Програма самопідготовки студентів до заняття Хімічна природа і будова ферментів. Кофактори

1 2 3

Ім'я файлу: Підсумкове заняття 1 БХ.docx
Розширення: docx
Розмір: 205кб.
Дата: 07.11.2020
скачати
Пов'язані файли:
підсумкове 13 (1).docx

Підсумкове заняття по темах 1 – 7

Програма самопідготовки студентів до заняття

1. Хімічна природа і будова ферментів. Кофактори.

2. Сучасні уявлення про механізм каталітичної дії ферментів. Кінетика ферментативних

реакцій. Константа Міхаеліса-Ментен.

3. Фізико-хімічні і каталітичні властивості ферментів. Ізоферменти.

4. Регуляція активності ферментів: проферменти, алостеричні модифікатори, конкурентні,

неконкурентні фактори. Рівняння Лаїнуівера –Берка.

5. Класифікація ферментів, характеристика окремих класів.

6. Дослідження активності ферментів. Ензимопатії. Принцип ензимодіагностики.

Ензимотерапія

7. Суть і призначення обміну речовин. Стадії, специфічні і спільні шляхи.

8. Механізм окисного декарбоксилування ПВК як реакція,що започатковує спільні шляхи

метаболізму.

9. Цикл трикарбонових кислот (ЦТК) Кребса, послідовність реакцій, відновні еквіваленти.

10. Енергетичний баланс, біологічні функції ЦТК.

11. Біологічне окиснення, суть і типи реакцій. Тканинне дихання.

12. Послідовність компонентів дихального ланцюга мітохондрій. Молекулярні комплекси.

13. Суть хеміосмотичної теорії Мітчела окисного фосфорилювання, пункти спряження,

механізм функціонування протонної АТФ-синтетази.

14. Інгібітори транспорту електронів, роз’єднувачі окисного фосфорилювання, наслідки їх

впливу на організм.

15. Мікросомальне окиснення: молекулярна організація оксигеназних ланцюгів. Цитохроми Р-450, в5.

1. Хімічна природа і будова ферментів. Кофактори.

Ферменти - біологічні каталізатори білкової природи, які синтезуються в клітинах живих організмів, прискорюють і координують біохімічні реакції, що регулюють обмін речовин (метаболізм).

Хімічна природа та будова ферментів

► Ферменти є біокаталізаторами, тобто речовинами біологічного походження, які прискорюють хімічні реакції. Організована послідовність процесів обміну речовин можлива при умовах, коли кожна клітина забезпечена власним генетично заданим набором ферментів. Тільки за таких умов здійснюється погоджена послідовність метаболічних реакцій.

► Ферменти (ензими, Е) утворюються в клітинах живих організмів і здатні прискорювати в них перебіг хімічних реакцій. Ферменти також містяться у різних рідинах організмів, наприклад, слині (амілаза), шлунковому соку (пепсин), соку підшлункової залози (ліпаза, амілаза та ін.) тощо.

За хімічною природою розрізняють прості та складні ферменти

Прості ферменти (однокомпонентні), так само, як і прості білки, при гідролізі розщеплюються до амінокислот. Прикладом простих ферментів є естераза печінки (альбуміни), уреаза, трипсин (глобуліни) та ін. Більшість простих ферментів каталізує реакції гідролізу (пепсин, трипсин, рибонуклеаза).

Складні ферменти (двокомпонентні) - належать до групи складних білків. Такі ферменти, крім білкової частини (апоферменту), містять групу небілкової природи - кофактор. Весь активний комплекс називається холоферментом.

Класифікація кофакторів

Кофактори - це допоміжний хімічний вид (молекула або іон), який зв'язується з ферментами, щоб виявити біологічну активність ферменту. Більшість ферментів потребують кофакторів для здійснення своєї активності, тоді як деякі ферменти можуть не потребувати їх. Фермент без кофактора є апоферментом.

Кофактори зазвичай поділяють на дві великі групи: коферменти і простетичні групи. Коферменти дуже вільно зв'язуються з ферментами та іншими білками та легко вивільняються в процесі нормального каталітичного циклу. Їхньою головною роллю зазвичай є перенесення хімічних групи між білками. На відміну від них, простетичні групи зв'язуються дуже щільно і формують постійну частину структури білка.

Простетичні групи (ФМН, ФАД, ТПФ)

Активатори (Са2+,Мn2+ ,Zn2+ тощо)

! Якщо група небілкового походження (кофактор) сполучена з білковою частиною ферменту слабкими електростатичними або ван-дер-ваальсівськими силами, то вона має назву - кофермент. Основними коферментами є НАД*, ФАД, КоА та ін.

Будова ферментів

В молекулах ферментів розрізняють активні та алостеричні центри.

В активному центрі (АЦ) є субстратна та каталітична ділянки.

!! Субстратна (контактна, якірна) ділянка відповідає за приєднання ферментів до субстрату.

!! Каталітична ділянка відповідає за перетворення субстрату.

Роль АЦ у простих ферментах виконують просторово орієнтовані залишки амінокислот (Сер, Гіс, Тир, Тре, Цис, Глу, Асп).

У складних ферментах - роль АЦ виконують кофактори та безпосередньо сполучена з ними частина апоферменту.

2. Сучасні уявлення про механізм каталітичної дії ферментів. Кінетика ферментативних

реакцій. Константа Міхаеліса-Ментен.

