Ім'я файлу: Секвенування дезоксирибонуклеїнової кислоти ДНК.doc
Розширення: doc
Розмір: 123кб.
Дата: 19.01.2022
скачати
Розширення: doc
Розмір: 123кб.
Дата: 19.01.2022
скачати
Реферат на тему:
Секвенування ДНК
2021
Введення
До кінця 70-х років перед дослідниками, що працювали у сфері молекулярної біології, гостро постала проблема встановлення послідовності нуклеотидів у ланцюгу ДНК («секвенування ДНК»). Як підійти до вирішення цієї проблеми? За 10 років до того Ердманом і Бегг була вирішена задача з'ясування послідовності амінокислот в білках («секвенування білків») в автоматичному режимі. З цим рішенням ми вже ознайомилися. Власне кажучи, новим у їхній метод був тільки спосіб автоматизації. Суть якраз цього методу було для хімії тривіальним. Був знайдений спосіб послідовного відщеплення по одній амінокислоті (хоча і в модифікованому вигляді) від кінця досліджуваної білкової ланцюга з подальшою ідентифікацією кожного з отриманих таким чином простих продуктів.
Відшукування аналогічного підходу для секвенування ДНК не надихало дослідників, оскільки для секвенування хоча б одного структурного гена належало визначати послідовність у 1-3 тисячі нуклеотидів, не кажучи вже про все геномі, коли рахунок повинен йти на мільйони, а у вищих організмів на мільярди нуклеотидів.
Початкові способи не автоматизованого секвенування ДНК
У 1977 році Максам і Гілберт запропонували зовсім інший, оригінальний метод вирішення проблеми секвенування. Їм вдалося знайти хімічну реакцію, яка розщеплювала молекулу ДНК за місцем розташування одного певного нуклеотиду. Вони позначали радіоактивною міткою перший нуклеотид досліджуваного однониткових (після денатурації) фрагмента ДНК, представленого, зрозуміло, величезною кількістю копій. Потім проводили реакцію розщеплення в таких умовах, що переважна більшість ниток ДНК розривалося тільки в одному з безлічі місць, де стояв обраний нуклеотид (а всі ці місця рівноправні). Після цього продукти розщеплення направлялися для аналізу методом електрофорезу в ПААГ. Ауторадіографії гелю виявляла таку картину.
Відрізки ДНК всіх можливих розмірів, рахуючи від початку молекули до відомого (піддалося хімічної атаки) нуклеотиду, розділилися і виявили себе смугами почорніння рентгенівської плівки. Найкоротші відрізки (у 2, 3 і навіть один перший нуклеотид) пішли в гелі далеко вперед. Довші відрізки відстали тим сильніше, ніж вони були довші. Ступінь почорніння смуг виявилася різна, оскільки число молекул ДНК, що розірвалися в кожному з можливих місць було випадковим. Але при достатній кількості вихідного матеріалу всі вони були добре видні. «Відрізані» частини молекул, навпаки, нічим себе в гелі не виявляли, тому що не містили міченого нуклеотиду.
Ця картина ще не несла в собі ніякої інформації про порядкових номерах нуклеотидів, за якими відбувся розрив. Однак аналогічні специфічні реакції розщеплення авторам вдалося знайти і для трьох інших нуклеотидів. Вони змогли отримати відповідні картини поділу відрізків ДНК і для них. Потім вони вели електрофоретичного розділення одночасно для всіх 4-х випадків у паралельних треках одного гелю. З зіставлення положень всіх смуг виявилося можливим отримати повну інформацію про послідовність нуклеотидів в досліджуваному фрагменті ДНК. Дійсно, всі смуги в 4-х треках повинні знаходитися на різних рівнях, тому що довжини відповідних цим смугам відрізків ДНК будуть відрізнятися між собою хоча б на один нуклеотид. Разом з тим, нічого іншого, крім чотирьох нуклеотидів, в ДНК немає. Це означає, що сукупність всіх відрізків дискретно вичерпує всі можливі віддалення від початку молекули. А отже, пронумерувавши всі смуги в гелі, починаючи з найвіддаленішої від старту, сукупно по всіх чотирьох треків можна отримати всю нуклеотидну послідовність секвеніруемого фрагмента ДНК.
