Міністерство охорони здоров’я України
Національний медичний університет імені О.О. Богомольця
МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
до практичних занять для студентів з теми:
«СКЛАДНІ МЕТОДИ ФАРБУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ. МЕТОД ГРАМА»
Навчальна дисципліна
«МІКРОБІОЛОГІЯ, ВІРУСОЛОГІЯ (З ОСНОВАМИ ІМУНОЛОГІЇ)»
Освітній рівень «Магістр»
Галузь знань 22 «Охорона здоров’я»
Спеціальність 222 «Медицина»
Кафедра мікробіології, вірусології та імунології
Затверджено на засіданні кафедри мікробіології, вірусології та імунології від ________202_р., протокол №___
Завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології академік НАН та НАМН України, професор ____________________ Широбоков В.П.
Розглянуто та затверджено: ЦМК з гігієнічних дисциплін від _________ 202_ р. , протокол №__
Тема заняття: «Складні методи фарбування мікроорганізмів. Метод Грама»
Компетенції:
- загальні:
ЗК 2. Здатність вчитися і оволодівати сучасними знаннями.
ЗК 3. Здатність застосовувати знання у практичних ситуаціях.
ЗК 4. Знання та розуміння предметної області та розуміння професійної діяльності.
ЗК 5. Здатність до адаптації та дії в новій ситуації.
ЗК 6. Здатність приймати обґрунтовані рішення.
ЗК 9. Здатність спілкуватися державною мовою як усно, так і письмово.
ЗК 12. Визначеність і наполегливість щодо поставлених завдань і взятих обов’язків.
- спеціальні (фахові, предметні):
ФК 2. Здатність до визначення необхідного переліку лабораторних та інструментальних досліджень та оцінки їх результатів.
ФК 11. Здатність розв’язувати медичні проблеми у нових або незнайомих середовищах за наявності неповної або обмеженої інформації з урахуванням аспектів соціальної та етичної відповідальності..
ФК 13. Здатність до проведення санітарно-гігієнічних та профілактичних заходів.
ФК 14. Здатність до планування і проведення профілактичних та протиепідемічних заходів щодо інфекційних хвороб.
ФК 20. Здатність до проведення епідеміологічних та медико-статистичних досліджень здоров’я населення; обробки соціальної, економічної та медичної інформації.
Мета. Ознайомитися із складними методами фарбування мікроорганізмів. Вивчити відмінності у будові клітинної стінки різних груп мікроорганізмів. Засвоїти техніку фарбування за Грамом, використовуючи культури грампозитивних та грамнегативних бактерій, вивчити властивості грампозитивних та грамнегативних бактерій.
Кількість аудиторних годин: 3 години.
Обладнання: мікроскопи лабораторні, біологічні «БИОЛАМ» (LOMO) × 1350 крат, спиртівка, бактеріологічні петлі, шпателі та голки; предметні та покривні скельця, промивалка з водою, вата, олівець по склу або маркер; фільтрувальний папір, дезінфікуючий розчин, набір барвників, скляний місток, ємність для фарбування препаратів, імерсійна олія.
План та організаційна структура заняття
| Назва етапу | Опис етапу | Рівні засвоєння | Час |
| 1. Підготовчий етап | | | 45 хв. |
| 1.1. Організаційні питання | Викладач перевіряє присутність студентів на занятті та оцінює наявність відповідної форми одягу | | 10 хв. |
| 1.2. Ознайомлення з темою заняття та формування мотивації | Викладач формулює тему практичного заняття та її значення для подальшого вивчення мікробіології, вірусології та імунології і професійної діяльності лікаря, щоб сформувати мотивацію для цілеспрямованої навчальної діяльності. Викладач наголошує про те, що метод фарбування бактерій за Грамом відноситься до складних методів. Складні методи застосовують для вивчення структури бактеріальних клітин, а також для диференціації одних мікроорганізмів від інших. Отже, вони мають важливе диференційно-діагностичне значення в мікробіології. Серед складних методів фарбування метод Грама є найбільш поширеним. При фарбуванні бактерій цим методом їх можна поділити на дві групи: грамнегативні та грапозитивні. Особливості фарбування за Грамом враховуються, поряд з іншими властивостями, при визначенні виду бактерій. | 1, 2 | 10 хв. |
| 1.3. Контроль і оцінка початкового рівня підготовки | Студенти виконують тестові завдання, вирішують ситуаційні задачі, викладач проводить усне опитування за стандартизованим переліком питань, аналізуючи найбільш важливі теоретичні та практичні питання. Зокрема, студенти вивчають властивості грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів, записують тинкторіальні властивості окремих груп мікроорганізмів, вивчають фактори, що впливають на фарбування методом Грамом, вивчають особливості хімічного складу клітинної стінки грампозитивних та грамнегативних бактерій. | 1,2 | 25 хв. |