Механізм ферментативних реакцій

За всю історію вчення про ферменти було запропоновано багато гіпотез, що пояснювали механізм їх дії. Більшість із них має суто історичний характер і не витримала випробувань у світлі нових даних про структуру ферментів та їх активного й алостеричного центрів. Заслуговує уваги гіпотеза, запропонована на початку ХХ ст. Варбургом і Бейлісом. Її значення полягає в тому, що вона пов’язувала механізм дії ферментів із дією неорганічних каталізаторів. Ця гіпотеза пояснювала, що поверхня ферменту служить місцем для адсорбції реагентів. За цих умов різко зростає кількість молекул субстрату, що припадає на одиницю площі ферменту, а отже, за законом діючих мас зростає і швидкість реакції. Також припускалось, що в результаті зв’язування субстрату з активним центром ферменту відбуваються механічні зміни молекул субстрату, що призводить до більшої реакційної здатності. Але адсорбційна гіпотеза не могла пояснити специфічності дії ферментів, тому вона не використовується. Для пояснення специфічності дії ферментів у 1894 р. Е. Фішер запропонував гіпотезу, яку ще й досі називають гіпотезою «ключа і замка» або гіпотезою «шаблону». В основі специфічності, за цією гіпотезою, лежить жорстка просторова відповідність субстрату і активного центру ферменту. За Е. Фішером, реакція можлива тільки в тому випадку, якщо просторово субстрат підходить до ферменту, як ключ до замка. Якщо субстрат (ключ) просторово відрізняється від структури активного центру ферменту (замок), то реакція не відбувається. Але і ця гіпотеза (її ще називають гіпотезою відповідності) не може пояснити різні види специфічності, бо важко уявити собі ситуацію, коли декілька ключів (субстратів) підходить до одного замка (ферменту). Тому ця гіпотеза була замінена і доповнена гіпотезою вимушеної співвідповідності (гіпотеза індукованої адаптації ферменту до субстрату). Згідно з цією гіпотезою, конфігурація ферменту і його активного центру є гнучкою й еластичною, що змінюється під впливом субстрату, тобто субстрат індукує у ферменті зміни конфігурації молекул відповідно до власної структури. Іншими словами, «замкова щілина», за Кошландом, виготовлена з еластичного матеріалу і тому набуває форми «ключа» при контакті з ними. Але приєднання субстрату до ферменту може викликати зміни активного центру, при яких він утворює із субстратом неактивний комплекс, і тоді реакція не відбувається. На рис. представлені зміни структури активного центру ферменту, що можуть викликатись субстратом (за Кошландом): Гіпотеза Кошланда про індуковану відповідність Значну роль у вивченні механізму взаємодії ферменту і субстрату відіграли класичні праці Міхаеліса і Ментен, опубліковані в 1913 р., про так звані ферментосубстратні комплекси. Згідно з гіпотезою Міхаеліса-Ментен, ферментативна реакція завжди супроводжується утворенням проміжної короткоіснуючої сполуки – ферментосубстратного комплексу. Процес утворення комплексу описується рівнянням і перебігає у декілька стадій, кожна з яких має свої особливості:

1 стадія – зв’язування субстрату з активним центром ферменту, тобто утворення ферментосубстратного комплексу (ES);

2 стадія – перетворення первинного ферментосубстратного комплексу в один або декілька активних ферментосубстратних комплексів (ЕSx i ESxx);

3 стадія – відокремлення продуктів реакції від активного центру ферменту і вивільнення ферменту та продукту (Е і Р).

1-а стадія за тривалістю найкоротша: вона проходить майже миттєво. За цей час субстрат орієнтується навколо активного центру й утворює з ним короткоіснуючу, неміцну проміжну сполуку.

На 2-й стадії, яка перебігає найповільніше, відбуваються розхитування зв’язків у молекулі субстрату, розрив їх та утворення нових із каталітичним центром ферменту. Знижується енергія активації субстрату, що зумовлює зростання швидкості його перетворення.

3-я стадія за тривалістю наближається до 1-ї, і швидкість її перебігу залежить від дифузії продукту в середовище.

Достовірність утворення ферментосубстратного комплексу, постульованого вперше Міхаелісом, зараз доведена експериментально, математично методами ЕПР і ЯМР. Перші докази існування ферментосубстратного комплексу були одержані в лабораторії Кейліна і Чанса. Сучасні методи дослідження дозволяють визначити для ряду ферментативних реакцій константи швидкості утворення ферментосубстратних комплексів та їх дисоціації на фермент і продукти. Встановлено, що в утворенні ферментосубстратних комплексів беруть участь водневі зв’язки, електростатичні та гідрофобні взаємодії. Досліджуючи рівняння Міхаеліса-Ментен, можна також вивчити кінетику ферментативних реакцій, встановити порядок реакції та стежити за впливом різних чинників на перебіг ферментативного процесу. В загальному, прискорення хімічних реакцій відбувається завдяки тому, що ферменти забезпечують правильну орієнтацію молекули субстрату біля каталітичного центру, надають для каталізу протон-донорні і протон-акцепторні групи, утворюють за допомогою ковалентних зв’язків нестабільні проміжні сполуки із субстратом і викликають напруження в молекулі субстрату або її деформацію

Кінетика ферментативних реакцій

Ферментативна кінетика досліджує вплив на швидкість перебігу реакції різних хімічних речовин і фізико-хімічних чинників, які є достатньо численними та різноманітними. До них відносять концентрацію фермента та субстрату, рН і температуру, наявність активаторів або інгібіторів.

