Методичні рекомендації до практичних занять для студентів з теми: «Організація бактеріологічної лабораторії. Барвники І прості методи фарбування мікроорганізмів. Мікроскопія.»

Міністерство охорони здоров’я України
Національний медичний університет імені О.О. Богомольця
МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
до практичних занять для студентів з теми:
«Організація бактеріологічної лабораторії. Барвники і прості методи
фарбування мікроорганізмів. Мікроскопія. »
Навчальна дисципліна
«МІКРОБІОЛОГІЯ, ВІРУСОЛОГІЯ (З ОСНОВАМИ ІМУНОЛОГІЇ)»
Освітній рівень «Магістр»
Галузь знань 22 «Охорона здоров’я»
Спеціальність 222 «Медицина»
Кафедра мікробіології, вірусології та імунології
Затверджено на засіданні кафедри мікробіології, вірусології та імунології від
30.08. 2022 р., протокол № 2
Завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології академік НАН та
НАМН України, професор ____________________ Широбоков В.П.
Розглянуто та затверджено: ЦМК з гігієнічних дисциплін від _________ 202_ р. , протокол №__

2
Тема заняття: «Організація бактеріологічної лабораторії. Барвники і
прості методи фарбування мікроорганізмів. Мікроскопія»
Компетенції:
- загальні:
ЗК 1. Здатність вчитися і оволодівати сучасними знаннями.
ЗК 2. Здатність застосовувати знання у практичних ситуаціях.
ЗК 3. Знання та розуміння предметної області та розуміння професійної діяльності.
ЗК 4. Здатність до адаптації та дії в новій ситуації.
ЗК 5. Здатність приймати обґрунтовані рішення.
ЗК 6. Здатність спілкуватися державною мовою як усно, так і письмово.
ЗК 7. Визначеність і наполегливість щодо поставлених завдань і взятих обов’язків.
ЗК 8. Здатність діяти соціально відповідально та свідомо.
ЗК 9. Здатність діяти на основі етичних міркувань (мотивів).
-
спеціальні (фахові, предметні):
СК 10. Здатність до визначення необхідного переліку лабораторних досліджень та оцінки їх результатів.
СК 11. Здатність до проведення санітарно-гігієнічних, профілактичних та протиепідемічних заходів щодо інфекційних хвороб.
СК 12. Здатність до планування профілактичних та протиепідемічних заходів щодо інфекційних хвороб.
СК 13. Здатність застосовувати інтелектуальні можливості і знання під час роботи із пацієнтом.
СК 14. Здатність давати медико-етичну та правову оцінку конкретних випадків з позицій конфіденційності та лікарської таємниці при вирішенні ситуаційних задач у хворих на ВІЛ-інфекцію.
Мета.
• Дидактична мета: ознайомитись із структурою та функцією бактеріологічної лабораторії, її місцем в системі практичних лікувальних та діагностичних закладів охорони здоров’я, оволодіти методикою виготовлення бактеріальних препаратів із чистих культур бактерій з використанням простих методів фарбування, методів мікроскопії, що застосовуються при діагностиці різних інфекційних захворювань, засвоїти методики імерсійної мікроскопії бактеріальних препаратів.
• Кількість аудиторних годин: 3 години.
Обладнання: мікроскоп з освітлювачем, спиртівка, сірники, бактеріологічні петлі, шпателі та голки; предметні та покривні скельця, промивалка з водою, вата, олівець по склу або маркер; фільтрувальний папір, дезінфікуючий розчин, набір барвників, скляний місток, ємність для фарбування препаратів,
імерсійна олія.