| 2. Основний етап. | | | 60 хв. |
| 2.1. Проведення практичних робіт | Цей етап передбачає проведення студентами запланованих досліджень, визначення результатів, їх оцінка, запис протоколу досліджень за встановленою формою. Рекомендується така послідовність проведення робіт. 1. Студенти записують у протокол заняття тему та план заняття. 2. Під керівництвом викладача готують бактеріальні препарати із чистих культур коків та паличок. 3. Фарбують за методом Грама. 4. Мікросокпують виготовлені препарати із використанням імерсійного об’єктиву, порівнюють тинкторіальні властивості грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів окремих груп мікроорганізмів. | 2,3 | 30 хв. |
| 2.2. Оформлення протоколу | Виконані завдання студенти записують у протокол. | 2,3 | 20 хв. |
| 2.2. Аналіз результатів дослідження та їх оцінка. | Студенти обговорюють результати дослідження та формулюють висновки, які записують у протокол. | 2,3,4 | 10 хв. |
| 3. Заключний етап. | | | 35 хв. |
| 3.1. Контроль кінцевого рівня підготовки та його оцінювання. | Викладач перевіряє оформлення протоколу та в індивідуальній бесіді з кожним студентом встановлює кінцевий рівень набутих знань з основних і найбільш важливих теоретичних та практичних питань та підписує протоколи студентів. | 3,4 | 25 хв. |
| 3.2. Загальна оцінка навчальної діяльності студента. | Викладач повідомляє кожному студенту про загальну оцінку його підготовки та роботи на занятті, виставляє оцінку у журнал обліку відвідувань і успішності студентів. Староста групи заносить оцінки у відомість обліку успішності і відвідування занять студентами, а викладач завіряє їх своїм підписом | | 5 хв. |
| 3.3. Інформування студентів про тему | Викладач інформує студентів про тему та план наступного практичного заняття, особливості підготовки | | 5 хв. |
Теоретичні питання до заняття:
Складні методи фарбування бактерій.
Метод Грама.
Механізм фарбування за Грамом.
Методика фарбування за Грамом.
Властивості грампозитивних та грамнегативних бактерій.
Тинкторіальні властивості окремих груп мікроорганізмів
Рекомендації для оформлення протоколу
«Складні методи фарбування мікроорганізмів. Метод Грама»
ВЛАСТИВОСТІ ГРАМПОЗИТИВНИХ ТА ГРАМНЕГАТИВНИХ МІКРООРГАНІЗМІВ
| ГРАМПОЗИТИВНІ | ГРАМНЕГАТИВНІ |
| Не чутливі до дії пепсину, трипсину, панкреатину. | Перетравлюються ферментами шлунково-кишкового тракту. |
| Чутливі до лізоциму, пеніциліну. | Мало чутливі. |
| Слабо виражені імуногенні властивості. | Добре виражені імуногенні властивості. |
| Можуть бути кислотостійкими. | Чутливі до дії кислот. |
| Можуть утворювати ендоспори. | Ендоспор не утворюють. |
| Фімбрій не мають. | Можуть мати фімбрії. |
| Можуть утворювати екзотоксин. | Рідко продукують екзотоксин. При руйнуванні клітин виділяється ендотоксин. |
ТИНКТОРІАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ДЕЯКИХ МІКРООРГАНІЗМІВ
| ГРАМПОЗИТИВНІ | ГРАМНЕГАТИВНІ |
| 1. Стафілокок. 2. Стрептокок. 3. Коринебактерії дифтерії. 4. Мікобактерії туберкульозу. 5. Збудник правця. 6. Збудник газової гангрени. 7. Збудник ботулізму. 8. Актиноміцети. | 1. Менінгококи. 2. Гонококи. 3. Кишкова паличка. 4. Сальмонели. 5. Шигели. 6. Збудник чуми. 7. Збудник туляремії. 8. Холерний вібріон. |
ФАКТОРИ, ЩО ВПЛИВАЮТЬ НА ФАРБУВАННЯ БАКТЕРІЙ ЗА ГРАМОМ
1. Клітинна стінка грампозитивних бактерій містить до 90% пептидоглікану (глікопептиду, муреїну), містить тейхоєві кислоти. Муреїн багатошаровий. У грампозитивних бактерій, проникність клітинної стінки нижча, ніж у грамнегативних бактерій. Комплекс генціанвіолет-йод утримується в стінці після дії спирту, оскільки при цьому зменшується діаметр пор в глікопептиді. Стінка грамнегативних бактерій містить глікопептиду значно менше, його молекула “зшита” слабкіше порівняно з стінкою грампозитивних бактерій. Вважають, що після обробки етиловим спиртом пори в молекулі глікопептиду грамнегативних бактерій залишаються широкими, що дозволяє екстрагувати комплекс генціанвіолет-йод.