1. Залежність швидкості ферментативної реакції від кількості ферменту

Якщо субстрат знаходиться в надлишку, що практично має місце в експериментальних умовах, то швидкість реакції пропорційна кількості ферменту. Але, якщо кількість ферменту збільшити настільки, щоб субстрат перестав бути в надлишку, то така пропорційність порушиться. Швидкість ферментативної реакції лінійно зростає із збільшенням вмісту ферменту .Але надмірне зростання концентрації ферменту призводить до того, що субстрату стає менше, ніж ферменту і це проявляється зменшенням наростання швидкості реакції .

2. Залежність швидкості ферментативної реакції від температури

Підвищення температури завжди збільшує швидкість хімічних реакцій, зокрема ферментативних. Як показник зростання швидкості реакції використовують температурний коефіцієнт Ван-Гофа Q10, що вказує на зростання швидкості реакції при підвищенні температури на 10 °С. Для хімічних процесів, каталізованих небіологічними каталізаторами, величина цього коефіцієнта дорівнює 2, що означає збільшення швидкості реакції вдвічі при зростанні температури на 10 °С. Однак для ферментативних процесів така закономірність існує тільки в діапазоні низьких температур – до 50-60 °С. Вище цих температур відбувається денатурація ферменту та, як наслідок, зниження активності. Оптимальні значення температури для більшості ферментів знаходяться в межах 20-40 °С.

Низькі температури також впливають на активність ферментів, але напротивагу високим температурам, вони інгібують їх дію, не руйнуючи структури. Перенесення ферментів із низьких температур в оптимальні повністю (в більшості випадків) відновлює їх активність. Цю властивість застосовують у біології і медицині. Охолодження біологічних рідин, тканин, органів використовують для пригнічення в них метаболічних процесів і попередження автокаталітичного розщеплення.

3. Залежність активності ферментів від рН середовища

Якщо активність ферментів визначати при різних значення рН, то графік залежності матиме вигляд куполоподібної кривої, крива може бути симетрична, з однаковим підйомом і спуском у кислому і лужному середовищах, або йти на зниження в якійсь одній ділянці.

Значення рН, при якому активність ферменту найвища, називається рН-оптимумом ферменту. Звичайно ферменти найактивніші в межах вузької зони рН, яка для більшості з них знаходиться в межах рН 6-8. Ряд внутрішньоклітинних ферментів найкраще функціонує у нейтральному середовищі. Разом із тим, для ферментів шлунково кишкового тракту рН-оптимум може знаходитись у зоні від нейтрального до сильно кислого і лужного середовищ. Так, пепсин має оптимум рН 1,5-2,5, трипсин – рН 8,0-9,0. Для виявлення залежності активності ферменту від концентрації водневих іонів експерименти проводять при оптимальній температурі, достатньо високих концентраціях субстрату, але при різних значеннях рН.

Чутливість активності ферментів до зміни рН середовища, очевидно, пов’язана з тим, що фермент, залежно від середовища, може знаходитись в іонізованій або неіонізованій формі, що буде обов’язково відображатися на третинній структурі білка, зокрема при формуванні активного центру та утворенні фермент-субстратного комплексу. Безумовно, різне значення рН буде по-різному впливати і на стан іонізації кофакторів та субстратів.

Можна стверджувати, що саме при рН-оптимумі між субстратом і ферментом існує найкраща просторова та електростатична комплементарність, яка забезпечує їх зв’язування, утворення ферментсубстратного комплексу і подальше перетворення його.

4. Дія на ферменти модуляторів

Активність ферментів може змінюватись не тільки за зміною кількості субстрату, ферменту, рН середовища, але і під впливом різних хімічних речовин. Речовини, що впливають на хід ферментативних реакцій, називаються їх модуляторами, або ефекторами. Вони поділяються на активатори та інгібітори, тобто під їх впливом реакція може прискорюватись або сповільнюватись. Вивчення дії модуляторів ферментів має практичне значення, бо дозволяє глибше зрозуміти природу дії ферментів. Деякі з них відіграють роль природних регуляторів метаболізму. Існує багато типів модуляторів активності ферментів, що відрізняються між собою за будовою та механізмом дії.

5. Активатори ферментів

Роль активаторів можуть відігравати як органічні (жовчні кислоти, ферменти й ін.), так і неорганічні речовини (іони металів, аніони). Нерідко зустрічаються випадки, коли одна і та ж речовина стосовно одного ферменту є активатором, а відносно іншого – інгібітором. Іони металів бувають досить специфічними активаторами для певних ферментів. Вони можуть сприяти приєднанню субстрату до ферменту, брати участь у формуванні третинної структури ферменту або бути складником активного центру. Іони багатьох металів (натрію, калію, кальцію, магнію, заліза, міді та ін.) є обов’язковими компонентами, що необхідні для нормального функціонування багатьох ферментів. Іноді для деяких ферментів потрібно декілька різних іонів. Наприклад, для Nа+, К+ - АТФази, що здійснює транспорт іонів через плазматичну мембрану, потрібні для нормального функціонування іони калію, натрію та магнію.

Метали можуть входити до складу простетичних груп ферментів. Наприклад, залізо в складі порфіринових сполук є необхідним компонентом ферментів цитохромної системи, каталази і пероксидази; кобальт входить до простетичної групи гомоцистеїнтрансметилази і метилмалонілізомерази ферментів; мідь – до аскорбатоксидази; марганець є активатором ізоцитратдегідрогенази.