Ауторадіографії - метод реєстрації становища радіоактивно-мічених речовин в гелі шляхом фіксації їх випромінювання на рентгенівській плівці. Адже кожному номеру, який опинився в будь-якому з треків, буде відповідати заздалегідь відомий нуклеотид, який визначив місце розриву ДНК при підготовці препарату саме для цього треку.
Зазначимо, що метод Максама і Гілберта дозволяє визначити всю послідовність, починаючи з першого-нуклеотиду. Але їх дуже нелегко в трактуванні результатів експерименту. Адже він вимагає впевненого визначення чергування смуг, що знаходяться в різних треках. Зокрема, і таких смуг, які відповідають відрізкам ДНК довжиною в кілька десятків, а то й сотень нуклеотидів з відзнакою в один нуклеотид. Тим часом умови підготовки препаратів, та й самого електрофорезу (наприклад, умови тепловідведення) можуть бути трохи різними для різних треків і це може сплутати всю картину визначення послідовності. Особливо у верхніх частинах пластини гелю, де тісно зрушені смуги, відповідні довгим відрізкам. З цієї причини метод Максама і Гілберта не дозволяв секвенувати фрагменти ДНК більше, ніж 200-300 нуклеотидних ланок. Крім того, він не піддавався автоматизації.
У тому ж 1977 році (трохи пізніше) Сенджер і співроб. запропонували інший метод секвенування ДНК. У принципі, він був багато в чому аналогічний описаному вище методу. Тут теж вдавалося отримати чотири набори відрізків ДНК всіх можливих розмірів, радіоактивно мічених і закінчуються на одному з чотирьох нуклеотидів. Їх точно так само розділяли електрофорезом в 4-х паралельних треках ПААГ, отримували чотири «сходи» смуг почорніння після ауторадіографії і сукупним аналізом послідовності смуг в них встановлювали послідовність нуклеотидів в досліджуваному фрагменті ДНК. Втім, не зовсім всю послідовність. Перші кілька нуклеотидів при цьому могли залишитися не визначеними з причини, яка стане зрозумілою з подальшого.
Звернемося тепер до того в чому два методи суттєво різнилися між собою. А саме, до способу отримання відрізків ДНК всіх можливих розмірів, які на будь-який з 4-х нуклеотидів. Нагадаю, що Максам і Гілберт радіоактивно мітили перший нуклеотид послідовності і хімічним способом розщеплювали досліджуваний однониткових фрагмент ДНК в усіх місцях знаходження кожного з нуклеотидів.
Сенджер і співроб. запропонували використовувати той же однониткових фрагмент ДНК в якості матриці для синтезу комплементарного по ній за допомогою ДНК-полімерази I безлічі неповних копій всіх можливих розмірів, які на певному нуклеотиді. Для цього обраний нукл-отиде повинен був бути модифікований таким чином, щоб «не втративши свого обличчя» бути включеним в зростаючу комплементарную ланцюг ДНК і ... тим самим припинити її зростання, фіксуючи розмір скопійованого ділянки матриці. Щоб отримати відрізки ДНК всіх можливих у цьому випадку розмірів, модифікований нуклеотид повинен бути наточити суміші чотирьох нормальних нуклеозидтрифосфатів - попередників біосинтезу ДНК теж у вигляді нуклеозидтрифосфат, але в такій малій кількості, щоб зупинка синтезу при випадковому його включенні відбувалася з однаковою ймовірністю в будь-якому місці синтезується копії.
