Електрофорез з одномолекулярним гель (SCGE) / комет, розроблений Н.П. Сингх1 , поєднує в собі простоту біохімічних прийомів для виявлення перерв ДНК з однорідними ланцюгами (відверті розриви ланцюгів та неповні ділянки для регенерації ексцизій), лужно-лабільні ділянки та зшивання з одним клітинним підходом, характерним для цитогенетичних аналізів. Переваги технології SCGE включають в себе: (1) збір даних на рівні окремої клітини, що дозволяє більш надійні види статистичного аналізу; (2) потреба в невеликій кількості клітин на вибірку (<10 000); (3) його чутливість для виявлення пошкодження ДНК; і (4) що практично будь-яка еукаріотична клітинна популяція піддається аналізу.
Нижче наведено робочий протокол, який можна використовувати для виявлення пошкоджень ДНК:
Підготовка препаратів:
Матеріали
Диметилсульфоксид (ДМСО)
Етилендіамінтетраоцтова кислота(ЕДТА)
Етидій бромід
Histopague
Фосфат буферний фізіологічний розчин (PBS) (Ca ++, Mg ++ вільні )
Хлорид натрію (NaCl)
Гідроксид натрію (NaOH)
Triton X-100
PBS (Ca ++, Mg ++ free): пакет PBS з Dulbecco - 1 L: додати 990 мл dH2O, відрегулювати рН до 7,4, q.s. (достатня кількість) до 1000 мл, зберігати при кімнатній температурі.
Лізис буфер: Інгредієнти на 1000 мл. : 2,5М NaCl – 146.1г ; 100mM EDTA – 37.2 gm/ 10mM Trizma base 1.2 gm
Додайте інгредієнти до приблизно 700 мл dH2O і починайте помішувати суміш. Додайте
8 г NaOH і дайте розчинити суміш (приблизно 20 хвилин). Відрегулюйте рН до 10,0, використовуючи концентровану НСІ або NaOH. q.s. до 890 мл з dH2O (Triton X-100 та DMSO збільшить об'єм до потрібної кількості), зберігати при кімнатній температурі.
Остаточний розчин лізису: додають свіжий 1% Трітон Х-100 та 10% ДМСО, а потім охолоджують принаймні 30 хвилин до додавання слайдів.
ПРИМІТКА. Мета ДМСО в розчині лізингу полягає в знятті радикалів, утворених залізом, що виділяється з гемоглобіну, коли використовують тканини крові або тварин. Це не потрібне в інших ситуаціях або де слайди будуть зберігатися в лізингу лише протягом короткого часу.
Буфер для електрофорезу (300мМ NaOH / 1мМ EDTA):
Готують з основних розчинів: 1. 10 N NaOH (200 г / 500 мл dH2O) 2. 200мМ ЕДТА (14,89г / 200мл дН2О, рН 10)
Зберігати як при кімнатній температурі. Ми готуємо вихідні розчини NaOH та EDTA кожні 2 тижні. Для буфера 1X (зроблено свіжо перед кожним електрофорезом): на літр, додають 30 мл NaOH і 5,0 мл EDTA, q.s. до 1000 мл, добре перемішати. Загальний обсяг залежить від ємності коробки гелю. Перед використанням вимірюйте рН буфера, щоб забезпечити> 13.
Нейтралізаційний буфер: 0,4 М трис - 48,5 г додано до
800 мл dH2O, відрегулюйте рН до 7,5 концентрованим (> 10 М) НСl: q.s. до 1000 мл з dH2O, зберігати при кімнатній температурі.
Електрофорез з одномолекулярним гель (SCGE) / комет, розроблений Н.П. Сингх1 , поєднує в собі простоту біохімічних прийомів для виявлення перерв ДНК з однорідними ланцюгами (відверті розриви ланцюгів та неповні ділянки для регенерації ексцизій), лужно-лабільні ділянки та зшивання з одним клітинним підходом, характерним для цитогенетичних аналізів. Переваги технології SCGE включають в себе: (1) збір даних на рівні окремої клітини, що дозволяє більш надійні види статистичного аналізу; (2) потреба в невеликій кількості клітин на вибірку (<10 000); (3) його чутливість для виявлення пошкодження ДНК; і (4) що практично будь-яка еукаріотична клітинна популяція піддається аналізу.