Металоферменти, що містять у своєму складі переважно дво- і тривалентні іони, утворюють із залишками функціональних груп амінокислот та відповідними іонами клешнеподібні хелатні сполуки. У таких сполуках іони надають ферментам певної просторової структури і сприяють утворенню ферментосубстратних комплексів. Деякі ферменти при відсутності металів просто не проявляють ферментативної дії. Наприклад, вугільна ангідраза без цинку не має властивостей ферменту і дію цинку не можна замінити жодним іншим іоном. Аніони, порівняно з катіонами, рідше є активаторами ферментів. Прикладами активуючої дії аніонів можуть бути аніони хлору відносно пепсину та амілази слини; аніони галогенів – аденілатциклази; жовчні кислоти панкреатичної ліпази. Деякі ферменти проявляють активуючу дію стосовно своїх неактивних форм (автокаталіз). Наприклад, пепсин відносно пепсиногену, трипсин – трипсиногену тощо. Деякі ферменти активують зовсім інші ферменти. Так, ентерокіназа шляхом відщеплення інгібітора перетворює неактивний трипсиноген в активний трипсин, а останній перетворює хімотрипсиноген у хімотрипсин. Активаторами можуть бути такі органічні сполуки, як цистеїн, відновлений глутатіон та інші, що мають вільну SH-групу. Ці сполуки здатні відновлювати дисульфідні зв’язки неактивних ферментів до сульфгідрильних груп і цим самим перетворювати ферменти в активні. Таким чином речовини з вільними SH-групами захищають ферменти від агресивних хімічних впливів, наприклад від окиснення, і тому виступають активаторами ферментів. Існує група ферментів, що активуються за допомогою циклічного АМФ. Такі ферменти називаються протеїнкіназами.

Механізм їх активації такий. Протеїнкіназа складається з двох субодиниць: каталітичної, що містить активний центр, і регуляторної, в якій розміщений центр зв’язування циклічного АМФ. Фермент неактивний, бо його активний центр закритий. Він звільняється тільки при взаємодії ц-АМФ і регуляторного центру ферменту.

Активація ряду ферментів залежить від процесів фосфорилювання і дефосфорилювання. Так, фосфорилаза, що відщеплює від глікогену одну молекулу глюкози, проявляє свою дію тільки у фосфорильованому стані (фосфорилаза А), в нефосфорильованому стані (фосфорилаза В) вона неактивна. Аналогічно ліпаза жирової тканини активність свою проявляє значно інтенсивніше у фосфорильованому стані. Фосфорилювання цих ферментів здійснюється за рахунок АТФ при участі протеїнкіназ. Дефосфорилювання фосфорильованої ліпази здійснюється під впливом фосфопротеїнфосфатази.

Деякі ферменти проявляють каталітичну дію тільки в нефосфорильованому стані, а фосфорилювання призводить до втрати їх активності.

Прикладом може служити фермент глікогенсинтаза. Таким чином, за допомогою поєднаної дії ферментів протеїнкіназ і фосфатаз певні ферменти можуть переходити з неактивного стану в активний і навпаки, що має важливе значення в регуляції метаболічних процесів. В основі активації ферментів, як було показано вище, лежать різні механізми. Серед них можна назвати такі:

1 – активація за допомогою впливу на активний центр;

2 – активація шляхом відщеплення від ферменту частини пептидного ланцюга або якоїсь неорганічної сполуки, що закривала активний центр;

3 – активація шляхом приєднання до ферменту якоїсь модифікуючої сполуки;

4 – активація шляхом дисоціації неактивного комплексу ферменту на субодиниці, одна з яких проявляє властивості ферменту.

6. Інгібітори ферментів

Подібно до активаторів, інгібуючу дію на ферменти можуть проявляти різні за будовою і за механізмом дії речовини. Вивчення різних інгібіторів відкриває великі можливості для розуміння механізмів дії ферментів.

Інгібітори – речовини, що, на відміну від активаторів, послаблюють або цілком призупиняють дію ферментів. Деякі інгібітори ферментів є отрутами для живих організмів (наприклад, ціаніди, сірководень, монооксид вуглецю). Ряд лікарських засобів також має виражені інгібуючі властивості щодо певних ферментних систем. Тому інгібітори широко застосовують в експериментальній медицині для з’ясування механізму дії лікарських середників.

За механізмом дії інгібітори поділяються на дві групи:

1. Інгібітори, що вступають із ферментами у зворотну реакцію.

2. Інгібітори, що реагують із ферментами незворотно.

Незворотний інгібітор утворює з ферментом міцну сполуку за рахунок ковалентних зв’язків. Ці зв’язки виникають між різними функціональними групами, що поєднуються з активним центром ферменту. Такий комплекс не розпадається і не дисоціює на вихідні речовини, наприклад, ціанідна кислота і її похідні, фосфороорганічні, тіолові отрути та ін.

Деякі незворотні інгібітори руйнують структуру молекули ферменту, тому їх ще називають денатурантами. Вони є неспецифічними інгібіторами для всіх ферментів. Сюди відносяться солі важких металів (свинець, ртуть, срібло). Зворотні інгібітори пригнічують реакцію, але не викликають значних змін у структурі молекули ферменту. Розрізняють три типи зворотного інгібування ферментів: конкурентне, неконкурентне і безконкурентне.

Константа Міхаеліса-Ментен

З термодинамічної точки зору ферменти прискорюють хімічні реакції в організмі завдяки тому, що знижують енергію активації (Ea).

Енергія активації - це мінімальна кількість енергії, яку слід надати молекулам речовини для того, щоб вони подолали енергетичний бар’єр, тобто вступили в реакцію або це мінімальна кількість енергії , необхідна для запуску реакції.