3
Рис.1 Інвентар для проведення лабораторної роботи.
Рис.2 Бактеріологічні голка, шпатель та петлі: а – голка; б – шпатель; в-д – петлі
(в – правильно зроблені; г, д – неправильно зроблені
План та організаційна структура заняття
Назва етапу
Опис етапу
Рівні
засвоєння
Час
1.
Підготовчий
етап
45 хв.
1.1.
Організаційні питання
Викладач перевіряє присутність студентів на занятті та оцінює наявність відповідної форми одягу
10 хв.
1.2.
Ознайомлення з темою заняття та формування мотивації
Викладач формулює тему практичного заняття та її значення для подальшого вивчення мікробіології, вірусології та імунології і професійної діяльності лікаря, щоб сформувати мотивацію для цілеспрямованої навчальної діяльності.
Викладач наголошує, що мікробіологічні
1,2 10 хв.

4 лабораторії розташовуються в спеціальних науково-дослідних, науково- практичних або практичних установах, в яких проводять мікробіологічні, вірусологічні та серологічні дослідження.
В мікробіологічних лабораторіях лікувально-профілактичних установ виконуються відповідні дослідження з метою діагностики інфекційних хвороб, визначення строків виписування хворих з лікувальних закладів, визначення чутливості збудників до антибіотиків та
інших препаратів. Тому на першому занятті важливо вивчити структуру бактеріологічної лабораторії,
її оснащення та організацію.
Бактеріоскопічне дослідження
інфекційного матеріалу є одним з найпоширеніших методів лабораторних досліджень.
На занятті студентам надається можливість оволодіти методикою виготовлення бактеріальних препаратів
із чистих культур мікроорганізмів, фарбування бактерій із застосуванням анілінових барвників та мікроскопією з використанням
імерсійних об’єктивів.
1.3. Контроль
і оцінка початкового рівня підготовки
Студенти виконують тестові завдання, вирішують ситуаційні задачі, викладач проводить усне опитування за станда ртизованим переліком питань, аналізуючи найбільш важливі теоретичні та практичні питання. Зокрема, студенти вивчають структуру мікробіологічної лабораторії, призначення різних підрозділів, організацію та оснащення робочого місця лікаря-бактеріолога, методику виготовлення бактеріального препарату-мазку, анілінові барвники та приготування фарбуючи розчинів для фарбування мікроорганізмів, прості та складні методи фарбування мікроорганізмів, види та принципи мікроскопії, світловий мікроскоп, будова, призначення окремих частин, визначення
1,2 25 хв.

5 збільшення та роздільної здатності мікроскопа, імерсійна система.
2. Основний
етап.
60 хв.
2.1.
Проведення практичних робіт
Цей етап передбачає проведення студентами запланованих досліджень, визначення результатів, їх оцінка, запис протоколу досліджень за встановленою формою.
Рекомендується така послідовність проведення робіт.
1.Студенти записують у протокол заняття тему та план заняття.
2.
Студенти під керівництвом викладача готують бактеріальні препарати із коків та паличок.
3. Фарбують простими методами препарати мазки.
4.
Проводять мікроскопію та аналізують морфологічні властивості мікроорганізмів, зафарбованих простим методом.
2,3 30 хв.
2.2.
Оформлення протоколу
Виконані завдання студенти заносять до протоколу
2,3 20 хв.
2.2.
Аналіз результатів дослідження та їх оцінка.
Студенти обговорюють результати дослідження та формулюють висновки, які записують у протокол.
2,3,4 10 хв.
3. Заключний
етап.
35 хв.
3.1. Контроль кінцевого рівня підготовки та його оцінювання.
Викладач перевіряє оформлення протоколу та в індивідуальній бесіді з кожним студентом встановлює кінцевий рівень набутих знань з основних і найбільш важливих теоретичних та практичних питань та підписує протоколи студентів.
3,4 25 хв.
3.2. Загальна оцінка навчальної діяльності студента.
Викладач повідомляє кожному студенту про загальну оцінку його підготовки та роботи на занятті, виставляє оцінку у журнал обліку відвідувань і успішності студентів. Староста групи заносить оцінки у відомість обліку успішності і відвідування занять студентами, а викладач завіряє їх своїм підписом
5 хв.