Нижче наведено робочий протокол, який можна використовувати для виявлення пошкоджень ДНК:
Підготовка препаратів:
Матеріали
Диметилсульфоксид (ДМСО)
Етилендіамінтетраоцтова кислота(ЕДТА)
Етидій бромід
Histopague
Фосфат буферний фізіологічний розчин (PBS) (Ca ++, Mg ++ вільні )
Хлорид натрію (NaCl)
Гідроксид натрію (NaOH)
Triton X-100
PBS (Ca ++, Mg ++ free): пакет PBS з Dulbecco - 1 L: додати 990 мл dH2O, відрегулювати рН до 7,4, q.s. (достатня кількість) до 1000 мл, зберігати при кімнатній температурі.
Лізис буфер: Інгредієнти на 1000 мл. : 2,5М NaCl – 146.1г ; 100mM EDTA – 37.2 gm/ 10mM Trizma base 1.2 gm
Додайте інгредієнти до приблизно 700 мл dH2O і починайте помішувати суміш. Додайте
8 г NaOH і дайте розчинити суміш (приблизно 20 хвилин). Відрегулюйте рН до 10,0, використовуючи концентровану НСІ або NaOH. q.s. до 890 мл з dH2O (Triton X-100 та DMSO збільшить об'єм до потрібної кількості), зберігати при кімнатній температурі.
Остаточний розчин лізису: додають свіжий 1% Трітон Х-100 та 10% ДМСО, а потім охолоджують принаймні 30 хвилин до додавання слайдів.
ПРИМІТКА. Мета ДМСО в розчині лізингу полягає в знятті радикалів, утворених залізом, що виділяється з гемоглобіну, коли використовують тканини крові або тварин. Це не потрібне в інших ситуаціях або де слайди будуть зберігатися в лізингу лише протягом короткого часу.
Буфер для електрофорезу (300мМ NaOH / 1мМ EDTA):
Готують з основних розчинів: 1. 10 N NaOH (200 г / 500 мл dH2O) 2. 200мМ ЕДТА (14,89г / 200мл дН2О, рН 10)
Зберігати як при кімнатній температурі. Ми готуємо вихідні розчини NaOH та EDTA кожні 2 тижні. Для буфера 1X (зроблено свіжо перед кожним електрофорезом): на літр, додають 30 мл NaOH і 5,0 мл EDTA, q.s. до 1000 мл, добре перемішати. Загальний обсяг залежить від ємності коробки гелю. Перед використанням вимірюйте рН буфера, щоб забезпечити> 13.
Нейтралізаційний буфер: 0,4 М трис - 48,5 г додано до
800 мл dH2O, відрегулюйте рН до 7,5 концентрованим (> 10 М) НСl: q.s. до 1000 мл з dH2O, зберігати при кімнатній температурі.Електрофорез з одномолекулярним гель (SCGE) / комет, розроблений Н.П. Сингх1 , поєднує в собі простоту біохімічних прийомів для виявлення перерв ДНК з однорідними ланцюгами (відверті розриви ланцюгів та неповні ділянки для регенерації ексцизій), лужно-лабільні ділянки та зшивання з одним клітинним підходом, характерним для цитогенетичних аналізів. Переваги технології SCGE включають в себе: (1) збір даних на рівні окремої клітини, що дозволяє більш надійні види статистичного аналізу; (2) потреба в невеликій кількості клітин на вибірку (<10 000); (3) його чутливість для виявлення пошкодження ДНК; і (4) що практично будь-яка еукаріотична клітинна популяція піддається аналізу.
Нижче наведено робочий протокол, який можна використовувати для виявлення пошкоджень ДНК:
Підготовка препаратів:
Матеріали
Диметилсульфоксид (ДМСО)
Етилендіамінтетраоцтова кислота(ЕДТА)
Етидій бромід
Histopague
Фосфат буферний фізіологічний розчин (PBS) (Ca ++, Mg ++ вільні )
Хлорид натрію (NaCl)
Гідроксид натрію (NaOH)
Triton X-100
PBS (Ca ++, Mg ++ free): пакет PBS з Dulbecco - 1 L: додати 990 мл dH2O, відрегулювати рН до 7,4, q.s. (достатня кількість) до 1000 мл, зберігати при кімнатній температурі.
Лізис буфер: Інгредієнти на 1000 мл. : 2,5М NaCl – 146.1г ; 100mM EDTA – 37.2 gm/ 10mM Trizma base 1.2 gm
Додайте інгредієнти до приблизно 700 мл dH2O і починайте помішувати суміш. Додайте
Буфер для електрофорезу (300мМ NaOH / 1мМ EDTA):
Нейтралізаційний буфер: 0,4 М трис - 48,5 г додано до
Розчин для фарбування: етидій бромід (EtBr; 10X запас - 20 мкг / мл): додати 10 мг в 50 мл dH2O, зберігати при кімнатній температурі. Для 1X складу - змішати 1 мл з 9 мл dH2O.