Тобто за наявності ферменту в реакційному середовищі більша кількість молекул може подолати енергетичний бар’єр реакції і перетворитися в продукт.

Значну роль у розвитку уявлень про механізм дії ферментів відіграли праці німецьких вчених Л. Міхаеліса та М. Ментена. Саме вони розвинули положення про формування фермент-субстратного комплексу при біологічному каталізі. Згідно з уявленням Міхаеліса-Ментена весь процес ферментативного каталізу можна умовно поділити на три стадії:

1. Утворення зворотного фермент-субстратного комплексу (ES). На цьому етапі субстрат певним чином орієнтується в активному центрі ферменту та нековалентно зв’язується з функціональними групами в ньому. Слабкі зв’язки, які утворюються в ході такої взаємодії, можуть руйнуватися, тому субстрат може відділятися від активного центру – стадія зворотна.

2. Утворення однієї або декількох активних форм ES з подальшим утворенням продукту реакції (Р). Ця стадія відбувається найбільш повільно, тому швидкість цієї стадії визначає швидкість усієї ферментативної реакції.

3.Відділення готового продукту реакції від ферменту. Ця стадія, як і друга, є незворотною.

Константа Міхаеліса-Ментен — у хімічній кінетиці — концентрація субстрату, при якій швидкість реакції дорівнює половині граничної (максимальної) швидкості реакції.

де Vmax — максимальна швидкість реакції, яка спостерігається тоді, коли фермент повністю насичений субстратом, Km — константа Міхаеліса .

Константа Міхаеліса-Ментен має розмірність моль/л і часто використовується для кількісного вираження спорідненості ферменту до субстрату (чим менша Km, тим більша спорідненість), проте таке її трактування не завжди коректне.

3. Фізико-хімічні і каталітичні властивості ферментів. Ізоферменти.

Ферменти, як і білки, володіють низкою властивостей, характерних для високомолекулярних сполук: амфотерність, велика молекулярна маса, стабільність. До каталітичних властивостей ферментів відносимо:

1) каталізують лише енергетично можливі реакції; 2) прискорюють як пряму, так і зворотну реакцію, але не зміщують напрямку хімічної рівноваги; 3) у ході реакції не змінюються та не входять до складу кінцевого продукту; 4) мають високу специфічність дії (здатність каталізувати перетворення однієї або групи подібних молекул); 5) значно більш ефективні, ніж звичайні небіологічні каталізатори – кожна молекула ферменту може виконувати від декількох тисяч до мільйонів «операцій» за секунду та прискорювати реакції у мільйони і мільярди разів; 6) діють у відносно м'яких умовах (фізіологічних значеннях рН, температури, нормальному атмосферному тиску); 7) вони є каталізаторами, активність яких може бути регульована, тобто збільшена або зменшена.

До фізико-хімічних відносимо:

1)специфічність ( кожен фермент діє на певний субстрат або на певну групу близьких за структурою до самого ферменту; Висока специфічність дії зумовлена конформаційною й електростатичною комплементарністю між молекулами субстрату і ферменту, а також особливістю структури активного центру ферменту, що забезпечує високу спорідненість із субстратом і вибірковість перебігу однієї якоїсь реакції)

2)залежність дії від pH( pH оптимум( значення, при якому активність ферменту найвищі) для всіх різний, для більшості він перебуває в межах 6-8. Ця чутливість повязана з тим, що фермент, залежо від середовища, може перебувати в іонізованій або неіонізованій формі, що буде відображатись на третинній структурі білка і на формуванні активного центру і ферментосубстратного комплексу.)

3)залежність дії від температури (т підвищення темп завжди збільшує швидкість ферментативних реакцій. Використовують показник Вант-Гоффа, що вказує на зростання швидкості реацій при підвищенні температури на 10 градусів. Тут він становить 2, що означає збільшення швидкості вдвічі при зростанні температури на 10 градусів. Але для ферментів ця закономірність у вузькому діапазоні до 50 градусів, далі відбувається денатурація ферменту і зниження активності.

Ізоферменти- ферменти, що каталізують однакову реакцію і знаходяться в різних тканинах, але відрізняються між собою деякими фізико-хімічними властивостями. Ферменти характеризуються гетерогенністю, тобто побудовані з декількох субодиниць і можуть існувати в різних молекулярних формах( не всі ферменти, лише деякі складні)Такі форми можуть зустрічатись ,наприклад, в різних тканинах організму або всередині однієї клітини. Такі ферменти діють на один і той самий субстрат, але відрізняються первинною структурою.Приклади ізоферментів : ЛДГ(лактатдегідрогеназа),лужна фосфатаза,малатдегідрогеназа. ЛДГ каталізує зворотну реакцію перетворення піровиноградної кислоти в молочну з участю коферменту НАД.ЛДГ виявляє 5 ізоформ, кожна з яких містить по 4 субодиниці. Характерно, що кожна тканина в нормі має своє співвідношення форм, свій ізоферментний спектр ЛДГ. За типом ізоферментного спектра ЛДГ біологічні об’єкти діляться на 3 групи: 1. Із переважним вмістом у спектрі анодних, "швидких" форм (ЛДГ1 і ЛДГ2). Сюди відносять: серце, мозок, нирки, підшлункову залозу, еритроцити. 2. Тканини з переважанням ЛДГ3 (легені, селезінка, лімфовузли). 3. Тканини, в яких переважають катодні, "повільні" ізоформи (печінка, скелетні м’язи).