Очевидно, що саме з цим модифікованим нуклеотидом слід зв'язати радіоактивну мітку, щоб локалізувати визначений ним відрізок ДНК на рентгенівській плівці після ауторадіографії. Але що ж це за модифікація? В якій частині нуклеотиду вона може мати місце? Очевидно, що не в самому нуклеїнових основ. Адже для того, щоб бути «впізнаним» ДНК-полімеразою та комплементарно включеним в зростаючу ланцюг ДНК-копії нуклеотид повинен «зберегти своє обличчя». Значить модифікація має торкнутися дезоксирибози. Тим більше, що саме вона бере участь у побудові цукрово-фосфатної зв'язку між нуклеотидами, тобто в самому процесі нарощування полинуклеотидной ланцюжка.
Звернемося до рисунків 24, 25 і 26 на стор 34 і 35. Розглядаючи їх, неважко пригадати, що зв'язок між сусідніми нуклеотидами утворюється за рахунок ферментативного відщеплення води від ОН-групи, якою закінчується залишок фосфорної кислоти в одному нуклеотиді (цей залишок приєднаний у 5'-положенні «своєї» дізоксірібози) і ОН-групи, приєднаної в 3'-положенні до дезоксирибози його партнера по зв'язку. Між цими двома положеннями і встановлюється фосфорнодіефірная зв'язок.
Сама дезоксирибоза, як видно з порівняння двох Сахаров на рис. 24, отримала своє найменування у зв'язку з тим, що у неї на одну ОН-групу менше, ніж у рибози. Якщо для отримання потрібного нам модифікованого нуклеотиду використовувати цукор, у якого замість ОН-групи в 3'-положенні варто просто Н, то такий цукор можна назвати «дідезоксірібозой», і повна назва відповідного йому нуклеотиду буде «дідезоксірібонуклеотід». Коли ДНК-полімераза включить в синтезируемую нитка ДНК, у відповідності до розділу комплементарності, дідезоксірібонуклеотід (а вона це зробить «не помітивши» підміни), то подальше нарощування нитки ДНК-копії припиниться, тому що не буде однією з двох ОН-груп, що беруть участь в утворенні цукрово-фосфатної зв'язку.
Описану процедуру автори методу зуміли повторити і з іншими трьома дідезоксірібонуклеотідамі. Після чого провели електрофорез продуктів чотирьох реакцій у чотирьох паралельних треках ПААГ і сукупний аналіз результатів поділу як у методі Максама і Гілберта. Перший час обидва методи були рівноправні. У методі Сенджера і співроб. була та перевага, що він допускав велике завантаження гелю при електрофорезі тому що в ньому немає невидимих відщепленим «хвостів» ДНК, що завантажують смуги мічених відрізків такої ж довжини. З іншого боку, недоліком методу була необхідність посадки прайм-мера на початок копійованої ДНК, від якого тільки й могла почати працювати ДНК-полімераза I. Праймер неважко було синтезувати штучно, але для цього треба було вже знати деяку початкову послідовність нуклеотидів в секвеніруемом фрагменті ДНК. Зрозуміло, сам праймер входив до складу всіх відрізків ДНК, розділених електрофорезом. Але якщо він був точно комплементарний початку матриці, то це не заважало її повного секвенированию. Саме секвенування починалося з першого нуклеотиду після праймера. Зауважимо про всяк випадок, що з'ясувавши послідовність нуклеотидів в синтезується нитки ДНК ми дізнаємося, в силу комплементарності, послідовність і в самої вихідної нитки ДНК.
Що ж стосується труднощі однозначного прочитання послідовності ДНК, на основі сукупного розгляду смуг в чотирьох треках, то вона в методі Сенджера залишалася такою ж, як зв методі Максама і Гілберта. Однак метод Сенджера і співроб. відкрив перспективу автоматизації трудомісткого процесу секвенування ДНК, і цим був здійснений стрибок у розвитку молекулярної біології.
Автоматичне секвенування (принцип)
Перехід до автоматичного секвенированию вимагав в першу чергу проведення електрофорезу всіх чотирьох сімейств відрізків ДНК в одному треку. Як вже зазначалося, встановлення відносного розташування чотирьох смуг, розташованих в різних треках і відрізняються по довжині всього на один нуклеотид, важко. Логіка візуальної оцінки ситуації людиною може ввести корективи у вказану раніше можливість неоднаковості умов поділу в різних треках. Напевно, цією логікою можна «навчити« і комп'ютер, але це сильно ускладнить його програму та її надійність важко передбачити.
