають відносно сильний струм, який може бути визначений за допомогою гальванометра. Фотоелементи найчастіше застосовуються в фотоелектроколориметр.
Фотоемісійні лампи - це розріджені трубки, що містять два електроди, один з яких при опроміненні випускає електрони, так як покритий світлочутливим матеріалом (лужний метал, нанесений на шар окису срібла або сурми). Виникає при цьому струм дуже слабкий, тому необхідно застосовувати підсилювальні пристрої.
Емісійні лампи застосовують по наступних основних причинах. Внаслідок низького внутрішнього опору посилення струму в фотоелементі утруднено. В спектрофотометрі використовується більш вузький промінь світла, ніж у колориметрі, завдяки чому струм у фотоелементі був би занадто слабкий для вимірювання. Потік фотоелемента, який піддається постійному висвітленню, повільно знижується в часі. Нарешті, спектральна відповідь фотоелементів обмежується видимою частиною спектра, фотоелементи майже марні в ультрафіолетовій області.Природа покриття визначає область хвиль, в якій емісійна лампа може бути використана (від 300 до 500 нм для шару металевого натрію і від 200 до 700 нм для шару калію).Фотопомножувачі пристроїв є подальшим розвитком фотоемісійних ламп. Первинні електрони, що випускаються фоточутливим електродом, спрямовуються на наступний електрод, який в свою чергу випускає кілька електронів на кожен падаючий на нього електрон і т. д. Після низки таких етапів вдається значно посилити струм при збереженні дуже невеликої величини початкового струму.
Методика спектрофотометричних вимірювань
Існує два типи спектрофотометрів: однопроменеві і двопроменеві. У однопроменевий приладі промінь світла, що виходить з монохроматора, проходить через одну кювету і потім потрапляє в детектор. Визначення поглинання роблять у такий спосіб. Спочатку прилад встановлюють на нуль проникання(нескінченна величина поглинання) з детектором в темряві, що робиться для компенсації слабкого струму, який є навіть за відсутності випромінювання і виникає внаслідок емісії теплових електронів. Потім в промінь поміщають кювету, що містить розчинник, і прилад встановлюється для вимірювання в одиницях проникнення (нуль поглинання) при певній довжині хвилі. Після чого, кювету з розчинником замінюють кюветою з розчином досліджуваної речовини і виробляють вимір.За цією методикою вимірюють два фотоструми - один пропорційний інтенсивності променя, що пройшов через розчинник, і другий - пропорційний інтенсивності променя, що пройшов через розчин речовини. Щоб співвідношення цих струмів були еквівалентні проникності, треба джерело випромінювання і детектор залишати постійними в межах, коли проникність встановлена на одиницю і коли проникність зменшується при вимірюванні поглинання речовини. Отже, особливу увагу необхідно звертати на постійну напругу, що подається на лампу.У двохпроменевій спектрофотометрії ця проблема вирішена наступним чином. Випромінювання, що виходить з монохроматора, розділяється на два промені, що мають однакові інтенсивності і спектральні розподіли. Один з променів проходить через кювету з розчинником, інший - через кювету з досліджуваним речовиною. На відношення випромінювань, що виходять з обох кювет, величина джерела світла не робить ніякого впливу. Ставлення випромінювань може бути виміряна двома способами.Промені, що вийшли з кювет, спрямовуються на катоди двох фотоемісійних ламп або фотопомножувач. Виходи цих детекторів пов'язані серією опорів, посилюють різницю між двома фотоструму і реєструють величину поглинання. Зручністю двопроменевих приладів є можливість реєстрації показань.У приладах з одним детектором промені, що виходять з двох кювет, спрямовуються на ту ж частина катода однієї лампи. За допомогою обертового непрозорого диска промені розбиваються на окремі порції. Таким чином, на детектор падає випромінювання, інтенсивність якого змінюється в межах I і I0, і його вихід змінюється з тією ж швидкістю, що і швидкість обертання диска. Це створює напругу, амплітуда якого буде пропорційна різниці в інтенсивності двох променів. Подальше вимір напруги, відповідного інтенсивності променів, залежить від конструкції приладу.Зазвичай для отримання спектрів потрібно від 0,1 до 100 мг речовини в залежності від молярного коефіцієнта поглинання. Розчини, що застосовуються в спектрофотометрії, є дуже розведеними, що обумовлює необхідність точного зважування зразка і точного відмірювання розчину при наступних розведеннях. Підходящої для вимірювань концентрацією є та, яка забезпечує показання поглинання між 0,2 і 0,7, що відповідає проникнення від 65 до 20%.Певне підвищення точності спектрофотометричного аналізу досягається шляхом, так званої диференціальної фотометрії. Цей метод заснований на порівнянні поглинання невідомого розчину і поглинання стандартного розчину, останній підібраний таким чином, що різниця в поглинаннях буде знаходитися в межах, в яких вимір може бути виконано з достатньою точністю. Диференціальний спосіб прийнятий Скандинавської фармакопеєю в якості основного методу для спектрофотометричних визначень.Відповідно до одного з варіантів диференціального методу, званого іноді ДЕ або Δε методом, вимірювання проводиться шляхом порівняння. Невідомої речовини при певній величині рН до тієї ж концентрації речовини, але при іншій, відмінній від першої, величиною рН. Наприклад, для визначення фенолів розводять частина розчину лужним, буфером, а іншу частину кислотним буфером. Вимірюють поглинання лужного розчину, використовуючи для порівняння кислотний розчин. Розраховують вміст фенолів, застосовуючи ДЕ значення, знайдене для чистої речовини в тій же парі буферних розчинів.Таким чином визначається зміст гексахлорофен в рідкому милі по Фармакопеї США XVII. Так як ряд речовин не показує змін до спектральних характеристиках при зміні рН, диференційний метод для фенолів можна вважати більш специфічним, ніж хімічний метод.
Список використаної літератури
Никитин В. А. Спектрофотометр // Физическая энциклопедия / Гл. ред. А. М. Прохоров. — М.: Большая Российская энциклопедия, 1994. — Т. 4. — С. 626. — 704 с.
Перейти обратно:1 2 Никитин В. А. Спектральные приборы // Физическая энциклопедия / Гл. ред. А. М. Прохоров. — М.: Большая Российская энциклопедия, 1994. — Т. 4. — С. 611—615. — 704 с.
Булатов М.И. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа - 5-е изд. / Булатов М.И. ,Калинкин И.П. – Л.: Химия ,1986. -432 с.
Дрозд А. В. Внутрішньолабораторна перевірка якості спектрофотометричних вимірювань / А. В. Дрозд, Н. О. Леонова, О. С. Каліненко // Метрологія та прилади.– 2010. – № 5 (25). – С. 62–66.
Берштейн И. Я. Спектрофотометрический анализ в органической химии / И. Я. Берштейн, Ю. Л. Каминский. – Л. : Химия, 1975. – 232 с.