4. Регуляція активності ферментів: проферменти, алостеричні модифікатори, конкурентні, неконкурентні фактори. Рівняння Лаїнуівера –Берка.

4. Регуляція активності ферментів: проферменти, алостеричні модифікатори, конкурентні, неконкурентні фактори. Рівняння Лаїнуівера –Берка

Регуляція Активності Ферментів

Методи регуляції активності ферментів:

• Аллостерична регуляція

• Зворотня ковалентна модифікація

• Ізоферменти

• Протеолітична активація

Аллостеричні ферменти мають спеціальну регуляторну ділянку (аллостеричний центр), яка просторово відмежована від активного центру Містять більше, ніж один поліпептидний ланцюг (мають четвертинну структуру).

Аллостеричні модулятори -зв ’язуються нековалентно з аллостеричним центром -регулюють активність фермента змінюючи його конформацію

2 типи аллостеричних модуляторів

• Негативні модулятори (інгібітори) –зв ’язуються з аллостеричним центром і інгібують активність фермента; –зазвичай є кінцевими продуктами біохімічних шляхів – зворотній негативний зв ’язок

• Позитивні модулятори (активатори) –зв ’язуються з аллостеричним центром і стимулюють активність фермента; –зазвичай є субстратом реакції – зворотній позитивний зв’язок

Приклад аллостеричного фермента – фосфофруктокіназа-1 (ФФК-1)

• Каталізує реакцію гліколізу на початку процесу • Фосфоенолпіруват, проміжна сполука з кінця гліколізу, є аллостеричним інгібітором ФФК-1

Регуляція активності ферментів шляхом ковалентної модифікації

Ковалентне приєднання молекули до амінокислотного залишку фермента може модифікувати активність останнього Типи ковалентної модифікації: -фосфорилювання; -ацетилювання; -карбоксилювання і ін. Фосфорилювання Реакція дефосфорилювання Як правило, фосфорильовані ферменти є більш активні Ферменти, відповідальні за фосфорилювання - протеїнкінази Ферменти, відповідальні за дефосфорилювання – фосфатази

Протеолітична активація

• Багато ферментів синтезуються як неактивні попередники (зимогени) і активуються протеолітичним розщепленням Приклади специфічного протеолізу

•Ферменти травлення –синтезуються як зимогени в шлунку і підшлунковій залозі

•Ферменти згортання крові –каскад протеолітичної активації

•Деякі білкові гормони –проінсулін в інсулін шляхом видалення пептиду

Проферменти. або проензімов. зімогени. ензімогени - функціонально неактивні попередники ферментів. піддаються тим чи іншим перетворенням (зазвичай розщепленню специфічними ендо- або екзопептідази або гідролізу), в результаті чого утворюється каталитически активний продукт - фермент. Відносяться до групи протеїназ (серинові, тіоловою, кислі). Синтез зімогенов здійснюється на рибосомах ендоплазматичної особливими секреторними клітинами у вигляді зімогенов гранул, які після завершення процесу мігрують до поверхні клітин і потім секретуються в навколишнє середовище. Досягнувши місця дії вони перетворюються в активні форми ферментів. До них відносяться пепсиноген. активною формою якого є пепсин (основний протеолітичний фермент шлункового соку), трипсиноген - трипсин. хімотріпсіноген - хімотрипсин, прокарбоксілепептідази - карбоксипептидази (ферменти підшлункової залози) і ін. До зімогенов відносяться ферменти згортання крові (фактори згортання крові), компоненти і фактори системи комплементу.

Рівняння Лайнвівера — Берка відображає залежність 1/V₀ від 1/[S]:

Графік цього рівняння відкладається у координатах і є лінійним. Він дозволяє легко отримати значення кінетичних констант V_max (перетин графіка із віссю 1/V₀ відповідає точці 1/V_max) та K_m (перетин графіка із віссю 1/[S] відповідає точці -1/ K_m) Тангенскута нахилу прямої становить K_m/V_max. Отримані значення будуть досить неточними, оскільки обернені графіки типу Лайнівера — Берка візуально спотворюють значення похибок вимірювань, тому в сучасних обчисленнях використовують частіше чисельні методи нелінійної регресії для прямого рівняння Міхаеліса — Ментен.

Оброблюючи рівняння Міхаеліса-Ментена методом подвійних зворотних величин можна отримати рівняння прямої лінії типу у=ах+b, а саме:

Однак слід зазначити, що при використанні графіка Лайнуівера-Берка точки в області високих концентрацій субстрату розташовуються надто густо, а положення прямої лінії багато в чому залежить від точок в області низьких концентрацій субстрату, де визначення швидкості менш надійно. Крім того, реальні експериментальні дані не завжди адекватно апроксимуються у вигляді прямої лінії.

Зворотні і незворотні інгібітори

Зворотні інігібітори – після зв’язування з ферментом (утворення EI комплексу) швидко дисоціює Фермент пригнічений тільки коли зв’язаний з інгібітором EI комплекс утримується разом за допомогою слабких нековалентних зв’язків Три типи зворотнього інгібування: Конкурентне, Неконкурентне, Безконкурентне

Конкурентне гальмування

•Інгібітор за структурою подібний до субстрату, тому зв ’язується з тим самим активним центром •Фермент не може розрізнити інгібітор і субстрат

•Приєднання інгібітора до активного центру попереджує зв’язування субстрату

•Конкурентний інгібітор знижує швидкість каталізу зменшуючи кількість молекул ферменту, зв’язаних із субстратом

•Інгібітор може бути витіснений з активного центру шляхом збільшеня концентрації субстрату Зворотнє інгібування

Конкурентні інгібітори - здатні зв’язуватись з E, але не з ES. При конкурентному інгібуванні зростає KM (тобто, інгібітор перешкоджає зв’язуванню субстрату), але не впливає на Vmax (оскільки інгібітор не перешкоджає каталізу в фермент-субстратному комплексі).