Тим часом в обох методах перехід до електрофорез в одному треку з використанням радіоактивної мітки неможливий. Для ідентифікації значення кожної смуги потрібно було б чотири різних радіоактивних ізотопу. Припустимо, що це були б доступні для біологічних застосувань ^ ^ 14 C, ^ S і 32?. Розходження цих ізотопів може проявити себе тільки в ступені почорніння рентгенівської плівки. Але, по-перше, енергія р-випромінювання двох з цих ізотопів (^ С і ^ S) майже однакові, а, по-друге, ступінь почорніння буде залежати ще від одного, зовсім невідомого фактора - кількості відрізків ДНК, які опинилися випадково однаковими за довжині і тому підсумовуючих своє випромінювання в одній смузі. (Не забудемо, що початково для секвенування ми маємо не один, а безліч однакових фрагментів ДНК, незалежно один від одного копійованих в умовах випадкових обривів цього процесу.)
Вирішення проблеми було знайдено використанням для ідентифікації смуг в гелі флюоресценції замість радіоактивності. На основі діхлорородаміна були розроблені чотири флюоресцентних барвника різних кольорів, з максимами випромінювання при 544, 569, 597 і 622 тц, що лежать в зеленій, жовто-зеленої, помаранчевої та червоній областях спектру і легко разделімие в спектрофотометрі. Авторам вдалося зв'язати ці барвники з чотирма дідезоксірібонуклетідамі. Таким чином при лазерному опроміненні гелю кожна смуга в методі Сенджера при електрофорезі в одному треку заявляла про свою специфічність відповідним кольором випромінювання.
Зрозуміло, кожна смуга в гелі, в силу своєї кінцевої ширини і якоїсь кривої розподілу речовини по цій ширині, випускала світло флюоресценції теж у вигляді якогось дзвоновидному піку інтенсивності світла, розтягнутого в напрямку електрофорезу. У нижніх своїх частинах ці піки могли перекриватися (як перекривалися своїми кордонами та відповідні смуги в гелі). Але вершини піків добре відділялися один від одного, і це дозволяло прямо по цих вершин визначати порядковий номер кожного нуклеотиду. А його індивідуальність - за кольором піку.
Практичні аспекти автоматичного секвенування
Перше питання, що вимагає прояснення - як бути з синтезом праймера, якщо початок секвеніруемого фрагмента ДНК невідомо. Відповіді може бути два. Перший (тривіальний) - якимось іншим способом визначити початкову послідовність секвеніруемой ДНК. Другий - приєднати до цієї ДНК, перед її початком, за допомогою природної цукрово-фосфатної зв'язку іншу коротку, але добре відому послідовність нуклео-тідов. Синтезувати праймер по ній, на неї ж його посадити і таким чином змусити ДНК-полімеразу зчитувати цікавить нас матрицю з першого нуклеотиду. Обидва варіанти вирішення проблеми можна знайти у вже знайомому нам матеріалі:
1. З'ясування початкової послідовності секвеніруемого фрагмента ДНК
а) Якщо про нього нічого невідомо, то можна скористатися «застарілим» методом Максама і Гілберта, який для перших десятків нуклеотидів досить швидко дає цілком надійні відомості.
б) У випадку, якщо нас цікавить секвенування певного гена, що направляє біосинтез цілком конкретного білка відомої структури, і якщо є підстави вважати, що цей ген (або хоча б його початок) входить до складу обстежуваного фрагмента ДНК. А значить і такої ж довжини початкову послідовність дезоксирибонуклеотидів відповідного гена. Синтезований праймер в цьому випадку просто відтворить розшифровану частина іРНК.
2. Приєднання до початку секвеніруемого фрагмента відомої послідовності ДНК для синтезу праймера по ній.