6 3.3.
Інформування студентів про тему
Викладач інформує студентів про тему та план наступного практичного заняття, особливості підготовки
5 хв.
Теоретичні питання до заняття:
• Структура мікробіологічної лабораторії, призначення різних підрозділів.
• Організація та оснащення робочого місця лікаря-бактеріолога.
• Методика виготовлення бактеріального препарату-мазку.
• Анілінові барвники та приготування фарбуючи розчинів для фарбування мікроорганізмів.
• Прості та складні методи фарбування мікроорганізмів.
• Види та принципи мікроскопії.
• Світовий мікроскоп, будова, призначення окремих частин.
• Визначення збільшення та роздільної здатності мікроскопа. Імерсійна система.
Рекомендації для оформлення протоколу
«Організація бактеріологічної лабораторії. Барвники і прості методи
фарбування мікроорганізмів. Мікроскопія».
ПРАВИЛА РОБОТИ В УЧБОВІЙ МІКРОБІОЛОГІЧНІЙ ЛАБОРАТОРІЇ
1. В лабораторію заборонено входити у верхньому одязі, працювати дозволено лише в халаті і шапочці.
2. Кожний студент повинен працювати на своєму робочому місці, яке необхідно утримувати в чистоті. На робочому місці не має бути нічого зайвого.
3. Матеріал для практичної роботи одержує черговий у лаборантській кімнаті
і роздає студентам групи в присутності викладача.
4. Використані в роботі матеріали, пробірки з культурами бактерій необхідно знезаразити, для чого черговий здає відпрацьований матеріал у лаборантську.
5. Якщо випадково розіб’ється посуд з заразним матеріалом чи розіллється рідкий заразний матеріал, студент повинен негайно сповістити викладача і разом з ним знезаразити інфіковане місце.
6. Черговий студент контролює порядок та чистоту на робочих місцях студентів в групі
7. У лабораторії ЗАБОРОНЯЄТЬСЯ вживати їжу, протирати вологою ганчіркою ввімкнені прилади; працювати з надтріснутим скляним посудом.
Відділи мікробіологічної лабораторії
Бактеріологічна лабораторія - спеціальні науково-дослідні, науково- практичні або практичні установи, в яких проводять мікробіологічні, біологічні та серологічні дослідження. Їх організовують при профільних науково-дослідних
інститутах, навчальних закладах, клінічних лікарнях, санітарно- епідеміологічних відділах.

7
Вірусологічна лабораторія - установа, що вивчає віруси, проводить діагностику вірусних інфекцій, виготовляє різноманітні вірусні препарати
(вакцини, діагностикуми, противірусні імунні сироватки тощо).
У мікологічних лабораторіях проводять мікроскопічні дослідження та
ідентифікацію культур патогенних грибів з метою діагностики мікозів. Режим їх роботи повинен попередити розсіювання зараженого грибами матеріалу, щоб уникнути інфікування персоналу.
Паразитологічні лабораторії - науково-практичні й практичні діагностичні установи, в яких здійснюються макроскопічні, мікроскопічні та імунологічні дослідження з метою діагностики паразитарних хвороб.
Імунологічні лабораторії - самостійними структурні одиниці або частина мікробіологічної лабораторії, що спеціалізується на проведені серологічних тестів.
Методи мікроскопії
І. Оптична (світлова) мікроскопія.
Оптичні мікроскопи працюють за рахунок фокусування, дифракції і відбиття електромагнітних хвиль видимого діапазону на препараті.
Збільшення мікроскопу = збільшення об'єктиву × збільшення окуляра.
Роздільна здатність мікроскопу – 0,2 мкм.
1. Світлопольна мікроскопія.
Візуалізації досліджуваного об'єкта ґрунтується на вибірковому поглинанні ним або елементами його структури світла з різною довжиною хвилі.
У мікроскопі зафарбований об’єкт видно на світлому фоні.
2. Темнопольна мікроскопія.
Замість конденсора Аббе застосовується спеціальний конденсор темного поля (параболоїд-конденсор), у якому бокова поверхня дзеркальна, а центральна частина нижньої лінзи затемнена, в результаті чого утворюється темне поле зору.
В об’єктив проникають лише ті промені, які відбиваються частинками препарату завдяки заломленню або дифракції. На темному полі зору мікробні клітини й
інші дрібні частинки виглядають дуже яскравими та нагадують «зоряне небо».
Метод дозволяє досліджувати рухливість мікроорганізмів.
3. Фазово-контрастна мікроскопія.
Живі клітини (бактерії), слабо поглинаючи світло, здатні змінювати фазу проникаючих променів. У різних ділянках клітини товщина, щільність та заломлення світла будуть неоднакові. За допомогою спеціального фазовоконтрастного пристрою ці різниці у фазах можна зробити видимими. При роботі з фазовоконтрастним пристрієм клітини можуть виглядати темними
(позитивний фазовий контраст) або світлими (негативний контраст) у порівнянні з оточуючим фоном.
4. Аноптральна мікроскопія.
Різновид фазовоконтрастної мікроскопії, при якій використовують об’єктиви зі спеціальними пластинками, нанесеними на одну з лінз у вигляді затемненого кільця кіптяви або міді. Це обумовлює поглинання близько 10 % світла і робить фон поля зору сіро-коричневим.