1. Підготуйте 1% (500мг на 50мл ФБР) і 0,5% LMPA (250мг на 50мл ПБС) та 1,0% NMA (500мг на 50мл у воді Міллі Q). Мікрохвильова піч або нагрівають до повного кип'ятіння, а агароза розчиняється. Для LMPA аліквотно 5 мл зразки в сцинтиляційні флакони (або інші відповідні контейнери) і охолоджувати до необхідного. При необхідності коротко розтопити агарозу в мікрохвильовій печі або іншим відповідним методом. Помістіть флакон LMPA у суха / водяну баню 37 ºC для охолодження та стабілізації температури.
2. Занурте ковзання в метанол і згоріть їх над блакитним полум'ям, щоб видалити масло машини та пил.
3. Поки агароза НМА гаряче, посуньте звичайні ковзання до однієї третини області матухи та обережно видаліть (2). Протріть нижню частину слайда, щоб видалити агарозу, і засуньте слайдер в лотку на рівній поверхні. Слайдери можна сушити повітрям або нагрітись при 500 ° С для швидшої сушки. Зберігайте слайди при кімнатній температурі до необхідного часу; уникати високих умов вологості. Ми зазвичай готуємо слайди за день до використання.
Електрофорез слайдів Microgel
Описана процедура є для електрофорезу при рН> 13 лужних умов.
1. Після принаймні 2 години при температурі 4 ° С, обережно зніміть слайди з розчину лізингу. Покладіть ковзання біля одного боку на горизонтальну коробку гелю біля одного кінця, ковзаючи їх як можна ближче один до одного.
2. Заповніть буферні резервуари зі свіжовиробленим буфером pH> 13 електрофорезу, поки рівень рідини повністю не покриє слайди (уникайте бульбашок над агарозою).
3. Нехай слайди сидять у лужному буфері протягом 20 хвилин, щоб дозволити розкручування ДНК та вираження лужно-лабільного пошкодження.
ПРИМІТКА. Чим довше виявляється дію на лугу, тим більше вираз лужно-лабільного пошкодження.
4. Увімкніть живлення до 24 вольт ( 0.74 В / см) і відрегулюйте струм до 300 міліамперів, збільшивши або зменшивши рівень буфера. Залежно від мети дослідження та за ступенем міграції у контрольних зразках, електрофорез слайдів протягом 30 хвилин.
ПРИМІТКА. Мета полягає в тому, щоб отримати міграцію між клітинками керування без надмірного використання.
Тривалість оптимального електрофорезу відрізняється для різних типів клітин. Якщо поперечне зшивання є одним з кінцевих точок, що оцінюються, то корисно використовувати контроль, що містить приблизно 25% міграції ДНК. Низька напруга, амплітуда струму та тривалість електрофорезу можуть забезпечити підвищену чутливість.
Різні коробки для гелю потребують різного рівняння напруги, щоб виправити відстань між анодом і катодом.
5. Вимкніть живлення. Обережно підніміть ковзання з буфера і покладіть на сливний лоток. Знизьте слайди за допомогою нейтралізаційного буфера, нехай сидять принаймні 5 хвилин. Злийте слайди і повторіть ще два рази.
6. Слайд може бути забарвлений 80 мкл 1X етидій бромідом, залиште протягом 5 хв, а потім занурюють у охолоджену дистильовану воду, щоб видалити зайві плями. Покривний матеріал розміщують над ним, а слайди зараховують одразу або висушують перед фарбуванням, як на етапі 7.
7. Злийте слайди, тримайте їх протягом 20 хвилин холодним 100% етанолом або холодним 100% метанолом для
зневоднення Повітря сушіть ковзання та помістіть їх у духовку при 500 ° С протягом 30 хв. Зберігати в сухому приміщенні.
8. Коли це зручно, повторно змішайте слайди з охолодженою дистильованою водою протягом 30 хвилин і забарвлюйте EtBr, як на етапі 6, і покрийте свіжою покривкою. Перш ніж переглядати слайди, зніміть зайву рідину на спині та краях. Після забиття, зніміть покривну плівку, промийте 100% алкоголем, щоб видалити забарвлення, залиште висушування та зберігайте для архівних цілей, якщо потрібно.
ПРИМІТКА. Виконайте кроки 1-4 під жовтим / затемненим світлом. Це запобігає пошкодженню ДНК, який може виникнути в результаті флуоресцентного білого світла.