Цю операцію ми вже, по суті кажучи, проробляли, коли розглядали можливість вбудовування фрагментів чужорідної ДНК, довжиною в тисячі нуклеотидів, у плазміди. Повна послідовність нуклеотидів для безлічі плазмід (що знаходяться у продажу) добре відома. Таким чином ми можемо природним чином зв'язати початок (і кінець) секвеніруемого фрагмента ДНК з відомою послідовністю нуклеотидів плазміди.
Постає питання: як дізнатися точно в яке місце плазміди включився наш фрагмент і як його потім «вирізати» назад разом з відомим, йому попереднім шматком плазміди - достатнім за своїми розмірами для посадки на нього надійного праймера? Для відповіді на це питання слід згадати про існування (і доступності на ринку) плазмід з «поліклоновим сайтом», що нараховує кілька десятків пар основ, штучно синтезованому так, щоб утримувати в собі «сайти впізнавання» для багатьох рестриктаз.
Для вирішення нашого завдання треба підібрати дві рестриктаз, сайти впізнавання яких у межах поліклонового сайту відстояли б один від одного досить далеко, на відстань, більшу, ніж довжина майбутнього праймера секвенування. Одна рестріктаза, сайт впізнавання якої знаходився б у «кінці» поліклонового сайту (якщо ми визначилися з напрямком майбутнього секвенування), повинна послужити для вбудовування підлягає секвенированию фрагмента ДНК. Друга - для його подальшого вирізання з плазміди разом з ділянкою поліклонового сайту розділяли сайти впізнавання обох рестриктаз. Вся послідовність нуклеотидів на цій ділянці відома і тому синтезувати комплементарний до нього праймер не представить праці.
Подальше секвенування таким чином подовженого фрагменту нашої ДНК або почнеться з його першого нуклеотиду, або з декількох попередніх нуклеотидів, що відносяться до копіювання приєднаного ділянки поліклонового сайту. Ці нуклеотиди легко впізнати і відокремити від послідовності самого досліджуваного фрагмента ДНК.
Природно, що з огляду на такий визначеності ситуації, фірми-постачальники плазмід з поліклоновимі сайтами пропонують і готові праймери (зазвичай 18-членні), які вони мають право називати «універсальними», бо вони придатні для секвенування будь-яких фрагментів ДНК, таким чином підготовлених.
Останнім часом для множення кількості секвеніруемой ДНК клонуванням і створення місця посадки праймера стали широко використовувати бактеріофаг М13. Це - ниткоподібний фаг, що містить однониткову, повністю розшифровану ДНК. У неї, за допомогою рестриктаз, точно так само, як в плазміду можна вбудувати чужорідну ДНК. Потрапляючи в клітину E.coli цей фаг набуває двунітевих структуру і таким чином розмножується в клітині («репликативная форма») до більш ніж 100 копій. Під час поділу клітини продовжує розмножуватися і фагів ДНК. Але одночасно з цим клітина E.coli (не гинучи!) Викидає в живильне середовище готові фаговой частки знову у вигляді однониткових ДНК, одягненою білком. Після видалення E.coli центрифугуванням, вільні фаги обробляють фенолом і отримують однониткову ДНК фага разом із спочатку вбудованим в неї фрагментом чужорідної ДНК. Розібравшись таким чином з проблемою праймера, займемося іншими важливими практичними аспектами секвенування ДНК.
По-перше відзначимо, що в процесі секвенування матрична ДНК повинна весь час залишатися суворо однониткових, без можливих «шпильок» - локальних двунітевих ділянок, що утворюються в силу наявності в цій ДНК близько розташованих, нехай невеликих, але комплементарних послідовностей. Те ж саме відноситься і до міченим відрізкам ДНК в процесі їх поділу електрофорезом. Як ми побачимо нижче, в процесі комплементарного синтезу за методом Сенджер (він повторюється багато разів - у кілька циклів) така небезпека не виникає, тому що в кожному циклі є стадія попередньої повної денатурації при температурі 96 ° С, а саме копіювання здійснюється при температурі 60 ° С. Але електрофорез доводиться проводити в сильно денатуруючих середовищі: 80%-ном розчині формамідом, що містить 5 mM розчин ЕДТА По-друге, слід потурбуватися про те, щоб при електрофорезі кількість флюоресцентної міченого матеріалу в кожній смузі (навіть такий, в якій міститься найменша кількість відрізків ДНК ) було достатнім для надійної реєстрації. Разом з тим, цього бажано домогтися без надмірного витрачання вихідного матеріалу ДНК, який звичайно дефіцитний.