8
5. Інтерференційна мікроскопія.
Основана на тих же принципах, що й фазово-контрастна, але на відміну від останньої дає можливість вивчати деталі прозорих об’єктів і проводити їх кількісний аналіз. Це досягається завдяки роздвоєнню світлового променя: один промінь проходить через частинку об’єкту, а другий поза нею. В окулярі обидва промені з’єднуються і інтерферують між собою. Різницю виникаючих фаз можна виміряти, визначаючи тим самим масу різних структур в клітині, що дає змогу зробити побічні висновки про проникність мембран, активність ферментів, метаболізм клітин, тощо.
6. Люмінесцентна мікроскопія.
Цей метод дозволяє спостерігати первинну або вторинну люмінесценцію мікроорганізмів. Зображення в люмінесцентному мікроскопі виникає через світіння самого препарату, яке виникає при освітленні його короткохвильовою частиною спектра. Метод оснований на використанні явища флуоресценції. Так як більшість мікроорганізмів не мають власної люмінесценції, їх спочатку обробляють слабкими розчинами спеціальних барвників – флуорохромів.
Найчастіше застосовують такі флуорохроми: акридиновий оранжевий, аурамін, корифосфін, ізотіоціанат флуоресцеїну та ін.
7. Конфокальна мікроскопія.
Цей метод застосовує точкове освітлення та діафрагму з мініатюрним отвором, встановлену перед детектором, щоб прибрати розсіяне позафокусне світло. Конфокальний мікроскоп дозволяє реконструювати на основі отриманих зображень тривимірну структуру досліджуваного зразка.
ІІ. Електронна мікроскопія.
Для вивчення будови мікроорганізмів на субклітинному і молекулярному рівнях, а також для дослідження структури і архітектоніки вірусів використовують електронний мікроскоп. Це високовольтний вакуумний прилад, у якому збільшене зображення отримують за допомогою потоку електронів. Він має високу роздільну здатність і може давати збільшення від 20 тис до 5 млн разів. За принципом дії розрізняють просвічуючі (трансмісивні), скануючі
(растрові) й комбіновані електронні мікроскопи.
Рис. 3. Схема промінів при сухій (А) і масляній (Б) системах;
1-фронтальна лінза об’єктиву; 2-імерсійне масло; 3-предметне скло.