Бензамідин конкурує з аргініном за зв ’ язування з трипсином

Неконкурентне гальмування

• Інгібітор приєднується не до активного центру, а до іншої ділянки ферменту

• Інгібітор і субстрат можуть зв’язуватися з ферментом в один і той же час

•Інгібітор може зв’ язуватися як з ферментом (EI) , так і з фермент-субстратним комплексом (ESI) •Інгібітор не може бути витіснений шляхом збільшення концентрації субстрату

Неконкуренті інгібітори мають ідентичну спорідненість до E і ES (Ki = Ki '). Неконкурентне інгібування не змінює KM (оскільки не перешкоджає зв’язуванню субстрату), але знижує Vmax (оскільки зв’язування інгібітора заважає каталізу).

Багато лікарських засобів є конкурентними інгібіторами ключових ферментів • Статинові препарати (ловастатин, симвастатин), що використовується для зниження холестерину крові конкурентно гальмують3-гідрокси-3-метилглутарил кофермент А (HMG CoA) редуктазу в біосинтезі холестерину. • Метотрексат, протипухлинний засіб препарат, конкурентно інгібує дигідрофолат редуктази, позбавляючи клітини активного фолата, необхідного для синтезу пуринів і дезокситимидину, що перешкоджає реплікації ДНК під час фази S. Приклад неконкурентного інгібітора є аллопуринол, який неконкурентно інгібує ксантин оксидазу

Безконкурентне гальмування

• Інгібітор приєднується до ES але не до вільного E

• Зустрічаться тільки в мультисубстратних реакціях

Незворотнє Інгібування дуже повільна дисоціація EI комплекса Міцно зв’язуються ковалентними зв’ язками з ферментом

Незворотні інгібітори

•інгібітори специфічні до груп амінокислотних залишків

•аналоги субстратів

•суїцидні інгібітори

Суїцидні інгібітори

•Інгібітор зв ’язується як субстрат і спочатку ініціює нормальний каталітичний механізм

•Потім утворюються хімічно реактивні сполуки, що інактивують фермент ковалентною модифікацію •”Суїцидний” тому що фермент сам бере участь в своєму інактивуванні

Активатор ферменту - це молекула, яка зв'язується з ферментом і підвищує його активність. У цих двох останніх випадках Км може зменшитися або Vmax може збільшуватися, але крива завжди буде нижче контролю.

5. Класифікація ферментів, характеристика окремих класів.

Каталізована хімічна реакція є тією специфічною ознакою, за якою один фермент відрізняється від іншого. Тому класифікація і номенклатура ферментів ґрунтується на цьому принципі. Сучасна класифікація ферментів (шифр – КФ – класифікація ферментів або ЕС – Enzym Comission Code) розроблена спеціальною Комісією Міжнародного Біохімічного Союзу.

У основі класифікації лежать три положення:

1) усі ферменти поділять на 6 класів за типом каталізованої реакції;

2) кожен фермент отримує систематичну назву, що включає назву субстрату, тип каталізованої реакції, і закінчення "аза"; крім того, Комісією були збережені і узаконені тривіальні назви. Таким чином, виникла подвійна система найменування ферментів;

3) кожному ферменту привласнюється чотиризначний шифр (код). Перше число вказує на клас ферментів, друге – підклас, третє – підпідклас, четверте – порядковий номер ферменту в підпідкласі.

Наприклад, алкогольдегідрогеназа (КФ.1.1.1.1): перша цифра – 1 – означає клас оксидоредуктази, друга цифра – 1 – підклас дегідрогенази (діє на СН–ОН-групу донорів), третя цифра – 1 – підпідклас анаеробна дегідрогеназа (акцептором служить НАД+ або НАДФ+), четверта цифра – 1 – конкретний фермент алкогольдегідрогеназа.

Або α-амілаза (КФ.3.2.1.1): перша цифра – 3 – клас гідролаз, друга цифра – 2 – підклас карбогідрази, третя цифра – 1 – підпідклас поліаз, четверта цифра – 1 – конкретний фермент α-амілаза.

Сучасна міжнародна класифікація ферментів поділяє усі ферменти на 6 основних класів:

1 клас (КФ 1) – оксидоредуктази – ферменти, що каталізують окиснювально-відновні реакції (приєднання О2, видалення і перенесення Н2, перенесення електролітів);

2 клас (КФ 2) – трансферази – ферменти перенесення; каталізують перенесення цілих атомних угрупувань з однієї сполуки на іншу (наприклад, залишків моносахаридів, амінокислот, залишків фосфорної кислоти, метильних і амінів груп і т.д.);

3 клас (КФ 3) – гідролази – ферменти, що каталізують реакції гідролізу, тобто розщеплення складних органічних сполук на простіші за участю води.