Тому реакцію обмеженого (включенням дідезоксірібонуклеотіда) матричного синтезу на тому реальну кількість секвеніруемой ДНК, яка направляється в експеримент, повторюють багато разів. Це робиться точно так само, як у розглянутої раніше симетричної ПЛР-реакції. Але з тією відмінністю, що використовується тільки один, початковий праймер («асиметрична ПЛР-реакція»). Етап елонгації закінчується по досягненні кінця матриці (якщо він не був зупинений раніше). Комплементарний синтез від другого праймера у зворотному напрямку тут не фігурує.
Подібно до того, як це описано у розділі 6, тут готують 20 мкл інкубаційної суміші, в якій міститься: одне або двуніте-вая нитка ДНК секвеніруемого фрагмента (в останньому випадку буде скопіювати лише одна з ниток - та, для якої синтезовано праймер), надмірне кількість 4-х нормальних дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, обмежена кількість 4-х флюоресцентних дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов, термостабільна Taq ДНК-полімераза і в достатній кількості синтетичний праймер (все це в буфері з MgClg). Інкубаційна суміш прогрівається попередньо в тонкостінної поліпропіленової пробірочке ємністю в 0,2 або 0,5 мл при 96 ° С для повної денатурації ДНК. Потім її поміщають у вбудований в прилад термоблок, де автоматично здійснюється 25 послідовних циклів, кожен з яких складається з наступних, дуже швидко змінюють один одного термічних експозицій:
- 10 секунд при 96 ° С,
- 5 секунд при 50 ° С,
- 4 хвилини при 60 ° С.
Експозиція при 96 ° С звільняє однониткових матричні молекули секвеніруемой ДНК від новосинтезованих укорочених копій своєї послідовності разом з праймерами і Taq ДНК-полімеразою.
При 50 ° С нові молекули праймера гибрідизуючою з початковими ділянками звільнилися матриць. Слідом за ними на ці матриці сідають і молекули Taq ДНК-полімерази.
Протягом 4-х хвилин вони ведуть комплементарний синтез ДНК аж до моменту випадкового включення флюоресцентної міченого дідезоксірібонуклеотіда.
Кількість копій при такому однонаправленому синтезі не збільшується багаторазово, як при симетричній ПЛР-реакції з двома праймерами, а зростає в кращому випадку лише в 25 разів - за кількістю циклів. Однак і цього виявляється достатньо для того, щоб обмежити кількість початково вноситься ДНК 0,2 або 0,5 мікрограма (відповідно для однониткових або двунітевой молекули). В інтересах реальної орієнтування, не заважає помітити, що для фрагмента двунітевой ДНК довжиною в 1000 пар нуклеотидів в 0,5 мкг міститься більше 10 11 копій цього фрагмента. У кожному з циклів ПЛР-реакції всі вони знову і знову виступають в якості матриць для випадковим чином укорочених копіювань. Це забезпечує в кінці кінців достатнє число однакових по довжині відрізків флюоресцентномеченой ДНК в будь-якій смузі електрофоретичного поділу.
Втім, щоб уникнути флюоресцентного фону суміш цих відрізків слід очистити від невикористаних мічених дидезоксинулеозидтрифосфатов. З цією метою новосинтезовані відрізки ДНК (разом з вихідними, немічених матрицями) облягають додаванням 1 мл 70%-го етанолу та центрифугуванням в мікропробірці на 1,5 мл. Осад розчиняють у 4 мкл 80%-ного формамідом з ЕДТА, прогрівають при 96 ° С 2 хвилини і в кількості 2 мкл вносять на старт треку пластини ПААГ.