9
Імерсійний об’єктив (лат. Immersio - занурення) – це об'єктив мікроскопа, у якого простір між першою лінзою і розглядаються предметом заповнений рідиною з показником заломлення як у скла (наприклад, кедрова олія).
Анілінові барвники
Водно-спиртові розчини похідних аніліну, що використовуються для фарбування мікроорганізмів. Анілінові барвники бувають: нейтральні, кислі та основні (для фарбування застосовуються останні).
Колір
Основні
Кислі
Червоний
Нейтральний червоний
Фуксин
Сафранін
Піронін
Кислий фуксин
Еозин
Фіолетовий
Генціанвіолет
Кристалвіолет
-
Синій
Метиленовий синій
-
Зелений
Малахітовий зелений
Бриліантовий зелений
-
Чорний
Інулін
Нігрозин
Жовтий
-
Конго
Аурантія
Коричневий
Хризоїдин
-
Техніка виготовлення бактеріального препарату-мазку
1. Приготуйте чисте предметне скельця.
2. Простерилізуйте бактеріологічну петлю.
3. Візьміть пробірку з культурою в ліву руку і помістіть її похило між великим і вказівним пальцем. Відкрийте пробірку, затискаючи корок мізинцем правої долоні.
Стерильну петлю введіть у пробірку з культурою, охолодіть, доторкнувшись до внутрішньої поверхні пробірки, а потім візьміть нею невелику кількість біомаси мікроорганізмів
4. Обпаліть краї пробірки та корка.
5. Закрийте пробірку, поставте її в штатив.
6. Петлею з біомасою зробіть штрих на склі, добавте краплю фізичного розчину та розтріть вийшла суспензія.
7. Простерилізуйте петлю.
8. Зафіксуйте мазок.
Існують прості та складні методи фарбування мікроорганізмів. Прості – з використанням одного барвника; складні – два та більше барвників.

11
Рекомендована література
Основна:
1.
Широбоков В. П. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія: підручник для студ. вищ. мед. навч. закл. / Видання 3-е перероблене і доповнене / [За заг.ред. Широбокова В.П.]. – Вінниця: Нова Книга, 2021. –
С. 42-46.
2.
Широбоков В.П., Климнюк С.І. Мікробіологія, вірусологія та імунологія в запитаннях і відповідях: навч. посіб. / [За заг ред. Широбокова В.П.
Климнюка С.І.]. – Тернопіль: ТДМУ, 2019. – С.14-16.
3.
Широбоков В.П., Климнюк С.І. Практична мікробіологія: навчальний посібник / [За заг.ред. Широбокова В.П., Климнюка С.І.]. – Вінниця: Нова
Книга, 2018. – С. 12-28.
4.
Medical microbiology, virology, immunology: a textbook for English-speaking students of higher medical schools’ translations from ukr. Published / [T.V.
Andrianova, V.V. Bobyr, etc.] ; Ed. by V.P. Shyrobokov. – Vinnytsia : Nova
Knyha, 2019. – P.33-39.
Додаткова:
1. Медична мікробіологія. Посібник з мікробних інфекцій: патогенез,
імунітет, лабораторна діагностика та контроль: 19 вид.: у 2 т. Том 2 /
Майкл Р. Барер, Вілл Ірвінг, Ендрю Свонн, Нелюн Перера: наук. ред. пер.:
С. Климнюк та ін. – К: ВСВ «Медицина». - 2021. – С. 9-24.
Питання для самопідготовки студента до заняття
• Що вивчає медична мікробіологія?
• Яка структура мікробіологічної лабораторії та яке призначення її підрозділів?
• Які види мікроскопії Вам відомі? Назвіть їх переваги та недоліки.
• Що таке імерсійна система? Які ознаки імерсійного об’єктиву?
• Як розрахувати загальне збільшення мікроскопа?
• Що таке роздільна здатність мікроскопа і чому вона дорівнює?
• Що таке анілінові барвники? Особливості їх приготування та застосування?
• З якою метою роблять фіксацію мазків на предметному склі?
• Які особливості фарбування мікроорганізмів? Назвіть їх види.