4 клас (КФ 4) – ліази – ферменти, що каталізують реакції негідролітичного відщеплення яких-небудь груп від субстрату з утворенням подвійного зв'язку або приєднання угрупувань за місцем розриву подвійного зв'язку (наприклад, Н2О, СО2, NH3 і т.д.);

5 клас (КФ 5) – ізомерази – ферменти, що каталізують реакції ізомеризації, тобто внутрішньомолекулярного перенесення хімічних угрупувань і утворення ізомерних форм різних органічних сполук;

6 клас (КФ 6) – лігази (синетази) – ферменти, що каталізують реакції синтезу, пов'язані з розривом високоенергетичного зв'язку АТФ й інших нуклеозидтрифосфатів (в такому випадку можливе утворення С–С–; С–S–; С–О–; і C–N–зв'язків).

НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТІВ

Назва у ферментів є досить складною і складається з декількох частин:

1) назва субстрату (тобто речовини, на яку діє фермент);

2) назва типу ферментативної реакції, що каталізує фермент;

3) назва продукту реакції та її учасників;

4) до назви ферменту додають закінчення -аза.

Наприклад, у печінці є фермент, що каталізує розщеплення глюкозо-6-фосфату на вільну глюкозу та фосфатну кислоту.

Глюкоза-6-фосфат-фосфогідролаза

В цій назві:

1) назва субстрату – глюкоза-6-фосфат;

2) назва продукту реакції – фосфорна кислота;

3) тип реакції – гідроліз;

4) додається закінчення -аза.

В практиці збереглись і другі назви ферментів, що називаються тривіальними: пепсин, амілаза, трипсин. До них відносяться гідролітичні ферменти шлунково-кишкового тракту.

6. Дослідження активності ферментів. Ензимопатії. Принцип ензимодіагностики. Ензимотерапія.

Дослідження активності ферментів

В основі багатьох захворювань лежать порушення нормального функціонування ферментативних процесів. Зміни в специфічних ферментативних реакціях можна кваліфікувати як причину або наслідок різних патологічних станів. Кількість ферменту визначають за його дією на субстрат і називають активністю. Про активність ферментів свідчать такі критерії:

1 кількість субстрату, перетвореного в одиницю часу за постійних умов;

2 кількість кінцевих продуктів реакції, що утворилися в одиницю часу за постійних умов;

3 час який, необхідний для перетворення певної кількості субстрату за постійних умов.

З цією метою використовують різні методи дослідження: спектрофотометричні, полярографічні, манометричні, хроматографічні та ін.

Мірою активності ферментів є умовні одиниці за міжнародну одиницю (МО) прийнята така кількість ферменту, яка каталізує перетворення 1 мкМ субстрату за 1 хв.

Ензимопатологія вивчає стан ферментативної активності в нормі й патології. Встановлено, що багато спадкових захворювань є наслідком дефекту якогось ферменту.

Причинами ензимопатій можуть бути:

1 відсутність, дефіцит або аномальна структура ферменту, апоферменту, коферменту, матриць ДНК і РНК;

2 порушення енергозабезпеченнядефіцит АТФ, ГТФ;

3 дефіцит вітамінів, мікроелементів, есенціальних жирних кислот;

4 порушення температурного і рНоптимумів;

За проявом ензимопатії поділяють на: Безсимптомні; Відносно безсимптомні; Клінічні-ензимопатії.

Приклад ензимопатій є галактоземія – спадкове захворювання, ,що проявляється підвищенням концентрації галактози в крові, розвивається внаслідок спадкового дефекту синтезу ключового ферменту – галактозофосфат-уридил-трансферази, який каталізує перетворення галактози в глюкозу.

.Ензимодіагностика. Значна роль відводиться ферментам у діагностиці захворювань. Використання їх із цією метою пов'язане з тим, що кожен орган або тканина має характерний для них спектр (набір) ферментів та поява їх у крові надає змогу діагностувати патологію. Також причиною використання ферментів у діагностиці є те, що в організмі здорової людини підтримується стан динамічної рівноваги між процесами анаболізму та катаболізму. Тому вміст у крові ферментів є величиною відносно постійною, а збільшення або зниження активності ферментів у ній свідчать про наявність патологічних процесів.

Приклад. При інфаркті міокарда відзначається суттєве збільшення активності аспартатамінотрансфераза (АСТ), креатинкіназа (КК), лактатдегідрогеназа (ЛДГ-1), при захворюванні печінки збільшується активність аланінамінотранс-фераза (АЛТ), альдолази, ЛДГ-4 та ЛДГ-5.

Ензимотерапія — використання ферментів як лікарських засобів проводиться переважно в разі нестачі в організмі якогось ферменту, коферменту або як допоміжний засіб при деяких захворюваннях. Засоби замісної терапії використовують досить давно. Передусім це ферменти шлункового соку (пепсин, абомін) та підшлункової залози (панкреатин), а також багатокомпонентні препарати, що містять у своєму складі ферменти, які чинять комплексний вплив на білки, жири, вуглеводи (фестал, панзинорм, дигестал, онотон, ктазим, комбіцин). їх застосовують для поліпшення функціонального стану травного каналу та нормалізації процесів травлення.

7. Суть і призначення обміну речовин. Стадії, специфічні і спільні шляхи.

Обмін речовин включає процеси споживання, нагромадження, перетворення, використання і видалення речовин і енергії, завдяки чому живі організми ростуть, розвиваються, розмножуються в умовах навколишнього середовища, а також пристосовуються до його постійних змін.

Використання терміна «метаболізм» може бути в більш розширеному контексті й означати сукупність усіх реакцій від моменту надходження поживних речовин до утворення та виведення кінцевих продуктів обміну. В цьому випадку метаболізм передбачає такі послідовні стадії):
1 2 3

скачати