2. У грампозитивних бактерій виявлено велику кількість рибонуклеїнату магнію (співвідношення РНК:ДНК у грампозитивних бактерій дорівнює 8:1, а у грамнегативних бактерій 1:1). Вважають, що рибонуклеїнат магнію утворює великі стійкі комплекси з барвником і йодом, які не вимиває спирт.
3. Відмінність в кислотності білків цитоплазми у грампозитивних та грамнегативних бактерій. Ізоелектрична точка білків цитоплазми грампозитивних бактерій знаходиться в межах рН 4-5, у грамнегативних бактерій – в межах рН 5-6. Кислі білки грампозитивних бактерій мають спорідненість до основних анілінових барвників, утворюють з йодом та генціанвіолетом більш стійкі до дії спирту комплекси.
ОСОБЛИВОСТІ ХІМІЧНОГО СКЛАДУ КЛІТИННОЇ СТІНКИ ГРАМПОЗИТИВНИХ ТА ГРАМНЕГАТИВНИХ БАКТЕРІЙ
| ГРАМПОЗИТИВНІ | ГРАМНЕГАТИВНІ |
| 1. У клітинній стінці мало білків, а пептиди одноманітні за складом амінокислот. | Клітинна стінка містить усі амінокислоти, містить білки. |
| 2. Ліпідів мало. | Ліпідів багато (до 22%). |
| 3. Пептидоглікану до 90%. | Пептидоглікану мало (5-9%). |
| 4. Містять тейхоєві кислоти. | Тейхоєві кислоти відсутні. |
СТРУКТУРНІ ОСОБЛИВОСТІ КЛІТИННИХ СТІНОК
| ГРАМПОЗИТИВНІ | ГРАМНЕГАТИВНІ | | |
| 1. Просто побудована клітинна стінка | 1. Клітинна стінка має складну структуру. | ||
| 2. Клітинна стінка складається з пептидоглікану. Товщина клітинної стінки 100-500А. | 2. Клітинна стінка багатошарова: внутрішній- глікопептид; середній- фосфоліпіди, ліпопротеїни, білки; зовнішній- ліпополісахариди. | ||
| 3. Пептидоглікан багатошаровий | 3. Один шар муреїну(пептидоглікану) | ||
| 4. Матрикс представлений полісахаридами (в тому числі тейхоєві кислоти) | 4. На пептидоглікановому каркасі зовні розміщуються ліпопротеїди, ліпополісахариди, фосфоліпіди. Тейхоєві кислоти не виявлені. | ||
Методика фарбування за Грамом.
На фіксований мазок наносять розчин генціанвіолету на 1-2 хв., після чого розчин зливають, не змиваючи його водою.
Наносять на мазок розчин Люголя на 1-2 хв.
Знебарвлюють мазок 96% спиртом протягом 15-20 сек.
Промивають водою.
Наносять на мазок розчин фуксину на 1-2 хв.
Промивають водою, висушують фільтрувальним папірцем.
Завдання 1. Приготувати бактеріальні препарати із коків, паличок та їх суміші, пофарбувати за Грамом, встановити морфологічні та тинкторіальні властивості.
Висновок:
Рекомендована література:
Основна:
Широбоков В. П. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія: підручник для студ. вищ. мед. навч. закл. / Видання 3-е перероблене і доповнене / [за гол.ред. Широбокова В.П.]. – Вінниця: Нова Книга, 2021. – С. 42-46.
Широбоков В.П., Климнюк С.І. Мікробіологія, вірусологія та імунологія в запитаннях і відповідях: навч. посіб. / [ За заг.ред Широбокова В.П. КлимнюкаС.І.]. – Тернопіль: ТДМУ, 2019. – С.14-16.
Широбоков В.П., Климнюк С.І. Практична мікробіологія: навчальний посібник / [За заг.ред.Широбокова В.П., Климнюка С.І.]. – Вінниця: Нова Книга, 2018. – С. 26-28.
Medical microbiology, virology, immunology: a textbook for English-speaking students of higher medical schools’ translations from ukr. Published / [T.V. Andrianova, V.V. Bobyr, etc.] ; Ed. by V.P. Shyrobokov. – Vinnytsia : Nova Knyha, 2019. – P.33-39.
Додаткова:
Медична мікробіологія. Посібник з мікробних інфекцій: патогенез, імунітет, лабораторна діагностика та контроль: 19 вид.: у 2 т. Том 2 / Майкл Р. Барер, Вілл Ірвінг, Ендрю Свонн, Нелюн Перера: наук. ред. пер.: С. Климнюк та ін. – К: ВСВ «Медицина». - 2020. – С. 9-24.
Питання для самопідготовки студента до заняття
Методика фарбування за Грамом.
Чому метод Грама називають диференційним?
Які особливості хімічного складу клітинної стінки грампозитивних та грамнегативних бактерій?
Які особливості будови клітинної стінки грампозитивних та грамнегативних бактерій?
Назвіть основні фактори, що впливають на забарвлення бактерій за Грамом.